ANALISIS KERAGAMAN GENETIK GEN 16S-rRNA DAN
advertisement
ANALISIS KERAGAMAN GENETIK GEN 16S-rRNA DAN KARAKTERISASI FISIOLOGIS BAKTERI ASAL USUS UDANG VANAME Litopenaeus vannamei DARI BERBAGAI UMUR ULFI YUNIDA ARDIANI DEPARTEMEN BUDIDAYA PERAIRAN FAKULTAS PERIKANAN DAN ILMU KELAUTAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR 2011 ABSTRAK ULFI YUNIDA ARDIANI. Analisis Keragaman Genetik Gen 16S-rRNA dan Karakterisasi Fisiologis Bakteri Asal Usus Udang Vaname Litopenaeus vannamei dari Berbagai Umur. Dibimbing oleh MUNTI YUHANA dan DINAMELLA WAHJUNINGRUM. Populasi mikroba usus sangat berperan dalam memelihara dan mempertahankan status kesehatan organisme dan secara keseluruhan memegang peran penting dalam produktivitas budidaya. Dalam penelitian ini dilakukan isolasi bakteri mikroflora normal asal usus udang vaname yang dipelihara di tambak perairan payau. Penelitian ini bertujuan untuk mengkarakterisasi keragaman genetik maupun fisiologis dari isolat-isolat yang terkumpul. Untuk pendekatan molekuler digunakan amplifikasi PCR terhadap gen target 16S-rRNA dengan teknik ARDRA (Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis), sedangkan karakterisasi fisiologis dilakukan dengan melakukan uji-uji biokimia dan morfologi sel. Sebanyak 45 isolat terseleksi dan 2 isolat referens yaitu bakteri V. harveyi digunakan dalam penelitian ini. Gen 16S-rRNA diamplifikasi dengan 3 pasang primer terpilih (yang paling sesuai untuk masing-masing isolat), yaitu primer 0008F berpasangan dengan 1524R , 63F berpasangan dengan 1387R, dan 0008F berpasangan dengan 1492RH. Hasil amplifikasi dipotong dengan enzim restriksi Sau3AI (5’-↓GATC). Pola ARDRA pada gel elektroforesis digunakan sebagai sumber data dan dilakukan input data matriks biner untuk kontruksi pohon filogenetika. Pohon filogenetika ini digunakan untuk mempelajari hubungan kekerabatan antar jenis bakteri yang diisolasi. Berdasarkan analisis filogeninya, diketahui keragaman bakteri pada usus udang terdiri dari 30 OTU (Organism Taxonomy Unit) yang berbeda. Berdasarkan hasil karakterisasi fisiologisnya, secara umum bakteri usus udang umur 1 bulan, 2 bulan, dan 3 bulan termasuk dalam genus Bacillus dan Kurthia. Kata kunci: Vaname, L. Vannamei, mikroflora usus, bakteri, ARDRA, analisis filogeni, karakterisasi fisiologis. ABSTRACT ULFI YUNIDA ARDIANI. Analyses of Intestinal Bacteria Isolated from Various Stages of Cultured-White Shrimp, Litopenaeus vannamei, using Genetic Diversity of 16S-rRNA genes and the Physiological Characterization. Supervised by MUNTI YUHANA and DINAMELLA WAHJUNINGRUM. Intestinal microbial population plays important roles in the shrimp health as the host and overall will influence the final productivity of the cultured shrimp. The number and the composition of the intestinal microbes of the aquatic organisms were greatly influenced by the microbes present in the water column which are mostly entered the digestion system of the shrimp unintentionally. In this study, we isolated intestinal bacteria of the white shrimp, Litopenaeus vannamei, cultured in brackishwater from various stages. The objective of this study was to analyse the diversity of the 16S rRNA gene employing ARDRA (Amplified Ribosomal DNA Restriction Analyses) technique as well as to characterize the physiological properties of those isolates. As many as 45 isolates were selected and 2 reference of V. harveyi were used in this study. PCR amplification were performed using 3 different primers pairs, depending on the isolates, i.e. 0008F and 1524R , 63F and 1387R. Amplification of 16S-rRNA gene of Vibrio was performed using 0008F and 1492RH. Physiological characterizations were conducted to observe the cell morphologies, and biochemical tests employing Gram staining, O/F test, catalase test, and oxidase test. PCR products of the different primers pairs resulted in the DNA lenghts ranging from 1400 to 1500 basepairs. The PCR products were subjected to digestion of restriction enzyme of Sau3AI (5’-↓GATC). After incubation, the digested PCR products were loaded in the agarose gels and further run by electrophoresis. Based on polymorphisms profile of DNA bands appeared in the agarose gels, the binary matrix was recorded and was used as the data source for phylogenetic tree construction. Phylogenetic analyses showed that those isolates are distributed into 30 different OTUs (Organisms Taxonomy Unit) which are common dominated by Bacillus and Kurthia. Keyword: White shrimp, L. vannamei, intestinal microflora, bacteria, ARDRA, philogenetic analysis, phisiological characterization. ANALISIS KERAGAMAN GENETIK GEN 16S-rRNA DAN KARAKTERISASI FISIOLOGIS BAKTERI ASAL USUS UDANG VANAME Litopenaeus vannamei DARI BERBAGAI UMUR ULFI YUNIDA ARDIANI SKRIPSI Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Perikanan pada Program Studi Teknologi & Manajemen Perikanan Budidaya Departemen Budidaya Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut Pertanian Bogor DEPARTEMEN BUDIDAYA PERAIRAN FAKULTAS PERIKANAN DAN ILMU KELAUTAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR 2011 PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN SUMBER INFORMASI Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi yang berjudul : ANALISIS KERAGAMAN GENETIK GEN 16S-rRNA DAN KARAKTERISASI FISIOLOGIS BAKTERI ASAL USUS UDANG VANAME Litopenaeus vannamei DARI BERBAGAI UMUR adalah benar merupakan hasil karya yang belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Semua sumber data dan informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini. Bogor, April 2011 ULFI YUNIDA ARDIANI C14060446 Judul Skripsi : Analisis Keragaman Genetik Gen 16S-rRNA dan Karakterisasi Fisiologis Bakteri Asal Usus Udang Vaname Litopenaeus vannamei dari Berbagai Umur Nama Mahasiswa : Ulfi Yunida Ardiani Nomor Pokok : C14060446 Menyetujui, Pembimbing I Pembimbing II Dr. Munti Yuhana, S.Pi., M.Si. NIP. 19691220 199403 2 002 Dr. Dinamella Wahjuningrum, S.Si., M.Si. NIP. 19700521 199903 2 001 Mengetahui, Ketua Departemen Budidaya Perairan Dr. Ir. Odang Carman, M.Sc. NIP. 19591222 198601 1 001 Tanggal Lulus: 01 April 2011 KATA PENGANTAR Puji dan syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT, atas segala limpahan rahmat-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi ini sesuai dengan waktu yang direncanakan. Skripsi yang berjudul “Analisis Keragaman Genetik Gen 16S-rRNA dan Karakterisasi Fisiologis Bakteri Asal Usus Udang Vaname Litopenaeus vannamei dari Berbagai Umur” telah selesai dikerjakan. Penulis mengucapkan terima kasih kepada Dr. Munti Yuhana selaku Pembimbing Skripsi I dan Dr. Dinamella Wahjuningrum selaku Pembimbing Skripsi II yang telah memberikan pengarahan dan bimbingan selama penelitian dan penyusunan skripsi, Dr. Tataq Budiardi selaku dosen penguji, serta Dr. Sukenda selaku manager tambak PT. Pinang Gading yang telah mengijinkan penulis memperoleh sampel udang, Dr. Dedi Jusadi selaku Pembimbing Akademik yang telah memberikan nasehat selama proses studi, Bapak Ranta dan Mbak Anna atas bimbingannya selama melaksanakan penelitian di laboratorium, Ayahanda dan Ibunda serta keluarga yang telah memberikan dorongan dan do‟anya, sahabat KMK yang telah memberikan motivasi tersendiri, teman-teman LKI„ers, teman-teman Genetic‟ers. teman-teman seperjuangan BDP angkatan‟43, serta bapak, ibu, dan kakak pasca sarjana. Adik-adik dari BDP angkatan ‟44 dan angkatan ‟45 yang tidak dapat saya sebutkan satu per satu, penulis berterima kasih atas segala bantuan, dukungan, dan supportnya. Akhirnya penyusun berharap semoga skripsi ini bermanfaat bagi semua pihak yang membutuhkannya. Bogor, April 2011 Ulfi Yunida Ardiani DAFTAR ISI Halaman DAFTAR ISI ...................................................................................... .. i DAFTAR GAMBAR ............................................................................. .. ii DAFTAR TABEL .................................................................................. .. iii DAFTAR LAMPIRAN ............................................................................ iv I. PENDAHULUAN .......................................................................... 1 II. BAHAN DAN METODE .............................................................. 2.1 Isolasi bakteri ........................................................................... 3 2.2 Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis (ARDRA)..... III. 2.2.1 Ekstraksi DNA Genom Bakteri ....................................... 3 2.2.2 Amplifikasi Gen 16S-rRNA .......................................... 4 2.2.3 Digesti dengan Enzim Restriksi Sau3AI ......................... 5 2.2.4 Elektroforesis ................................................................. 5 2.2.5 Konstruksi Pohon Filogenetika dari Pola ARDRA ........ 6 2.3 Analisis Keanekaragaman dan Dominansi ................................ 6 2.4 Karakterisasi Fisiologis dari Isolat............................................. 7 HASIL DAN PEMBAHASAN ...................................................... 3.1 Hasil .......................................................................................... 8 3.2 Pembahasan ............................................................................... 14 IV. KESIMPULAN .................................................................................. 27 DAFTAR PUSTAKA ................................................................................... 28 LAMPIRAN .................................................................................................. 30 i DAFTAR GAMBAR Halaman 1. PCR Amplifikasi Gen 16S-rRNA 47 Isolat Bakteri pada Usus Udang dari Udang Umur 1 Bulan, 2 Bulan, dan 3 Bulan ............................... 9 2. Elektroforegraf Gel Agarosa Hasil Pemotongan Gen 16S-rRNA dengan Enzim Restriksi Sau3AI untuk 47 Isolat Bakteri dari Usus Udang ................................................................................................ 11 3. Intepretasi Hasil Pemotongan Gen 16S-rRNA dengan Enzim Restriksi Sau3AI untuk 47 Isolat Bakteri dari Usus Udang ................. 13 4. Bagian dari Anatomi Tubuh Udang (Usus) yang Diteliti .................... 15 5. Bagian Sistem Pencernaan pada Udang .............................................. 15 6. Pohon Filogenetika 31 Filotipe Bakteri dari Usus Udang Umur 1 Bulan, 2 Bulan, dan 3 Bulan dengan Menggunakan Enzim Restriksi Sau3AI ............................................................................................... 20 7. Ilustrasi Komponen Bakteri Usus Udang Umur 1 Bulan, 2 Bulan, dan 3 Bulan Berdasarkan Uji Morfologi, Fisiologi, dan Biokimia…………... 24 ii DAFTAR TABEL Halaman 1. Pemilihan Koloni Bakteri Unik dari Usus Udang ............................... 8 2. Nilai Indeks Keanekaragaman dan Indeks Dominansi ....................... 13 3. Hasil Karakterisasi Morfologi, Fisiologi, dan Biokimia Bakteri Usus Udang yang Memiliki Pola ARDRA Unik ......................................... 14 4. Kondisi Kualitas Air Pemeliharaan........................................................ 17 5. Kelompok Filogeni Bakteri Asal Usus Udang Umur 1 Bulan ................ 22 6. Kelompok Filogeni Bakteri Asal Usus Udang Umur 2 Bulan ................ 23 7. Kelompok Filogeni Bakteri Asal Usus Udang Umur 3 Bulan ................ 23 8. Kelompok Filogeni Bakteri yang Terdapat pada Usus Udang Umur 1, 2, dan 3 Bulan ....................................................................................... 24 9. Probiotik Udang dalam Industri Akuakultur .......................................... 26 iii DAFTAR LAMPIRAN Halaman 1. Isolasi Bakteri dengan Metode Cawan Sebar ......................................... 31 2. Pewarnaan Gram ................................................................................... 32 3. PCR (Polymerase Chain Reaction)........................................................ 33 4. Uji Biokimia ......................................................................................... 34 5. Tabel Asal Isolat ................................................................................... 37 6. Nilai Keanekaragaman dan Dominansi .................................................. 38 iv I. PENDAHULUAN Selaras dengan program peningkatan produksi perikanan, KKP telah menetapkan target produksi perikanan sebesar 22,54 juta ton pada tahun 2014. Dari jumlah tersebut, sebanyak 16,89 juta ton berasal dari perikanan budidaya, yang salah satu komoditas unggulannya adalah udang. Komoditas udang diproyeksikan mengalami peningkatan produksi setiap tahun sebesar 13 persen untuk udang windu Penaeus monodon dan 16 persen untuk vaname Litopenaeus vannamei. Sementara produksi udang pada tahun 2014 ditargetkan adalah sebesar 699 ribu ton, yang terdiri atas 188 ribu ton udang windu dan 511 ribu ton udang vaname (KKP, 2010). Parameter indikator keberhasilan dalam budidaya intensif udang vaname yaitu tingginya nilai Average Daily Growth (ADG) atau pertumbuhan rata-rata harian (gram/hari) dan nilai Feed Convertion Ratio (FCR) yang rendah sehingga memperoleh keuntungan yang tinggi (Shahab, 2006). Keberhasilan dalam budidaya udang vaname didukung oleh kelebihan yang dimiliki udang vaname. Kelebihan jenis udang vaname adalah resisten terhadap penyakit dan toleran terhadap kualitas lingkungan yang rendah, antara lain toleran terhadap perubahan suhu air yaitu antara 23-30 ºC dan kandungan oksigen terlarut nilainya lebih dari 5 mg/l (Boyd, 1991). Selain itu, kelebihan udang vaname adalah mampu memanfaatkan seluruh kolom air dengan padat tebar yang cukup tinggi yaitu sekitar 100 – 300 ekor/m2 (Shahab, 2006). Dengan mempertimbangkan kelebihan udang vaname tersebut maka perlu dilakukan eksplorasi dan karakterisasi untuk mengetahui berbagai macam mikroflora normal yang berada pada usus udang tersebut, karena keseimbangan mikroflora yang normal merupakan salah satu faktor yang sangat menentukan status kesehatan udang. Selain itu, perlu dilakukan karakterisasi keberagaman bakterinya yang diduga memiliki potensi sebagai kandidat probiotik khususnya untuk udang, dan umumnya untuk organisme budidaya air payau atau laut lainnya. Aplikasi teknik molekuler untuk menganalisis keragaman mikroba, seperti analisis gen 16S-rRNA dengan Polymerase Chain Reaction (PCR) mampu menampilkan keragaman genetika mikroba, baik yang dapat dikulturkan maupun tidak. Gen 16S-rRNA merupakan pilihan karena gen ini terdapat pada semua prokariota dan memiliki bagian atau sekuen konservatif dan sekuen lainnya yang sangat bervariasi (Madigan et al. 1997). Penggunaan gen 16S rRNA telah digunakan sebagai parameter sistematik molekular yang universal, representatif, dan praktis untuk mengkonstruksi kekerabatan filogenetik pada tingkat spesies (Woese et al. 1990 dalam Khaeruni 2005). Analisis keragaman genetika yang cepat dan sederhana, untuk menelaah profil DNA gen 16S-rRNA hasil amplifikasi dengan PCR dapat dilakukan dengan teknik amplified ribosomal DNA restriction analysis (ARDRA). Analisis ini dilakukan dengan cara mengamplifikasi gen 16SrRNA dengan primer yang disesuaikan dengan sampel DNA yang akan diamplifikasi (Bornerman et al. 1996). Marchesi et al. (1998) dan Lane (1991) telah mendesain primer untuk amplifikasi gen 16S-rRNA yang memungkinkan untuk melakukan studi keragaman bakteri secara genetik. Hasil amplifikasi gen 16S-rRNA ini kemudian dipotong dengan enzim restriksi. Pola hasil pemotongan dengan enzim restriksi ini dapat digunakan untuk memperkirakan keragaman jenis bakterinya. Metode ini didasarkan pada prinsip pemotongan enzim restriksi yang spesifik pada bagian tertentu dari gen 16SrRNA sehingga dapat menunjukkan pohon filogenetika yang berbeda untuk setiap jenis prokariota (Deya et al. 1995). Sifat metabolisme bakteri dalam fisiologis dan uji biokimia biasanya dilihat dari interaksi metabolit-metabolit yang dihasilkan dengan reagen-reagen kimia. Selain itu dilihat kemampuannya menggunakan senyawa tertentu sebagai sumber karbon dan