Efektivitas Isolat Bakteri Yang Berasal Dari Berbagai Rhizosfer dan
advertisement
1 Efektivitas Isolat Bakteri Yang Berasal Dari Berbagai Rhizosfer dan Bahan Organik Terhadap Patogen Penyakit Layu Secara In vitro The Effectivity of Bacterial Isolates From Several Rhizospheres And Organic Materials To Wilt Disease Pathogens of Potato In-vitro Tutik Kuswinanti1),Baharuddin2) and Sri Sukmawati2) 1) Dept. of Plant Pests and Diseases, Agriculture Faculty, Hasanuddin University, Makassar 2) Graduate Student of Agriculture Faculty, Hasanuddin University, Makassar Abstract As the new regional development of potato, Tana Toraja District has the different climate, and types of soil compared with other regions. Rhizosphere is an ideal area for growth and development of microbial antagonists, caused of rhizosphere function as providers of nutrition. Some nutrients that secreted in the rhizosphere are influenced by many environmental factors. Based on these facts, the research were aimed to explore the diversity of bacteria from the rhizosphere of plants and organic materials in Tana Toraja, which has role as biological control agents of wilt disease on potato. The research was conducted at Agricultural Biotechnology Laboratory of Hasanuddin University Makassar. Soil samples were collected from the rhizosphere of rice, bamboo, potato and locally eggplant (terong belanda), as well as from organic materials of striped buffalo and pig. It followed by isolation, purification, and antagonist test against R. solanacearum and F. oxysporum by dual culture method, and identification according to Schaad (2001). The results showed that from totally 74 bacterial isolates, only 18 isolates were able in inhibit the growth of R. solanacearum and F. oxysporum in vitro. Isolates which have best inhibition ability to R. solanacearum were BT5, KB11, KB25 and KB26 isolates, whereas against F. oxysporum were BT5, KB11, KT9 and KB25 isolates. Based on the morphological, physiological and biochemical characters, bacterial isolates are belongs to Genera of Pseudomonas, Bacillus, Pantoea, Clostridium, Coryneform and Streptomyces. 2 PENDAHULUAN Rendahnya produktifitas kentang di Indonesia disebabkan oleh teknik budidaya yang belum optimal, kurangnya ketersediaan bibit yang bermutu dan bersertifikat, serta serangan organisme pengganggu tanaman (OPT). Organisme pengganggu tanaman merupakan faktor pembatas terhadap peningkatan produktivitas tanaman kentang di Indonesia. Semangun (2004), melaporkan bahwa salah satu penyakit pada kentang adalah penyakit layu bakteri Ralstonia solanacearum dan layu Fusarium. Serangan patogen ini dilaporkan dapat menyebabkan kerugian besar pada berbagai sentra produksi dan ancaman pada daerah target pengembangan di Indonesia. Penyakit ini dapat menimbulkan kerugian besar, karena mengurangi kualitas dan kuantitas umbi kentang antara 43 sampai 78% (Zulkarnaen, 2007), bahkan dapat mematikan tanaman atau kegagalan panen (Rukmana, 2007). Penelitian terhadap keberadaan dan keragaman mikroba pada rizosfer tanaman sehat telah dilakukan oleh beberapa peneliti sebelumnya dan menunjukkan adanya beberapa mikroba yang menyelimuti perakaran tanaman sehat sebagai pelindung dari serangan patogen penyakit layu (Zulkarnaen, 2007). Hal ini juga ditemukan pada pertanaman kentang di lapangan, pada perakaran tanaman sehat telah ditemukan