Document
advertisement
LAPORAN PRAKTIKUM BIOLOGI DASAR PERCOBAAN 3 PEMBUATAN MEDIA PADAT DAN ISOLASI MIKROORGANISME DENGAN METODE TUANG DAN AGAR MIRING OLEH: RAMADHAN NURCHOLIS (1500529) AYU ARTI PUTRI HANDA (1500634) RIZKI YANTI RAHAYU (1500753) GHINA ANZALINA (1500769) NOVITA PURNAMASARI HENDARMIN (1503646) KELOMPOK 2 PROGRAM STUDI PENDIDIKAN TEKNOLOGI AGROINDUSTRI FAKULTAS PENDIDIKAN DAN TEKNOLOGI KEJURUAN UNIVERSITAS PENDIDIKAN INDONESIA 2015 I. Teori 1.1.Yoghurt Susu segar merupakan bahan makanan yang bergizi tinggi karena mengandung zat-zat makanan yang lengkap dan seimbang seperti protein, lemak, karbohidrat, mineral, dan vitamin yang sangat dibutuhkan oleh manusia. Nilai gizinya yang tinggi juga menyebabkan susu merupakan medium yang sangat disukai oleh mikrooganisme untuk pertumbuhan dan perkembangannya sehingga dalam waktu yang sangat singkat susu menjadi tidak layak dikonsumsi bila tidak ditangani secara benar. Mikroorganisme yang berkembang didalam susu selain menyebabkan susu menjadi rusak juga membahayakan kesehatan masyarakat sebagai konsumen akhir. Disamping itu penanganan susu yang benar juga dapat menyebabkan daya simpan susu menjadi singkat, harga jual murah yang pada akhirnya juga akan mempengaruhi pendapatan peternak sebagai produsen susu. Kerusakan pada susu disebabkan oleh terbentuknya asam laktat sebagai hasil fermentasi laktosa oleh koli. Fermentasi oleh bakteri ini akan menyebabkan aroma susu menjadi berubah dan tidak disukai oleh konsumen. Untuk meminimalkan kontaminasi oleh mikroorganisme dan menghambat pertumbuhan bakteri pada susu agar dapat disimpan lebih lama maka penanganan sesudah pemerahan hendaknya menjadi perhatian utama peternak. Salah satu cara yang dapat ditempuh untuk mencegah kerusakan pada susu adalah dengan cara pemanasan (pasteurisasi) baik dengan suhu tinggi maupun suhu rendah yang dapat diterapkan pada peternak. Dengan pemanasan ini diharapkan akan dapat membunuh bakteri patogen yang membahayakan kesehatan manusia dan meminimalisasi perkembangan bakteri lain, baik selama pemanasan maupun pada saat penyimpanan. Proses pengolahan susu bertujuan untuk memperoleh susu yang beraneka ragam, berkualitas tinggi, berkadar gizi tinggi, tahan simpan, mempermudah pemasaran dan transportasi, sekaligus meningkatkan nilai tukar dan daya guna bahan mentahnya. Proses pengolahan susu selalu berkembang sejalan dengan berkembangnya ilmu dibidang tekologi pangan. Dengan demikian semakin lama akan semakin banyak jenis produk susu yang dikenal. Hal ini sangat menggembirakan dan merupakan langkah yang sangat tepat untuk mengimbangi laju permintaan pasar. Banyak jenis bahan makanan yang dapat dibuat dari bahan baku susu. Antara lain jenis produk susu yang sudah dikenal dikalangan masyarakat adalah es krim, susu bubuk, susu kental, mentega, yoghurt yang dihasilkan melalui proses homogenisasi, sterilisasi, pasteurisasi dan fermentasi. Yoghurt adalah bahan makanan yang berasal dari susu sapi, yang merupakan hasil pemeraman susu dalam bentuk mirip bubur atau es krim yang mempunyai rasa agak asam sebagai hasil fermentasi oleh bakteri-bakteri tertentu. Pembuatannya telah berevolusi dari pengalaman beberapa abad yang lalu dengan membiarkan susu yang tercemar secara alami menjadi masam pada suhu tinggi, mungkin sekitar 40-50°C. Akhir-akhir ini ditemukan pula bahwa yoghurt dapat pula dibuat dari susu skim, full krim atau bahkan dari kacang kedelai (disebut Soyghurt). Yoghurt lebih mudah dicerna didalam perut dibandingkan susu biasa. Selain itu yoghurt juga mengandung nilai pengobatan terhadap lambung dan usus yang terluka, kadar kolestrol didalam darah dapat diturunkan dengan mengkonsumsi yoghurt, sehingga dapat mencegah terjadinya penyumbatan pembuluh darah (atherosklerosis). Yoghurt sangat sesuai dikonsumsi oleh penderita defisiensi enzim laktase dalam tubuhnya (lactose intolerance), dimana tubuh tidak mampu mengubah laktose menjadi glukosa dan galaktosa. Kelainan ini mengakibatkan timbulnya sakit perut dan diare setelah mengkonsumsi susu. Dengan mengkonsumsi yoghurt kejadian tersebut tidak perlu terjadi. Yoghurt mempunyai kandungan protein lebih daripada susu sapi, tetapi mempunyai lemak yang lebih rendah. Hal ini tentu sangat bermanfaat bagi orang yang ingin melakukan diet. Prinsip pembuatan yoghurt adalah fermentasi susu dengan cara penambahan bakteribakteri Lactobacillus bulgaricus dan Streptoccus thermophillus. Dengan fermentasi ini maka rasa yoghurt akan menjadi asam, karena adanya perubahan laktosa menjadi asam laktat oleh bakteri-bakteri tersebut. Apabila tidak diinginkan rasa yang tidak terlalu asam, tambahkan zat pemanis (gula, sirup) maupun berbagai flavour buatan dari buah-buahan strawberry, nenas, mangga, jambu, dan sebagainya. Lactobacillus termasuk golongan bakteri asam laktat yang sering dijumpai pada makanan fermentasi, produk olahan ikan, daging, susu, dan buah-buahan (Napitupulu et al., 1997). Sejauh ini telah diketahui bahwa keberadaan bakteri ini tidak bersifat patogen dan aman bagi kesehatan sehingga sering digunakan dalam industri pengawetan makanan, minuman dan berpotensi sebagai produk probiotik. Sifat yang menguntungkan dari bakteri Lactobacillus dalam bentuk probiotik adalah dapat digunakan untuk mendukung peningkatan kesehatan. Bakteri tersebut berperan sebagai flora normal dalam sistem pencernaan. Fungsinya adalah untuk menjaga keseimbangan asam dan basa sehingga pH dalam kolon konstan. Cartney (1997) melaporkan bahwa bakteri probiotik menjaga kesehatan usus, membantu penyerapan makanan, produksi vitamin, dan mencegah pertumbuhan bakteri patogen. Selain itu dapat meningkatkan fungsi sistem kekebalan tubuh, metabolisme kolesterol, karsinogenesis, dan menghambat penuaan. Heprer et al., (1979) menyatakan bahwa pemberian suplemen yoghurt selama satu minggu, dapat menurunkan serum kolesterol pada manusia. Yoghurt dan susu menurunkan kolesterol setelah menginduksi hypercholesterolemia kelinci. Yoghurt lebih besar memberi pengaruh dari pada susu. Lactobacillus mempunyai potensi yang besar sebagai produk probiotik karena keunggulannya dibanding bakteri asam laktat lainnya (Davis dan Gasson. 