ISOLASI SENYAWA ANTIBIOTIKA YANG

JURNAL TEKNOLOGI &
INDUSTRI
ISSN 2087-6920
Vol. 2 No. 1; Juli 2012
UJI AKTIVITAS SENYAWA ANTIBIOTIKA YANG DIHASILKAN OLEH
AKTINOMISETES ENDOFIT Streptomyces bacillaris AY999817 DARI
BATANG TANAMAN URANG ARING
*ERFANUR ADLHANI1, ANIS HERLIYATI MAHSUNAH2, YUNIANTA3
1Program
2Balai
Studi Teknologi Industri Pertanian, Jl. A. Yani, Km.6, Ds. Panggung, kec. Pelaihari, kab. Tanah
Laut, Kalimantan Selatan
Pengkajian Bioteknologi–BPPT, Kawasan Puspiptek Gedung 630, Serpong, Tangerang, Banten
3Fakultas
Teknologi Pertanian, Program Pasca Sarjana Universitas Brawijaya, Malang, Jawa Timur
Naskah diterima: 20 April 2012; Naskah disetujui: 21 Juni 2012
ABSTRAK
Antibiotik merupakan senyawa antimikroba yang diproduksi oleh organisme hidup dan juga secara sintesis
kimia, yang memiliki aktivitas penghambatan terhadap organisme lain. Tujuan penelitian ini adalah untuk
menguji aktivitas senyawa antibiotika yang dihasilkan oleh isolat aktinomisetes endofit Streptomyces
bacillaris AY999817 yang berasal dari batang tanaman urang aring. Penelitian ini menggunakan metode
analisa deskripsi kualitatif, dimana isolasi antibiotik dilakukan dengan menumbuhkan isolat pada media
fermentatif selama empat hari, dan ekstraksi menggunakan pelarut butanol dengan proses pemecahan sel
menggunakan gelombang ultrasonik (sonikasi). Hasil penelitian menunjukkan bahwa isolat yang digunakan
memiliki aktivitas penghambatan melawan bakteri Bacillus subtilis, Echerichia coli, Pseudomonas
aeruginosa dan Staphylococcus aureus.
Kata Kunci:
antibiotik, aktinomisetes endofit, ekstraksi, sonikasi, Streptomyces bacillaris AY999817
PENDAHULUAN
Antibiotik merupakan senyawa antimikroba yang diproduksi oleh organisme hidup dan
juga secara sintesis kimia, dan memiliki aktivitas penghambatan terhadap pertumbuhan organisme
lain. Kebanyakan antibiotik diproduksi sebagai metabolit sekunder. Isolasi antibiotik dari
organisme hidup relatif mudah jika dibandingkan dengan sintesis kimia antibiotik. Sintesis kimia
antibiotik biasanya meliputi beberapa tahapan dan dimulai dari bahan yang mahal. Selain itu, pada
akhir pengerjaannya digunakan asam dan basa kuat serta pelarut dengan titik didih tinggi, dan
antibiotik yang dihasilkan biasanya diperoleh bersamaan dengan banyak bahan toksik sehingga
prosesnya secara menyeluruh menjadi mahal (Ahmed, 2007).
Organisme penghasil antibiotik dapat berupa jamur, bakteri dan aktinomisetes, namun
sebagian besar diisolasi dari beberapa spesies aktinomisetes. Aktinomisetes menunjukkan sifat
sebagai sumber yang kaya akan metabolit yang aktif secara biologis seperti agen antibiotik,
agrokimia, enzim, substansi kekebalan, antiparasit dan antikanker (Kavitha & Vijayalakhsmi,
2007). Antibiotik yang dihasilkan aktinomisetes mencapai 75% bagian dari keseluruhan produk
antibiotik yang telah dikenal. Organisme ini merupakan kelompok berfilamen, bakteri Grampositif yang memiliki kandungan G+C tinggi dalam DNA mereka, sifatnya aerobik, saprofit, dan
bentuknya mesofil yang secara alami memiliki habitat dalam tanah (Han et al., 2004).