bakteri antagonis seperti Pseudomonas flourences, Bacillus subtilis (Baharuddin et al., 2007) dan Streptomyces sp. (Tiro, 2007), bakteri antagonis tersebut berpotensi sebagai penghambat pertumbuhan bakteri layu secara In-vitro maupun di pembibitan. Sebagai daerah pengembangan kentang yang baru, Kabupaten Tana Toraja yang memiliki potensi menjadi daerah pengembangan tanaman hortikultura dataran tinggi, karena memiliki iklim dan jenis tanah yang berbeda serta potensi lahannya masih luas berada pada ketinggian mulai 700– 2.889 m dari permukaan laut (Anonim, 2012). Sehingga perlu dilakukan penelitian untuk mengeksplorasi keragaman bakteri yang berasal dari beberapa rizosfer tanaman dan bahan organik, yang dapat berasosiasi dengan tanaman kentang sebagai agens hayati terhadap penyakit layu. BAHAN DAN METODE Lokasi dan Rancangan Penelitian Penelitian ini dilakukan di Desa Minanga, Kecamatan Mengkendek, Kabupaten Tana Toraja Provinsi Sulawesi Selatan dengan mengumpulkan 6 sampel berasal dari rizosfer tanaman kentang, bambu, padi, terung belanda, bahan organik kerbau belang 3 dan babi. Selanjutnya dilakukan pengujian di Laboratorium Bioteknologi Pertanian Universitas Hasanuddin Makassar. Metode penelitian ini adalah metode survei lapang dan pengujian secara in-vitro, serta identifikasi isolat bakteri. Metode Penelitian Isolasi Bakteri Patogen Dan Bakteri Antagonis Bakteri patogen diisolasi dari bagian tanaman yang bergejala dari lapangan. Selanjutnya dilakukan pemurnian isolat bakteri untuk identifikasi pada media selektif TTC (Klement et al., 1954) dan uji efektivitas dengan metode dual kulturberdasarkan metode Stonier (1960). Bakteri antagonis diisolasi dari pengenceran 6 sampel dan diinkubasi pada media NGA. Setelah itu dilakukan pemurnian isolat untuk keperluan uji efektivitas dan identifikasi. Uji Efektivitas Terhadap R. solanacearum Secara In-vitro Pengujian efektifitas dilakukan berdasarkan metode dual kultur : Satu isolat murni bakteri diinokulasikan ke botol balsam berisi media NB cair steril, lalu dishaker dengan kecepatan 120 rpm selama 3 hari. Setelah itu, sebanyak 1 ml media cair dimasukkan ke tabung eppendof dan disentrifius selama 10 menit dengan kecepatan 100 rpm. Lalu supernatan disaring menggunakan filter 0,02 µm dan dimasukkan ke tabung eppendof berisi larutan khloroform dan supernatan. Selanjutnya dilakukan pengenceran isolat murni bakteri patogen dan diratakan pada media NGA. Setelah itu kertas saring steril berukuran 0,5 cm dicelupkan ke tabung eppendoft dan diletakkan pada bagian tengah media yang telah berisi bakteri patogen (Stonier, 1960). Efektifitas isolat bakteri diukur berdasarkan diameter penghambatan terhadap R. solanacearum disekitar kertas saring Uji Efektivitas Terhadap Fusarium oxysporum Secara In-vitro Uji daya hambat terhadap F. oxysporum dilakukan dengan tujuan skrining bakteri potensil terbaik dalam menekan F. oxysporum Schlecht sebagai salah satu patogen penyebab penyakit. Prosedur pengujian penghambatan dilakukan dengan dual kultur yang dikembangkan oleh Fokkema (1973). Cara pengamatan dilakukan dengan mengukur jari-jari pada zona hambatan (R2) dan (R1), lalu dibandingkan dengan (Ro) cawan kontrol /tanpa perlakuan isolat bakteri. 