sumber energi (Waluyo, 2004). Penelitian ini bertujuan untuk menganalisis keragaman genetik gen 16SrRNA dengan menggunakan teknik ARDRA dan mengkarakterisasi fisiologis mikroflora yang berasal dari usus udang pada umur 1 bulan, 2 bulan, dan 3 bulan. Hasil penelitian ini selanjutnya dapat dijadikan dasar bagi pemilihan bakteri probiotik. I. BAHAN DAN METODE 2.1 Isolasi Bakteri Isolasi bakteri merupakan proses memisahkan koloni-koloni bakteri yang secara morfologi terlihat mendominasi maupun yang unik (segi warna, morfologi, dan ukuran) dari media pemeliharaan. Udang sampel diambil dari tambak udang PT. Pinang Gading Lampung. Udang sampel ini berasal dari berbagai umur yang berbeda yaitu berumur 1 bulan, 2 bulan, dan 3 bulan. Ketiga umur tersebut masing-masing berjumlah 3 ekor dan diambil dari petak tambak yang berbeda. Pengisolasian pertama kali dilakukan dengan pembedahan sampel usus udang vanname Litopenaeus vannamei. Bagian abdomen udang dibedah dan diambil ususnya, usus tersebut dicacah atau dihaluskan dengan menambahkan sedikit akuades. Usus yang telah dihaluskan dilakukan pengenceran dari 10-1, sampai 10-4 dengan larutan Phosphate-Buffered Saline (PBS) (Lampiran 1). Hasil dari pengenceran masing-masing disebar pada media Sea Water Complete (SWC) yang berada dalam cawan petri. Setelah itu diinkubasi selama 24 jam. Koloni bakteri yang secara morfologi terlihat mendominasi maupun yang unik diisolasi untuk diamati keragaman genetik bakterinya. Koloni-koloni yang tampak unik dalam pigmentasi dan morfologinya secara visual juga diambil, kemudian dimurnikan dengan metode kuadran hingga didapatkan koloni bakteri tunggal. Setelah itu koloni bakteri tunggal tersebut diidentifikasi dengan pewarnaan Gram. Adapun metode dan bahan pewarnaan Gram dapat dilihat pada lampiran 2. 2.2 Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis (ARDRA) 2.2.1 Ekstraksi DNA Genom Bakteri Pengekstraksian DNA dilakukan dengan menggunakan larutan cetyltrimetyl ammonium bromide (CTAB) (modifikasi Murray and Thompson 1980). Isolat bakteri yang telah murni, masing-masing ditumbuhkan dalam media SWC (Sea Water Complete) cair. Bakteri ditumbuhkan selama 18-24 jam pada suhu 28oC dalam shaker dengan kecepatan 140-160 rpm. Kemudian bakteri dipanen sebanyak 5 ml dan dimasukkan ke dalam eppendorf, disentrifugasi dengan kecepatan 12000 rpm selama 1 menit dan supernatannya dibuang. Pelet yang telah mengendap dalam eppendorf dikeringkan dengan membalikkan di atas tisue. Ke dalam tabung yang berisi pelet bakteri ditambahkan 500 µl 1x TE buffer, kemudian diresuspensi dan sentrifugasi dengan kecepatan 12000 rpm selama 5 menit. Supernatan dibuang dan pelet sel diresuspensikan kembali dengan 1x TE buffer sebanyak 500 µl. Kedalam tabung yang berisi pelet juga ditambahkan 100 µl lysozym (50 mg/µl) dan diinkubasi pada suhu 37oC selama 1 jam (setiap 15 menit dibolak-balik). Setelah itu ditambahkan 100 µl SDS 10% dan 10 µl KProteinase diinkubasi lagi pada suhu 37 oC selama 1 jam. Kemudian dimasukkan 100 µl NaCl 5M dan100 µl CTAB, dihomogenkan dan diinkubasi pada suhu 65 oC selama 20 menit. Selanjutnya ke dalam campuran ditambahkan 500 µl phenol:chloroform:isoamyl alkohol (25:24:1), divortex selama 30 detik, kemudian disentrifugasi pada kecepatan 10.000 rpm selama 5 menit. Supernatan diambil dan dipindahkan ke dalam Eppendorf steril yang telah berisi 600 µl isopropanol/ethanol absolut dingin (-20oC) dan dibolak-balik hingga timbul benang-benang DNA. DNA dalam bentuk pelet dicuci dengan 1 ml ethanol 70% dingin dan dikeringudarakan selama 4-24 jam untuk menguapkan ethanol yang masih tersisa. Langkah terakhir dalam ekstraksi DNA adalah penambahan elution buffer sebanyak 20 – 30 µl dan selanjutnya DNA disimpan pada suhu -20oC untuk keperluan selanjutnya. 2.2.2 Amplifikasi Gen 16S-rRNA Sampel DNA sebanyak 0,5 µl dimasukkan ke dalam tabung PCR yang berisi reagen-reagen PCR yang dicampur. Reagen PCR yang dicampur ini antara lain 17,5 µl ddH2O, 2,5 µl dNTP 2,5 mM, 2,5 µl Buffer Taq, 0,2 µl enzim DNA Taq Polimerase, 1 µl primer. Secara umum sampel DNA bakteri pada penelitian ini menggunakan primer 0008F (5’ AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG 3’) 1.5 µM yang berpasangan dengan primer 1524R (5’ AAG GAG GTG ATC CAR CCG 3’). Sampel DNA referens menggunakan primer 0008F (5’ AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG 3’) 1,5 µM yang berpasangan dengan primer 1492RH (5’ GHT ACC TTG TTA CGA CTT 3’) 1,5 µM (Lane, 1991). Sampel DNA bakteri yang tidak dapat teramplifikasi dengan primer 0008F yang berpasangan dengan 1524R, alternatifnya digunakan primer 63F (5’ CAG GCC TAA CAC ATG CAA GTC 3’) 5 pmol berpasangan dengan 1387R (5’ GGG CGG WGT GTA CAA GGC 3’) 5 pmol (Marchesi et al. 1998). PCR dilakukan menggunakan PCR GeneAmp®PCR System 2400, Perkin Elmer, USA (Lampiran 3). Primer 0008F dan 1524R di PCR dengan kondisi: Pre start 94oC 2 menit; denaturasi 92oC 2 menit, annealing primer 58oC 30 detik, extention 72oC 1 menit 20 detik yang dilakukan sebanyak 25 siklus; post PCR 72oC 10 menit. Primer 63F dan 1387R di PCR dengan kondisi Pre start 94oC 2 menit, denaturasi 92oC 2 menit, annealing primer 55oC 30 detik, extention 75 oC 1 menit, yang dilakukan sebanyak 30 siklus; post PCR 72oC 20 menit. Primer 0008f dan 1492rh diPCR dengan kondisi Pre start 94oC 2 menit; denaturasi 94 oC 15 detik, annealing primer 50oC 30 detik, extention 72oC 1 menit 30 detik, ekstra extention 72 oC 10 menit, yang dilakukan sebanyak 30 siklus; post PCR 10oC 10 menit. Setelah itu, suhu diturunkan dan diakhiri pada 4oC. 2.2.3 Digesti dengan Enzim Restriksi Sau3AI Hasil amplifikasi gen 16S-rRNA dari masing-masing sampel dipotong dengan menggunakan enzim restriksi Sau3AI (5’-↓GATC) (EU, PureExtreme™ Fermentas). Setiap reaksi pemotongan terdiri atas 6 µl hasil PCR (gen 16SrRNA), 1,5 µl buffer enzim restriksi 10X, 0,15 µl enzim restriksi [10 unit/ µl], dan 7,5 µl ddH2O. Selanjutnya setiap tabung yang berisi reaksi di atas, diinkubasi pada suhu 37oC selama 16 jam. Hasil pemotongan kemudian dielektroforesis dengan kondisi 150 V 80 mA, sampai ± 45 menit. Setelah proses elektroforesis selesai, gel diamati di atas lampu UV transiluminator dan didokumentasi untuk melihat pola ARDRA. Pola ARDRA ini dijadikan data biner sebagai input untuk konstruksi pohon filogenetika. 2.2.4 Elektroforesis Gel agarose dibuat dengan melarutkan serbuk gel agarose sebanyak 1,9% dalam 30 ml larutan Tris boric EDTA (TBE) yang mengandung ethidium bromida (0,01 g/ml). Kemudian dipanaskan dalam microwave sampai larutan menjadi berwarna bening. Larutan tersebut didiamkan sampai hangat lalu dituangkan ke dalam cetakan yang sudah terpasang sisir pembuat sumur. Kemudian gel dibiarkan sampai membeku. Setelah itu, sisir dilepaskan dan padatan gel dimasukkan ke dalam bak elektroforesis yang berisi buffer TBE. Sampel produk PCR sebanyak 5 µl dicampurkan dengan 0,5-1 µl loading dye, lalu dimasukkan ke dalam sumur yang terdapat dalam gel dengan menggunakan mikropipet. Setelah itu, 2 µl marker DNA dimasukkan ke dalam sumur di dekat sumur sampel. Bak elektroforesis ditutup dan listrik dialirkan dengan tegangan 150 volt dan kuat arus 80 mA. DNA akan bermigrasi dari kutub negatif ke positif. Setelah pewarna bromophenol blue bermigrasi sampai tiga per empat bagian dari panjang gel (± 45 menit), aliran listrik dihentikan. Lalu gel diangkat dan dilepaskan dari cetakannya. Kemudian keberadaan DNA dilihat dengan bantuan ultraviolet transluminator. Dokumentasi dilakukan dengan menggunakan kamera digital yang sudah terhubung dengan komputer. 2.2.5 Konstruksi Pohon Filogenetika dari Pola ARDRA Data biner hasil pemotongan dengan enzim restriksi Sau3AI dimasukkan sebagai input program Treecon software copyright (c) Yves Van de Peer (Belgia) untuk konstruksi pohon filogenetika. 