*Korespondensi:
Telepon/nomor faks
Email
: 0512-21537
1
: [email protected]
Kelompok
aktinomisetes
menghasilkan
bermacam-macam
antibiotik
meliputi
aminoglikosida, glikopeptida, β-laktam, makrolida, nukleosida, peptida, polimer, dan tetrasiklin,
dan kebanyakan dari mereka diisolasi dari genus Streptomyces (Ahmed, 2007), sebagai contohnya,
streptomisin yang dihasilkan oleh Streptomyces griseus, spektinomisin yang dihasilkan oleh
Streptomyces spp., neomisin yang dihasilkan oleh Streptomyces fradiae, kanamisin yang
dihasilkan oleh Streptomyces canomyceticus, tetrasiklin yang dihasilkan oleh Streptomyces spp.,
eritromisin yang dihasilkan oleh Streptomyces erythreus, 4-metilaeruginoat yang diisolasi dari
Streptomyces sp., sineromisin dan musain yang diisolasi dari Streptomyces griseovirid, dan 8hidroksikuinolin yang diisolasi dari Streptomyces sp ANU 6277. Oleh karena itulah dilakukan
penelitian mengenai uji aktivitas senyawa antibiotik dari Streptomyces yang berasal dari bahan
alam.
METODOLOGI
Mikroorgansime
Isolat aktinomisetes yang digunakan berasal dari stock culture Balai Pengkajian
Bioteknologi-BPPT Kawasan Puspiptek Serpong, dengan kode isolat BiOMCC-00042 yang
merupakan isolat endofit dari spesies Streptomyces bacillaris AY999817. Isolat ini berasal dari
bagian batang tanaman urang aring dari daerah Bondowoso, Jawa Timur. Sedangkan mikroba uji
yang digunakan untuk uji aktivitas antimikroba ditampilkan pada Tabel 1.
Gambar 1. Isolat Streptomyces bacillaris AY999817
Tabel 1. Mikroorganisme Uji
Mikroba Uji
Jenis Mikroba
Eschericia coli ATCC 25992
Bakteri Gram(-)
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853
Bakteri Gram(-)
Bacillus subtilis ATCC 6633
Bakteri Gram (+)
Staphylococcus aeureus BioMCC 00115
Bakteri Gram(+)
Bahan-bahan Kimia
Bahan-bahan kimia yang digunakan antara lain pelarut organik metanol, butanol, bahan
untuk pembuatan media merek Oxoid dan Difco seperti: potato starch, D(+)-glukosa, soybean
2
meal, yeast ekstrak, malt ekstrak, bakto agar, bakto pepton, Nutrien Agar (NA), Potato Dextrose
Agar (PDA), dan Nutrien Broth (NB); bahan-bahan kimia merek Merck seperti: NaCl, CaCO3,
CuSO4.5H2O, MnCl2.4H2O, ZnSO4.7H2O, NaCl, HCl, Na2SO4 anhidrat dan Fe-sitrat.nH2O,
rifampisin, dan akuades.
Regenerasi Isolat
Sebanyak 1 ose isolat digoreskan (streak) dalam cawan petri berisi media ISP2 (malt
ekstrak, yeast ekstrak, bakto agar dan D(+)-glukosa). Isolat kemudian ditumbuhkan dalam
inkubator selama 8x24 jam.
Menumbuhkan Kultur Vegetatif (seed culture)
Isolat aktinomisetes yang telah diregenerasi diinokulasikan sebanyak 1 ose ke dalam media
YM (0,1 g baktopepton, 0,06 g yeast ekstrak, 0,06 g malt ekstrak, dan 0,2 g D(+)-glukosa dalam
20 ml akuades, pH = 7,6 ± 0,2). Kemudian ditumbuhkan selama 2x24 jam dengan rotary shaker,
suhu 280C, kecepatan 150 rpm.
