Bab II Tinjauan Pustaka
advertisement
Bab II Tinjauan Pustaka II.1. Tanaman Kakao (Theobroma cacao L.) Tanaman kakao (Theobroma cacao L.) merupakan komoditas perkebunan yang memegang peranan penting dalam perekonomian Indonesia karena merupakan penghasil devisa perkebunan nomor tiga setelah kelapa sawit dan karet. Indonesia merupakan negara penghasil biji kakao terbesar ketiga di dunia setelah Côte d'Ivoire atau Ivory Coast (Pantai Gading) dan Ghana (http://www.icco.org). Sebanyak 40% produksi kakao dunia berasal dari Pantai Gading, Ghana dan Indonesia masing-masing menghasilkan 15% buah kakao, Brazil, Nigeria, Kamerun, Guatemala, Honduras, Ekuador, Kolombia, Venezuela memproduksi dalam jumlah yang lebih kecil (http://en.wikipedia.org.htm). Menurut Dewanto (1989), kakao dapat dimanfaatkan sebagai bahan baku makanan karena memiliki citarasa yang khas, bahan baku kosmetik, dan bahan baku pembuatan obat. Dalam buku yang berjudul Medicinal Herb Index in Indonesia disebutkan bahwa, beberapa negara penghasil kakao seperti Ghana, Meksiko, Panama, dan Venezuela telah mengembangkan kakao sebagai bahan baku pembuatan obat antidiuretik, antiseptik, reumatik, antibisa ular, penambah nafsu makan, dan obat batuk (PT. Esai Indonesia, 1995; Prameswari, 2004). Sebagai bahan makanan, kakao kerap disebut dengan istilah cokelat yang berasal dari bahasa Aztec yaitu chocolatl yang berarti air yang pahit (http://en.wikipedia.org.htm). Suku Aztec percaya bahwa dewa Quetzalcoatl yaitu naga besar penjaga kebun di surga membawa biji kakao dari surga ke bumi dan mengajarkan mereka cara menanamnya (http://heartsmuseum.berkeley.edu). Cokelat merupakan salah satu produk makanan olahan tertua di dunia yang ditemukan pertama kali oleh bangsa Amerika Tengah dan memiliki nilai gizi tinggi. Suku Aztec dan beberapa suku asli bangsa Meksiko, Guatemala, dan Honduras memproses biji kakao menjadi minuman cokelat yang telah berlangsung di Amerika Tengah sejak 4.600 tahun yang lalu (Smith, 2005). Minuman cokelat 7 pada awalnya disajikan terbatas pada kalangan tertentu saja yaitu bangsawan, prajurit dan pedagang (http://heartsmuseum.berkeley.edu). Terdapat dua pendapat mengenai asal muasal tanaman kakao. Pendapat pertama menyatakan bahwa tanaman kakao berasal dari Meksiko Tenggara dan disebarkan ke lembah Amazon yaitu ke Lacandon di Amerika Tengah dan dataran rendah Orinoco di Amerika Selatan. Pendapat kedua berdasarkan studi genetik tanaman kakao, tanaman tersebut diperkirakan berasal dari Amazon dan didistribusikan ke Amerika Tengah. Minuman cokelat diyakini telah dikonsumsi sejak tahun 800 1.100 SM oleh penduduk asli Amerika yaitu suku Maya dan Suku Aztec (http:// heartsmuseum.berkeley.edu). Tanaman kakao masuk ke Indonesia tahun 1560 dibawa oleh bangsa Spanyol ke daerah Sulawesi tepatnya ke Kepulauan Sangir dan Minahasa. Berdasarkan letak geografisnya, tanaman kakao akan tumbuh dengan baik di daerah yang terletak antara 10° LU - 10° LS, dengan ketinggian kurang dari 600 m di atas permukaan laut dan di daerah yang beriklim tropis dengan kondisi pH tanah netral (Chatt, 1953). Perkebunan kakao di Pulau Jawa, secara besar-besaran dimulai tahun 1880 ketika penyakit daun kopi merajalela, sehingga sejak itu tanaman kopi diganti secara bertahap dengan tanaman kakao (Siregar, 1964). Usaha kakao melibatkan lebih dari 965.000 keluarga petani pedesaan dan untuk perkebunan besar melibatkan kurang lebih 84.000 tenaga kerja yang sebagian besar berada di Kawasan Timur Indonesia (KTI). Menurut Ditjenbun (2006), pengusahaan kakao di Indonesia dilakukan melalui tiga bentuk usaha yaitu perkebunan rakyat seluas 887.735 Ha (89,45%) dengan produksi sebesar 586.672 ton (89,92%), perkebunan besar negara seluas 49.976 Ha (5,03%) dengan produksi sebesar 32.946 ton (5,06%) dan perkebunan besar swasta seluas 54.737 Ha (5,52%) dengan produksi sebesar 32.778 ton (5,02%). II.1.1. Botani Tanaman Kakao Carrolus Linnaeus seorang taksonom yang berasal dari Swedia memberikan nama Theobroma cacao bagi tanaman yang berasal dari Amerika Selatan ini. 8 Theobroma berarti “Makanan para Dewa” sedangkan cacao berasal dari Nahuatl (bahasa Aztec) yaitu cacahuatl sedangkan suku Maya menyebutnya kakaw. Tanaman ini termasuk ke dalam famili Sterculiaceae dari ordo Malvales (http://en.wikipedia.org.htm). sumber: dokumentasi pribadi http://heartsmuseum.berkeley.edu Gambar II.1. Tanaman kakao (Theobroma cacao L.) Klasifikasi tanaman kakao menurut Backer & Van der Brinck (1968) adalah sebagai berikut: Divisio : Spermathophyta Subdivisio : Angiospermae Klas : Dicotyledonae Ordo : Malvales Famili : Sterculiaceae Genus : Theobroma Spesies : Theobroma cacao L. Menurut Siregar et al., (1992) kakao digolongkan ke dalam tanaman caulifloris yaitu tanaman yang dapat menumbuhkan bunga dari batang atau cabang (Gambar II.1). Tanaman kakao memiliki tinggi 4 - 8 m, mulai dapat dipanen buahnya pada umur 5 tahun dan mencapai produksi buah tertinggi pada umur 12 tahun. Buahnya 9 dapat terus menerus dipanen sampai tanaman berumur 50 tahun dengan panen besar dua kali dalam satu tahun (Nasution et al., 1976). Berdasarkan nilai ekonomisnya yang dapat dibedakan dari bentuk buah, warna buah, dan warna biji terdapat tiga varietas kakao yaitu: a. Criollo, merupakan varietas unggul, hampir seluruh bijinya berwarna putih dengan waktu fermentasi singkat. Kulit buah tipis dan mudah diiris, warna buah merah ketika muda dan kuning setelah masak dengan aroma khas, tidak tahan terhadap hama dan penyakit serta kurang produktif (Nasution et al., 1976; Rohan 1963). b. Forastero, merupakan varietas yang produktivitasnya lebih tinggi dan lebih tahan terhadap hama. Buah muda berwarna hijau, setelah matang berwarna kuning dengan aroma yang lebih lemah dan rasa agak pahit. Kulit buah keras dan sulit diiris, biji gepeng dan berwarna ungu. c. Trinitario, merupakan hibrida dari kakao varietas Criollo dan Trinitario memiliki sifat di antara keduanya. Kakao Criollo dan Trinitario menghasilkan cokelat dengan aroma khas, disebut edel cacao atau kakao murni, sedangkan varietas Forestario menghasilkan cokelat dengan aroma yang biasa dan dikenal sebagai bulk cacao, kakao curah atau kakao lindak. Kurang lebih 93% kakao dunia adalah kakao curah dihasilkan oleh Afrika Barat, Brazil, dan Dominika sedang kurang dari 7% kakao mulia dihasilkan Equador, Venezuela, Trinidad, Grenada, Jamaica, Srilanka, Indonesia, dan Samoa (Minifie, 1980). Di Indonesia tanaman yang dikembangkan dari varietas kakao mulia adalah klon DR (Djati Runggo) sedangkan dari varietas kakao curah adalah klon Afrika Barat dan Upper Amazon Hybrid (UAH). Dari klon tersebut yang paling banyak dikembangkan adalah UAH (Effendi, 1982). Kematangan buah kakao ditandai dengan perubahan warna buah. Pada buah kakao klon UAH warna berubah dari hijau menjadi agak kekuningan. Seteleh dipetik dan dikelompokkan berdasarkan kematangan kemudian dipecah untuk mendapatkan bijinya, lalu difermentasi. 10 II.1.2. Karakteristik Buah dan Biji Kakao Buah kakao berbentuk bulat lonjong (ovoid) dengan panjang 15 - 30 cm dan lebar 8 - 10 cm terdiri dari 4 bagian utama yaitu kulit buah, plasenta, arillus / pulp dan biji (Gambar II.2). Buah yang telah masak berwarna kuning terang sedangkan buah muda berwarna hijau atau merah tergantung jenisnya (http://en.wikipedia. org.htm). Bagian buah kakao yang diolah menjadi cokelat adalah bijinya. keping biji kakao yang diselimuti pulp plasenta arillus/ pulp yang berwarna putih kulit buah kakao sumber: http://en.wikipedia.org http://hearstmuseum.berkeley.edu Gambar II.2. Penampang Melintang dan Memanjang Buah Kakao Biji kakao terdiri dari dua bagian yaitu kulit biji dan keping biji. Sekitar 86 90% dari berat kering biji merupakan keping biji, sedangkan sisanya adalah kulit biji yang meliputi 10 - 14% dari berat kering biji (Rohan, 1963). Biji kakao ketika masih berada dalam buah yang matang belum terkontaminasi berbagai mikroorganisme. Segera setelah pemecahan buah dilakukan, biji kakao segar langsung mengalami kontak dengan udara di sekitarnya dan arilus yang mengelilingi biji terpapar oleh berbagai populasi mikroorganisme yang berasal dari kulit buah, tangan, wadah yang digunakan untuk mengangkut biji, sisa-sisa arilus dari