2.2.6 Analisis Keragaman dan Dominansi Analisis keragaman dan dominansi ini digunakan untuk menghitung indeks keragaman dan dominansi suatu spesies di dalam populasi. Penelitian ini menggunakan populasi bakteri usus udang umur 1 bulan, 2 bulan, 3 bulan, dan penggabungan ketiga umur tersebut. Hasil konstruksi pohon filogenetika dianalisis lagi indeks keragaman dan dominansinya, dengan indeks keragaman dan indeks dominansi menurut Krebs (1972) yang dirumuskan sebagai berikut. a. Indeks Keanekaragaman Dimana: H’ = Indeks keanekaragaman S = Jumlah jenis (spesies) Pi = Ni/N = Sebagai proporsi jenis ke-i Ni = Jumlah total individu jenis i N = Jumlah seluruh individu dalam total n Kriteria yang digunakan untuk menginterpretasikan keanekaragaman yaitu: H’ < 1, keanekaragaman rendah 1 – 3, keanekaragaman sedang >3, keanekaragaman tinggi b. Indeks Dominansi Dimana: C = Indeks dominansi S = Jumlah jenis (spesies) Pi = Ni/N = Sebagai proporsi jenis ke-i Ni = Jumlah total individu jenis i N = Jumlah seluruh individu dalam total n Kriteria yang digunakan untuk menginterpretasikan dominansi yaitu: Mendekati 0 : indeks semakin rendah atau dominansi oleh satu spesies individu Mendekati 1 : indeks besar atau cenderung dominansi oleh beberapa spesies individu. 2.3 Karakterisasi Fisiologis dari Isolat Hasil dari pola ARDRA yang berbeda yaitu didapatkan 31 pola ARDRA dari 45 sampel dengan 2 sampel referens. Perwakilan dari sampel dengan pola ARDRA yang berbeda dilakukan uji biokimia yang meliputi (1) uji motilitas dengan menggunakan media Sulfide Indol Motile (SIM), (2) uji katalase dengan menggunakan Hidrogen Peroksida (H2O2) 3%, (3) uji sitokrom oksidase dengan menggunakan p-aminodimethylaniline-oxalat 1%, (4) uji oksidatif/fermentatif menggunakan media oksidatif fermentatif, glukosa dan parafin cair (Lampiran 4) untuk mengkarakterisasi fisiologis bakteri tersebut. I. HASIL DAN PEMBAHASAN 3.1. Hasil Pada saat pemeliharaan di tambak udang diberi probiotik bakteri Bacillus sp dengan dosis yang sama banyaknya di setiap umur. Kondisi suhu, DO, salinitas, dan pH juga relatif sama, sedangkan pembeda antara udang umur 1 bulan, 2 bulan, dan 3 bulan adalah tempat keberadaannya atau berbeda petak tambaknya. Bakteri yang tumbuh dominan dan unik dibandingkan dengan koloni bakteri yang lain pada pengenceran tertinggi yaitu 104 diisolasi dari media Sea Water Complete (SWC). Total jumlah koloni bakteri yang berada pada usus udang yaitu 45 isolat dan 2 isolat bakteri Vibrio harveyi sebagai bakteri referens untuk data biner pohon filogenetika. Pada usus udang umur 1 bulan didapatkan koloni bakteri sebanyak 15 isolat, yaitu 4 koloni pada usus udang pertama, 5 koloni pada usus udang kedua, dan 6 koloni pada usus udang ketiga. Pada usus udang umur 2 bulan didapatkan koloni bakteri sebanyak 13 isolat, yaitu 5 koloni pada usus udang pertama, 4 koloni pada usus udang kedua, dan 4 koloni pada usus udang ketiga. Pada usus udang umur 3 bulan didapatkan koloni bakteri sebanyak 17 isolat, yaitu 8 koloni pada usus udang pertama, 4 koloni pada usus udang kedua, dan 5 koloni pada usus udang yang ketiga. Ditambahkan 2 isolat bakteri Vibrio harveyi sebagai referens ke-45 isolat tersebut, jadi total semua bakteri berjumlah 47 isolat. Untuk lebih jelasnya dapat dilihat pada Tabel 1 berikut. Tabel 1. Pemilihan Koloni Bakteri Unik dari Usus Udang Ulangan 1 2 3 ∑ Umur Udang (Bulan) 1 2 3 4 5 8 5 4 4 6 4 5 15 13 17 Jumlah keragaman koloni bakteri pada umur 2 bulan paling rendah dibandingkan dengan jumlah keragaman koloni bakteri 1 bulan dan 3 bulan. Jumlah keragaman koloni bakteri pada umur 1 bulan diantara umur 2 bulan dan 3 bulan. Sedangkan jumlah keragaman koloni bakteri pada udang umur 3 bulan paling tinggi dibandingkan dengan umur 1 bulan dan 2 bulan. Dilakukan ekstraksi DNA bakteri sebanyak 47 koloni, kemudian gen 16SrRNAnya diamplifikasi dengan PCR, fragmen DNA gen 16S-rRNA yang didapatkan berkisar 1400-1500 bp seperti yang terlihat pada Gambar 1. M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1a. PCR amplifikasi gen 16S-rRNA isolat bakteri pada usus udang umur 1 bulan. M 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 14 1b. PCR amplifikasi gen 16S-rRNA isolat bakteri pada usus udang umur 2 bulan. M 29 30 31 32 33 34 35 43 37 38 39 40 41 42 36 44 1c. PCR amplifikasi gen 16S-rRNA isolat bakteri pada usus udang umur 3 bulan. M 45 46 47 1d. PCR amplifikasi gen 16S-rRNA isolat bakteri referens. Gambar 1. PCR Amplifikasi Gen 16S-rRNA 47 Isolat Bakteri pada Usus Udang dari Udang Umur 1 Bulan, 2 Bulan, dan 3 Bulan. M: Standar Ukuran Molekul (Gene RulerTM DNA Ladder Lambda DNA/EcoRI+HindIII, Fermentas); 1-47: Urutan Nomor Isolat Bakteri (Lampiran 5). Hasil yang didapat setelah semua koloni bakteri berhasil diamplifikasi kemudian dipotong dengan enzim restriksi Sau3AI didapatkan 31 pola ARDRA, yaitu pola a, b, c, d, e, f, g, h, i, j, k, l, m, n, o, p, q, r, s, t, u, v, w, x, y, z, aa, bb, cc, dd, ee seperti yang terlihat pada Gambar 2. M 1 2 a 3 b 4 b 5 c 6 a 7 a 8 a 9 a 10 d 11 e 12 b 13 f 14 15 h i g 2a. Elektroforegraf gel agarosa hasil pemotongan gen 16S-rRNA isolat koloni bakteri pada usus udang umur 1 bulan. M 14 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 j k l m n o o p o q r s r 15 2b. Elektroforegraf gel agarosa hasil pemotongan gen 16S-rRNA isolat koloni bakteri pada usus udang umur 2 bulan. M 28 29 30 14 15 31 32 33 34 35 36 37 38 t v t u u w x y z u 39 aa 40 bb 41 cc 42 v 43 44 o bb 2c. Elektroforegraf gel agarosa hasil pemotongan gen 16S-rRNA isolat koloni bakteri pada usus udang umur 3 bulan. M 2d. 45 46 47 dd ee ee Elektroforegraf gel agarosa hasil pemotongan gen 16S-rRNA isolat koloni bakteri referens. M 2e. 2 14 15 16 b h i j 17 k 22 o 23 p 24 o 26 r 27 s 28 r 43 o 46 ee 47 ee Elektroforegraf gel agarosa hasil pemotongan gen 16S-rRNA isolat koloni bakteri campuran. Gambar 2. Elektroforegraf Gel Agarosa Hasil Pemotongan Gen 16S-rRNA dengan Enzim Restriksi Sau3AI untuk 47 Isolat Bakteri dari Usus Udang. M: Standar Ukuran Molekul (Gene RulerTM DNA Ladder 100 bp, Fermentas); 1-47: Urutan Nomor Isolat Bakteri; a-ee: Pola ARDRA. (Lampiran 5). Intepretasi hasil pemotongan pola ARDRA dapat dilihat pada Gambar 3 berikut. M 1 2 a 3 b 4 b 5 c 6 a 7 a 8 a 9 a 10 d 11 e 12 b 13 f 14 g 15 h i 3a. Intepretasi hasil pemotongan gen 16S-rRNA isolat koloni bakteri pada usus udang umur 1 bulan. M 3b. 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 j k l m n o o p o q r 27 s 28 r Intepretasi hasil pemotongan gen 16S-rRNA isolat koloni bakteri pada usus udang umur 2 bulan. M 29 30 t 3c. u 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 v u w y t u x z 41 42 aa bb cc v 43 44 o 45 46 47 bb dd ee ee Intepretasi hasil pemotongan gen 16S-rRNA isolat koloni bakteri pada usus udang umur 3 bulan dan bakteri V. harveyi sebagai referens. Gambar 3. Intepretasi Hasil Pemotongan Gen 16S-rRNA dengan Enzim Restriksi Sau3AI untuk 47 Isolat Bakteri dari Usus Udang. M: Standar Ukuran Molekul; 1-47: Urutan Nomor Isolat Bakteri; a-ee: Pola ARDRA. (Lampiran 5). Hasil pemotongan dengan ARDRA dijadikan data biner sebagai input data dalam software pohon filogenetika untuk dilihat tingkat perbedaan dan kekerabatannya. Untuk melihat nilai keragaman dan dominansinya digunakan indeks keragaman dan indeks dominansi. Berdasarkan hasil perhitungan indeks keanekaragaman dan indeks dominansi (Lampiran 6) dapat ditunjukkan pada tabel 2 berikut. Tabel 2. Nilai Indeks Keanekaragaman dan Indeks Dominansi Indeks Umur 1 bulan Umur 2 bulan Umur 3 bulan H' 2,9 3,2 3,3 C 0,18 0,13 0,10 Keterangan: H’ = Indeks Keanekaragaman C = Indeks Dominansi Gabungan 4,6 0,04 Hasil yang didapat dari analisis pohon filogenetika yang berbeda digunakan untuk pemilihan koloni, setiap koloni yang berbeda dilakukan uji biokimia, hasil dari karakterisasi fisiologis dapat ditunjukkan pada Tabel 3 berikut. Tabel 3. Hasil Karakterisasi Morfologi, Fisiologi dan Biokimia Bakteri Usus Udang yang Memiliki Pola ARDRA Unik. Kode isolat dengan pola ARDRA unik 26 28 47 18 27 17 45 41 38 36 10 2 37 16 23 31 42 40 44 35 29 30 25 20 19 21 22 24 43 39 4 14 12 15 13 9 5 Filotipe 1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 