Fermentasi
Sebanyak 10% media YM kultur vegetatif dipindahkan dalam media BY. Komposisi
media BY adalah 1,5 g baktopepton; 0,3 g yeast ekstrak; dan 0,03 g Fe-sitrat n H2O dalam 100 ml
akuades. pH = 7,6 ± 0,2. Kemudian diinkubasi dengan rotary shaker pada suhu 280C selama 4x24
jam, dengan kecepatan 150 rpm. Pertumbuhan isolat aktinomisetes diamati berdasarkan ada
tidaknya biomassa sel yang dihasilkan, dimana bentuknya berupa butiran tanpa miselium. Apabila
terbentuk miselium, maka dapat dikatakan terkontaminasi oleh jamur. Sedangkan untuk
mengetahui kontaminasi bakteri, dilihat dari kekeruhan media, yang mana media pertumbuhan
bakteri berwarna putih susu dan terjadi pencampuran antara biomassa sel dengan cairan media.
Kontrol lainnya dapat juga dilakukan dengan pengamatan di bawah mikroskop, dimana
aktinomisetes akan menunjukkan koloni dengan garis-garis tipis hifa, dibandingkan dengan jamur
yang hifanya terlihat sangat jelas dan bakteri yang tidak memiliki hifa.
Ekstraksi Pelarut
Kaldu fermentasi (fermentation broth) disentrifuse dingin selama 20 menit dengan
kecepatan 8000 rpm. Supernatan diambil dan disimpan dalam refrigerator, sedangkan biomassa
dicuci 1 kali dengan akuades kemudian disentrifuse dingin kembali selama 25 menit. Filtrat
dibuang dan biomassanya disimpan dalam refrigerator sebelum digunakan.
Supernatan
Supernatan yang diperoleh diukur volume totalnya, kemudian dicampurkan pelarut
dengan perbandingan 1:1. Setelah itu dikocok dengan shaker selama 60 menit dengan kecepatan
300 rpm (Abdel-Raouf & Ibraheem, 2008) dan dipisahkan dengan corong pisah. Apabila terbentuk
3
endapan atau busa putih, maka disentrifuse kembali, endapannya dibuang dan supernatannya
diambil sebagai fase organik.
Biomassa
Sebelum diekstraksi, sampel biomassa disonikasi terlebih dahulu selama 30 menit.
Biomassa dilarutkan dalam pelarut dengan perbandingan 1:10 (tiap 1 g dalam 10 ml pelarut),
kemudian dikocok selama 30 menit dengan shaker, kecepatan 300 rpm. Setelah itu dipisahkan
dalam corong pisah, fase organiknya diambil sedangkan fase airnya dibuang.
Untuk biomassa yang tidak larut dalam pelarut, pada saat sonikasi dilarutkan terlebih
dahulu dengan akuades, setelah itu baru dicampurkan pelarut 2x volume akuades dan dikocok
dengan shaker selama 60 menit. Apabila terjadi endapan atau busa putih, maka dilakukan
perlakukan yang sama seperti pada sampel supernatan.
Sonikasi
Substrat fermentasi dimasukkan dalam tabung sentrifuse yang diletakkan dalam gelas
beaker berisi es. Kemudian batang logam sonikator dimasukkan ke dalamnya hingga berjarak ± 1
cm dari dasar tabung sentrifuse. Sonikasi dilakukan selama 30 menit, setiap 30 detik berhenti 10
detik, dengan kekuatan ultrasonik 7 MHz.
Uji Aktivitas Antimikroba
Uji aktivitas antimikroba dilakukan menggunakan metode difusi agar, mikroba uji yang
telah ditumbuhkan dipipet berdasarkan jumlah selnya ke dalam media NA, diaduk dengan stirer
kemudian dituang dalam cawan petri dan dibiarkan mengeras. Masing-masing ekstrak dalam
metanol diteteskan setiap 10 µl di atas kertas cakram 6 mm. Kertas cakram didiamkan ± 15 menit
hingga metanol menguap. Setelah itu, masing-masing kertas cakram ini diletakkan dalam cawan
petri pada jarak tertentu, sesuai dengan penomoran pada dasar petri, untuk memudahkan
pengamatan. Cawan petri berisi kertas cakram ini kemudian didifusikan dalam refrigerator selama
± 2 jam, setelah itu dimasukkan dalam inkubator selama 2x24 jam pada suhu 37 0C (Abdel-Raouf
& Ibraheem, 2008). Pengamatan dilakukan pada hari pertama (setelah 1x24 jam) dan hari kedua
(setelah 2x24 jam). Isolat dengan aktivitas tertinggi memiliki diameter zona bening terluas dan
tidak parsial.