proses fermentasi sebelumnya pada peti-peti fermentasi dan juga oleh lalat buah (Drosophila melanogaster). Dari sekian banyak jenis mikroorganisme pada tahap awal fermentasi hanya ragi yang dapat berkembang biak dan mendominasi arilus. Ini disebabkan arilus mengandung kadar gula yang tinggi, pH rendah dan sedikit oksigen dan asam sitrat. Hasil metabolisme mikroorganisme pada arilus akan berdifusi ke dalam keping biji sehingga menyebabkan terbentuknya prekursor aroma, perubahan 11 warna dan perbaikan rasa biji kakao. Mikroorganisme yang terdapat pada kakao berbeda-beda tergantung iklim, waktu fermentasi, varietas kakao yang diolah, dan faktor geografis tempat pengolahan sehingga mengakibatkan berbeda pula citarasa cokelat yang dihasilkan (Chatt, 1953). Ragi yang terdapat pada biji kakao akan menyebabkan terjadinya fermentasi alkohol dengan memanfaatkan gula pada arilus. Selain menghasilkan alkohol, metabolisme ini juga menghasilkan CO2 dan panas dengan reaksi: C12H22O11 + H2O amilum/pati C6H12O6 glukosa 2C6H12O6 + 4,5 kalori air glukosa 2CO2 + karbondioksida 2C2H5OH + 22,3 kalori alkohol II.1.3. Pengolahan Biji Kakao Cokelat menjadi makanan atau minuman yang digemari karena aroma dan cita rasanya yang khas. ”The hidden flavor of the hidden fruit of a hidden tree” merupakan motto yang dikemukakan oleh Jacobs (1951) untuk kakao. Untuk mendapatkan aroma yang tersembunyi itu maka perlu dilakukan fermentasi terhadap biji kakao. Menurut Knapp (1937) dalam Away (1989), biji kakao yang tidak difermentasi tidak akan menghasilkan aroma yang khas dan memiliki rasa yang lebih sepat dan pahit (Rohan, 1963). Pengolahan biji kakao segar di perkebunan besar meliputi pemanenan, pengupasan, fermentasi, perendaman, pencucian, pengeringan, dan sortasi. Proses pengolahan buah kakao menentukan mutu produk akhir kakao, karena dalam proses ini terjadi pembentukan calon cita rasa khas kakao dan pengurangan cita rasa yang tidak dikehendaki, misalnya rasa pahit dan sepat (http://www.kadin-indonesia.or). Tanaman kakao dipanen setelah buahnya masak yaitu setelah 6 bulan dari proses pembuahan. Buah kakao yang masak mempunyai ukuran panjang 10-19 cm, dengan berat antara 450 - 490 g dan mengandung 30 - 40 biji yang diselubungi oleh arilus (Rohan, 1963). Setelah dipetik, buah tidak langsung dibelah melainkan diperam dahulu selama 5-7 hari di tempat yang teduh untuk memperoleh keseragaman kematangan buah serta memudahkan pengeluaran biji dari buah kakao. Pemecahan atau pembelahan buah kakao dimaksudkan untuk mendapatkan 12 biji kakao, pemecahan buah kakao harus dilakukan secara hati-hati, agar tidak melukai atau merusak biji kakao. Pemecahan buah kakao dapat menggunakan pemukul kayu atau memukulkan buah satu dengan buah lainnya, harus dihindari kontak langsung biji kakao dengan benda-benda logam, karena dapat menyebabkan warna biji kakao menjadi kelabu. Biji kakao dikeluarkan lalu dimasukan dalam ember plastik atau wadah lain yang bersih, sedang plasenta yang melekat pada biji dibuang (http://www.kadin-indonesia.or). Tahap yang sangat penting adalah fermentasi dan pengeringan. Selama fermentasi biji kakao mengalami perubahan fisik, kimia, dan biologi (Rohan, 1963; Manurung & Soelistyowati, 1976; Rahayu, 1986). Menurut Frazier (1988) tujuan fermentasi adalah untuk melepaskan pulp dari biji, mematikan embrio, memperbaiki rasa, membentuk prekursor (calon) aroma, dan memberi warna pada biji yang terjadi secara enzimatis setelah kematian embrio (Roelofsen, 1958; Effendi, 1982). Pernyataan tersebut dikuatkan oleh Martelli dan Dittmar (1960) yang menyebutkan bahwa selama proses fermentasi berlangsung terjadi peningkatan temperatur hingga 50° C. Pada saat itu terjadi kematian embrio, induksi autolisis pada kotiledon, perubahan warna menjadi cokelat dan terbentuknya senyawa polifenol yang menimbulkan aroma khas pada biji kakao. Fermentasi merupakan proses metabolisme penghasil energi yang melibatkan proses oksidasi dan reduksi di dalam suatu reaksi berantai secara enzimatis dengan substrat sebagai donor primer elektron sedangkan senyawa organik sebagai akseptor elektron terminal. Proses fermentasi sesuai dengan kondisi, proses dan hasilnya dibagi menjadi: 1. Proses fermentasi secara alkoholis, jika hasilnya adalah alkohol seperti pada pembuatan beberapa jenis minuman seperti bir, anggur, tuak, brem, dan lain sebagainya 2. Proses fermentasi non alkoholis, hasilnya bukan senyawa alkohol, tetapi berupa asam organik, vitamin, asam amino, dan lain-lain seperti pada pembuatan tempe, kecap, yoghurt dan lain sebagainya (Suriawiria, 1986). 13 Pada pengolahan biji kakao, fermentasi mencakup keduanya. Hasil yang diinginkan terutama asam organik yang diperoleh secara langsung maupun tidak langsung maupun melalui pembentukan alkohol terlebih dahulu pada pulp biji kakao. Kehadiran mikroorganisme akan menghasilkan panas dan asam asetat yang akan berdifusi ke dalam biji sehingga menyebabkan terbentukanya prekursor aroma, perubahan warna, dan perbaikan rasa secara enzimatis di dalam keping biji (Roelofsen, 1958; Rohan, 1963). Kematian embrio disebabkan oleh panas dan asam asetat yang dihasilkan oleh mikroorganisme. Ragi mengubah gula yang terkandung dalam pulp menjadi alkohol dan CO2 yang kemudian akan diubah menjadi asam asetat, H2O dan panas. Fermentasi di perkebunan dilakukan secara alamiah menggunakan kotak-kotak fermentasi yang terbuat dari kayu berukuran tinggi 0,9 m, lebar 1,2 m, panjang 1,5 m, dan memuat 1500 kg biji seperti ditunjukkan oleh Gambar II.3. Lama waktu fermentasi tergantung pada klonnya umumnya memerlukan waktu 3 - 12 hari. Di Layungsari (Cianjur) lama fermentasi biji kakao berkisar antara 5 sampai dengan 7 hari sedangkan di Bunisari (Pamengpeuk) untuk edel cacao lama fermentasi yang optimum adalah 4 hari sedangkan untuk bulk cacao selama 6 hari (Effendi, 1982). sumber: dokumentasi pribadi Gambar II.3. Kotak-Kotak Fermentasi Biji Kakao Citarasa dan aroma khas cokelat akan muncul pada biji kakao yang telah mengalami proses fermentasi yang sempurna. Secara kualitatif, kesempurnaan 14 proses fermentasi dapat dilihat dari perubahan warna keping biji kakao dengan uji belah yang dilakukan dengan cara membelah biji kakao memanjang di bagian tengah. Permukaan biji yang terbelah akan memperlihatkan warna dominan ungu (violet) pada keping biji tanpa fermentasi atau sering disebut biji slaty. Warna tersebut secara bertahap akan berubah menjadi cokelat sejalan dengan perkembangan proses dan waktu fermentasi. Makin panjang waktu fermentasi, warna cokelat makin dominan. Secara kuantitatif, tingkat kesempurnaan fermentasi dapat dianalisis dengan metoda kimiawi. Pengujian dilakukan dengan cara menyangrai biji kakao pada suhu dan waktu tertentu kemudian dilarutkan dengan senyawa kimia standar. Penentuan derajat fermentasi berdasarkan warna keping biji yang diukur dengan spektrofotometer pada panjang gelombang tertentu. Derajat fermentasi berdasarkan warna keping biji dapat diklasifikasikan menjadi beberapa tingkat, yaitu (http://www.agribisnis.net): - Fermentasi yang kurang akan menghasilkan keping biji berwarna ungu penuh (tanpa fermentasi), warna ungu seperti batu tulis (fermentasi 1 hari), warna ungu dan cokelat sebagian (fermentasi 2 - 3 hari), warna cokelat dengan sedikit ungu (fermentasi 4 hari) - Fermentasi sempurna menghasilkan keping biji berwarna coklat dominan - Fermentasi berlebihan menghasilkan warna keping biji coklat gelap dan berbau tidak enak. Pulp memegang peranan yang cukup penting dalam proses fermentasi biji kakao yaitu sebagai tempat berlangsungnya fermentasi. Di dalam pulp terkandung strain ragi yang akan menginisiasi fermentasi selain itu juga mengandung substrat yang dibutuhkan bagi metabolismenya (Frazier & Westhoff, 1988). Namun demikian, setelah proses fermentasi biji kakao selesai maka lendir kakao hanyalah merupakan hasil sampingan dari proses fermentasi tersebut. Berbagai mikroorganisme dapat tumbuh pada pulp, tetapi yang memegang peranan penting adalah bakteri dan ragi (Manurung & Soelistyowati, 1976). Dari 15 hasil penelitian di beberapa negara menurut Roelofsen (1958) dan Camargo et al., (1963) dalam Rohan (1963) bahwa jenis ragi yang banyak ditemui adalah Saccharomyces