1981; Muriana dan Klaenhammer, 1987). Selanjutnya Annonym (2000) mengatakan bahwa Lactobacillus plantarum dan L. casei dapat aktif pada pH rendah dan menghasilkan asam laktat dalam jumlah banyak sehingga pada makanan ternak dapat membantu menyimpan energi. Napitupulu et al. (2000) melaporkan bahwa Lactobacillus menghasilkan anti bakteri. Filtrat Lactobacillus dapat menghambat pertumbuhan bakteri patogen Streptococcus, Staphylococcus aureus, dan Escerichia coli, bahkan filtrat yang sudah disimpan selama 6 bulan memiliki kemampuan sama. Lactobacillus juga mampu menghambat pertumbuhan bakteri lain yang merugikan atau patogen (Tagg et al., 1976; Chassy, 1987). Goldin dan Gorbach (1992) mengatakan bahwa beberapa substansi antimikroba yang dihasilkan bakteri probiotik, misalnya L. acidophilus menghasilkan acidotin, acidophilin, bacteriocin, lactocidin, L. bulgaricus (bulgarican), L. plantarum (lactolin), L. brevis (lactobullin, lactobrevin), dan L. reuteri (rauterin). Beberapa kriteria penting untuk karakter fisiologi yang merupakan seleksi kelayakan bakteri sebagai produk probiotik antara lain uji pertumbuhan/resistensi bakteri probiotik pada pH rendah. Fetlinski dan Stepaniak (1994) menyebutkan bahwa dapat tidaknya suatu bakteri sebagai probiotik tergantung resistensi atau ketahanan probiotik terhadap pH rendah, garam empedu, dan kemampuan untuk hidup dalam sistem pencernaan. Dalam praktikum kali ini, kami menggunakan sampel yoghurt dan memanfaatkan bakteri yang ada di dalam yoghurt yaitu Lactobacillus bulgaricus dan Streptoccus thermophillussebagai biakan untuk di isolasi di media pertumbuhan mikroorganisme 1.2.Media Pertumbuhan Mikroorganisme Medium pertumbuhan (disingkat medium) adalah tempat untuk menumbuhkanmikroba. Mikroba memerlukan nutrisi untuk memenuhi kebutuhan energi dan untuk bahan pembangun sel, untuk sintesa protoplasma dan bagian-bagian sel lain. Setiap mikroba mempunyai sifat fisiologi tertentu, sehingga memerlukan nutrisi tertentu pula. Susunan kimia sel mikroba relatif tetap, baik unsur kimia maupun senyawa yang terkandung di dalam sel. Dari hasil analisis kimia diketahui bahwa penyusun utama sel adalah unsur kimia C, H, O, N, dan P, yang jumlahnya + 95 % dari berat kering sel, sedangkan sisanya tersusun dari unsur-unsur lain. Susunan dan kadar nutrisi suatu medium untuk pertumbuhan mikroba harus seimbang agar mikroba dapat tumbuh optimal. Hal ini perlu dikemukakan mengingat banyak senyawa yang menjadi zat penghambat atau racun bagi mikroba jika kadarnya terlalu tinggi (misalnya garam dari asam lemak, gula, dan sebagainya). Banyak alga yang sangat peka terhadap fosfat anorganik. Disamping itu dalam medium yang terlalu pekat aktivitas metabolisme dan pertumbuhan mikroba dapat berubah. Perubahan faktor lingkungan menyebabkan aktivitas fisiologi mikroba dapat terganggu, bahkan mikroba dapat mati. Medium memerlukan kemasaman (pH) tertentu tergantung pada jenis jasad yang ditumbuhkan. Aktivitas metabolisme mikroba dapat mengubah pH, sehingga untuk mempertahankan pH medium ditambahkan bahan buffer. Beberapa komponenpenyusun medium dapat juga berfungsi sebagai buffer. Berikut imi adalah macammacam medium pertumbuhan: 1. Medium dasar/basal mineral Medium dasar adalah medium yang mengandung campuran senyawa anorganik. Medium dasar ini selanjutnya ditambah zat lain apabila diperlukan, misalnya sumber karbon, sumber energi, sumber nitrogen, faktor tumbuh, dan faktor lingkungan yang penting seperti pH dan oksigen serta tekanan osmosis. 2. Medium sintetik Medium sintetik adalah medium yang seluruh susunan kimia dan kadarnya telah diketahui dengan pasti. Sebagai contoh adalah medium dasar yang ditambah NH4Cl (medium 1) dengan sumber karbon berupa gas CO2, apabila diinkubasikan dalam keadaan gelap dapat digunakan untuk menumbuhkan bakteri nitrifikasi khemoototrof, misalnya bakteri Nitrosomonas. Bakteri ini memperoleh energi dari oksidasi amonium, selain itu amonium juga berfungsi sebagai sumber nitrogen. Contoh lain adalah medium dengan susunan sama dengan medium 1 tetapi ditambah glukosa (medium 2). Dalam keadaan aerob merupakan medium untuk perbanyakan jamur dan bakteri yang bersifat heterotrof. Glukosa berfungsi sebagai sumber karbon dan sumber energi. Dalam keadaan anaerob, medium ini dapat digunakan untuk menumbuhkan bakteri fakultatif anaerob maupun anaerob obligat. Energi diperoleh dari hasil fermentasi glukosa. Untuk menumbuhkan mikroba yang memerlukan faktor tumbuh dapat menggunakan medium yang komposisinya sama dengan medium 2 tetapi ditambah asam nikotinat (vitamin) sebagai faktor tumbuh (medium 3). 3. Medium kompleks Medium kompleks adalah medium yang susunan kimianya belum diketahui dengan pasti. Sebagai contoh medium ini adalah medium dasar yang ditambah glukosa dan ekstrak khamir (medium 4). Susunan kimia ekstrak khamir tidak diketahui secara pasti, tetapi mengandung berbagai faktor tumbuh yang sering diperlukan oleh mikroba. Medium ini dapat untuk menumbuhkan mikroba khemoheterotrof aerob maupun anaerob baik yang memerlukan maupun yang tidak memerlukan faktor tumbuh. Medium yang juga termasuk medium kompleks adalah yang mengandung ekstrak tanah. 4. Medium diperkaya Medium Medium diperkaya adalah medium yang ditambah zat tertentu yang merupakan nutrisi spesifik untuk jenis mikroba tertentu. Medium ini digunakan untuk membuat kultur diperkaya (enrichment culture) dan untuk mengisolasi mikroba spesifik, dengan cara mengatur faktor lingkungan (suhu, pH, cahaya), kebutuhan nutrisi spesifik dan sifat fisiologinya. Dengan demikian dapat disusun medium diperkaya untuk bakteri yang bersifat khemoheterotrof, khemoototrof, fotosintetik, dan untuk mikroba lain yang bersifat spesifik. 1.3.Fungsi Nutrisi Bagi Mikroba Setiap unsur nutrisi mempunyai peran tersendiri dalam fisiologi sel. Unsurtersebut diberikan ke dalam medium sebagai kation garam anorganik yang jumlahnyaberbeda-beda tergantung pada keperluannya. Beberapa golongan mikroba misalnyadiatomae dan alga tertentu memerlukan silika (Si) yang biasanya diberikan dalambentuk silikat untuk menyusun dinding sel. Fungsi dan kebutuhan natrium (Na) untukbeberapa jasad belum diketahui jumlahnya. Natrium dalam kadar yang agak tinggidiperlukan oleh bakteri tertentu yang hidup di laut, algae hijau biru, dan bakterifotosintetik. Natrium tersebut tidak dapat digantikan oleh kation monovalen yang lain.Jasad hidup dapat menggunakan makanannya dalam bentuk padat maupun cair(larutan). Jasad yang dapat menggunakan makanan dalam bentuk padat tergolong tipeholozoik, sedangkan yang menggunakan makanan dalam bentuk cair tergolong tipeholofitik. Jasad holofitik dapat pula menggunakan makanan dalam bentuk padat, tetapimakanan tersebut harus dicernakan lebih dulu di luar sel dengan pertolongan enzimekstraseluler. Pencernaan di luar sel ini dikenal sebagai extracorporeal digestion.Bahan makanan yang digunakan oleh jasad hidup dapat berfungsi sebagaisumber energi, bahan pembangun sel, dan sebagai aseptor atau donor elektron. Dalamgaris besarnya bahan makanan dibagi menjadi tujuh golongan yaitu air, sumber energi,sumber karbon, sumber aseptor elektron, sumber mineral, faktor tumbuh, dan sumbernitrogen. 1. Air Air merupakan komponen utama sel mikroba dan medium. Fungsi air adalahsebagai sumber oksigen untuk bahan organik sel pada respirasi. Selain itu air berfungsisebagai pelarut dan alat pengangkut dalam metabolisme. 2. Sumber energi Ada beberapa sumber energi untuk mikroba yaitu senyawa organik atauanorganik yang dapat dioksidasi dan cahaya terutama cahaya matahari. 