Analisis Data
Analisa data dilakukan secara deskripsi kualitatif dengan penentuan aktivitas berdasarkan
pada besarnya zona penghambat terhadap mikroba uji.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Pada penelitian ini, ekstraksi senyawa antibiotik dari isolat Streptomyces bacillaris
AY999817 dilakukan dengan cara fermentasi isolat dalam media BY, kemudian dipisahkan antara
4
biomassa dan supernatan. Dipisahkan antara biomassa dan supernatan dengan tujuan untuk
mengetahui jenis metabolit sekunder yang dihasilkan, ekstraseluler atau intraseluler. Menurut
suwandi (1990), apabila produk disekresikan ke dalam medium (ekstrasel), bagian cairan dapat
langsung diambil dan diekstraksi pada proses berikutnya, atau ekstraksi dapat langsung dilakukan
tanpa memisahkan biomassa sel dan cairan media. Sedangkan metabolit intraseluler dalam proses
perlakuannya lebih rumit jika dibandingkan dengan metabolit ekstraseluler, karena harus
memisahkan antara biomassa dan supernatan terlebih dahulu, namun untuk pemurniannya
cenderung lebih murni, sehingga lebih mudah digunakan untuk elusidasi struktur senyawa aktif.
Setelah dipisahkan antara biomassa dan supernatan, selanjutnya dilakukan ekstraksi
menggunakan pelarut butanol dan ekstrak cair dalam butanol hasil ekstraksi dipekatkan untuk
memperoleh ekstrak kering. Digunakan pelarut butanol karena pada penelitian sebelumnya, pelarut
butanol telah terbukti dapat mengekstrak senyawa antibiotik dari isolat Streptomyces dengan zona
penghambatan cukup besar terhadap antimikroba.
Tabel 2. Tabel Hasil Pengamatan Uji Aktivitas Antimikroba
Zona Hambat (mm)
Perlakuan
SA
BS
PA
EC
Biomassa
27,76
25,51
24,50
30,32
Supernatan
10,67
9,32
12,07
10,45
19,84
15,16
19,07
16,32
-
-
-
-
Rifampisin 500 ppm (kontrol
positif bakteri)
Butanol (kontrol negatif)
Keterangan:
SA (Staphylococcus aureus), BS (Bacillus subtilis), PA
(Pseudomonas aeruginosa), EC (Escherichia coli). Tanda (-)
menunjukkan tidak ada aktivitas penghambatan; ukuran kertas
cakram = 6mm.
Ekstrak kering kemudian dilarutkan dalam metanol, karena metanol merupakan pelarut
yang dapat melarutkan hampir semua jenis senyawa, sehingga diharapkan ekstrak kering yang
diperoleh dapat terlarut sempurna. Ekstrak dalam metanol ini kemudian diuji aktivitasnya terhadap
bakteri uji menggunakan metode difusi agar. Hasil uji aktivitas antibakteri senyawa antibiotik yang
dihasilkan oleh isolat Streptomyces bacillaris AY999817 ditunjukkan pada Tabel 2.
5
Gambar 2. Diagram Batang Zona Penghambatan Bakteri Uji
(1)
(2)
(3)
(4)
Gambar 3. Hasil Uji Aktivitas Isolat BioMCC-00042 untuk (1). bakteri Staphylococcus
aureus, (2). Bakteri Bacillus subtilis, (3). Bakteri Echerichia coli, (4).
Bakteri Pseudomonas aeruginosa
Berdasarkan hasil yang diperoleh, dapat dilihat bahwa senyawa antibiotik yang dihasilkan
memiliki zona penghambatan terhadap bakteri uji yang digunakan, yang berarti senyawa antibiotik
yang dihasilkan terbukti memiliki kemampuan sebagai antibakteri. Dari Gambar 2. terlihat dengan
jelas besarnya zona hambat bakteri dari ekstrak biomassa lebih besar dibandingkan ekstrak
supernatan, sehingga dapat disimpulkan senyawa antibiotik yang dihasilkan termasuk metabolit
intraseluler, yaitu yang dihasilkan dari dalam sel.