sp., S. cerevisiae var ellipsoideus, S. pombe, Candida krusei, Pichia fermentans, Torulopsis sp., Koeckera apiculata, Hansenula anomala. Sedangkan bakteri yang ditemukan diantaranya Acetobacter xylinum, A. ascendens, Propionibacterium xylinoides, P. orleanence (Eckman, 1928 dalam Chatt 1953). Di Jawa Tengah ditemukan sejumlah besar bakteri asam laktat (Roelofsen & Gisberger, 1974; Chatt, 1953). Jacobs (1951) telah menemukan adanya Acetobacter aceti yang turut berperan dalam fermentasi biji kakao. Ragi yang berperan pada awal fermentasi berfungsi mengubah gula menjadi alkohol dan CO2 (Soetiardjo & Mangoenksoekarjo, 1980). Di samping berkemampuan mengubah gula menjadi alkohol dan CO2, ragi juga mampu untuk menghancurkan pulp (Rohan, 1963; Nurhidayat, 1984; Rahayu, 1986). Kegiatan ragi dominan pada proses fermentasi selama 24 jam pertama, kadar alkohol maksimal yang dapat dihasilkan mencapai sekitar 3,7%. Dengan meningkatnya kadar alkohol yang dihasilkan maka jumlah ragi akan menurun karena pertumbuhannya dihambat oleh alkohol yang bersifat sebagai desinfektan. Setelah 48 jam fermentasi, dapat dikatakan tidak terdapat ragi lagi (Nurhidayat, 1984; Rahayu, 1986). Bakteri fermentasi muncul pada 24 jam terakhir dari fermentasi, jumlah yang dapat tumbuh dan jenisnya bervariasi tergantung iklim sepanjang tahun dan baik tidaknya pengudaraan selama fermentasi (Siregar, 1964; Nurhidayat, 1984). Dengan adanya bakteri asam asetat, maka alkohol diubah menjadi asam asetat, air, dan panas. Konsentrasi asam asetat yang dapat dicapai setelah fermentasi berlangsung sekitar 37 jam kurang lebih sekitar 1% dan ini sudah dapat mematikan embrio (Nurhidayat, 1984). Sebenarnya sebelum asam asetat terbentuk dapat dikatakan bahwa biji telah mati oleh adanya kerja ragi dan bakteri asam laktat (Siregar, 1964). 16 Selama fermentasi berlangsung, terjadi perubahan-perubahan secara enzimatis dalam keping biji segera setelah biji mati. Enzim-enzim dalam keping biji tersebut sebenarnya dipersiapkan untuk perkecambahan, antara lain invertase, rattinase, amilase, gliserofosfatase, phytase, oksidase, dan peroksidase (Rohan, 1963). Salah satu reaksi enzimatis yang terjadi adalah pemecahan senyawa polifenol sehingga rasa sepat menjadi berkurang. Menurut Forsyth (1955) dalam Effendi (1982) terdapat enzim polifenoloksidase di seluruh jaringan keping biji kecuali pada sel yang mengandung tannin. Enzim ini akan bereaksi dengan senyawa polifenol sehingga mengurangi rasa sepat tersebut. Hal ini terjadi pada saat embrio mati dan bila biji kakao disangrai akan terbentuk warna cokelat (browning). Apabila embrio masih hidup maka senyawa polifenol tetap tinggal dalam sel yang mengandung tannin sehingga reaksi di atas tidak berlangsung (Knapp 1937; Effendi, 1983). Menurut Rohan dan Stewart (1967), prekursor aroma cokelat adalah asam amino dan gula pereduksi. Asam amino dihasilkan dari hidrolisis protein, yang juga menghasilkan peptida. Menurut Forsyth (1955) biji kakao variasi curah mengandung senyawa polifenol yang terdiri dari empat senyawa katekin, tiga leukosianidin, dua senyawa antosianin. Sebanyak 92% dari senyawa katekin adalah epikatekin jumlah ini sama dengan 35% dari total polifenol. Bila epikatekin tidak terurai sempurna oleh enzim polifenolase selama pengeringan maka akan terdapat rasa sepat pada biji kakao (Griffiths, 1960). Citarasa cokelat juga dipengaruhi oleh senyawa purin yang sangat pahit. Theobromin sebagai senyawa purin yang utama terdapat sekitar 1,55 % dari berat kering biji, sedangkan kafein hanya sekitar 0,15 % (Minifie, 1980). Protein dapat mengakibatkan aroma yang tak enak bila biji disangrai (De Witt, 1957). Melalui hidrolisis enzimatis selama fermentasi, konsentrasi protein akan berkurang menghasilkan peptida dan asam amino (Rohan & Stewart, 1967). Dari hidrolisis enzimatis sukrosa selama fermentasi akan membentuk gula pereduksi. Menurut Rohan (1963) gula pereduksi merupakan faktor penting dalam pembentukan aroma cokelat. Pemeriksaan dengan kromatografi kertas menunjukkan bahwa gula yang terdapat pada ekstrak biji yang difermentasi 17 adalah glukosa dan fruktosa sedangkan yang tidak difermentasi hanya mengandung sukrosa. Schonberg dan Moubasher (1952) menyatakan bahwa glukosa dapat bereaksi dengan asam amino menghasilkan aldehida. Reaksi ini dikenal sebagai degradasi stacker. Pada saat ini sudah dikenal adanya 200 macam senyawa komponen aroma cokelat dari hasil fermentasi (Minifie, 1980). Di antara jumlah ini terdapat 30 macam senyawa pirazin, 10 macam pirol, dan 15 macam fural (Reineccius et al., 1972). Terdapat pula isovarelaldehida yaitu senyawa yang mudah menguap dari aroma cokelat yang terbentuk dari asam amino melalui reaksi degradasi stecker. Tahap pengolahan biji kakao setelah fermentasi adalah perendaman, pencucian, dan pengeringan. Maksud perendaman biji hasil fermentasi adalah untuk mendapatkan persentase biji bulat. Perendaman selama 1-2 jam akan menghasilkan persentase biji bulat yang besar (Soenaryo et al., 1978; Nurhidayat, 1984). Perendaman selama 4 jam akan menyebabkan kehilangan asam amino bebas dan gula pereduksi melalui proses difusi (Effendi, 1982). Pencucian biji kakao setelah dilakukan perendaman hanya untuk mengurangi sisa pulp. Bila pencucian terlalu bersih akan mengurangi berat dan merapuhkan kulit biji (Hardjosuwito, 1983). Tetapi dengan pencucian, biji akan lebih tahan terhadap serangan jamur dan serangga serta memperbaiki penampakannya (Siregar, 1964). sumber: dokumentasi pribadi Gambar II.4 Pengeringan Biji Kakao dengan Penjemuran Pengeringan dilakukan untuk mendapatkan biji kakao dengan kadar air 6 - 7%. Proses pengeringan dapat dilakukan dengan pengeringan sinar matahari seperti 18 pada Gambar II.4. dan / atau pengeringan buatan dengan menggunakan oven dan tungku (Gambar II.5.). Bila dalam pengeringan mencapai suhu 45-50° C, maka biji akan mengkerut dan permukaannya keras (Siregar, 1964). Biji buah kakao kering dapat dilihat pada Gambar II.6. Guritno dan Hardjosuwito (1983) membuktikan bahwa suhu pengeringan berpengaruh terhadap kadar lemak, keasaman, dan kadar asam amino bebas. Makin tinggi suhu pengeringan, kadar lemak makin rendah dan keasaman serta kadar asam amino meningkat. Bila biji dikeringkan dengan cepat akan berpengaruh terhadap bau asam yang sangat tajam sebaliknya bila terlalu lambat, jamur akan mudah tumbuh. sumber: dokumentasi pribadi Gambar II.5. Tungku untuk Mengeringkan Biji Kakao Proses pengolahan biji kakao yang baik akan mempengaruhi kualitas atau mutu biji yang dihasilkan. Standar mutu diperlukan sebagai sarana pengawasan untuk menentukan kualitas biji kakao. Food and Drugs Adiministration (FDA) dari USA memprakarsai penyusunan standard kakao internasional dengan mengadakan pertemuan antara produsen dan konsumen pada tahun 1969 di Paris. Pertemuan tersebut menyepakati ditetapkannya Standar Kakao Internasional. Standar ini telah diadopsi oleh hampir semua negara penghasil kakao di dunia tertuma yang mengekspor biji kakao ke Amerika. Secara umum persyaratan yang tercantum standar kakao Indonesia sejalan dengan dengan yang ditentukan dalam Standar Kakao International. Standar mutu biji kakao Indonesia diatur dalam Standar Nasional Indonesia Biji Kakao (SNI 01 - 19 2323-1991). Standar ini meliputi definisi, klasifikasi, syarat mutu, cara pengambilan contoh, cara uji, syarat penandaan (labelling), cara pengemasan dan rekomendasi. Beberapa batasan umum yang menggolongkan biji kakao yang layak untuk diperdagangkan di pasaran internasional (cocoa merchantable quality) adalah sebagai berikut (http://www.agribisnis.net): - Biji kakao harus difermentasi, kering (kadar air 6-7 %) , bebas dari biji smoky, bebas dari bau yang tidak normal dan bau asing serta bebas dari bukti-bukti pemalsuan - Biji kakao harus bebas dari serangga hidup - Biji kakao dalam satu kemasan harus mempunyai ukuran seragam, bebas dari biji pecah, pecahan biji dan pecahan kulit, dan bebas dari benda-benda asing. Fermentasi biji kakao yang sempurna biasanya dilakukan dalam waktu 5 hari, dengan pengadukan dan pembalikan yang dilakukan pada hari kedua. Selama proses fermentasi, lendir/ pulp biji kakao akan mengalir keluar dari kotak atau wadah fermentasi. sumber: http://borumat.de. Gambar II.6. Biji Buah Kakao Kering II.1.4. Limbah Cair Pulp Kakao Pengolahan buah kakao sampai menjadi biji kakao akan menghasilkan limbah baik berupa limbah padat maupun limbah cair (Lampiran H). Kedua jenis limbah dari pengolahan biji kakao ini belum termanfaatkan dengan baik. Sampai saat ini pemanfaatan limbah kakao terbatas hanya pada limbah padat yaitu kulit buah kakao yang digunakan sebagai pupuk dan bahan tambahan pakan ternak. Menurut Ginting dalam tulisannya yang berjudul Tantangan dan Peluang Pemanfaatan 20 Pakan Lokal untuk Pengembangan Peternakan Kambing di Indonesia (disampaikan pada salah satu Lokakarya Nasional) produksi buah kakao segar mencapai 1.750 kg/Ha dan menghasilkan limbah berupa kulit buah dengan kandungan serat tinggi dan protein yang rendah mencapai 74% dari total berat tersebut. Kulit buah kakao ditambahkan pada pakan ternak maksimal sebesar 15%, jika lebih akan menurunkan performa hewan ternak dalam mencerna pakan karena kandungan seratnya yang sangat tinggi. Penggunaan kulit buah kakao sebagai tambahan pakan ternak ini telah berlangsung di desa Bongancina Kabupaten Buleleng, Bali sejak tahun 2000. Kulit buah kakao dihancurkan dengan alat penggilingan dan difermentasi menggunakan Aspergillus niger sehingga dapat meningkatkan kandungan proteinnya sebesar 18 % (Widiata, 2006). Limbah cair selain dihasilkan dari proses pemecahan buah kakao juga dihasilkan dari proses pencucian dan perendaman serta dari proses fermentasi biji kakao. Fermentasi biji kakao tentunya akan menghasilkan cokelat dengan mutu yang baik namun dalam proses fermentasi tersebut akan dihasilkan lendir kakao atau pulp yang merupakan limbah dari industri pengolahan biji kakao dan mencapai sekitar 10 % dari berat basah biji (Quesnel, 1967). Sampai saat ini limbah pulp kakao belum dimanfaatkan secara optimum karena dipandang kurang bernilai ekonomis sehingga masih terdapat permasalahan dalam pengolahan limbahnya. Selain itu, yang menjadi kendala utama dalam pemanfaatan limbah cair pulp kakao ini adalah mekanisme pengumpulan dan pengawetan limbah tersebut sebelum diproses lebih lanjut (Taufik, 1996). Jika dilihat komposisi kimia lendir biji kakao (Tabel II.1) berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh Rohan (1963), lendir biji kakao masih dapat dimanfaatkan mengingat kandungan gula pada limbah ini masih cukup tinggi. Limbah pulp kakao masih mengandung 11,60 – 15,32% glukosa. Menurut penelitian yang dilakukan oleh Sulam Taufik (1996), limbah cair pulp ini ternyata dapat digunakan untuk menghasilkan senyawa aroma diantaranya etanol, 2-metil-1propanol, 3-metil-1-butanol, benzaldehida, asam asetat, asam propanoat, 2,3- 21 butandiol. Senyawa aroma merupakan suatu senyawa atau bahan yang dapat mengeluarkan bau atau aroma yang khas. Senyawa aroma umumnya digunakan dalam industri makanan, pakan, kosmetika, farmasi, dan minuman (Jansens et al., 1992; Taufik, 1996). Tabel II.1. Komposisi Kimia Lendir Biji Kakao Komponen Air Bahan kering Asam-asam tidak menguap Asam-asam menguap Glukosa Sukrosa Pektin Protein Abu Pati Oksida Fe Garam K, Na, Ca, Mg Komposisi ( % berat kering biji kakao) 79,20-84,20 15,80-21,80 0,77-1,52 0,02-0,04 11,6-15,32 0,11-0,9 5,00-6,90 0,42-0,50 0,40-0,50 sedikit 0,03 0,40-0,45 sumber: Rohan, 1963 Limbah pulp kakao mengandung beberapa senyawa, seperti gula yang dapat dijadikan substrat untuk metabolisme beberapa mikroorganisme menghasilkan senyawa-senyawa alkohol, asam organik, senyawa ester, dan senyawa kimia lainnya. Pulp yang mengandung glukosa, sukrosa, pektin, pati dan beberapa senyawa lain ini dapat disterilisasi dan dijadikan minuman, atau difermentasi menjadi etanol atau minuman fermentasi lainnya. Pernyataan tersebut diperkuat pula oleh Kamaruddin & Sudirman (2006) yang menyatakan bahwa limbah pulp ini dapat dimanfaatkan menjadi suatu produk yang berguna dan mempunyai nilai jual yang tinggi yaitu cuka/asam asetat. Prameswari (2004) juga melakukan penelitian menggunakan limbah pulp kakao untuk memproduksi vinegar dengan cara fermentasi bertingkat menggunakan kultur murni Saccharomycess cerevisiae dan Acetobacter aceti. Vinegar yang dihasilkan dari proses ini mengandung asam asetat sebesar 4,8 % b/v. Beberapa penelitian tersebut menunjukkan bahwa limbah pulp kakao dapat diolah secara biologi menghasilkan produk yang bernilai ekonomis. 22 II.2. Pengolahan Limbah Secara Biologi Pengolahan limbah secara biologi berdasarkan konsumsi oksigen oleh mikroorganisme pengolahnya dapat berlangsung dalam dua kondisi yaitu aerob dan anaerob. Kondisi aerob yaitu kondisi ketika oksigen terlarut / dissolve oxygen (DO) dalam air buangan terdapat dalam jumlah yang cukup banyak sehingga oksigen bukan merupakan faktor pembatas dan oksigen bertindak sebagai akseptor elektron terakhir. Sedangkan kondisi anaerob berlangsung ketika jumlah oksigen terlarut jumlahnya sangat sedikit atau bahkan tidak terdapat dalam air buangan sehingga oksigen menjadi faktor pembatas dalam proses metabolisme, dan senyawa lain selain oksigen bertindak sebagai akseptor elektron terakhir (Wisjnuprapto dan Djajadiningrat, 1990; Chaerul, 2001). Pengolahan secara biologi melibatkan organisme hidup sebagai pengolah limbah, dalam hal ini mikroorganisme. Mikroorganisme yang digunakan dapat berupa kultur murni maupun kultur campur. Kultur murni atau pure culture merupakan mikroorganisme yang terdiri dari satu strain mikroorganisme saja sedangkan mix culture atau kultur campur terdiri dari dua atau lebih mikroorganisme (Johnson dan Zeikus, 1991). II.2.1. Mikroorganisme Mix Culture (Kultur Campuran) Fermentasi kultur campuran adalah fermentasi yang melibatkan dua atau lebih mikroorganisme sebaliknya fermentasi kultur murni merupakan fermentasi yang hanya melibatkan satu strain mikroorganisme saja. Maka jika suatu fermentasi menggunakan dua atau lebih strain mikroorganisme, meskipun berasal dari jenis yang sama tidak termasuk ke dalam fermentasi kultur murni melainkan fermentasi kultur campuran. Kultur campuran dapat terdiri dari jenis yang telah diketahui seperti pada yoghurt atau campuran dari mikroorganisme yang belum diketahui jenisnya yang terjadi pada fermentasi makanan tradisional secara alami. Kultur campuran dapat terdiri dari satu kelompok mikroorganisme, misal bakteri saja, atau campuran dari beberapa kelompok seperti jamur dan bakteri, atau jamur dan ragi (Johnson dan Zeikus, 1991). 23 Menurut Johnson dan Zeikus (1991), fermentasi kultur campuran memberikan beberapa keuntungan dibandingkan dengan fermentasi kultur murni, diantaranya adalah: - Produk yield-nya lebih tinggi - Laju pertumbuhannya lebih tinggi - Kultur campuran memberikan perlindungan lebih terhadap kontaminasi - Pada beberapa kultur campuran dapat terjadi hubungan keterkaitan yang stabil antara mikroorganisme yang terlibat - Senyawa yang terbentuk oleh mikroorganisme kadang melengkapi satu sama lain dan dapat menghambat pertumbuhan mikroorganisme yang tidak diinginkan - Substrat dapat terurai dengan baik oleh kultur campuran - Kultur campuran dapat memberikan transformasi beberapa tahap yang mustahil dilakukan oleh fermentasi kultur murni - Untuk memelihara fermentasi kultur campur dapat dilakukan oleh orang tanpa keahlian khusus. - Dapat mereduksi infeksi dari bakteriofaga - Dapat terjadi perubahan yang simultan dari substrat - Dapat menggunakan substrat yang murah dan tidak murni - Kultur campuran dapat memenuhi kebutuhan nutrisi yang diperlukan untuk pertumbuhan yang optimal Sedangkan kerugian jika menggunakan kultur campuran yaitu: - Produk yang dihasilkan dari fermentasi kultur campuran dapat bervariasi jika dibandingkan dengan yang menggunakan kultur murni - Studi ilmiah mengenai kultur campuran relatif sulit - Sulit untuk mendeteksi dan mengontrol kontaminasi yang terjadi - Ketika dua atau lebih mikroorganisme disatukan, akan memerlukan ruang dan waktu untuk membuat beberapa inokulum - Masalah utamanya adalah cara mengontrol kesetimbangan optimum diantara mikroorganisme yang terlibat. 