3. Sumber karbon Sumber karbon untuk mikroba dapat berbentuk senyawa organik maupunanorganik. Senyawa organik meliputi karbohidrat, lemak, protein, asam amino, asamorganik, garam asam organik, polialkohol, dan sebagainya. Senyawa anorganikmisalnya karbonat dan gas CO2 yang merupakan sumber karbon utama terutama untuktumbuhan tingkat tinggi. 4. Sumber aseptor elektron Proses oksidasi biologi merupakan proses pengambilan dan pemindahanelektron dari substrat. Karena elektron dalam sel tidak berada dalam bentuk bebas,maka harus ada suatu zat yang dapat menangkap elektron tersebut. Penangkapelektron ini disebut aseptor elektron. Aseptor elektron ialah agensia pengoksidasi. Padamikrobia yang dapat berfungsi sebagai aseptor elektron ialah O2, senyawa organik, NO3-, NO2-, N2O, SO2, CO2, dan Fe3+. 5. Sumber mineral Mineral merupakan bagian dari sel. Unsur penyusun utama sel ialah C, O, N, H,dan P. unsur mineral lainnya yang diperlukan sel ialah K, Ca, Mg, Na, S, Cl. Unsurmineral yang digunakan dalam jumlah sangat sedikit ialah Fe, Mn, Co, Cu, Bo, Zn, Mo,Al, Ni, Va, Sc, Si, Tu, dan sebagainya yang tidak diperlukan jasad. Unsur yang digunakan dalam jumlah besar disebut unsur makro, dalam jumlah sedang unsur oligo,dan dalam jumlah sangat sedikit unsur mikro. Unsur mikro sering terdapat sebagaiikutan (impurities) pada garam unsur makro, dan dapat masuk ke dalam medium lewatkontaminasi gelas tempatnya atau lewat partikel debu.Selain berfungsi sebagai penyusun sel, unsur mineral juga berfungsi untukmengatur tekanan osmose, kadar ion H+ (kemasaman, pH), dan potensial oksidasireduksi (redox potential) medium. 6. Faktor tumbuh Faktor tumbuh ialah senyawa organik yang sangat diperlukan untukpertumbuhan (sebagai prekursor, atau penyusun bahan sel) dan senyawa ini tidak dapatdisintesis dari sumber karbon yang sederhana. Faktor tumbuh sering juga disebut zattumbuh dan hanya diperlukan dalam jumlah sangat sedikit.Berdasarkan struktur dan fungsinya dalam metabolisme, faktor tumbuhdigolongkan menjadi asam amino, sebagai penyusun protein; base purin dan pirimidin,sebagai penyusun asam nukleat; dan vitamin sebagai gugus prostetis atau bagian aktifdari enzim. 7. Sumber nitrogen Mikroba dapat menggunakan nitrogen dalam bentuk amonium, nitrat, asamamino, protein, dan sebagainya. Jenis senyawa nitrogen yang digunakan tergantungpada jenis jasadnya. Beberapa mikroba dapat menggunakan nitrogen dalam bentuk gas N2 (zat lemas) udara. Mikroba ini disebut mikrobia penambat nitrogen. 1.4.Isolasi Mikroorganisme Isolasi adalah mengambil mikroorganisme yang terdapat di alam dan menumbuhkannya dalam suatu medium buatan. Prinsip dari isolasi mikroba adalah memisahkan satu jenis mikroba dengan mikroba lainnya yang berasal dari campuran bermacam-macam mikroba. Hal ini dapat dilakukan dengan menumbuhkannya dalam media padat sel-sel mikroba akan membentuk suatu koloni sel yang tetap pada tempatnya. Isolasi bakteri atau biakan yang terdiri dari satu jenis mikroorganisme (bakteri) dikenal sebagaibiakan murniataubiakan aksenik. Biakan yang berisi lebih dari satu macam mikroorganisme (bakteri) dikenal sebagaibiakan campuran, jika hanya terdiri dari dua jenis mikroorganisme, yang dengan sengaja dipelihara satu sama lain dalam asosiasi, dikenal sebagaibiakan dua-jenis. Persyaratan utama bagi isolasi dan kultivasi fage adalah harus adanya kondisi optimum untuk pertumbuhan organisme inangnya. Sumber bakteriofage yang paling baik dan paling utama adalah habitat inang. Sebagai contoh fage koli yang di jumpai di dalam pencernaan dapat diisolasi dari limbah atau pupuk kandang. Hal ini dilakukan dengan sentifugasi atau filtrasi bahan sumbrnya dan penambahan kloroform untuk membunuh sel-sel bakterinya (Adams, 2000). Ada beberapa cara yang digunakan untuk bakteri, fungi, dan khamir dengan metode garis, metode tuang, metode sebar, metode penuangan, serta micromanipulator. Dua diantaranya yang paling sering banyak digunakan adalah teknik cawan tuang dan cawan gores. Kedua metode ini didasarkan pada prinsip yang sama yaitu mengencerkan organisme sedemikian rupa sehingga individu species dapat dipisahkan (plezar, 2006) Mikroorganisme dibiakkan di laboratorium pada medium yang terdiri dari bahan nutrient. Biasanya pemilihan medium yang dipakai bergantung kepada banyak faktor seperti seperti apa jenis mikroorganisme yang akan ditumbuhkan. 1.5.Pertumbuhan Mikroorganisme Ada 4 fase kurva pertumbuhan mikroorganisme, yaitu : 1. Fase lag Jika mikroba dipindahkan ke dalam suatu medium, mula-mula akan mengalami fase adaptasi untuk menyesuaikan dengan kondisi lingkungandi sekitarnya. Lamanya fase adaptasi ini dipengaruhi oleh beberapa factor,diantaranya: a. Medium dan lingkungan pertumbuhan Jika medium dan lingkungan pertumbuhan sama seperti medium dan lingkungansebelumnya, mungkin tidak diperlukan waktu adaptasi. Tetapi jika nutrient yangtersedia dan kondisi lingkungan yang baru berbeda dengan sebelumnya,diperlukan waktu penyesuaian untuk mensintesa enzim-enzim. b. Jumlah inokulum Jumlah awal sel yang semakin tinggi akan mempercepat fase adaptasi.Fase adaptasi mungkin berjalan lambat karena beberapa sebab, misalnya: (1)kultur dipindahkan dari medium yang kaya nutrien ke medium yang kandungannuriennya terbatas, (2) mutan yang baru dipindahkan dari fase statis ke medium barudengan komposisi sama seperti sebelumnya. 2. Fase log Pada fase ini mikroba membelah dengan cepat dan konstan mengikuti kurva logaritmik. Pada fase inikecepatan pertumbuhan sangat dipengaruhi oleh medium tempat tumbuhnya sepertipH dan kandungan nutrient, juga kondisi lingkungan termasuk suhu dan kelembabanudara. Pada fase ini mikroba membutuhkan energi lebih banyak dari pada faselainnya. Pada fase ini kultur paling sensitif terhadap keadaan lingkungan. Akhir faselog, kecepatan pertumbuhan populasi menurun dikarenakan : a. Nutrien di dalam medium sudah berkurang. b. Adanya hasil metabolisme yang mungkin beracun atau dapat menghambatpertumbuhan mikroba. 3. Fase stationer Pada fase ini jumlah populasi sel tetap karena jumlah sel yang tumbuh sama dengan jumlah sel yang mati. Ukuran sel pada fase ini menjadi lebihkecil karena sel tetap membelah meskipun zat-zat nutrisi sudah habis. Karenakekurangan zat nutrisi, sel kemungkinan mempunyai komposisi yang berbedadengan sel yang tumbuh pada fase logaritmik. Pada fase ini sel-sel lebih tahanterhadap keadaan ekstrim seperti panas, dingin, radiasi, dan bahan-bahan kimia. 4. Fase kematian Pada fase ini sebagian populasi mikroba mulai mengalami kematian karena beberapa sebab yaitu: a. Nutrien di dalam medium sudah habis. b. Energi cadangan di dalam sel habis. Kecepatan kematian bergantung pada kondisi nutrien, lingkungan, dan jenis mikroba. II. Tujuan Praktikum 1. Untuk mengetahui cara pembatan media padat. 2. Untuk mengetahui cara pengenceran. 