15 16 16 17 18 19 20 21 22 23 23 23 23 24 25 26 27 28 29 30 31 Pewarnaan Gram Uji O/F Uji Gelatinase Uji Oxydase Uji Katalase Uji Motilitas Gram Bentuk Fermentatif Fermentatif Oksidatif Fermentatif Oksidatif Oksidatif Fermentatif Fermentatif Fermentatif Fermentatif Fermentatif Fermentatif Oksidatif - + + + + - + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + Batang Batang Batang Coccus Batang Coccus Coccus Coccus Batang Batang Coccus Coccus Batang Batang Coccus Batang Batang Coccus Batang Coccus Batang Batang Batang Coccus Coccus Coccus Batang Batang Coccus Coccus Batang Batang Batang Batang Batang Batang Batang 3.2 Pembahasan Pada penelitian kali ini dilakukan eksplorasi keragaman bakteri di dalam usus udang umur 1 bulan, 2 bulan, dan 3 bulan. Jumlah bakteri terbanyak biasanya berada di dalam usus, baik itu bakteri patogen maupun yang non-patogen. Bakteri yang non patogen inilah yang memiliki potensi untuk meningkatkan produksi dan mempertahankan SR (Survival Rate) pada udang vaname. Menurut Diogenes (2006) usus udang terletak pada abdomen yang berada di sepanjang bagian dorsal tubuh. Usus merupakan salah satu organ pencernaan yang vital dan selalu terdapat bakteri. Usus Gambar 4. Bagian dari Anatomi Tubuh Udang (Usus) yang Diteliti (Yudha, 2005) Fungsi kolon pada usus udang antara lain: menyerap air selama proses pencernaan, tempat dihasilkannya vitamin K, dan vitamin H (Biotin) sebagai hasil simbiosis dengan bakteri usus, misalnya E.coli pada manusia atau bisa dikatakan menciptakan lingkungan yang sesuai untuk mikroba usus, membentuk massa feses, mendorong sisa makanan hasil pencernaan (feses) keluar dari tubuh (Wasetiawan, 2009). Saluran pencernaan semua hewan dapat dianggap sebagai tabung dari mulut sampai ke anus dan fungsinya adalah mencerna, mengabsorbsi, dan mengeluarkan sisa makanan yang tidak tercerna (Abun, 2008). Gambar 5. Bagian Sistem Pencernaan pada Udang (Abun, 2008) Keterangan: a.Oesophagus b.Ruang cardiac c.Ruang pyloric d.Cardiac plate Proventriculus(perut) e.Gigi-gigicardiac f.Cardiac ossicle g.Hepatopancreas h.Usus i.anus Pada penelitian ini dilakukan pengamatan tentang pola keragaman dan dominansi genetik bakteri yang berada pada usus udang tersebut. Bakteri pada usus udang umur 1 bulan, 2 bulan, dan 3 bulan relatif beragam baik jenis bakterinya yang dilihat dari segi genetiknya maupun dari segi fisiologisnya. Faktor yang menjadi pemicu keberagaman jenis bakteri pada usus tersebut diduga karena sumber makanannya, akibat dipelihara pada petak tambak yang berbeda dan adanya keberadaan bakteri probiotik. Rao et al., (1998), menjelaskan bahwa probiotik merupakan mikroba hidup yang a-patogen, yang mekanisme kerjanya mendesak mikroba non-indigenous keluar dari ekosistem saluran pencernaan, dan menggantikan lokasi mikroba patogen di dalam saluran pencernaan. Karena probiotik berasal dari mikroba indigenous, maka proses translokasi yang terjadi berjalan secara alamiah di dalam ekosistem usus. Keasaman bagian-bagian alat pencernaan mempunyai efek terhadap kehidupan mikroba pencernaan yang erat sekali hubungannya dengan produk enzim pencernaan maupun enzim produk mikroorganisme dari usus. Komponen ion H+ dapat bersifat membunuh bakteri patogen ditambah dengan suasana pH yang rendah (Abun, 2008). Salah satu pemicu tingkat keasaman pada bagian alatalat pencernaan adalah stres yang dialami udang. Keberagaman jenis koloni bakteri yang berada pada usus udang dilihat dari warna koloni, tepian koloni, serta bentuk koloni. Menurut, Abun, 2008, faktor-faktor yang mempengaruhi kolorisasi mikroorganisme antara lain: faktor yang berhubungan dengan inangnya (suhu tubuh, pH, dan tingkat potensi-oksidasi reduksi, asam lambung, enzim, dan antibodi, faktor yang berhubungan dengan interaksi mikroba (efek antagonistik, bakteriofag, bakteriosin), makanan dan faktor lingkungan (seperti manosa, laktosa, dan karbohidrat lainnya dan atau serat makanan serta faktor stres lingkungan). Tabel 4 berikut merupakan gambaran umum kondisi kualitas air ketika pemeliharaan udang vaname. Tabel 4. Kondisi Kualitas Air Pemeliharaan Parameter Satuan Nilai* Nilai optimal** Suhu ºc 29-31 27-32 DO mg/l 3-8 ≥5 Salinitas º/oo 28-32 28-35 - 6,8-7,8 6-9 pH Sumber:*) Tambak Udang PT. Pinang Gading Lampung **) Boyd, 1991 PCR merupakan suatu reaksi in vitro untuk menggandakan jumlah molekul DNA target tertentu dengan cara mensintesis molekul DNA baru yang berkomplemen dengan molekul DNA target tersebut dengan bantuan enzim dan oligonukleotida sebagai primer dalam suatu thermocycler (Muladno, 2002). Amplifikasi DNA secara in vitro dengan PCR terdiri atas beberapa siklus, yang setiap siklusnya terdiri dari 3 tahap, yaitu tahap denaturasi, pelekatan (annealing) dan pemanjangan (elongation). Tahap denaturasi adalah pembentukan DNA utas tunggal dari DNA utas ganda (putusnya ikatan hidrogen dari kedua utas tunggal DNA yang berkomplementer) yang umumnya terjadi pada suhu ≥ 95oC. Tahapan annealing yaitu pelekatan primer yang terjadi pada suhu sekitar 35-65oC, bergantung pada panjang pendeknya oligonukleotida primer yang digunakan. Tahapan pemanjangan primer terjadi sebagai hasil aktivitas polimerisasi oleh enzim Taq DNA polymerase, yang pada umumnya dilakukan pada suhu 70 oC (Madigan et al., 1977). Sebanyak 45 isolat bakteri didapatkan dari pengenceran paling tinggi, dan 2 isolat bakteri Vibrio harveyi sebagai referens ke-45 isolat tersebut, ke-47 isolat bakteri tersebut gen 16S-rRNAnya diamplifikasi dengan PCR. Hasil amplifikasi kemudian dilanjutkan dengan pemotongan DNA, dengan enzim restriksi atau teknik ARDRA (Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis). Hasil pemotongan 47 sampel dengan enzim restriksi Sau3AI ada yang menunjukkan pola ARDRA yang dominan dan mendapatkan 31 pola ARDRA yang beragam. Adapun pola ARDRA yang dominan pada udang umur 1 bulan, pola pemotongannya a dengan kode sampel 1, 5, 6, 7, 8. Pada udang umur 2 bulan memiliki pola ARDRA yang dominan pada pola pemotongan o dengan kode sampel 21, 22, 24, sedangkan pada udang umur 3 bulan yang memiliki pola ARDRA yang dominan pada pola pemotongan u dengan kode sampel 30, 33, 34. Pola ARDRA yang dominan ini menunjukkan bahwa pada setiap umur udang memiliki bakteri yang mendominasi usus udang pada kisaran umur tersebut. Pola ARDRA yang sama juga menunjukkan bahwa bakteri tersebut memiliki hubungan kekerabatan yang dekat atau sejenis. Selain setiap usus udang yang berbeda umur memiliki karakter yang mendominasi, ada juga bakteri yang sejenis atau memiliki hubungan kekerabatan yang dekat tetapi terdapat pada usus yang berbeda sampel udang dan yang berbeda umur. Hasil penelitian ini juga menunjukkan bahwa pola ARDRA pada pola pemotongan o dengan kode sampel 43 adalah isolat bakteri yang terdapat pada usus udang umur 3 bulan, sedangkan pola pemotongan o juga merupakan dominasi dari isolat usus udang umur 2 bulan. Pada usus udang dengan umur yang sama, juga terdapat persamaan isolat bakteri antara udang satu dengan kedua udang yang lain. Pada pola pemotongan a dengan kode sampel 1 merupakan salah satu isolat bakteri yang terdapat pada usus udang pertama umur 1 bulan, sedangkan kode sampel 5, 6, 7, 8 merupakan isolat bakteri dari udang kedua umur 1 bulan. Begitu juga pada pola pemotongan b, v, dan bb. Dimana pada pola b dengan kode sampel 11 merupakan salah satu isolat bakteri pada udang ketiga umur 1 bulan, dan kode sampel 2, 3 merupakan isolat bakteri pada udang pertama umur 1 bulan. Pada pola pemotongan v dengan kode sampel 31 merupakan salah satu isolat bakteri pada udang pertama umur 3 bulan, sedangkan kode sampel 42 merupakan salah satu isolat bakteri pada udang ketiga umur 3 bulan. Pola pemotongan bb dengan kode sampel 40 dengan 44, dimana kode sampel 40 merupakan salah satu isolat bakteri pada udang kedua umur 3 bulan, sedangkan kode sampel 44 merupakan salah satu isolat bakteri pada udang ketiga umur 3 bulan. Daerah yang dipotong oleh enzim tersebut adalah sama karena enzim