24 II.2.2. Circulating Bed Reactor (CBR) Dalam penelitian ini limbah diolah dengan sistem batch. Pada reaktor yang dijalankan dengan sistem batch tidak ada aliran yang masuk maupun keluar dari reaktor dan terjadi pengadukan terhadap larutan/limbah yang terdapat di dalam reaktor (Metcalf dan Eddy, 2003). Dalam suatu bioreaktor diperlukan pengadukan yang efektif agar tejadi pencampuran yang sempurna diantara semua elemen yang terdapat di dalam reaktor. Penggunaan reaktor Circulating Bed Reactor (CBR) pada penelitian ini didasarkan pada pencampuran yang terjadi di dalam reaktor ini tidak merusak mikroorganisme karena rendahnya shear stress yang terjadi. CBR merupakan modifikasi dari bubble coloumn yang prinsip kerjanya didasarkan pada energi untuk mengangkat udara agar terjadi pengadukan sehingga terjadi pencampuran antara mikroorgnisme dan nutriennya. Udara atau gas dimasukkan menggunakan pompa udara untuk dialirkan melalui bagian bawah reaktor dan diresirkulasikan melalui piringan berlubang yang diletakkan di dasar reaktor. Pola pengadukan yang terjadi berbeda-beda sesuai dengan konfigurasi piringan yang digunakan. Pada penelitian ini digunakan piringan yang dilubangi sebagian karena memberikan efisiensi yang paling baik dibandingkan yang lain. Fakta ini telah dibuktikan dengan penelitian yang dilakukan oleh Fynn dan Syafila (1990) dalam mengolah air buangan sintetis yang mengandung glukosa dan pada penguraian pestisida karbaril oleh Syafila (1991). Hal itu dapat terjadi karena gelembung-gelembung yang terbentuk terkonsentrasi pada satu sisi kolom sehingga mengakibatkan terbentuknya pola resirkulasi yang efektif. II.2.3. Pengolahan Limbah secara Anaerob Sistem pengolahan anaerob pada awalnya digunakan untuk mengolah limbah sludge dan limbah organik kuat. Dengan semakin banyaknya penelitian yang telah dilakukan maka penerapan sistem ini pada aliran limbah cair juga semakin banyak ditemukan pada pengolahan limbah cair. Pengolahan secara anaerob banyak diterapkan untuk pengolahan air buangan domestik maupun industri terutama di negara yang sedang berkembang karena energi yang diperlukan untuk 25 pengoperasian proses lebih kecil jika dibandingkan dengan pengolahan secara aerob (Chaerul, 2001). Proses fermentasi anaerobik merupakan proses yang menguntungkan karena dihasilkan biomassa dengan yield rendah dan energi dalam bentuk metana dapat diambil dari konversi biologis dari substrat organik. Menurut Speece (1996), pengolahan air buangan secara anaerob dapat dibandingkan dengan pengolahan secara aerob ditinjau dari beberapa segi, diantaranya: - Laju pembebanan organik volumetrik anaerob 5 - 10 kali lebih tinggi daripada proses aerobik - Laju sintesis biomassa anaerob 5 - 20% lebih kecil dibandingkan proses aerob - Biomassa anaerob dapat terjaga selama beberapa bulan bahkan tahun tanpa gangguan aktivitas serius dibandingkan biomassa aerob - Tidak perlu energi untuk aerasi selama proses anaerobik dibandingkan kebutuhan proses aerobik sebesar 500 - 2000 kwh/1000kg - Produksi gas methan sekitar 12.000.000 BTU/1000 kg COD terdegradasi Proses anaerobik dapat dilakukan untuk mengolah limbah cair dengan beban yang tinggi dan merupakan proses yang sangat cost-effectif dibandingkan dengan proses aerobik. Hal tersebut dapat terjadi dengan adanya penghematan pada aspek energi, penambahan nutrisi, dan volume reaktor. Namun demikian, kualitas efluen yang dihasilkan tidak sebanding dengan hasil dari proses aerobik, maka pengolahan anaerob ini pada umumnya digunakan sebagai pretreatment kemudian dilanjutkan dengan proses aerob. Menurut Sayed (1987), dalam Syafila (1997), proses anaerob dapat berlangsung melalui 4 tahap (Gambar II.7) yaitu: 1. Hidrolisis Pada tahap ini mikroorganisme yang berperan adalah mikroorganisme hidrolitik. Mikroorganisme ini akan menghasilkan enzim-enzim yang akan dilepaskan ke dalam medium untuk menghidrolisis senyawa-senyawa organik kompleks seperti selulosa, hemiselulosa, pektin, tepung dan senyawa organik 26 rantai panjang lain menjadi senyawa yang lebih sederhana seperti glukosa, asam amino dan peptida. 2. Asidogenesis Senyawa-senyawa organik yang lebih sederhana dari proses hidrolisis akan dimetabolisme menjadi asam-asam volatil rantai pendek seperti asetat, propionat, butirat, H2 dan CO2 Asidogenesis merupakan reaksi biologi yang mengubah monomer sederhana seperti glukosa, asam amino dan peptida menjadi volatile fatty acid atau asamasam lemak volatil sederhana seperti asetat, propionat, butirat, H2 dan CO2 dengan reksi-reaksi sebagai berikut: - Produksi asam asetat: C6H12O6 - Produksi asam butirat: C6H12O6 - 2CH3COOH + 2CO2 + 4H2 CH3CH2CH2COOH + 2CO2 + 2 H2 Produksi asam asetat dan asam propionat: C6H12O6 CH3CH2COOH + CH3COOH + CO2 + H2 3. Asetogenesis Hasil dari proses asidogenesis berupa asam-asam lemak rantai pendek, butirat, dan propionat akan dioksidasi menjadi asam asetat dan hidrogen oleh mikroorganisme penghasil asetat. Pada beberapa literatur asetogenesis seringkali digabungkan dengan proses asidogenesis karena sesungguhnya pada proses ini masih dihasilkan asam namun lebih spesifik menghasilkan asam asetat sehingga pada beberapa literatur, tahapan ini dipisahkan dengan tahap asidogenesis. 4. Methanogenesis Methanogenesis merupakan tahap akhir dari keseluruhan proses anaerob. Pada proses ini akan dihasilkan CH4 dan CO2, sebagian besar gas methan yang terbentuk yaitu sekitar 70 – 80 % berasal dari asam asetat, sisanya diperoleh dari H2 dan CO2. Pernyataan tersebut dikuatkan oleh Speece (2003) yang menyatakan bahwa sekitar 72% metana yang dihasilkan dari proses anaerob berasal dari asam asetat (Gambar II.8.). 27 POLIMER Lipida Polisakarida Protein Asam Nukleat Monosakarida Asam Amino & Peptida Purin & Pirimidin Hidrolisis Asam Lemak & Gliserol MONOMER dan OLIGOMER Asidogenesis Alkohol, propionate, asetat, butirat, suksinat, laktat, produk fermentasi lain Asetogenesis CO2 + H2 Metanogenesis asetat metanol metilamina formiat Metana dan CO2 Gambar II.7. Skema Proses Anaerob (hidrolisis,asidogenesis, dan metanogenesis) (Sayed, 1987; Syafila, 1997) Reaksi oksidasi asetat dan hidrogen menghasilkan gas methan adalah: - - Pembentukan gas methan dari hidrogen 4 H2 + H2CO3 CH4 + 3 H2O 4 H2 + CO2 CH4 + 2 H2O Pembentukan gas methan dari asam asetat CH3COOH + H2O CH4 + H2CO3 CH3COOH CH4 + CO2 Pada tahap ini yang memegang peranan adalah kelompok bakteri methanogens. Terdapat dua kelompok bakteri methanogens yaitu aseiclastic methanogens yang 28 dapat mengubah asam asetat menjadi metana dan karbon dioksida serta kelompok hydrogen-utilizing methanogens yang menggunakan hidrogen sebagai donor elektron dan CO2 sebagai ekseptor elektron untuk menghasilkan metana. Senyawa organik kompleks (karbohidrat, protein, lemak) 5% 20 % Hidrolisis 10 % Senyawa organik sederhana (gula, asam amino, peptida) 35 % Asidogenesis Asam lemak rantai panjang (propionat, butirat, dll) 13 % 17 % CO2 + H2 asetat 28 % CH4 + CO2 72 % Gambar II.8. Rangkaian Hasil Metabolisme dalam Proses Anaerob (Speece, 2003) II.2.4. Mikroorganisme yang Berperan dalam Proses Anaerob Menurut Grady dan Lim (1980) terdapat dua kelompok bakteri yang berperan dalam proses anaerob yang menghasilkan metana yaitu bakteri nonmetanogenik yang terdiri dari bakteri hidrolitik, bakteri asidogenik, bakteri penghasil asam dan penghasil hidrogen dan bakteri metanogenik yang terdiri dari bakteri penghasil metana. Sedangkan Bitton (1994) mengemukakan bahwa terdapat empat kategori bakteri yang terlibat dalam proses pembentukan metana dan CO2 melalui transformasi senyawa kompleks. Kategori yang pertama adalah bakteri hidrolitik, yang berperan dalam hidrolisis molekul organik kompleks atau polimer seperti polisakarida, protein, dan lemak menjadi senyawa yang lebih sederhana atau monomer seperti glukosa, asam amino, asam lemak dan gliserol. Proses hidrolisis molekul kompleks ini dikatalisis oleh enzim seluler seperti selulose, protease, dan lipase. Monomer ini kemudian akan dimetabolisme oleh bakteri kategori kedua yaitu bakteri fermentatif asidogenik atau bakteri 29 penghasil asam menjadi asam organik (seperti asam asetat, propionat, format, laktat, butirat, atau suksinat), alkohol, dan keton (etanol, methanol, gliserol, dan aseton), CO2 dan H2. Bakteri asetogenik atau bakteri penghasil asetat merupakan bakteri kategori ketiga yaitu bakteri yang berperan dalam mengubah hasil metabolisme bakteri kategori kedua menjadi asetat, CO2, dan