4 Persentase penghambatan antagonis berdasarkan teori yang dikemukakan oleh Soesanto (2008) dapat dihitung dengan menggunakan rumus sebagai berikut : Dimana: R0 = Jari-jari pertumbuhan cendawan patogen pada kontrol (cm), R1&2 = Jari-jari pertumbuhan cendawan patogen pada perlakuan (cm), P = Persentase penghambatan pertumbuhan (%). Efektifitas isolat bakteri rizosfer dan bahan organik diukur berdasarkan jari-jari pertumbuhan cendawan F. oxysporum pada media padat PDA. Rancangan yang digunakan adalah acak lengkap. Setiap perlakuan diulang sebanyak 3 unit cawan petri. Analisis sidik ragam dilakukan, jika diantara perlakuan menunjukkan perbedaan yang nyata dengan uji Duncan pada taraf 0,05. Hasil dari uji penghambatan akan diperoleh isolat bakteri potensil bersifat antagonis untuk menekan cendawan F. oxysporum. Identifikasi Bakteri Potensil Kultur murni bakteri yang diperoleh diamati berdasarkan karakteristik morfologi dan fisiologi. Karateristik morfologi meliputi penampakan warna koloni pada media NGA dan fisiologi meliputi reaksigram, pembentukan endospora, pertumbuhan anaerob, miselium udara, koloni kuning pada media YDC, Pigmen fluorescen. Tahapan identifikasi karakteristik yang dilakukan berdasarkan buku identifikasi Schaad et al.,(2001). HASIL DAN PEMBAHASAN Uji Efektivitas Terhadap R. solanacearum Secara In-vitro Hasil isolasi terhadap beberapa sampel rizosfer dan bahan organik yang dikoleksi, ditemukan 74 isolat bakteri yang diantaranya 32 isolat diperoleh dari rizosfer pertanaman dan 42 isolat dari bahan organik. Selanjutnya isolat bakteri tersebut diuji efektivitasnya terhadap pertumbuhan bakteri R. Solanacearum. 5 Pada pengujian efektivitas terdapat 10 isolat yang memiliki daya hambat terbaik terhadap R. solanacearum secara in-vitro adalah BT5, KB6, KB11, KB25, KB26, KB29, KB20, KB22, KB12. Isolat-isolat ini berasal dari rizosfer bambu dan bahan organik kerbau belang. Aktivitas penghambatan isolat bakteri terhadap R. solanacearum dapat dilihat pada (Gambar 1). a b Gambar 1 : Hasil pengujian efektivitas terhadap R solanacearum pada media NGA (a). Kontrol, dan (b) Isolat bakteri yang menunjukkan zona penghambatan berwarna bening. Hasil penelitian ini memperlihatkan bahwa terdapat 74 isolat bakteri yang berhasil diisolasi, diantaranya 32 isolat dari rizosfer dan 42 isolat dari bahan organik. Namun hasil uji efektifitas penghambatan terhadap patogen R. solanacearum secara in-vitro, hanya diperoleh 10 isolat bakteri potensil yang bersifat antagonis. Keanekaragaman genus bakteri pada bahan organik lebih beragam dibandingkan rizosfer, disebabkan keberadaan bakteri dipengaruhi oleh struktur tanah, kesuburan tanah, kelembaban tanah dan ketersediaan nutrisi. Suwahyono (2011), mengemukakan bahwa bahan organik hewani mengandung mikroba yang mampu melindungi perakaran tanaman dan meningkatkan daya tahan terhadap serangan patogen, disebabkan bahan organik dapat memperbaiki struktur tanah, menyediakan hara mikro, meningkatkan kandungan hara tanah, kesuburan tanah dan kandungan mikroorganisme berguna bagi tanaman. Uji Efektivitas Terhadap Fusarium oxysporum. secara In-vitro Daya hambat bakteri potensil terhadap pertumbuhan F. oxysporum pada hari kesepuluh mempelihatkan beda nyata antara isolat BT5, KT9 dan KB11 dengan persentase isolat lainnya. Pengamatan pada hari kesepuluh, persentase daya hambat tertinggi terlihat pada isolat BT5 sebesar 80,68%, KB11 sebesar 71,59%, KT9 sebesar 6 67,41% dan KB25 sebesar 65,91%. Dan berbeda nyata pada isolat KB6 dengan