3. Untuk mengetahui isolasi mikroorganisme dengan metode tuang dan agar miring. III. 3.1 Alat dan Bahan A. Pembuatan Media Padat (Nutrient Agar) Alat Bahan Hot plate Nutrient Agar Erlenmeyer Aquades Gelas ukur Autoklaf B. Pengenceran Alat Bahan Erlenmeyer NaCl fisiologis Autoklaf Aquades Tabung ulir Sampel (yogurt) Rak tabung reaksi Pipet ukur Bunsen Beaker glass C. Inokulasi Mikroorganisme pada Yogurt Alat Bahan Inkubator Nutrient Agar Jarum ose NaCl fisiologi Bunsen Yogurt Petridisk Alkohol 95% Tabung ulir Rak tabung reaksi Pipet ukuran 1 ml Pipet ukuran 10 ml IV. Prosedur Kerja 4.1 Pembuatan Media Padat (Nutrient Agar) 1. Timbang komponen medium dengan menggunakan timbangan analitis untuk volume yang diinginkan sesuai dengan komposisi berikut: Beef extract 3 g Peptone 5 g Agar 15 g Akuades s.d 1000 ml 2. Akuades sebanyak 100 ml dibagi menjadi dua satu bagian untuk melarutkan Beef extract dan peptone dan sebagian lagi untuk melarutkan agar. Sebaiknya air untuk melarutkan agar lebih banyak. 3. Agar dilarutkan pada sebagian air tersebut dengan mengaduk secara konstan dan diberi panas. Dapat menggunakan kompor gas atau hot plate stirrer (jangan sampai overheat, karena akan terbentuk busa dan memuai sehingga tumpah). 4. Sementara itu sebagian akuades digunakan untuk melarutkan peptone dan beef extract, cukup dengan pengadukan. 5. Setelah keduanya larut, larutan dituangkan ke larutan agar dan diaduk sampai homogen. Kemudian pH media diukur dengan mencelupkan kertas pH indikator. Jika pH tidak netral maka dapat ditambahkan HCl/NaOH. 6. Setelah itu media dimasukkan ke dalam labu Erlenmeyer dan disterilisasi dengan autoklaf. 7. Meyimpan media di labu erlenmeyer tidak boleh terlalu penuh 8. Tutup erlenmeyer dengan sumbat kapas dan alumunium foil lalu rekatkan dengan plastik wrap. 9. Sterilisasi media menggunakan autoklaf pada suhu 121oC selama 20 menit. 4.2 Pengenceran 1. Membuat NaCl fisiologis Timbang 8,5 gram NaCl masukkan dalam labu ukur 1 liter Tambahkan 1 liter aquades Simpan dalam botol PP 2. Membuat Pengenceran - Pipet 9 ml NaCl fisiologis lalu masukkan ke dalam labu ulir - Tutup labu ulir lalu sterilisasi menggunakan autoclave 121oC selama 30 menit. - Timbang 1 gram bahan yang ingin diketahui kandungan mikroorganismenya lalu simpan dalam tabung reaksi. - Tambahkan 9 ml aquadest steril (pengenceran 0) Lakukan pengenceran sampai (10-5 ) dengan cara ambil 1 ml dari pengenceran ke-0 lalu masukkan ke dalam labu ulir yang telah berisi 9 ml NaCl fisiologis (pengenceran 10-1), lalu ambil 1 ml dari pengeceran 10-1 lalu masukkan ke dalam labu ulir yang telah berisi 9 ml NaCl fisiologis (pengenceran 10-2), lalu ambil 1 ml dari pengeceran 10-2 lalu masukkan ke dalam labu ulir yang telah berisi 9 ml NaCl fisiologis (pengenceran 10-3), lalu ambil 1 ml dari pengeceran 10-3 lalu masukkan ke dalam labu ulir yang telah berisi 9 ml NaCl fisiologis (pengenceran 10-4), lalu ambil 1 ml dari pengeceran 10-4 lalu masukkan ke dalam labu ulir yang telah berisi 9 ml NaCl fisiologis (pengenceran 10-5). 4.3 Inokulasi Mikroorganisme pada Yogurt 1) Cara Tuang Ambil 1 ml dari pengenceran 10-5 lalu tanam di media nutrien agar dengan cara tuang yaitu : Suspensi bakteri dituangkan ke dalam media Nutrient Agar steril yang belum membeku (suhu ± 45oC) supaya bakteri tidak mati. Memutarkan cawan petri beberapa kali dengan gerakan ke kiri dan kanan supaya bakteri menyebar merata. Setelah media padat, Inkubasi media selama 24 jam dengan cara meletakkan petridish terbalik. Amati bakteri yang ada. 2) Cara Tuang Gores Media nutrisi agar steril yang telah dipanaskan (media mencair) dituangkan sebanyak 10 ml ke dalam petridish steril. Biarkan media menjadi padat dan dingin. Ambil ose lalu ujung ose dibakar terlebih dahulu sampai memijar, kemudian ambil satu ose suspensi campuran bakteri dalam tabung reaksi yang telah disediakan, segera goreskan ose yang telah mengandung suspensi bakteri dengan goresan sebagai berikut : Cawan petri disimpan dengan tutup di sebelah bawah untuk menjaga supaya air kondensasi tidak jatuh ke permukaan media yang akan mengganggu pertumbuhan koloni. Inkubasi satu sampai dua hari untuk memberikan kesempatan pada bakteri membentuk koloni. Amati koloni yang terbentuk, catat dan bedakan berdasarkan sifatsifat koloni yaitu warna, bentuk, margin/tepian. 3) Cara Agar Miring Sediakan kurang lebih 5 ml media Nutrient Agar pada tabung reaksi lalu disterilkan. Pada saat media masih panas, tabung diletakkan dalam keadaan miring (sekitar 15o) sampai media membeku. Ambil satu ose bakteri secara aseptik, buatlah goresan sebanyak mungkin pada permukaan media (goresan zigzag). Inkubasikan 24 jam. Lihat pertumbuhannya. V. Hasil Pengamatan Kelompok VI. Metode (Jumlah Koloni) Cara Tuang Tuang Gores Agar Miring 1 9 7 0 2 5 7 0 3 8 9 0 4 1 17 0 5 37 28 0 6 11 19 0 Pembahasan Nama : Novita Purnamasari H Tanggal Praktikum : 29 September 2015 NIM : 1503646 Tanggal Laporan : 15 Oktober 2015 Judul Praktikum : Pembuatan Media Padat dan Isolasi Mikroorganisme dengan Metode Tuang dan Agar Miring Medium pertumbuhan (disingkat medium) adalah tempat untuk menumbuhkan mikroba. Mikroba memerlukan nutrisi untuk memenuhi kebutuhan energi dan untuk bahan pembangun sel, untuk sintesa protoplasma dan bagian-bagian sel lain. Susunan dan kadar nutrisi suatu medium untuk pertumbuhan mikroba harus seimbang agar mikroba dapat tumbuh optimal. Hal ini perlu dikemukakan karena banyak senyawa yang menjadi zat penghambat atau racun bagi mikroba jika kadarnya terlalu tinggi. Selain itu, dalam medium yang terlalu pekat aktivitas metabolisme dan pertumbuhan mikroba dapat terganggu. Perubahan faktor lingkungan menyebabkan aktivitas fisiologi mikroba dapat terganggu, bahkan mikroba dapat mati (Haribi, 2008). Dalam praktikum kali ini, media yang digunakan adalah media padat, yaitu Nutrient Agar, komponen penyusunnya adalah Beef extract, Peptone, dan Agar. NA (Nutrient Agar) adalah medium umum untuk uji air dan produk dairy. NA juga digunakan untuk pertumbuhan mayoritas dari mikroorganisme yang tidak selektif, dalam artian mikroorganisme heterotrof. NA merupakan salah satu media yang umum digunakan dalam prosedur bakteriologi seperti uji biasa dari air, sewage, produk pangan, untuk membawa stok kultur, untuk pertumbuhan sampel pada uji bakteri, dan untuk mengisolasi organisme dalam kultur murni. NA juga di gunakan sebagai media kapang dan khamir. Nutrient Agar yang digunakan dalam praktikum ini adalah Nutrient Agar instan, sehingga sudah siap pakai, caranya dengan melarutkan NA sebanyak 8,5 gram dengan 40 ml aquades, kemudian diaduk secara konstan dan diberi panas, dapat menggunakan kompor gas atau hot plate stirrer (jangan sampai overheat). Lalu NA disimpan di tabung ulir (tidak boleh terlalu penuh), dan disterilkan di dalam autoklaf selama 20 menit pada suhu 121̊ C. Terlebih dahulu semua alat-alat yang akan digunakan