H2. Selanjutnya ketiga senyawa tersebut akan diubah menjadi metana (CH4) oleh bakteri keempat yaitu bakteri metanogenik atau bakteri penghasil metana. Terdapat dua sub kategori bakteri metanogen yaitu Hydrogenotrophic methanogens yang berperan dalam mengkonversi hidrogen dan karbon dioksida menjadi metana seperti persamaan di bawah ini CO2 + 4H2 CH4 + metana 2H2O dan Acetotropihic methanogens yang dapat menghasilkan metana dari konversi asam asetat melalui reaksi sebagai berikut CH3COOH CH4 + metana asetat 2H2O Mikroorganisme yang dominan dalam proses anaerob ini adalah bakteri. Sejumlah besar bakteri anaerob dan fakultatif, seperti Bacteroides, Bifidobacterium, Clostridium, Lactobacillus, Streptococcus, terlibat dalam proses hidrolisa dan fermentasi senyawa organik. II.2.5. Alur Degradasi Komponen Organik Secara Anaerob Senyawa organik terdiri dari tiga kelompok utama, yaitu karbohidrat, protein, dan lemak. Sebagian besar bahan organik tersebut terurai menjadi piruvat sebagai produk antara. Piruvat merupakan produk antara yang umumnya terbentuk dari penguraian karbohidrat maupun senyawa organik lainnya oleh sebagian besar mikroorganisme (Gaudy dan Gaudy, 1980; Gottschalk, 1986). Gambar II.9 menunjukkan macam-macam produk fermentasi yang dihasilkan dari penguraian senyawa organik dalam hal ini karbohidrat. Karbohidrat mengalami hidrolisis menjadi glukosa. Pada tahap pertama dari fermentasi glukosa selalu terbentuk asam piruvat. Menurut Fardiaz (1992) dan Doelle (1994) dalam Rosdyana (2004) terdapat empat jalur pemecahan glukosa menjadi asam piruvat: 30 1. Jalur Embden-Meyerhof-Parnas (EMP) atau glikolisis, ditemukan pada fungi, bakteri serta pada hewan dan manusia. 2. Jalur Entner-Doudoroff (ED) , hanya ditemukan pada beberapa bakteri. 3. Jalur Heksosamonofosfat (HMF), ditemukan pada berbagai organisme 4. Jalur Fosfoketolase (FK), hanya ditemukan pada bakteri yang tergolong Lactobacili heterofermentatif. Jalur ini merupakan percabangan dari jalur Heksosamonofosfat. Dari gambar tersebut juga dapat dilihat bahwa produk fermentasi piruvat terdiri dari asam-asam volatil (format, asetat, propionat, butirat), asam-asama non-volatil (laktat dan suksinat), dan etanol serta gas-gas H2 dan CO2. KARBOHIDRAT GLUKOSA EMP HMF Asetil CoA ED Laktat PIRUVAT unit asetil asetaldehida Oksaloasetat etanol Suksinat asetoasetat asetoin 2 asetil + 2 format Propionat butirat 2 H2 asetat butirat aseton + CO2 2CO2 etanol 2,3 butanediol butanol isopropanol Gambar II.9. Produk akhir fermentasi pemecahan glukosa (Doelle, 1994; Rosdyana, 2004) 31 II.2.5.1. Fermentasi Alkohol Fermentasi glukosa menjadi alkohol (etanol) dapat dilakukan oleh banyak mikroorganisme seperti Saccharomyces cerevisiae dan Zymomonas sp. Saccharomyces cerevisiae memecah glukosa menjadi piruvat melalui jalur EMP (Embden-Meyerhof-Parnas) dapat dilihat pada Lampiran J. Pada fermentasi alkohol ini, glukosa didegradasi menjadi piruvat, piruvat yang terbentuk akan didekarboksilasi menghasilkan karbondioksida dan asetaldehida yang akan berperan sebagai aseptor elektron untuk reoksidasi NADH dan menghasilkan etanol sebagai produk akhir seperti reaksi berikut (Doelle, 1994; Rosdyana, 2004): CH3CO COOH CO2 Piruvat CH3CHO asetaldehid NADH + NAD+ CH3CH2OH etanol Transformasi piruvat menjadi etanol mencakup dua tahap. Pada tahap pertama piruvat didekarboksilasi menjadi asetaldehida oleh piruvat dekarboksilase dengan melibatkan tiamin pirofosfat. Pada tahap ini piruvat akan diuraikan menjadi asetilCoA yang berfungsi sebagai prekursor utama pembentukan asetaldehid. Selanjutnya asetaldehid akan membentuk etanol dengan bantuan enzim alkohol dehidrogenase. Reaksi-reaksi yang terjadi dapat dilihat sebagai berikut (Gaudy dan Gaudy, 1981, Gottschalk, 1986): CH3-OC-COOH HCOOH + CH3-CO ScoA piruvat format asetil-CoA CH3COH CH3CH2OH asetaldehid etanol CH3COH asetaldehid Pada fermentasi alkohol, secara teoritis dapat dihasilkan alkohol dan CO2 dengan jumlah 51,1% dan 48,9% dari jumlah gula yang difermentasi. Pada kenyataannya alkohol dan CO2 yang dihasilkan tidak sesuai dengan teori karena terdapat berbagai faktor yang mempengaruhi yaitu terdapat hasil samping yang dihasilkan seperti asam asetat, asam laktat, asetaldehida dan gliserol, selain itu adanya sebagian gula yang digunakan oleh mikroorganisme lain serta adanya alkohol yang hilang karena penguapan. 32 Faktor-faktor yang mempengaruhi proses fermentasi alkohol adalah (Prescott & Dunn, 1959) : 1. Konsentrasi gula Ragi memerlukan energi yang berasal dari karbon untuk pertumbuhannya. Gula adalah substrat yang lebih disukai, oleh karenanya konsentrasi gula sangat mempengaruhi kuantitas alkohol yang dihasilkan. 2. pH pH optimum untuk pertumbuhan ragi berkisar antara 4,0 sampai 4,5. Pada pH 3,0 atau lebih rendah lagi fermentasi alkohol akan berjalan dengan lambat, selain itu dapat memacu pertumbuhan bakteri-bakteri tertentu (Prescott & Dunn, 1959). 3. Faktor-faktor pertumbuhan ragi Ragi membutuhkan biotin, inositol, asam nikotinat, asam pantotenat, asam paminobenzoat, piridoksin (vitamin B6) dan tiamin (vitamin B1) untuk pertumbuhannya. Komponen-komponen tersebut tidak perlu ditambahkan lagi ke dalam sari buah, yang merupakan substrat untuk fermentasi alkoholik, karena pada umumnya sudah terdapat dalam jumlah yang cukup (Prescott & Dunn, 1959). 4. Suhu Suhu optimum untuk ragi berkisar antara 25 sampai 30°C sedangkan suhu maksimum antara 35 sampai 47°C. (Cook, 1958). Suhu selama fermentasi perlu diperhatikan karena disamping suhu mempunyai efek yang langsung terhadap pertumbuahan ragi juga mempengaruhi komposisi produk akhir. Semakin rendah suhu fermentasi maka alkohol yang dihasilkan semakin tinggi karena pada suhu rendah fermentasi akan lebih sempurna dan kehilangan alkohol karena terbawa oleh gas CO2 akan lebih sedikit. Pada suhu yang relatif tinggi dapat mengakibatkan terjadinya kehilangan alkohol dan senyawa aromatik lainnya. Selain itu suhu yang relatif tinggi akan menonaktifkan ragi dan akan menyebabkan pertumbuhan mikroorganisme lainnya, misalnya Lactobacilli yang akan tumbuh dan menyebabkan kerusakan yang tidak diinginkan, seperti perubahan cita rasa dari produk akhir (Prescott & Dunn, 1959). 33 5. Oksigen Fermentasi alkohol oleh ragi Saccharomyces cerevisiae dilakukan secara anerob (Cook, 1958), tetapi beberapa ragi lain dari kultur yang diaerasi akan menghasilkan alkohol dalam jumlah yang lebih besar apabila dibandingkan dengan ragi dari kultur yang tanpa aerasi. Tetapi efek tersebut bervariasi tergantung ragi yang digunakan (Hariyum, 1986). II.2.5.2. Fermentasi Laktat Laktat merupakan produk akhir yang biasa terbentuk pada fermentasi yang dilakukan oleh berbagai jenis mikroorganisme. Beberapa jenis bakteri asam laktat (diperoleh dari bahan yang berasal dari tumbuhan, buah-buahan, susu, dan berasal dari saluran pencernaan Sporolactobacillus, hewan) berasal Streptococcus, dari genus Leuconostoc, Lactobacillus, Pediococcus, dan Bifidobacterium. Bakteri asam laktat merupakan mikroorganisme yang strictly fermentatif tetapi aerotolerant. Terdapat tiga jalur utama bagi pembentukan laktat dari glukosa (Gottschalk, 1986), yaitu : a. Homofermentatif Pembentukan laktat dari glukosa seperti halnya pada pembentukan alkohol akan melalui jalur EMP menghasilkan piruvat. Piruvat yang dihasilkan tidak didekarboksilasi menjadi asetaldehid seperti pada fermentasi alkohol tetapi digunakan sebagai akseptor H+. C6H12O6 2 CH3CHOHCOOH glukosa laktat b. Heterofermentative Pada jalur heterofermentatif, laktat dapat terbentuk dari glukosa melalui jalur Pentosa Phosphate. Xilulosa-5-fosfat dipecah menjadi gliseraldehid-3-fosfat dan asetil fosfat oleh enzim fosfoketolase (dapat dilihat pada Lampiran J). Gliseraldehid-3-fosfat akan masuk ke dalam jalur pembentukan laktat. Asetil fosfat akan dionversi menjadi asetil-CoA oleh enzim fosfotransasetilase kemudian oleh enzim alkohol dehidrogenase akan diubah menjadi alkohol. C6H12O6 glukosa CH3CHOHCOOH + C2H5OH + CO2 aktat 34 etanol c. Bifidium Pada jalur ini akan terbentuk laktat dari gliseraldehid-3-fosfat dan asetat dari asetil fosfat. Seperti pada jalur homofermentatif dan heterofermentatif, pembentukan laktat dari gliseraldehid-3-fosfat pada jalur