persentase daya hambat terendah yaitu 27,69% (Tabel 2). Tabel 2. Hasil pengujian daya hambat isolat bakteri potensil terhadap pertumbuhan F. oxysporum. Sumber Isolat Bakteri Rizosfer Kentang (KT) + Kriteria Penghambatan (isolat) ++ +++ ++++ - - KT5 & KT10 KT9 Rizosfer Bambu (BT) BT6 - - BT5 Rizosfer Padi (PT) PT3 & PT8 PT7 - - Bahan Organik Kerbau Belang (KB) KB6 KB12, KB19, KB20, KB22 & KB31 KB26 KB11 & KB25 Bahan Organik Babi (BB) BB8 - - - Ket. : Kriteria Penghambatan : ++ : > 35,0 % - 50 %, +++ : 0 - 5 %, + : > 5 % - 35 %, : > 50,0 % - 65 %, ++++ : > 65,0 % Aktivitas daya penghambatan isolat bakteri dari rizosfer pertanaman dan bahan organik berasal dari Tana Toraja terhadap pertumbuhan cendawan F. oxysporum secara In-vitro dapat dilihat pada Gambar 2. a b c Gambar 2. Hasil Uji penghambatan isolat bakteri terhadap F. oxysporum pada media PDA (a) Kontrol, (b) isolat bakteri BT5 yang menunjukkan zona penghambatan dan (c) isolat bakteri KB11 yang menunjukkan zona penghambatan. Gambar 3. Grafik daya hambat bakteri potensil terhadap pertumbuhan F.oxysporum pada pengamatan hari ke-2 sampai hari ke- 10. Daya hambat bakteri potensil dari rizosfer dan bahan organik terhadap pertumbuhan F. oxysporum diamati pada media PDA dengan interval waktu 2 hari yang dimulai setelah aplikasi. Dari Gambar 3, terlihat penghambatan bakteri potensil terhadap pertumbuhan F.oxysporum tertinggi pada isolat BT5, KB11, KB25 dan KB26 mengalami frekuensi penghambatan yang semakin hari meningkat. Tehrani dan Ramezani (2003) melaporkan bahwa kelompok rhizobakteria merupakan mikroba yang mampu mengantagonis dan memiliki efek pengendali diatas 51 persen terhadap patogen tular tanah seperti F. oxysporum Schlecht. Martini dkk (2006) mengemukakan bahwa pengendalian hayati dengan mempergunakan mikroba antagonis dapat menekan pertumbuhan patogen hingga mencapai 60 %, sehingga dapat dikategorikan sebagai agens pengendali yang efektif. Pernyataan ini didukung oleh Soesanto (2008) keberhasilan pengendalian hayati tergantung kepada mekanisme yang dimiliki oleh agens hayati. Bakteri antagonis mempunyai mekanisme penghambatan tersendiri dan ada pula yang lebih dari satu mekanisme penghambatan. Mekanisme utama berupa kompetisi nutrisi, antibiotika, dan kemampuan induksi reistensi serta memacu pertumbuhan tanaman. Identifikasi Bakteri Rizosfer dan Bahan Organik. Berdasarkan uji efektifitas diperoleh 10 isolat bakteri potensil bersifat antagonis dalam menghambat pertumbuhan R. solancearum secara in vitro. Untuk mengetahui karakteristik masing-masing isolat dilakukan pengamatan morfologi, fisiologi dan biokimia berdasarkan tahapan prosedur Schaad yang mengarahkan untuk mengidentifikasi genus bakteri yang ditemukan (Tabel 3). Tabel 3. Hasil Identifikasi 18 Isolat Bakteri rhizosfer dan bahan organik Isolat Warna koloni KB6 KB11 KB12 KB20 KB25 Putih Putih keruh Putih Putih keruh Putih kekuningan Putih keruh KB26 KB29 KB31 BT5 KB22 Reaksi Gram + + + + Koloni Miselium kuning udara 0 0 0 0 0 0 0 Endospora Anaerob + + + 0 ̶ + ̶ ̶ 0 + + 0 Pantoea + + ̶ 0 0 Bacillus Putih keruh + + ̶ 0 0 Bacillus Putih Putih keruh Putih transparan + + ̶ + + 0 ̶ 0 0 0 0 0 0 Clostridium Bacillus Pseudomonas ̶ ̶ Hasil Coryneform Bacillus Clostridium Bacillus Keterangan : (+) reaksi positif; (-) reaksi negatif; (o) Tidak diujikan Tahapan identifikasi yaitu pengamatan karakteristik