6
Isolat Streptomyces bacillaris AY999817 merupakan isolat endofit, karena diisolasi dari jaringan
batang tanaman urang aring. Petrini dkk. (1992) menyatakan bahwa endofit merupakan
mikroorganisme yang sebagian atau seluruh hidupnya berada di dalam jaringan hidup tanaman
inang dan menurut de Araujo et al. (1999), mikroorganisme endofit memiliki habitat pada bagian
dalam tanaman, melindungi tanaman inang dari serangga dan penyakit, dan mereka dapat
menghasilkan substansi farmasi berharga untuk kepentingan bioteknologi.
UCAPAN TERIMAKASIH
Proyek penelitian ini didukung secara finansial oleh Balai Pengkajian Bioteknologi–
BPPT, Kawasan Puspiptek Gedung 630, Serpong Tangerang dan dan Program Beasiswa Double
Degree BKPLN DEPDIKNAS Republik Indonesia.
DAFTAR PUSTAKA
Abdel-Raouf, N. and Ibraheem, I.B.M. 2008. Antibiotic Activity of Two Anabaena Species
Againts Four Fish Pathogenic Aeromonas Species. African Journal of Biotechnology. 15:
2644-2648.
Ahmed, A.A. 2007. Production of Antimicrobial Agent by Streptomyces violachromogenes. Saudi
Journal of Biological Sciences 14: 7-16.
Broz, J. and Paulus, C. 2007. Benzoic acid – a new additive for swinew feed. International Pig
Topics. Vol. 20, No. 7.
Dooley, D.P., Tyler, J.R, Wortham, W.G, Harrison, L.S. and Starnes, Jr. W.F. 2003. Prolonged
Stability of Antimicrobial Activity in Peritoneal Dialysis Solution. Peritoneal Dialysis
International. 23: 58–62.
Han, W.C., Lee, J.Y, Park, D.H, Lim, C.K. and Hwang. B.K. 2004. Isolation and Antifungal and
Antioomycete Activity of Streptomyces scabiei Strain PK-A41, the Causal Agent of
Common Scab Disease. Plant Pathol. J. 20: 115-126.
Kavitha and
Vijayalakshmi, M. 2007. Studies on Cultural, Physiological and Antimicrobial
Activities of Streptomyces rochei. Journal of Applied Sciences Research. 3 : 2026-2029.
Lucas, E.M.F., de Castro, M.C.M. and Takahashi. J.A. 2007. Antimicrobial Properties of
Sclerotiorin, Isochromophilone VI dan Pencolide, Metabolit from Brazilian Cerrado
Isolate of Penicillium sclerotiorum Van Beyma. Brazilian Journal of Microbiology. 38:
785-789.
Moncheva, P. S. Tishkov, N. Dimitrova, V. Hipeva, S. Antonova-Nikolova. And Bogatzevska, N.
2002. Characteristics of Soil Actinomycetes From Antartica. J. Cult. Collect. 3: 3-14.
7
Sarhan, A.A. 2007. Mutagenic Activity of N-butyl and N-Hexyl Azide in the Salmonella
Muatgenicity Test (Ames Test). Journal of Applied Sciences Research. 3(9): 886-889.
Stermitz, F.R., Lorenz, P, Tawara, J.N, Zenewicz, L.N. and Lewis, K. 1999. Synergy in a
Medicinal
Plant:
Antimicrobial
Action
of
Berberine
Potentiated
by
5*-
Methoxyhydnocarpin, a Multidrug Pump Inhibitor. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97(4):
1433-1437.
Wibbertmann, A., Kielhorn, J, Koennecker, G, Mangelsdorf, I. and Melber, V. 2005. Benzoic Acid
and Sodium Benzoat. Concise International Chemical Assessment Document 26.
8