bifidum juga membutuhkan kehadiran H2 yang akan diikat oleh NAD membentuk NADH dan H+. Sedangkan pada pembentukan asetat dari asetil fosfat tidak memerlukan adanya H2. C6H12O6 3 CH3COOH + CH3CHOHCOOH glukosa II.2.5.3. asetat laktat Fermentasi Butirat Butirat dapat terbentuk dari degradasi glukosa melalui jalur Embden Meyerhof Parnas menghasilkan piruvat dan asetil-CoA. Asetil-CoA akan diubah menjadi butirat melalui serangkaian reaksi yang melibatkan beberapa enzim (Lampiran J). Butirat terbentuk dari glukosa dengan reaksi sebagai berikut : C6H12O6 CH3CH2CH2COOH + 2 CO2 + 2 H2 glukosa II.2.5.4. butirat Fermentasi Propionat dan Suksinat Beberapa bakteri anaerob seperti Clostridium propionicum dan Megasphaera (Peptostreptococcus) elsdenii dapat memfermentasi glukosa menjadi propionat asetat dan CO2 melalui reaksi berikut: 1,5 C6H12O6 2 CH3CH2COOH + CH3COOH + CO2 glukosa propionat asetat Bakteri pembentuk propionat dapat membentuk propionat dari laktat melalui dua jalur yaitu alur akrilat dan alur suksinat-propionat. a. Alur akrilat Melalui alur akrilat ini akan terbentuk propionat, asetat dan H2O: 3 CH3CHOHCOOH laktat 2 CH3CH2COOH + CH3COOH + H2O propionat asetat b. Alur Suksinat-Propionat Pada alur suksinat-propionat, laktat akan membentuk propionat: 3 CH3CHOHCOOH 2 CH3CH2COOH + H2O laktat propionat 35 Suksinat merupakan produk antara pada pembentukan propionat namun dapat pula diperoleh sebagai produk akhir fermentasi piruvat. II.2.5.5. Fermentasi Format Format dapat terbentuk dari glukosa melalui piruvat. Piruvat akan membentuk format dan asetil-CoA. CH3COCOOH HCOOH + CH3OCSCoA piruvat II.2.5.6. format asetil-CoA Fermentasi Asetat Beberapa jenis bakteri dapat memfermentasi piruvat menjadi asetat melalui asetilCoA. Alur pembentukan asetat dari berbagai senyawa dapat dilihat pada Lampiran J. Asam asetat dapat terbentuk melalui oksidasi alkohol secara aerob dengan bantuan bakteri asam asetat seperti reaksi berikut (Adams, 1985) CH3CH2OH + O CH3COH asetaldehida etanol CH3COH + H2O + H2O asetaldehida CH3CH(OH)2 asetaldehida hidrat CH3CH(OH)2 + O CH3COOH + H2O asetaldehida hidrat asetat Selain melalui reaksi tersebut di atas terdapat beberapa reaksi yang dapat meghasilkan asam asetat secara anaerob. Beberapa spesies bakteri dapat hidup pada pembentukan asetat dari H2 dan CO2 menurut persamaan berikut ini (Wieringa, 1936 dalam Syafila, 1997): 4H2 + 2CO2 4CO + 2H2O CH3COOH + 2H2O CH3COOH+ 2CO2 4CH3OH + CO2 CH3COOH + 2H2O Pembentukan asetat juga dapat terjadi dari etanol, butirat, dan propionat seperti yang terlihat dalam reaksi dibawah ini: - Pembentukan asetat dari etanol: CH3CH2OH + H2O etanol CH3COOH + 2H2 + H asetat 36 - Pembentukan asetat dari butirat: CH3CH2CH2COOH + 2H2O 2CH3COOH + 2H2 butirat - asetat Pembentukan asetat dari propionat: CH3CH2COOH + 2H2O CH3COOH + CO2 + 2H2 propionat asetat II.2.6. Recovery Limbah Pulp Kakao Pengolahan limbah bukan berarti hanya terbatas pada mengolah air buangan menjadi tidak berbahaya untuk kemudian dibuang ke badan perairan namun pengolahan limbah juga dapat memiliki makna yang lain. Pada penelitian yang dilakukan kali ini, pengolahan limbah pulp kakao yang dilakukan secara anaerob tidak bertujuan untuk dibuang ke perairan. Pengolahan limbah dilakukan untuk menghasilkan suatu produk yang dapat meningkatkan nilai ekonomis dari limbah itu sendiri. Limbah dapat ditingkatkan nilai ekonomisnya dengan cara recovery limbah menjadi bahan yang lebih bernilai secara ekonomis. Penelitian ini diharapkan akan menghasilkan suatu produk dengan konsentrasi asam asetat yang relatif tinggi. Limbah pulp kakao merupakan limbah yang berasal dari buah-buahan yang masih mengandung kadar gula yang cukup tinggi sehingga dapat digunakan sebagai substrat untuk pembuatan minumam fermentasi. Pada penelitian ini limbah pulp kakao diolah menjadi asam asetat dengan teknik yang relatif sederhana sehingga dapat pula dilakukan di rumah-rumah. Recovery limbah pulp kakao menjadi asam asetat seperti telah disebutkan dalam sub bab sebelumnya dapat diperoleh dari metabolisme beberapa senyawa oleh bakteri asam asetat. Pembentukan asam asetat dapat dilakukan dengan 2 cara yaitu secara aerob maupun anaerob. Secara aerob melalui oksidasi etanol menjadi asetat namun pembentukan etanol dari glukosa berlangsung dalam kondisi anaerob. Secara anaerob, asam asetat dapat diperoleh dari transformasi asam-asam volatil seperti butirat dan propionat, etanol, serta melalui reaksi antara H2 dan CO2. 37 II.2.7. Asam Asetat Asam asetat yang juga dikenal sebagai asam etanoat adalah komponen kimia organik yang diketahui sebagai pemberi cita rasa pada vinegar. Asam asetat dalam air murni (asam asetat glasial) berbentuk cairan higroskopik yang tidak berwarna. Asam asetat dapat membeku di bawah 16.7° C menjadi kristal padat yang tidak berwarna. Asam asetat bersifat korosif, uapnya dapat membuat mata dan hidung teriritasi meskipun merupakan asam lemah (http://en.wikipedia.org.htm). Asam asetat merupakan salah satu asam karboksilat yang paling sederhana (yang kedua adalah asam format). Asam asetat digunkan sebagai reagen kimia dan bahan baku industri kimia, diantaranya dapat digunakan dalam produksi polyethylene terephtalate (umumnya digunkan dalam pembuatan botol softdrink), cellulose acetate (digunakan untuk film untuk fotografi), dan polyvinyl acetate (untuk pembuatan lem kayu). Dalam rumah tangga digunakan sebagai agen descaling sedangkan dalam industri makanan digunakan sebagai bahan tambahan makanan (food additive) dengan kode E260 sebagai pengatur asam. Permintaan asam asetat di dunia dapat mencapai 6.5 juta ton per tahun, kira-kira 1.5 juta ton per tahun diperoleh dari proses daur ulang (sisa pengolahan petrokimia atau sumber biologi) (http://en.wikipedia.org.htm). Penggunaan asam asetat dalam pengawetan pangan sudah dilakukan sejak lama, seperti pada pengacaran (pembuatan pickles). Selain cuka (4% asam asetat) dan asam asetat, bentuk-bentuk lain yang digunakan dalam makanan adalah sodium, kalsium, dan potassium asetat. Bentuk garam-garam tersebut digunakan dalam roti dan produk-produk bakery lainnya yanitu untuk mencegah pembentukan ropy bread. Asam asetat digunakan dalam mengacar sayur maupun daging dan ikan. Selain sebagai anti mikroba, asam asetat juga berkontribusi terhadap citarasa makanan seperti pada produk mayonaise, acar, saus tomat, dan lain-lain. Aktivitas antimikroba asam asetat meningkat dengan menurunnya pH (Siagian, 2002). Asam asetat dapat dibuat dengan dengan dua cara yaitu sintetis dan dengan cara fermentasi. Seperti telah dikemukakan pada Bab Pendahuluan, menurut Irdawati, 1999, larutan cuka sintetis dibuat dengan cara mengoksidasi asetaldehida yang diperoleh dari hasil dehidrasi asetilen atau dehidrogenasi alkohol. Reaksi 38 pembentukan asam asetat ini melibatkan beberapa logam berat yang berfungsi sebagai katalisator diantaranya Hg2+, Mn2+, dan Cu (Luthfiantho, 1995). Selain itu digunakan pula berbagai bahan kimia lain yang dapat terakumulasi di dalam tubuh. Asam asetat yang dibuat dengan cara fermentasi dilakukan secara aerob maupun anaerob dengan menggunakan mikroorganisme. Asam asetat yang dihasilkan dari proses ini dikenal dengan istilah vinegar. Faktor-faktor yang mempengaruhi fermentasi asam asetat oleh bakteri adalah (Rosdyana, 2004): 1. Jenis mikroorganisme serta jumlah kultur Jenis bakteri asam asetat yang digunakan harus dapat menghasilkan produk yang dikehendaki dalam jumlah yang cukup banyak (Pelczar & Chan, 1986). Jumlah inokulum harus seimbang agar tidak terjadi kompetisi yang menyebabkan produk yang dihasilkan tidak maksimal. 2. Suhu Semua proses pertumbuhan bergantung pada reaksi kimiawi, laju reaksi-reaksi ini dipengaruhi oleh suhu, maka pola pertumbuhan bakteri sangat dipengaruhi oleh suhu. Suhu juga mempengaruhi laju pertumbuhan dan jumlah total pertumbuhan organisme. Keragaman suhu dapat juga mengubah proses-proses metabolik tertentu serta morfologi sel (Pelczar & Chan, 1986). Suhu optimum untuk pembentukan asam asetat berkisar antara 23,9°C sampai dengan 29,4°C (Prescott & Dunn, 1959). Pada suhu yang lebih rendah, fermentasi akan berjalan dengan lambat. Pada suhu yang lebih tinggi disamping akan memperlambat proses fermentasi juga akan mengakibatkan terjadi penguapan beberapa senyawa aromatis. Penguapan senyawa-senyawa aromatis ini tidak dikehendaki karena merupakan penyusun citarasa dari vinegar (Waluyo, 1984). 