restriksi memiliki urutan nukleotida yang dikenali secara spesifik. Menurut, Yuwono (2005), bahwa enzim endonuklease restriksi dapat dibedakan atas urutan nukleotida yang dikenali yaitu dapat berupa urutan empat, lima, atau enam basa yang spesifik. Daerah yang dipotong enzim tersebut bersifat spesifik dan terletak pada bagian yang sama. Hubungan kekerabatan antar isolat bakteri beserta galur referens berdasarkan hasil pemotongan dengan enzin restriksi Sau3AI dapat dilihat pada Gambar 6 berikut ini. Gambar 6a. Pohon filogenetika pengelompokan isolat bakteri asal usus udang umur 1 bulan berdasarkan pola ARDRA. Gambar 6b. Pohon filogenetika pengelompokan isolat bakteri asal usus udang umur 2 bulan berdasarkan pola ARDRA. Gambar 6c. Pohon filogenetika pengelompokan isolat bakteri asal usus udang umur 3 bulan berdasarkan pola ARDRA. Gambar 6d. Pohon filogenetika umur 1 bulan, 2 bulan, dan 3 bulan berdasarkan pola ARDRA. Gambar 6. Pohon Filogenetika 31 Filotipe Bakteri dari Usus Udang Umur 1 Bulan, 2 Bulan, dan 3 Bulan dengan Menggunakan Enzim Restriksi Sau3AI. 0,1 : 10% Profile Difference, Angka 3 - 100 : Tingkat Keakuratan dari Percabangan Pohon Filogenetika. Pada pohon filogenetika udang umur 1 bulan terdapat 9 felotipe dari 15 sampel, dari ke-9 filotipe yang berbeda tersebut terdapat 2 filotipe yang isolat bakterinya berasal dari 2 udang yang berbeda tetapi masih dalam satu umur yaitu umur 1 bulan, dengan kode sampel 1, 5, 6, 7, 8 dengan 2, 3, 11. Pada pohon filogenetika umur satu bulan ini didominasi oleh filotipe 9 dengan kode sampel 1, 5, 6, 7, 8. Berdasarkan keanekaragaman dan dominansi yang dikemukakan oleh Kreb (1972) (Lampiran 6). Didapatkan pada bakteri usus udang umur 1 bulan ini tingkat keanekaragamannya bernilai sedang yaitu berkisar 1-3 dengan nilai H’= 2,9. Nilai dominansi bakteri usus udang umur 1 bulan ini rendah yaitu mendekati 0 dengan nilai C= 0,18 , sehingga cenderung beragam. Pada pohon filogenetika udang umur 2 bulan terdapat 10 filotipe dari 13 sampel, dan didominasi oleh filotipe pertama dengan kode sampel 22, 21, 24. Pada bakteri usus udang umur 2 bulan ini indeks keanekaragamannya cenderung tinggi yaitu bernilai >3 dengan nilai H’= 3,2 , nilai dominansinya juga mendekati 0 tetapi nilainya lebih rendah daripada bakteri usus udang pada umur 1 bulan dengan nilai C= 0,13. Berarti bakteri usus udang umur 2 bulan cenderung lebih beragam dari pada bakteri usus udang umur 1 bulan. Pada pohon filogenetika udang umur 3 bulan terdapat 12 filotipe dari 17 sampel. Di pohon filogenetika udang umur 3 bulan ini juga terdapat 2 filotipe dari 12 filotipe yang berbeda dimana isolat bakterinya berasal dari 2 udang yang berbeda tetapi masih dalam satu umur yaitu umur 3 bulan, diantaranya adalah filotipe 1 dan 3 dengan kode sampel 42, 31 dengan 44, 40. Dominasi bakteri udang umur 3 bulan terdapat pada filotipe 11 dengan kode sampel 34, 33, 30. Berdasarkan nilai indeks keanekaragaman, bakteri usus udang umur 3 bulan ini keanekaragamannya bernilai tinggi, yaitu >3, tetapi lebih tinggi daripada keanekaragaman usus udang umur 2 bulan dengan nilai H’= 3,3 , sedangkan nilai dominansinya rendah yaitu mendekati 0. Bakteri usus udang umur 3 bulan ini nilai dominansinya paling rendah diantara bakteri yang berasal dari 2 umur yang berbeda yaitu umur 1 bulan dan 2 bulan dengan nilai C= 0,10. Pada pohon filogenetika penggabungan bakteri usus udang umur 1 bulan, 2 bulan, dan 3 bulan yang ditambahkan 2 sampel referens yang sudah diketahui spesiesnya, terlihat bahwa dari ke-47 sampel dapat dibedakan 31 filotipe (Gambar 6), berarti keragaman populasi bakteri yang terdapat pada usus udang vaname sedikitnya terdiri atas 31 jenis bakteri yang berbeda dari segi keragaman genetiknya. Dari ke-31 filotipe yang berbeda tersebut terdapat 1 filotipe yang menggambarkan keberadaan isolat bakteri berjenis sama atau dekat kekerabatannya tetapi berasal dari umur dan udang yang berbeda, ditunjukkan pada filotipe ke 23 dengan kode sampel 21, 22, 24, 43. Pada filotipe ini juga termasuk dalam dominasi isolat bakteri pada udang umur 2 bulan. Secara umum dominasi isolat bakteri dari udang umur 1 bulan, 2 bulan, dan 3 bulan terdapat pada filotipe ke-31, dimana kebanyakan berasal dari isolat bakteri udang umur 1 bulan. Berdasarkan nilai indeks keragamannya seluruh bakteri dari usus udang ( sebanyak 31 filotipe) ini memiliki nilai keanekaragaman yang tergolong tinggi, yaitu >3 yaitu dengan niali H’= 4,6 , sedangkan nilai dominansi dari keseluruhan bakteri usus udang ini tergolong mendekati 0 atau bernilai rendah dengan nilai C= 0,04. Bakteri usus udang umur 1 bulan berdasarkan hasil pengamatan fisiologinya didominasi dengan bakteri berbentuk batang dan termasuk Gram positif. Berdasarkan sifat fisiologi, morfologi, dan biokimianya bakteri ini termasuk dalam genus Bacillus (Tabel 5). Bakteri sejenis yang terdapat pada sampel udang berbeda tetapi masih dalam satu umur yaitu umur 1 bulan ada 2, yang pertama termasuk bakteri berbentuk coccus, Gram positif, dimana menurut hasil karakterisasi fisiologinya termasuk dalam genus Streptococcus. Bakteri yang kedua berbentuk batang termasuk Gram positif, hasil karakterisasinya termasuk dalam genus Bacillus. Tabel 5. Kelompok Filogeni Bakteri Asal Usus Udang Umur 1 Bulan Kelompok filotipe Keterangan Kode sampel Kelompok genus Filotipe 9 Filotipe 1 1, 5, 6, 7, 8 Bacillus 2, 3, 11 Streptococcus Bakteri dominan dan bakteri yang terdapat pada sampel udang 1 dan 2 Bakteri yang terdapat pada sampel udang 1 dan 3 Pada bakteri usus udang umur 2 bulan didominasi oleh bakteri yang berbentuk batang dan coccus dan bersifat Gram positif. Berdasarkan hasil identifikasinya termasuk bakteri bergenus Bacillus, Streptococcus, dan Listeria (Tabel 6). Bakteri yang mendominasi usus udang umur 3 bulan berbentuk batang termasuk dalam Gram positif, berdasarkan hasil identifikasinya termasuk genus Kurthia. Bakteri sejenis yang terdapat pada sampel udang yang berbeda pada udang umur 3 bulan ada 2. Bakteri yang pertama termasuk dalam bakteri berbentuk batang, Gram positif, hasil karakterisasi fisiologisnya termasuk genus Bacillus dan Kurthia. Bakteri yang kedua berbentuk coccus dan batang termasuk Gram positif, bedasarkan hasil identifikasinya termasuk genus Micrococcus dan Bacillus (Tabel 7). Tabel 6. Kelompok Filogeni Bakteri Asal Usus Udang Umur 2 Bulan Kelompok filotipe Filotipe 1 Kode sampel 22 21 24 Kelompok genus Bacillus Streptococcus Listeria Keterangan Bakteri dominan Tabel 7. Kelompok Filogeni Bakteri Asal Usus Udang Umur 3 Bulan Kelompok filotipe Filotipe 11 Filotipe 1 Filotipe 3 Kode sampel Kelompok genus Keterangan 34, 33, 30 42 Kurthia Bacillus Bakteri dominan 31 Kurthia Bakteri yang terdapat pada sampel udang 1 dan 3 44 40 Bacillus Micrococcus Bakteri yang terdapat pada sampel udang 2 dan 3 Bakteri sejenis yang berasal dari isolat, umur, dan udang yang berbeda, ditemukan dengan ciri-ciri bakteri yang berbentuk batang dan coccus bersifat Gram positif, hasil karakterisasi fisiologinya termasuk genus Staphylococcus, Bacillus, Streptococcus, dan Listeria. Bakteri yang mendominasi usus udang pada semua sampel udang adalah bakteri pada umur 1 bulan. Bakteri tersebut termasuk dalam genus Bacillus (Tabel 8). Tabel 8. Kelompok Filogeni Bakteri yang Terdapat pada Usus Udang Umur 1, 2, dan 3 Bulan Kelompok Kode sampel Kelompok genus Keterangan filotipe Bakteri paling dominan Filotipe 31 1, 5, 6, 7, 8 Bacillus 43 Staphylococcus Bakteri yang terdapat 22 Bacillus Filotipe 23 pada usus udang umur 2 21 Streptococcus bulan dan 3 bulan 24 Listeria Ilustrasi komponen bakteri yang ditemukan pada usus udang umur 1 bulan, 2 bulan, dan 3 bulan berdasarkan hasil uji fisiologi, morfologi, dan biokimianya dapat dilihat pada Gambar 7 berikut. Bakteri usus udang umur 1 bln Streptococcus Corynebacterium Bakteri usus udang umur 2 bln Listeria Bacillus Kurthia Micrococcus Staphylococcus Bakteri usus udang umur 3 bln Gambar 7. Ilustrasi Komponen Bakteri Usus Udang Umur 1 Bulan, 