untuk pengerjaan medium dan pengenceran inokulasi benar-benar steril. Hal ini untuk menghindari terjadinya kontaminasi, yaitu masuknya mikroba lain yang tidak diinginkan sehingga biakan yang tumbuh di dalam medium adalah benar-benar biakan murni. Sampel yang digunakan dalam praktikum ini adalah bakteri yang ada di yogurt, yaitu Lactobacillus bulgaricus dan Streptoccus thermophillus. Sebelumnya sampel tersebut harus disuspensikan dalam larutan NaCl fisiologis 0,85% yang telah disterilkan. Setelah terbentuk suspensi maka dilakukan pengenceran sampai tahap10-5.Pengenceran dilakukan agar pertumbuhan mikroorganisme pada sampel tidak terlalu banyak sehingga dapat dilakukan penghitungan. NaCl fisiologis digunakan sebagai pengencer agar suspensi sampel tetap steril dan menghindari adanya kontaminan pada sampel. Selain itu, NaCl fisiologis juga dapat mempertahankan kondisi pH. Sebagaimana kita ketahui bahwa pertumbuhan mikroorganisme sangat peka terhadap perubahan pH, sehingga diperlukan suatu larutan pengencer yang tidak mempengaruhi kondisi pH. Pemindahan bakteri dari medium lama ke medium yang baru atau dikenal dengan istilah inokulasi bakteri ini memerlukan banyak ketelitian. Dalam pengerjaannya pun harus dilakukan di dekat bunsen yang menyala, agar tidak terkontaminasi oleh bakteri dari udara.Terdapat 3 metode yang dilakukan dalam inokulasi bakteri di praktikum ini, yaitu : 1. Cara tuang Satu mili suspensi bakteri yang sudah melewati tahappengenceran dicampur dengan NA yang masih cair (belum membeku) di cawan petri, dengan demikian akan diperolehpiaraan adukan. Setelah itu tunggu beberapa saat hingga NA membeku. 2. Cara tuang gores Jarum ose yang membawa bakteri digesekkan atau digoreskan dengan bentuk zig-zag pada permukaan NA yang telah membeku (padat) dalam cawan petri sampai meliputi seluruh permukaan, perlu kehati-hatian saat melakukan hal ini, supaya NA tidak ikut tergores hingga sobek. Untuk memperoleh hasil yang baik diperlukan keterampilan, yang biasanya diperoleh dari pengalaman. Metode cawan gores yang dilakukan dengan baik kebanyakan akan menyebabkan terisolasinya mikroorganisme yang diinginkan. Dua macam kesalahan yang umum sekali dilakukan adalah tidak memanfaatkan permukaan medium dengan sebaik- baiknya untuk digores sehingga pengenceran mikroorganisme menjadi kurang lanjut dan cenderung untuk menggunakan inokulum terlalu banyak sehingga menyulitkan pemisahan sel - sel yang digores. 3. Cara agar miring Jarum ose yang membawakan bakteri digesekkan atau digoreskan secara zigzag pada permukaan NA(yang telah membeku) di dalam tabung reaksi yang dimiringkan hingga sudut 15º. Setelah semua metode telah dilakukan, cawan petri disimpan di inkubasi selama 24 jam. Cawan petri yang disimpan di inkubasi harus dalam keadaan terbalik, hal ini bertujuan untuk uap-uap air yang dihasilkan tidak menempel di langit-langit cawan petri, lalu tetesan air tersebut jatuh mengenai agar, sehingga pertumbuhan bakteri jauh lebih cepat karena lingkungan cawan petri menjadi lembab. Untuk memenuhi persyaratan statistik, cawan yang dipilih untuk pengitungan koloni adalah yang mengandung antara 30-300 koloni, apabila terdapat >300 koloni, maka disebut TBUD (terlalu banyak untuk dihitung) atau TNTC (too numerous to count), apabila terdapat <300 koloni, maka disebut Too Few To Count.Berdasarkan hasil pengamatan, tampak bahwa setiap kelompok mempunyai jumlah koloni 0 di metode agar miring. Kemungkinan hal ini terjadi karena praktikan kurang berhati-hati saat melakukan inokulasi bakteri, kemungkinan jarum ose yang dipijarkan terlalu panas sehingga bakteri yang akan dipindahkan sudah mati, atau mungkin juga karena praktikan kurang terampil saat melakukan penggoresan di agar miring. Nama : Ayu Arti Putri Tanggal Praktikum : 29 September 2015 NIM : 1500634 Tanggal Laporan : 15 Oktober 2015 Judul Praktikum : Pembuatan Media Padat dan Isolasi Mikroorganisme dengan Metode Tuang dan Agar Miring Nama : Rizki Yanti Rahayu Tanggal Praktikum : 29 September 2015 NIM : 150753 Tanggal Laporan : 15 Oktober 2015 Judul Praktikum : Pembuatan Media Padat dan Isolasi Mikroorganisme dengan Metode Tuang dan Agar Miring Isolasi air adalah cara pemisahan mikroorganisme tertentu dari lingkungan, sehingga dapat diperoleh biakkan yang sifatnya murni,sehingga dapat di buat sebagai biakkan kultur murni. (Nurhaeria.2013) Mikroorganisme dibiakkan di laboratorium pada bahan nutrient yang di sebut medium yang tersedia, yaitu macamnya yang di pakai bergantung kepada banyak faktor, salah satu diantaranya adalah macam mikroorganisme yang akan ditumbuhkan.(pelczar.1988) Pemindahan bakteri dari medium yang lama ke medium yang baru harus dengan ketelitian yang tinggi. Terlebih dahulu harus diusahakan agar semua alat-alat dalam keadaan steril untuk mencegah terjadinya kontaminasi. Media yang di gunakan yaitu terdiri dari tiga jenis yaitu: 1. Media padat Media padat diperoleh dengan cara menambahkan agar-agar. Agarnya itu berasal dari ganggang,alga yang berfungsi sebagai bahan pemadat.Alga digunakan karena bahan ini tidak diuraikan oleh mikroorganisme, dan dapat membeku pada suhu diatas 45o C. Media padat terbagi menjadi agar miring dan agar deep. 2. Media setengah padat di buat dengan bahan sama dengan media padat,akan tetapi yang berbedda adalah komposisi agarnya. Media ini digunakan untuk melihat gerak kuman secara mikroskopik. Medium untuk membiakkan microbe haruslah steril sebelum digunkan. Engenceran (kontaminas) dari luar terutama bersal dari udara yang mengandung banyak mikroorganisme. Teknik biakan murni untuk satu spesies dikenal dengan beberapa cara, yaitu: 1. Cara pengenceran Cara dalam metode ini dengan mengencerkan suatu suspense yang berupa campuran bermacam-macam spesies yang kemudian diencerkan dalam suatu tabung tersendiri. Dari pengenceran ini kemudian di ambil 1 ml untuk diencerkan lagi. Kalau perlu, dari enceran yang kedua dimbil 1 ml untuk diencerkan lebih lanjut. Langkah selanjutnya yaitu dari pengenceran yang ketiga di ambil 0,1 ml untuuk disebarkan pada suatu medium padat. Kemungkinan besar kita akan mendapatkan beberapa koloni tumbuh dalam medium tersebut, tetapi mungkin juga memperoleh satu koloni murni, dan selanjutnya spesies ini dapat kita jadikan piaraan murni. 2. Cara Penuangan Isolasi dengn menggunaan medium cair dengan cara pengenceran, seperti yang telah di jelaskan ebelumnya. Prinsip melakukan pengenceran adalah dengan mengambil sedikit sampel campuran bakteri yang sudhah diencerkan, dan sampl itu kemudian di sebarkan dalam suatu medium . Dengan mengulang pekerjaan sepertidiatas, akhirnya akan diperoleh biakan murni yang lebih terjamin.Agar tidak leka mencar, karena titik cairnya 95o C. Sehingga teknik ini sekarang sering fdisebut dengan teknik agar tuang. 