3. pH Setiap mikroorganisme mempunyai pH optimum bagi pertumbuhannya. Sel mikroorganisme secara signifikan sangat dipengaruhi oleh pH medium, karena mikroorganisme tidak memiliki mekanisme untuk mengatur pH internal sel (Frazier, 1988). pH optimum medium diperlukan oleh bakteri agar metabolisme 39 dari bakteri dapat berjalan maksimal sehingga diperoleh produk fermentasi akhir yang diinginkan. 4. Ketersediaan oksigen Asam asetat dapat terbentuk melalui reaksi aerob maupun anaerob tergantung jenis mikroorganisme yang digunakan sebagai kultur/ inokulum. Pada penelitian ini digunakan sistem anaerobik sehingga keberadaan oksigen tidak diperlukan. Namun karena kultur yang digunakan adalah kultur campuran maka tidak menutup kemungkinan di dalam sistem terdapat mikroorganisme yang bersifat anaerob fakultatif sehingga dapat melakukan pembentukan asam asetat melalui oksidasi alkohol. II.2.8. Vinegar Kata vinegar berasal dari bahasa Perancis yaitu vin dan aigre. Vin mempunyai arti anggur (wine) sedangkan aigre berarti asam, maka vinegar berarti anggur yang telah diasamkan (Prescott & Dunn, 1959). Vinegar merupakan cairan asam hasil fermentasi yang telah banyak digunakan sejak tahun 1800-an sebagai bahan tambahan atau penyedap masakan karena dapat memberikan citarasa dan aroma. Ketajaman citarasa dalam vinegar disebabkan adanya asam asetat dan berbagai senyawa ester yang terkandung di dalamnya (Adams, 1997). Vinegar merupakan bumbu penyedap yang dibuat dari substrat yang mengandung gula atau pati dengan fermentasi alkoholik dan kemudian dilanjutkan dengan fermentasi asetat (Frazier & Westhoff, 1988). Menurut Salle (1961), vinegar dapat dikelompokkan beradasarkan bahan pembentuknya, yaitu: - Cider vinegar, vinegar yang berasal dari sari buah-buahan seperti apel, anggur, jeruk, pir, berri, dan lain sebagainya - Malt vinegar, vinegar yang berasal dari fermentasi biji-bijian yang mengandung tepung seperti barley, rye, gandum, dan jagung - Wine vinegar, merupakan vinegar yang dihasilkan dari sari buah anggur. - Sugar vinegar, yaitu vinegar yang berasal dari bahan yang mengandung kadar gula tinggi seperti sirup, molase, madu, dan sirup mapple, dan lain sebagainya 40 - Spirit vinegar, berasal dari spirits atau alkohol yang berasal dari limbah pembuatan bir oleh ragi atau berasal dari hasil destilasi yang telah diencerkan atau proses denaturasi etil alkohol yang telah diencerkan - vinegar yang berasal dari sayuran yang mengandung pati seperti kentang atau kentang manis namun pati pada sayuran tersebut telah dihidrolisis terlebih dahulu menjadi gula. Secara kimiawi, vinegar memiliki sifat-sifat berikut (Poultney, 1949) : - Biodegradable, karena vinegar merupakan asam organik ringan - Relatif bersifat non toksik sehingga aman untuk dikonsumsi - Tidak menghasilkan residu yang membahayakan. Vinegar dibuat dengan dua langkah, yang pertama adalah fermentasi gula menjadi etil alkohol dan yang kedua adalah oksidasi alkohol menjadi asam asetat. Langkah pertama merupakan proses anaerob yang dilakukan oleh ragi, secara alami telah terdapat pada bahan pembuatnya, atau dengan melakukan penambahan kultur ragi yang memiliki kemampuan memproduksi alkohol seperti Saccharomyces cerevisiae. Di antara langkah pertama dan kedua terdapat reaksi antara yang menghasilkan sejumlah kecil produk akhir seperti gliserol dan asam asetat. Juga terdapat beberapa substansi lain dalam jumlah kecil yang terbentuk dari substrat selain gula seperti asam suksinat dan amil alkohol. Langkah kedua adalah oksidasi alkohol menjadi asam asetat dengan reaksi aerob melibatkan bakteri asam asetat. Senyawa antara juga dihasilkan dari reaksi kedua yaitu asetaldehid, maka pada produk akhir ditemukan aldehid, aster dan asetoin dalam jumlah kecil. Bakteri yang berperan dalam proses ini adalah bakteri asam asetat. Dalam Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology edisi ketujuh disebutkan bahwa terdapat 13 jenis bakteri pembentuk asam asetat, yaitu 7 jenis berasal dari genus Acetobacter dan 6 jenis berasal dari genus Bacterium. Aroma merupakan ciri khas yang dihasilkan dari pengolahan suatu substrat menjadi vinegar, aroma dan rasa yang khas ini tergantung dari substrat atau bahan baku pembuatnya. Aroma dan citarasa yang terandung di dalam vinegar 41 merupakan salah satu keunggulan yang membedakannya dengan larutan cuka (asam asetat) yang dibuat secara sintetis. II.2.8.1. Faktor-faktor Yang Mempengaruhi Produksi Vinegar Menurut Rosdyana (2004), terdapat beberapa faktor yang perlu diperhatikan dalam produksi vinegar karena dapat mempengaruhi kualitas dan kuantitas produk yang diperoleh diantaranya : 1. Bahan mentah Mutu vinegar sangat tergantung dari mutu bahan mentahnya (Poultney, 1949). Buah-buahan yang digunakan harus sehat, bebas bahan pengawet dan bersih. Sebelum diolah buah-buahan harus dicuci terlebih dahulu, karena buahbuahan merupakan sumber kontaminasi. Dengan pencucian maka jumlah mikroorganisme yang terdapat pada kulit luar buah-buahan akan dapat dikurangi. Mikroorganisme yang terdapat pada buah yang belum dicuci dapat mencapai jutaan sel. Mikroorganisme tersebut dapat berasal dari tanah, air, kotoran-kotoran, udara, binatang dan sebagainya yang menempel pada permukaan buah-buahan. Apabila kondisi pertumbuhan dari mikroorganisme yang menempel pada permukaan buah-buahan ini memungkinkan, maka mikroorganisme-mikroorganisme ini akan cepat berkembangbiak sehingga mencapai jumlah yang jauh lebih banyak dari semula. Adanya mikroorganisme-mikroorganisme ini mungkin dapat mengganggu proses fermentasi alkohol dan asam asetat (Waluyo, 1984). Buah-buahan yang digunakan juga harus memiliki derajat kematangan yang optimal. Buah-buahan yang derajat kematangannya tidak optimal yaitu dengan kandungan glukosa yang rendah, dapat menghasilkan vinegar dengan kadar asam asetat yang terlalu rendah (Waluyo, 1984). Vinegar yang diperoleh dari sari buah apel (cider vinegar) di samping mengandung asam asetat 4 g setiap 100 mL (pada 20°C), juga mengandung sejumlah kecil alkohol, gliserol, esterester, gula invert, pentosa, garam-garam dan substansi lainnya. Substansisubstansi ini sangat besar peranannya dalam membentuk citarasa dari vinegar (Waluyo, 1984 ). 42 2. Konsentrasi alkohol Penambahan alkohol pada medium dapat meningkatkan keberhasilan proses fermentasi (Prescott & Dunn, 1959). Alkohol pada konsentrasi 10 – 13% secara cepat akan difermentasikan oleh bakteri asam asetat. Jika kandungan alkohol dalam medium mencapai 14% atau lebih, maka alkohol tidak dapat teroksidasi secara lengkap. Sebaliknya, jika konsentrasi alkohol yang terkandung dalam medium kurang dari 2%, vinegar tidak dapat terbentuk karena ester dan asam asetat yang dihasilkan akan segera teroksidasi. Hal ini ditandai dengan hilangnya aroma serta rasa. Selain itu dapat pula terjadi fermentasi lanjutan yaitu terbentuknya karbondioksida dan air dengan reaksi sebagai berikut (Prescott & Dunn, 1959) : CH3COOH + 2O2 2CO2 + 2H2O 3. Mikroorganisme dan jumlah kultur biomassa mikroorganisme / inokulum Terdapat beberapa jenis mikroorganisme yang dapat memproduksi alkohol dan asam asetat dengan hasil yang relatif sangat rendah, oleh karena itu perlu dilakukan seleksi terhadap jenis-jenis mikroorganisme untuk fermentasi sehingga bisa diperoleh produk vinegar seperti yang diinginkan. Pada tahap fermentasi alkohol, biasanya ditambahkan kultur Saccharomyces cerevisiae, karena mampu memproduksi alkohol secara optimal. Bakteri-bakteri yang biasanya digunakan pada tahap fermentasi asam asetat adalah Acetobacter aceti, A. pasteurianum, A. ascendense dan A. acetigenum (Adams, 1985). Jumlah inokulum yang ditambahkan juga mempengaruhi produksi vinegar. Diperlukan jumlah inokulum yang optimum untuk menghasilkan vinegar dengan kualitas yang baik yaitu dengan konsentrasi asam asetat 4 g per 100 mL (Frazier, 1988). Pada penggunaan kultur campuran dilakukan pengontrolan dengan rekayasa teknologi sehingga mikroorganisme yang berperan adalah mikroorganisme yang diinginkan dan mampu menghasilkan asam asetat. 43