morfologi berdasarkan warna koloni, dan karakteristik fisiologi berdasarkan beberapa pengujian yaitu reaksi gram, pembentukan endospora, pertumbuhan anaerob, koloni kuning pada media YDC dan miselium udara. Hasil identifikasi memperlihatkan 6 genus bakteri yaitu genus Bacillus (KB11, KB20, KB25, KB26 dan KB31), genus Clostridium (KB12 dan KB29), genus Pantoea (KB22), genus Coryneform (KB6) dan Pseudomonas (BT5), sedangkan genus isolat BB8 belum dapat diketahui karena masih perlu dilakukan pengujian selanjutnya. KESIMPULAN DAN SARAN Hasil isolasi dan pengujian efektifitas secara in vitro pada 6 sampel berasal dari rizosfer dan bahan organik diperoleh 10 isolat bakteri potensil menghambat pertumbuhan R. solanacearum. Dan hasil identifikasi memperlihatkan 6 genus bakteri, yaitu Bacillus, Clostridium, Streptomyces, Pantoea, Coryneform dan Pseudomonas. Perlu dilakukan uji aplikasi bakteri potensil pada kondisi green house dan lapangan, agar dapat ditemukan agens pengendali hayati yang paling efektif dalam mengendalikan bakteri R.solancearum. Serta dilakukan pengujian lebih lanjut dalam terhadap mekanisme antagonis, agar lebih meyakinkan kemampuan bakteri potensil sebagai agen pengendali penyakit layu pada tanaman kentang. DAFTARPUSTAKA Anonim (2012). Sulawesi Selatan Incar Produksi Ton.http://www.kabar-bisnis.com/read/2820169. Kentang 38.160 Baharuddin, Nur Rosida, Ach Sayifudin (2007). Pengembangan Usaha Perbenihan Kentmang Hasil Kultur Jaringan. FORKOM IPTEKDA LIPI. Gedung IPTEK Universitas Hasanuddin.Makassar. Deptan 2006. Jenis-jenis Organisme Pengganggu Tumbuhan Karantina (OPTK) Golongan I dan Golongan II (Kategori A1). Klement, Z (1954). The Relationship Of Pathogenicity In Pseudomonas solanacearum To Colony Appearance On Tetrazolium Medium. Phytopatology 44: 693-695. Klement, Z., K. Rudolf and D.C. Sands (1990). Methods In Phytobacteriology. Akademial Kiado, Budapest. 370–372, 376. Mulya,K., and S. Tsuyumu (1998). Some Physiologycal Factors Influencing Antibiotic Production by Pseudomonas fluorencens PfG32In Biological Control Of Gaeumannomyces graminis. Journal Bacteriol.170 : 3499-3508. Rukmana (2007). Budidaya Dan Pengelolaan Pasca Panen Bawang Merah. Kanisius.Yogyakarta. Schaad, N.W, J.B.Jones and W.Chun(2001).Plant Pathogenic Bacteria, Third Edition. The American Phytopathological Society. St. Paul, Minnesota. Semangun (2004). Pengantar Ilmu Penyakit Tumbuhan. Gadjah Mada University Press. Yogyakarta. 585-593 Soesanto, L (2008). PengantarPengendalian Hayati Penyakit Tanaman. PT RajaGrafindo Perkasa, Jakarta. Stonier, T (1960). Agrobacterium tumefaciens Conn. II Production of an Antibiotic Subtance. J, Bacteriol. 79: 889-898. Suwahyono, U (2011). Petunjuk Praktis Penggunaan Pupuk Organik Secara Efektif dan Efisien. Penebar Swadaya, Jakarta. Tiro, Nurjannah (2007). Isolasi Bakteri Antagonis Pada Rizosfer Kentang (Solanum tuberosum L) dan Uji Efektifitasnya Terhadap Patogen Rastonia solanacearum Penyebab Penyakit Layu Bakteri Secara in Vitro (Skripsi).Jurusan Hama dan Penyakit Tumbuhan Fakultas Pertanian Universitas Hasanuddin, Makassar. Zulkarnain (2007). Keragaman Intensitas Beberapa Penyakit Penting Tanaman Kentang pada Sistem Perbenihan Aeroponik dan Perbenihan dengan Menggunakan Media Arang Sekam (Skripsi).Jurusan Hama dan penyakit Tumbuhan Fakultas Pertanian,Universitas Hasanuddin, Makassar.