3. Cara penggoresan Cara ini lebih mengutungkan bila ditinjau dari sudut ekonomi dan waktu, tetapi memerlukan keerampilan yang diperoleh dari latihan.Penggoresan yang sempurna akan menghasilkan koloni yang terpisah. Tetapi kelemahan cara ini adalah bakteri-bakteri anaerob tidak dapat tumbuh. Bakteri mempunyai flagel seringkali membentuk koloni yang menyebar terutama bila digunakan lempengan agar yang basah. Untuk mencegah hal ini hars digunakan lempengan agar yang benar-benar kering. Untuk mendapatkan koloni yang terpisah sewaktu melakukan goresan harus memperhatikan: 1. Gunakan ose yang telah dingin untuk menggores permukaan lempengan agar. Ose yang dipanaskan akan mematikan mikroorganisme, sehingga tidak terjadi pertumbuhan pada bekas goresan. 2. Sewaktu menggores, lempengan. Agar ose yang dibiarkan luka meluncur akan diatas mengganggu permukaan pertumbuhan mikroorganisme, sehingga sulit diperoleh koloni yang terpisah 3. Oe yang harus dioijarkan setelah menggores suatu daerah, hal ini dengan tujuan mematikan mikroorganisme yang melekat pada mata ose dan mencegah pencemaran pada penggorsan berikutnya. 4. Menggunakan tutup cawan petr untuk melindungi permukaan supaya terhindar dari pencemaran. 5. Membalikkan lempeng agar untuk mencegah air kondensasi jatuh diatas permukaan sehingga dapat terjadi penyebaran koloni. Ada beberapa teknik penggoresan yaitu: a. Goresan T b. Goresan kuadran, teknik ini sama dengan goresan T, hanya lempengan aar dibagi menjadi 4 c. Goresan Radian d. Goresan Sinambung Metode-metode ini mengasumsikan jumlah bakteri yang di tanam pada suatu cawan sama dengan jumlah koloni pada cawan tersebut. Perhitungan metode ini juga di bantu dengan alat yang disebut colony counter. Alat colony counter masih mngaruskan para peneliti pada laboratorium menghitung jumlah koloni secara manual. Hasil perhitungan tidak menunjukkan jumlah sel mikroba yang sebenarnya, karena beberapa sel yang berdekatan mungkin membentuk satu koloni. Medium dan kondisi yang berbeda mungkin menghasilkan nilai yang berbeda pula. Mikroba yang di tumbuhkan harus dapat tumbuh pada medium padat dan membentuk koloni yang kompak dan jelas tidak menyebar. Selain itu juga memerlukan persiapan waktu inkubasi beberapa hari sehingga pertumbuhan koloni dapat diitung. Nama : Ramadhan Nurcholis Tanggal Praktikum : 29 September 2015 NIM : 1500529 Tanggal Laporan : 15 Oktober 2015 Judul Praktikum : Pembuatan Media Padat dan Isolasi Mikroorganisme dengan Metode Tuang dan Agar Miring Media adalah suatu bahan yang terdiri dari campuran zat-zat hara (nutrient) yang berguna untuk membiakkan mikroba. Dengan mempergunakan bermacam-macam media dapat dilakukan isolasi, perbanyakan, pengujian sifat-sifat fisiologis dan perhitungan jumlah mikroba (Sutedjo,1991). Media pertumbuhan bakteri atau media kultur bakteri adalah cairan atau gel yang di design untuk mendukung pertumbuhan mikroorganisme dan sel. Terdapat dua jenis utama media pertumbuhan yaitu media yang digunakan untuk kultur pertumbuhan sel tumbuhan atau binatang dan jenis yang kedua yaitu kultur mikrobiologi yang digunakan untuk menumbuhkan mikroorganisme seperti bakteri dan jamur (Madigan, 2005). Menurut Murachman (1995), macam-macam media yaitu sebagai berikut: 1. Media cair (liquid media) yaitu media yang, berbentuk cair. 2. Media padat (solid media) yaitu media yang berbentuk padat. Media dapat berupa bahan organik alamiah misalnya media wortel, media kentang atau anorganik (silika gel). 3. Media padat yang dapat dicairkan (semi solid) yaitu media yang dalam keadaan panas berbentuk cair, sedangkan dalam keadaan dingin berbentuk padat, misalnya mengandung agar atau gelatin. Praktikum sesi pertama kita membuat media padat dengan alat & bahan sebagai berikut: - Erlenmayer - NA (Nutrient Agar) - Autoclave - Aquades - Timbangan analitik Langkah pertama kita menimbang NA dengan timbangan analitik seberat 15 gr, selanjutnya aquades 100 ml dibagi menjadi dua bagian. Larutkan NA pada aquades dan taruh pada hot plate stirrer hingga mendidih dan sebaiknya tidak sampai over heat. Aquades lainnya digunakan untuk melarutkan peptone + beef extract dengan diaduk lalu dituanglan pada larutan agar yang telah dipanaskan di hot plate stirrer dan diaduk hingga larutan tersebut menjadi homogen. Kemudian larutan tersebut dituangkan kedalam tabung erlenmayer dan disterilisasi dengan autoclave pada suhu 121°C selama 20 menit. Selanjutnya kita melakukan pengenceran NaCl fisiologis dengan alat & bahan sebagai berikut: - Erlenmeyer - Autoklaf - Tabung ulir - Rak tabung reaksi - Pipet ukur - Bunsen - NaCl Fisiologis Aquades Langkah pertama yang dilakukan untuk pengenceran adalah menimbang NaCl 8,5 gr lalu masukan kedalam labu ulir 1 L dan ditambahkan Aquades 1 L simpan dalam botol PP. Pipet 9ml NaCl fisiologis lalu masukan pada labu ulir dan sterilisasi menggunakan autoclave dengan suhu 121°C selama 30 menit. Setelah larutan NaCl fisiologis disterilisai kemudian siapkan 9ml aquades dan lakukan pengenceran dengan pipet 1ml aquades lalu masukan ke labu ulir yang berisi 9ml larutan NaCl fisiologis (pengenceran 10ˉ1) lakukan hingga pengenceran 10ˉ5. Praktikum terakhir kita melakukan Inokulasi. Inokulasi merupakan kegiatan memindahkan mikroorganisme baik berupa bakteri maupun jamur dari tempat atau sumber asalnya ke medium baru yang telah dibuat dengan tingkat ketelitian yang sangat tinggi dan aseptis. Dengan demikian akan didapatkan biakan mikroorganisme murni yang dapat dimanfaatkan untuk pembelajaran maupun untuk kepentingan lainnya. Inokulasi yang kita laksanakan melakukan tiga perlakuan yaitu, cara tuang, tuang gores dan agar miring. Alat dan bahan yang dibutuhkan saat inokulasi seperti berikut: - Jarum ose - NA - Bunsen - NaCl Fisiologis - Petri disc - Alkohol 95% - Tabung reaksi - Rak tabung reaksi - Inkubator - Pipet ukuran 1 ml dan 10 ml - Yoghurt Pertama, kita melakukan inokulasi dengan cara tuang, ambil 1 ml dari pengenceran 10-5yang telah kita lakukan sebelumnya lalu tanam pada nutrient agar. Masukan NA dan suspensi bakteri kedalam petri disk sebelum agar mengeras. Kemudian putar cawan petri agar NA dan suspensi bakteri tercampur dengan rata. Setelah NA telah memadat masukan kedalam inkubator selama 24 jam dengan posisi petri disk secara terbalik. Kedua, kita melakukan inokulasi dengan cara tuang gores, langkah pertama masukan 10 ml NA steril kedalam petri disk lalu tunggu hingga NA memadat dan dingin, kemudian pijarkan ose ke bunsen lalu masukan kedalam yoghurt dan goreskan ke permukaan agar yang telah memadat. Inkubsi petri disk dengan cara terbalik agar air kondensasi tidak jatuh ke media. Ketiga, praktikum kita yang terakhir adalah inokulasi dengan cara agar miring. Langkah pertama tuangkan 5 ml NA kedalam tabung ulir lalu disterilisasikan. Setelah disterilisasikan NA masih dalam keadaan panas langsung dimiringkan 15 derajat hingga NA menjadi dingin dan memadat. Selanjutnya jarum ose