2 Bulan, dan 3 Bulan Berdasarkan Uji Fisiologi, Morfologi, dan Biokimia. Berdasarkan Gambar 7 terlihat bahwa pada bakteri usus udang umur 1 bulan dan 2 bulan berdasarkan karakterisasi fisiologisnya terdapat 3 bakteri yang bergenus sama yaitu genus Streptococcus, Bacillus, dan Kurthia. Sedangkan bakteri yang terdapat pada usus udang umur 2 bulan dan 3 bulan berdasarkan karakterisasi fisiologisnya terdapat 4 bakteri yang bergenus sama yaitu genus Micrococcus, Staphylococcus, Bacillus, dan Kurthia. Jika dilihat secara keseluruhan berdasarkan karakterisasi fisiologisnya bakteri yang terdapat pada usus udang umur 1 bulan, 2 bulan, dan 3 bulan memiliki bakteri yang bergenus sama, yaitu genus Bacillus dan Kurthia. Berdasarkan hasil yang telah diperoleh, pada beberapa kelompok bakteri ini diduga merupakan kelompok bakteri probiotik yang diberikan pada air pemeliharaan udang. Bakteri ini diberikan ke tambak bertujuan untuk menjaga kualitas air pemeliharaan. Diduga bakteri tersebut termakan oleh udang, dan terekspresi di dalam usus udang sehingga menyeimbangkan mikroflora usus udang vaname yang dipelihara. Pernyataan ini sesuai dengan Wanasuria, 2010, yang mengatakan bahwa probiotik (mikroorganisme) yang ditambahkan ke dalam air juga akan diserap oleh pakan dan ikut masuk ke dalam sistem pencernaan untuk berkompetisi dengan bakteri patogen. Penggunaan probiotik merupakan salah satu kontrol biologis untuk mengendalikan penyakit pada budidaya perikanan. Mikroorganisme yang dapat digunakan sebagai probiotik tidak hanya berasal dari golongan bakteri (Bacillus, Thiobacillus) tetapi juga berasal dari golongan yeast (Sacharomyces cerevisiae) dan mikro alga (Tetraselmis sp). Bakteri probiotik biasanya bersimbiosis pada usus atau saluran pencernaan yang berperan sebagai bakteri non patogen, dan mengeliminir bakteri pathogen. Bakteri ini juga membantu dalam sistem perombakan makanan dalam usus, maka di dalam usus terjadi simbiosis mutualisme antara bakteri dan inangnya. Menurut Fuller (1989) definisi probiotik adalah suatu produk yang mengandung mikroba hidup non-patogen, yang diberikan pada hewan untuk memperbaiki laju pertumbuhan, efisiensi konversi ransum, dan kesehatan hewan. Mulai saat ini telah berkembang penggunaan probiotik sebagai pemacu pertumbuhan dan meningkatkan kesehatan, termasuk untuk kesehatan ikan. Probiotik dalam penerapannya sebagai produk bioteknologi terdiri atas tiga jenis produk yaitu probiotik yang mengandung kultur bakteri, kultur khamir, dan kultur molds (kapang) serta kombinasinya. Probiotik tidak hanya menjaga keseimbangan ekosistem, namun juga menyediakan enzim yang mampu mencerna serat kasar, protein, lemak, dan mendetoksikasi zat racun atau metabolitnya. Probiotik mempercepat/menahan aktivitas mikroba sehingga menyebabkan pH usus menurun. Hal ini akibat dari terbentuknya ammonia. Probiotik pada hewan mempengaruhi indigenous mikroflora sehingga merangsang pertumbuhan dengan konversi pakan lebih baik, menjaga kesehatan, khususnya gangguan usus melalui stimulasi perbaikan indigenous mikroflora dan kekebalan koloni dalam usus, stimulasi imun nonspesifik, predigestion faktor antinutrisi (ANFs) seperti asam pitat, glukosinolat, tripsin, inhibitor, lektin, dan polisakarida non-pati (serat) (Abun, 2008). Adapun berbagai macam bakteri probiotik serta sistem aplikasinya dapat dilihat pada tabel 9 berikut. Tabel 9. Probiotik Udang dalam Industri Akuakultur (Florez dan Guzman, 2009). Bakteri probiotik Bacillus sp. (Strain S11) Bacillus sp. (Strain S11) Bacillus sp. (Strain S11) Bacillus sp. (Strain S11) Bacillus sp. (Strain P64) Bacillus sp. (Strain BT23) Digunakan di P. monodon Aplikasi Dicampur dengan pakan Cara kerja Antagonisme terhadap Vibrio harveyi dan kualitas air Imunostimulan dan pelindung udang dari V. harveyi Antagonisme terhadap Vibrio harveyi dan kualitas air Dosis (cfu/ml) Antagonis dengan V. harveyi 103 P. monodon Dicampur dengan pakan Dicampur dengan pakan Dicampur dengan pakan L. vannamei Air Antagonis dengan V. harveyi 107 P. monodon Air Antagonis dengan V. harveyi 108 Bacillus sp. Penaeids Air Bacillus sp. Bacillus sp, Saccharomyces cerevisiae, Nitrosomonas sp., Nitrobacter sp. Bacillus sp, Saccharomyces cerevisiae, Nitrosomonas sp., Nitrobacter sp. Bacillus sp, Saccharomyces sp. Bacillus sp, Nitrosomonas sp., Nitrobacter sp. Spora dari B. subtilis, B. licheniformis, B. polymyxa, B. laterosporus, B. circulans B. pumilus, B. spaerichus, B. subtilis Lactobacillus bulgaricus (strain NCIM 2056) Lactobacillus bulgaricus (strain NCIM 2057) L. acidhopilus (strain NCIM 2285) L. vannamei Pakan Pencernaan 108 P. monodon P. monodon 102 108 109, 4.5 x 105, 6.4 x 104, 2.8 x 106 L. vannamei Air Kualitas air dan kontrol bakteri P. monodon Air Populasi bakteri dan status kesehatan dari udang P. monodon Air Kualitas air 108 + 5.6 x 105 P. monodon Air Kualitas air 108 F. indicus Air dan pakan Pencernaan 106 dan 107 P. monodon Pakan Antagonisme terhadap Vibrio harveyi dan Immunostimulan 1011 - 1012 F. indicus Pakan Antagonnisme terhadap V. alginolyticus 5 x 106 F. indicus Pakan Antagonnisme terhadap V. alginolyticus 5 x 106 F. indicus Pakan Antagonnisme terhadap V. alginolyticus 5 x 106 I. KESIMPULAN 1.1. Kesimpulan Sebanyak 45 isolat bakteri terseleksi, berhasil dikoleksi dari usus udang berumur 1, 2, dan 3 bulan. Berdasarkan analisis genetik Gen 16S-rRNAnya, didapatkan 30 pola ARDRA yang berbeda (OTU/ Organism Taxonomy Unit). Analisa pohon filogenetika, menunjukkan keragaman genetika mikroflora usus udang terkelompok menjadi 30 cabang filotipe (OTU). Dari hasil karakterisasi fisiologis, jenis bakteri yang selalu ditemukan dalam populasi mikroflora usus tersebut adalah genus Bacillus dan Kurthia. 1.2. Saran Perlu dilakukan penelitian lanjutan, screening bakteri probiotik potensial dari isolat bakteri terkoleksi, serta aplikasi bakteri probiotik tersebut pada berbagai usaha budidaya ikan/udang air laut atau payau. DAFTAR PUSTAKA Abun. 2008. Hubungan Mikroflora dengan Metabolisme dalam Saluran Pencernaan Unggas dan Monogastrik. [Makalah Ilmiah]. Jurusan Nutrisi dan Makanan Ternak, Fakultas Peternakan, Universitas Padjadjaran Jatinangor. Bandung. Bornerman, J., P.W. Skorch, K.M. O’Sullivan, J.A. Palus, N.G. Rumnajek, J.L. Jansen, J. Neinhuis, E.W. Triplett. 1996. Molecular microbial diversity of an agricultural soil in Wisconsin. Appl Environ Microbial 62: 1935-1943. Deya, A.A.M., D.A. Odelson, R.F. Hiekey, J.M. Tiedje. 1995. Bacterial comunity fingerprinting of amplified 16S-23S ribosomal DNA gene sequences and restriction endonuclease analisis (ARDRA). Di dalam: Akkermans ADL, Elsas JDV, Bruijin FJ. Moleculer Microbial Ecology Manual. London: Kluwer Academic Publishers. Hlm 3.3.2/1-3.3.2/6. Diogenes, P. 2006. Giant Red Hermit Crab Specimen Condition Live Specimen . Gulf of Mexico, captive at Texas State Aquarium. Available http://www.scribd.com/doc/28724426/ARTHOPODA. html. [8 Februari 2011]. Florez, M.L. and G.A. Guzman. 2009. The use of probiotic in fish and shrimp aquaculture. A. Review. Production, Evaluation, and Uses In Animal Feed. Campeche Mexico. Fuller R. 1989. Application and Practical Aspects. Probiotik 2. Chapman & Hall. Kennet, T. 2011. The genus Bacillus. Available http://www.text book of bacteriology.net/Bacillus.html Khaeruni, A. 2005. Keragaman genetik dan pengembangan metode deteksi cepat penyebab pustule bakteri (Xanthomonas axonopodis pv. glycines) pada kedelai. [Tesis]. Institut Pertanian Bogor, Bogor. KKP. 2010. KKP Tingkatkan Produksi Udang dengan Jenis Unggul. Available http://www.cji.or.id/10/index.php?option=com_content&view=article&id=13 52:kkp-tingkatkan-produksi-udang-dengan-jenis unggul & catid = 22:news & Itemid=3. html. [10 Februari 2011]. Krebs, C. J. 1972. Ecology: The Experimental Analysis of Distribution and Abundance. Harper and Row Publisher. New York. Lane D. J. 1991. 16S/23S rRNA sequencing. P. 115-175. In E. Stackebrandt and M. Goodfellow (ed.), Nucleic acid techniques in bacterial systematics. John Wiley & Sons Ltd., Chichester, United Kingdom. Madigan, M.T., J.M. Martinko, J. Parker. 1997. Biology of Microorganisms. Ed ke-8. New Jersey: Prentice-Hall. Marchesi, J.R., T. Sato, A.J. Weightman, T.A. Martin, J.C. Fry, S.J. Hiom, W.E. Wade. 1998. Design and evalution of useful bacterium specific PCR primers that amplify genes coding for bacterial 16S-rRNA. Appl. Environ Microbiol 64: 795-799. Muladno, 2002. Seputar Teknologi Rekayasa Genetika. Edisi pertama. Bogor: Wirausaha Muda dan USESE Foundation. Hlm 60-61. Murray, M.G., and W.F. Thompson. 1980. Rapid isolation of high molecular weight plant DNA. Nucl. Acids. Res. 8: 4321-4325 Rao, M.B., A.M. Tanksale, M.S. Ghatge, and V.V. Deshpande, 1998. Molecular and Biotechnological Aspect of Microbial Proteases. J. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62(3) : 597 – 635. Shahab, A. 2006. Optimasi Produktivitas Budidaya Udang Vanname Litopenaeus vanname dengan Menggunakan Metode Respon Surface dan non Linier Programming. [Tesis]. Institut Teknologi Surabaya, Surabaya. Wasetiawan. 2009. Sistem Pencernaan Pada Hewan. Available http:// unila.ac.id/wasetiawan/files/2009/10/sistem-pencernaan-pada-hewan.pdf. html. [9 Februari 2011]. Waluyo, L. 2004. Mikrobiologi Umum. Universitas Muhamadiyah Malang: Malang Wanasuria, S. 2010. Probiotik Akuakultur. Available http://agritekno.com/ probiotik/103-probiotik-akuakultur.html. [1 Maret 2011] Yudha, I.G. 2005. Udang Vanname kuning. Available http://blog. unila.ac.id/ indragumay/2010/06/05/udang-vannamei-kuning/. html. [21 Januari 2009]. Yuwono, T. 2005. Biologi Molekular. Erlangga: Laboratorium Mikrobiologi, Fakultas Pertanian, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta. LAMPIRAN Lampiran 1. Isolasi Bakteri dengan Metode Cawan Sebar 0,1 ml 0,25 ml Usus udang 100 0,9 ml PBS 10-1 10-2 10-3 Agar SWC 10-4 Gambar diatas merupakan cara pengenceran bakteri dari usus udang. Setelah diinkubasi 24 jam, mendapatkan koloni yang dapat dilihat secara visual berbeda bentuk, pigmentasi, dan morfologi. Koloni tersebut kemudian dimurnikan di media SWC (Sea Water Complete). Lampiran 2. Pewarnaan Gram Koloni bakteri yang didapat diamati bentuk dan jenis Gramnya dengan cara pewarnaan. Pewarnaan Gram ini yang harus dilakukan pertama kali yaitu menginokulasikan koloni bakteri ke cover gelas yang telah ditetesi aquades dan dikeringkan. Sampel tersebut kemudian ditetesi larutan kristal violet selama 1 menit, dibilas lagi dengan aquades, dan dikeringkan. Tahap selanjutunya isolat ditetesi larutan Kalium Iodida selama 1 menit, dibilas lagi dengan aquades dan dikeringkan. Sampel yang telah kering ditetesi lagi dengan alkohol 95% selama 30 detik, lalu dikeringkan. Tahap yang terakhir ditetesi pewarna safranin selama 30 detik, kemudian dibilas, dan dikering udarakan. Sampel tersebut siap diamati di bawah mikroskop. Jika berwarna pink termasuk dalam bakteri Gram negatif, tetapi jika berwarna ungu termasuk dalam bakteri Gram positif. (http://aguskrisnoblog.wordpress.com/2011/01/11/pewarnaan-bakteri-dan-peran-nutrisisebagai-dasat-kehidupan-pada-mikroba/) a. Ekspresi sel bakteri Gram negatif (http://www.textbookofbacteriology.n et/Bacillus.html) b. Ekspresi sel bakteri Gram positif (http://archive.microbelibrary.org/ASMO nly/Details.asp?ID=1988) Lampiran 3. PCR (Polymerase Chain Reaction) Pertama kali dilakukan ketika proses PCR yaitu membuat master mix. Master mix ini terdiri dari ddH2O, 10X Taq buffer, primer yang digunakan, dan DNA Taq Polymerase. Pembuatan master mix ini selalu dalam keadaan suhu rendah (-4 ºC sampai -20 ºC) untuk mengurangi kerusakan reagen-reagen PCR yang akan digunakan. Master mix kemudian dibagi-bagi pada tube PCR sesuai yang diperlukan. Tahap yang terakhir mencampur hasil ekstraksi DNA sampel ke dalam pembagian master mix tersebut, dan menginkubasinya di mesin thermocycler (PCR). Berikut merupakan gambaran pada saat dilakukannya proses PCR. Master mix (on ice) Mesin PCR Spin down Lampiran 4. Uji Biokimia 4a. Uji motilitas Pada uji ini digunakan media SIM. Cara mengujinya yaitu isolat bakteri diambil dari medianya dengan menggunakan jarum ose, kemudian jarum ose tersebut ditusukkan ke dalam media yang semi padat tadi. Diinkubasi selama 24 jam, diamati pergerakan bakterinya. Berikut merupakan contoh hasil akhirnya. Non Motil Motil Tipe Motilitas Bakteri ( http//science-query.com/tag/pada-media/) 4b. Uji Oksidasi/Fermentasi Pada uji ini digunakan media O/F. Cara uji O/F dengan melakukan inokulasi bakteri pada media O/F (dengan cara ditusukkan). Salah satu tabung diberi parafin cair 1 ml. Media yang telah diinokulasikan tersebut diinkubasi selama 24 jam. Jika warna kedua tabung setelah diinkubasi berwarna kuning maka berarti bersifat fermentatif. Apabila tabung tetapi jika tabung yang tidak diberi parafin cair berubah menjadi kuning sedangkan yang diberi parafin cair tidak berubah warna maka bersifat Oksidatif. Jika hasil kedua tabung berwarna hijau berarti bersifat negatif. Berikut merupakan contoh hasilnya. Fermentatif Negatif Oksidatif 4c. Uji Oxydase Uji ini dilakukan dengan p-aminodimethylaniline-oxalat 1%, dimana cara ujinya dilakukan dengan meneteskan larutan tersebut diatas gelas preparat yang sudah ada kertas saringnya, kemudian inokulasi isolat bakteri diatas larutan dan kertas saring tersebut. Jika hasilnya berubah warna berarti positif, tetapi jika tetap berwarna ungu hasilnya negatif. Berikut merupakan salah satu hasil pengujiannya. positif negatif 4d. Uji katalase Uji ini dilakukan dengan larutan Hidrogen Peroksida (H2O2) 3%, cara ujinya, Diinokulasi isolat bakteri dengan ose pada gelas preparat, kemudian ditetesi larutan tersebut 1 tetes, hasilnya jika mengeluarkan gelembung berarti positif, tetapi jika tidak bergelembung hasilnya negatif. Berikut merupakan salah satu hasil yang didapatkan setelah diuji katalase. positif Negatif Lampiran 5. Tabel Asal Isolat Kode isolat 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 Umur (bulan) Asal isolat Sampel udang ke- 1 1 1 2 1 3 2 1 2 2 2 3 3 1 3 2 3 3 Lampiran 6. Nilai Keanekaragaman dan Dominansi. 6a. Indeks Keanekaragaman 1 Pi 1 Bln 0,2 Pi 2 Bln 0,23 Pi 3 Bln 0,12 Pi Gabungan 0,04 H’ 1 Bln 0,46 H’ 2 Bln 0,49 H’ 3 Bln 0,37 H’ Gabungan 0,19 2 0,07 0,08 0,06 0,04 0,27 0,29 0,24 0,19 3 0,07 0,08 0,12 0,02 0,27 0,29 0,37 0,11 4 0,07 0,08 0,06 0,02 0,27 0,29 0,24 0,11 5 0,07 0,08 0,06 0,02 0,27 0,29 0,24 0,11 6 0,07 0,08 0,06 0,02 0,27 0,29 0,24 0,11 7 0,07 0,08 0,06 0,02 0,27 0,29 0,24 0,11 8 0,07 0,15 0,06 0,02 0,27 0,41 0,24 0,11 9 0,33 0,08 0,06 0,02 0,53 0,29 0,24 0,11 0,08 0,18 0,02 0,29 0,45 0,11 0,12 0,06 0,37 0,24 Filotipe 10 11 12 0,02 0,11 13 0,02 0,11 14 0,02 0,11 15 0,04 0,19 16 0,04 0,19 17 0,02 0,11 18 0,04 0,19 19 0,06 0,24 20 0,02 0,11 21 0,02 0,11 22 0,02 0,11 23 0,09 0,31 24 0,02 0,11 25 0,02 0,11 26 0,02 0,11 27 0,02 0,11 28 0,02 0,11 29 0,02 0,11 30 0,02 0,11 31 0,11 0,35 Keanekaragaman (H’) Keterangan : Pi H’ 2,87 = Proporsi jenis ke-i = Indeks Keanekaragaman 3,23 3,25 4,56 6b. Indeks Dominansi 1 2 3 4 5 6 Pi 1 Bln 0,20 0,07 0,07 0,07 0,07 0,07 Pi 2 Bln 0,23 0,08 0,08 0,08 0,08 0,08 Pi 3 Bln 0,12 0,06 0,12 0,06 0,06 0,06 Pi Gabungan 0,04 0,04 0,02 0,02 0,02 0,02 C 1 Bln 0,04 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 C 2 Bln 0,05 0,01 0,01 0,01 0,01 0,01 C 3 Bln 0,01 0,00 0,01 0,00 0,00 0,00 C Gabungan 0,0016 0,0016 0,0004 0,0004 0,0004 0,0004 7 8 0,07 0,07 0,08 0,15 0,06 0,06 0,02 0,02 0,00 0,00 0,01 0,02 0,00 0,00 0,0004 0,0004 9 10 0,33 0,08 0,08 0,06 0,18 0,02 0,02 0,11 0,01 0,01 0,00 0,03 0,0004 0,0004 0,12 0,06 0,02 0,01 0,0036 0,0004 Filotipe 11 12 13 14 0,02 0,02 0,0004 0,0004 15 16 0,04 0,04 0,0016 0,0016 17 18 0,02 0,04 0,0004 0,0016 19 20 21 22 23 24 0,06 0,02 0,02 0,02 0,09 0,02 0,0036 0,0004 0,0004 0,0004 0,0081 0,0004 25 26 27 28 29 30 0,02 0,02 0,02 0,02 0,02 0,02 0,0004 0,0004 0,0004 0,0004 0,0004 0,0004 31 0,11 0,0121 Indeks Dominansi Keterangan: Pi C (C) = Proporsi jenis ke-i = Indeks Dominansi 0,18 0,13 0,10 0,0442