dipijarkan lalu ambil suspensi bakteri dan digoreskan perlahan diatas permukaan NA secara zig-zag. Terakhir menginkubsi tabung ulir selama 24 jam. Nama : Ghina Anzalina Tanggal Praktikum : 29 September 2015 NIM : 1500769 Tanggal Laporan : 15 Oktober 2015 Judul Praktikum : Pembuatan Media Padat dan Isolasi Mikroorganisme dengan Metode Tuang dan Agar Miring Berdasarkan konsistensinya, media dikelompokkan menjadi dua macam, yaitu media cair (liquid media) dan media padat (solid media). Apabila media cair merupakan ekstrak kompleks maerial biologis, maka media tersebud dinamakan rich medaia atau broth. Media padat menggunakan bahan pembeku (solidifying agent), misalnya agar, suatu kompleks polisakarida yang diperoleh dari alga merah (red algae). Agar memiliki komposisi kimia berupa D-galaktosa, 3,6-anhidro-L-galaktosa, Dglucuronic acid. Agar sebagai bahan pembeku akan mencair saat didihkan, kemudian didnginkan pada suhu 40-42o C sebelum dibekukan. Medai agar ini tidak akan mencair lagi kecuali pada suhu 80-90o C. Agar merupakan agen pengeras yang bagus sekali karena tidak dapat didegradasi oleh mikroorganisme (Sylvia, 2008). Menurut Nurohaianah et al (2007), Pengenceran merupakan proses yang dilakukan untuk menurunkan atau memperkecil konsentrasi larutan dengan menambah zat pelarut ke dalam larutan sehingga volume larutan menjadi berubah. Menurut Nur, I. dan Asnani (2007), Prinsip dari isolasi mikroba adalah memisahkan satu jenis mikroba dengan mikroba lain yang berasal dari campuran bermacam-macam mikroba. Hal ini dapat dilakukan dengan menumbuhkannya dalam media padat, sel-sel mikroba akan membentuk koloni sel yang tetap pada tempatnya. Proses pemisahan atau pemurnian dari mikroorganisme lain perlu dilakukan karena semua pekerjaan mikrobiologis, misalnya telah dan identifikasi mikroorganisme, memerlukan suatu populasi yang hanya terdiri dari satu macam mikroorganisme saja. Teknik tersebut dikenal dengan Isolasai Mikroba (Admin, 2008) : Untuk menumbuhkan suatu biakan bakteri dalam media steril sejumlah sel-sel (inokulum) dipindahkan (diinokulasi) ke dalam media dengan perlakuan khusus untuk mempertahankan kemurnian dari biakan . Dalam waktu inokulasi harus dipijarkan di atas api segera sebelum dan sesudah melakukan pemindahan. Pemanasan ini menghancurkan setiap bentuk kehidupan yang ada pada permukaan jarum atau alat pemindah . Bagian jarum yang dipanaskan tidak terbatas pada bagian ujungnya saja tetapi termasuk pula bagian bawahnya (Mulyono, 1992). Seperti semua bentuk kehidupan lain, mikroba membutuhkan zat-zat hara dan lingkungan yang sesuai untuk pertumbuhan. Pertama-tama media harus mangandung senyawa-senyawa hara yang penting untuk pertumbuhan mikroba. Disamping itu media harus juga memberikan lingkungan yang cocok bagi pertumbuhan seperti pH, tekanan osmosis, oksigen dan lain-lain. Pada umumnya semua media untuk pertumbuhan mikroba terdapat dalam dua bentuk yaitu media cair (Broth Media) dan media Padat (Solid Media) (Mulyani, 1991). Sifat-sifat umum suatu koloni: A. Besar kecilnya koloni. Ada koloni yang hanya berupa suatu titik, ada pula yang melebar sampai menutup permukaan medium. B. Bentuk. Ada koloni yang bulat, ada yang memanjang, ada tepi yang rata, ada tepinya yang tidak rata. C. Kenaikan permukaan. Ada koloni yang rata saja dengan permukaan medium, ada pula yang timbul, yaitu menjulung tebal diatas permukaan medium. D. Halus-kasarnya permukaan. Ada koloni yang permukaanya halus saja, ada yang permukaanya kasar tidak rata. E. Wajah permukaan. Ada koloni yang permukaanya mengkilat, ada yang permukaanya suram. F. Warna. Kebanyakan koloni bakteri itu berwarna keputihan atau kekuningkuningan, akan tetapi ada juga kolini yang kemerah-merahan, coklat, jingga, biru, hijau dan ungu. G. Kepekatan. Ada koloni yang lunak seperti lendir, ada yang lunak seperti mentega ada yang keras dan kering (Dwidjoseputro, 2005). Populasi bakteri tumbuh sangat cepat ketika mereka ditambahkan dan disesuaikan dengan gizi dan kondisi lingkungan yang memungkinkan mereka untuk berkembang. Melalui pertumbuhan ini, berbagai jenis bakteri kadang memberi penampilan yang khas. Beberapa koloni mungkin akan berwarna, ada yang berbentuk lingkaran, sementara ada yang bentuknya tidak teratur. (Devacurii, 2012). Cara mengisolasi mikroba dapat dilakukan dengan beberapa cara yaitu sebagai berikut ini: a. Isolasi mikroba dengan cara penggoresan. Tujuan utama dari penggoresan ini adalah untuk menghasilkan koloni-koloni bakteri yang terpisah dengan baik dari suspensi sel yang pekat. Cara ini lebih menguntungkan bila ditinjau dari sudut ekonomi dan waktu, tapi memerlukan ketrampilan yang diperoleh dengan latihan. Penggoresan yang sempurna akan menghasilkan koloni yang terpisah. Ada beberapa teknik goresan, antara lain : Goresan T, Goresan kuadran, Goresan radian, dan Goresan sinambung. b. Isolasi mikroba dengan cara penaburan Cara penaburan ( pour plate) merupakan cara yang kedua di samping penggoresan untuk memperoleh biakan murni dari biakan campuran mikroba. Cara ini berbeda dari cara penggoresan dimana media agar diinokulasi dalam keadaan tetap cair yaitu pada suhu 450C, dan demikian pula koloni-koloni akan berkembang di seluruh media, tidak hanya pada permukaan. Untuk beberapa tujuan hal ini menguntungkan, contohnya dalam mempelajari pertumbuhan koloni streptococcal pada sel-sel darah merah. Supaya koloni yang tumbuh dalam cawan tidak terlalu banyak ataupun sedikit maka contoh diencerkan hingga beberapa kali pengenceran dan ditaburkan pada beberapa cawan. Metode cawan gores memiliki dua keuntungan yaitu menghemat bahan dan waktu. Namun untuk memperoleh hasil yang baik diperlukan keterampilan yang lumayan yang biasanya diperoleh dari pengalaman. Metode cawan gores yang dilaksanakan dengan baik kebanyakan akan menyebabkan terisolasinya mikroorganisme seperti yang diinginkan. Dua macam kesalahan yang umum sekali dilakukan oleh para mahasiswa yang baru mulai mempelajari mikrobiologi ialah tidak memanfaatkan permukaan medium dengan sebaik-baiknya untuk digores sehingga pengenceran mikroorganisme menjadi kurang lanjut dan cenderung untuk menggunakan inokulum terlalu banyak sehingga menyulitkan pemisahan sel-sel yang digoreskan (Ratna, 1990). Larutan pengencer/ larutan fisiologis adalah larutan yang digunakan untuk mengencerkan contoh pada analisis mikrobiologi. Pengenceran dilakukan untuk memperoleh jumlah mikroba terbaik untuk dapat dihitung yaitu antara 30 sampai 300 sel mikroba per ml. Pengenceran biasanya dilakukan 1:10, 1:100, 1:1000, dan seterusnya. Larutan Fisiologis ini lebih tepatnya medium setengah padat karena mengandung 0,9 % NACl yang terkandung didalamnya. Medium sintetis juga bias dibilang bagian dari larutan fisiologis karena Larutan fisiologis ini sudah diketahui jumlah, jenis dan takarannya, (Feny, 2013). Pada praktikum pembuatan media padat dan isolasi mikroorganisme pada tanggal 29 september 2015, didapatkan pembahasan sebagai berikut : 1. Pada pembuatan media padat menggunakan Nutrient Agar instant, dengan cara melarutkan Nutrient Agar 8 gr dengan aquades 100 ml kemudian dipanaskan. Media padat Nutrient Agar sendiri bisa padat karena mengandung bahan beef extract, pepton dan juga agar. Larutan NA dengan aquades yang telah tercampur dimasukan ke dalam labu erlenmeyer kemudian mengukur pH larutan menggunakan pH indikator dan jika larutan telah memiliki pH netral maka selanjutnya disterilisasi dengan menggunakan autoklaf selama 15 menit dengan suhu 121oC. Larutan memiliki warna kekuningan. 2. Pada pengenceran, menggunakan larutan Nacl fisiologis 0,8% dengan aquades kemudian dimasukan ke dalam tabung ulir sebanyak 9 ml. kemudian dalam praktikum ini menggunakan bahan yoghurt yang dimasukan sebanyak 1 ml ke dalam tabung ulir (pengenceran 10 o). melakukan pengenceran sampai dengan 10-5 dengan cara mengambil 1 ml dari tabung sebelumnya dan dimasukan ke tabung selanjutnya. Pengenceran bertujuan untuk membuat penyebaran bakteri dan akan memudahkan pada saat menghitung jumlah bakteri. Jika tidak dilakukan pengenceran, maka bakteri akan sulit dihitung karena jumlahnya yang sangat banyak. 3. Isolasi mikroorganisme yang digunakan yaitu dengan cara tuang, tuang gores dan agar miring. Pada cara tuang dengan menuangkan sespensi bakteri ke dalam media Nutrient Agar pada cawan petri kemudian diinkubator denagn suhu 45oC selama 24 jam dan meletakkan cawan petri terbalik. Dari hasil pengamatan didapatkan bahwa koloni bakteri yang tumbuh yaitu 5 koloni. Pada cara tuang gores, menuangkan media Nutrient Agar pada cawan petri dan biarkan sampai padat. Jarum ose dipanaskan terlebih dahulu sampai memijar kamudian mengambil campuran bakteri dalam tabung reaksi kemudian menggoreskannya pada media padat dan di inkubasi selama 24 jam. koloni yang tumbuh pada cara tuang gores yaitu sebanyak 7 koloni. Pada cara agar miring menggunakan media Nutrient Agar pada tabung reaksi yang disterilkan. Pada saat media masih panas, tabung diletakkan dalam keadaan miring sekitar 15O sampai media padat. Kemudian mengambil bakteri menggunakan jarum ose yang dipanaskan dan membuat goresan pada media yang telah padat. Membuat goresan pada permukaan media secara zigzag dan diinkubasi selama 24 jam. Pada hasil praktikum menggunakan cara agar miring ini koloni bakteri tidak tumbuh. Hal tersebut dapat terjadi dikarenakan pada saat pemindahan jarum ose terlalu panas sehingga bakteri mati atau terkontaminasi sehingga tidak steril. VII. Kesimpulan A. Novita Purnamasari Hendarmin (1503646) 1. Pembuatan Nutrient Agar pada praktikum ini adalah NA instan, caranya dengan melarutkan NA sebanyak 8 gram dengan 40 ml aquades, kemudian diaduk secara konstan dan diberi panas, dapat menggunakan kompor gas atau hot plate stirrer (jangan sampai overheat). 2. Semua alat-alat yang akan digunakan untuk pengerjaan medium dan pengenceran inokulasi benar-benar steril. Hal ini untuk menghindari terjadinya kontaminasi. 3. Sampel tersebut harus disuspensikan dalam larutan NaCl fisiologis 0,85% yang telah disterilkan. Setelah terbentuk suspensi maka dilakukan pengenceran sampai tahap10-5. Pengenceran dilakukan agar pertumbuhan mikroorganisme pada sampel tidak terlalu banyak sehingga dapat dilakukan penghitungan. 4. NaCl fisiologis dapat mempertahankan kondisi pH. 5. Metode yang dilakukan pada inokulasi bakteri adalah cara tuang, cara tuang gores, cara agar miring. B. Ayu Arti Putri H C. Rizki Yanti Rahayu (1500753) 1. Alat-alat yang di gunakan dalam praktikum ini harus benar-benar dalamkeadaan steril agar terhindar dari kontaminasi udara kotor dan bakteri . 2. Metode yang di lakukan pada isolasi mikroorganisme ini yaitu cara tuang,gores, dan agar miring. 3. Pembuatan isolasi mikroorganisme media padat berupa nutrient agar harus benar-benar dalam keadaan padat. 4. Pemanasan ose dalam cara gores dan agar miring sebaiknya tidak terlalu panas agar bakteri yang ada dalam media tersebut tidak mati,dan pada saat memasukkan ose juga harus dalam keadaan steril baik secara alat-alatnya maupun lingkungan sekitar agar tidak terkontaminasi pada media yang akan di uji. D. Ramadhan Nurcholis (1500529) Berdasarkan praktikum yang telah dilakukan dapat disimpulkan bahwa: 1. Inokulasi dapat dilakukan melalui 3 cara yaitu, cara tuang, cara tuang gores, dan cara agar miring 2. Faktor yang dapat memengaruhi tumbuhnya koloni bakteri di media adalah tertgantung benar tidaknya saat proses inokulasi. 3. Cara tuang menghaasilkan 5 koloni 4. Cara tuang gores menghasilkan 7 koloni Cara agar miring tidak menghasilkan koloni dikarenakan saat pemindahan suspensi bakteri ke media, jarum ose terlalu masuk kedalam permukaan NA. E. Ghina Anzalina (1500769) 1. Pengenceran merupakan proses yang dilakukan untuk menurunkan atau memperkecil konsentrasi larutan. 2. Pengencerandilakukan karena untuk membuat penyebaran bakteri dan akan memudahkan pada saat menghitung jumlah bakteri 3. Pembuatan media padat menggunakan Nutrient Agar instant, dengan cara melarutkan Nutrient Agar dengan aquades yang dipanaskan. Media padat Nutrient Agar sendiri bisa padat karena mengandung bahan beef extract, pepton dan juga agar. 4. Prinsip dari isolasi mikroba adalah memisahkan satu jenis mikroba dengan mikroba lain yang berasal dari campuran bermacam-macam mikroba. 5. Isolasi mikroorganisme menggunakan 3 cara yaitu cara tuang, tuang gores dan agar miring. 6. Pada hasil pengamatan kelompok 2, Pada cara tuang bakteri yang tumbuh yaitu 5 koloni, pada cara tuang gores bakteri yang tumbuh yaitu 7 koloni dan pada cara agar miring tiak ada bakteri yang tumbuh. Hal tersebut dapat terjadi dikarenakan pada saat pemindahan jarum ose terlalu panas sehingga bakteri mati atau terkontaminasi sehingga tidak steril. VIII. Daftar Pustaka A. Novita Purnamasari Hendarmin (1503646) Anonim. (2013). Teknik Isolasi Bakteri. [Online]. Diases dari https://mikrobiologilautunpad.files.wordpress.com/2013/04/3_mikrolaut_ modul_3_ta2013.pdf Hardiningsih, Riani, dkk. (2005). Isolasi dan Uji Resistensi Beberapa Isolat Lactobacillus pada pH Rendah. Journal of Biological Diversity, vol 7 no 1, hlm 15-17 Sumarsih, Sri. (2003). Mikrobiologi Pangan. Diktat kuliah. Jurusan Ilmu Tanah Universitas Veteran (UPN): Yogyakarta Saleh, Eniza. (2004). Teknologi Pengolahan Susu dan Hasil Ikutan Ternak. USU digital library B. Ayu Arti Putri C. Rizki Yanti Rahayu (1500753) Waluyo, Lud. (2011). Mikrobiologi Umum. Malang: Universitas Muhammadiyah Malang D. Ramadhan Nurcholis (1500529) Murachman, Ahmad Soewarso, dan Heppy Nursyam.1995. Buku Panduan Praktikum Mikrobiologi jilid 2.FPIK. Universitas Brawijaya : Malang. Sutedjo, Mulmulyani., A. E. Kartapoerta, dan S. Sastroatmojo. 1991. Mikrobiologi Tanah. Rineka Cipta : Jakarta
