Isolasi DNA pada Leukosit

BAB 1
PENDAHULUAN
A. Latar Belakang Masalah
Salah satu ciri makhluk hidup adalah berkembang biak
(mereproduksi jenisnya). Dimana keturunan berikutnya memiliki sifat
yang hampir sama dengan orangtuanya. Dalam menghasilkan keturunan
baru, informasi genetik juga diwariskan dari orang tua kepada
keturunannya. Proses demikian disebut dengan Hereditas (pewarisan).
Genetika adalah ilmu tentang hereditas yang terkait dengan gen.
Gen adalah bagian dari DNA kromosom yang mengkode satu buah
molekul RNA spesifik, yang selanjutnya mengkode untuk polipeptida
tertentu. Gen tersusun dari DNA (Deoxyribo Nucleic Acid). DNA tersusun
atas basa nitrogen, asam deoxyribosa dan fosfat. Dimana DNA adalah
dasar kimia hereditas (pewarisan) dan diorganisasikan kedalam gen, yang
menjadi unit dasar informasi genetika. Pembuktian bahwa DNA
mengandung informasi genetik dilakukn pertama kali pada tahun 1944
dalam serangkain percobaan oleh Avery, MacLeod, McCarty. Ketiga
peneliti ini memperlihatkan bahwa penetapan genetik dari karakter kapsul
pneumokukus spesifik dapat dipindahkan kepada pneumokukus lain
dengan tipe kapsul yang berbeda melalui penyisipan DNA yang
dimurnikan sehingga memiliki tipe yang spesifik dengan pneumokukus
awalnya.
1
Kandungan informasi DNA (kode genetik) terletak didalam
(rangkaian)
sequence
tempat
tersusunnya
monomer-monomer
deoksiribosanukleotida purin dan pirimidin yang saling berikatan sangat
kuat yaitu ikatan fosfodieter. Dimana dengan seperti ini dapat ditentukan
stuktur DNA membentuk heliks ganda. Gen juga mengendalikan sistesis
berbagai tipe RNA (mRNA, rRNA, tRNA) dari DNA yang sebagian besar
diantaranya terlibat dalam sintesis protein. DNA diperoleh melalui proses
isolasi DNA didalam gen itu sendiri.
B. Perumusan Masalah
Berdasarkan latar belakang masalah yang telah dikemukakan di atas, maka
dapat dirumuskan:
1.
Apa sifat gen?
2.
Bagaimana aliran informasi genetik dalam pembentukan protein ?
3.
Bagaimana struktur DNA?
4.
Bagaimana isolasi DNA?
C. Tujuan Penulisan
Pembuatan makalah ini bertujuan untuk:
1.
Untuk memenuhi salah satu tugas mata kuliah biokimia
2.
Untuk memahami bagaimana sifat gen.
3.
Untuk mengetahui aliran informasi genetik dalam pembentukan
protein.
4.
Untuk mengetahui struktur DNA.
5.
Untuk mempelajari proses isolasi DNA
2
D. Manfaat Penulisan
1. Sebagai informasi bagi siapa yang ingin mengetahui mengenai proses
fermentasi.
2. Sebagai rujukan bagi mereka yang ingin meneliti lebih lanjut mengenai
fermentasi.
3
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
A. Sifat – Sifat Gen
Genetika adalah cabang ilmu biologi yang mempelajari sifat-sifat
keturunan (hereditas) serta segala seluk beluknya secara ilmiah. Unit-unit
hereditas yang ditransmisikan dari satu generasi ke generasi berikutnya (dengan
kata lain, yang diwariskan) disebut gen. Pertama kali istilah gen diperkenalkan
oleh Thomas Hunt Morgan, ahli Genetika dan Embriologi Amerika Serikat
(1911), yang mengatakan bahwa substansi hereditas yang dinamakan gen terdapat
dalam lokus, di dalam kromosom.
Defenisi gen telah berevolusi sejalan dengan sejarah genetika. Pada konsep
Mendelian, suatu gen digambarkan sebagai unit penurunan sifat yang mempunyai
ciri-ciri yang mempengaruhi karakteristik fenotip. Menurut W. Johansen, gen
merupakan unit terkecil dari suatu makhluk hidup yang mengandung substansi
hereditas, terdapat di dalam lokus gen. Gen terdiri dari protein dan asam nukleat
(DNA dan RNA), berukuran antara 4 – 8 m (mikron).
Gen mempunyai sifat-sifat sebagai berikut:
a. Mengandung informasi genetik.
Hal ini dibuktikan dari percobaan Fred Griffith (1928) yang
menunjukkan DNA bakteri dapat memindahkan informasi genetik
melalui proses yang disebut transformasi.
b. Tiap gen mempunyai tugas dan fungsi berbeda.
4
c. Pada waktu pembelahan mitosis dan meiosis dapat mengadakan
duplikasi.
d. Ditentukan oleh susunan kombinasi basa nitrogen.
e. Sebagai materi tersendiri yang terdapat dalam kromosom.
Gen menyimpan instruksi untuk membuat protein tetapi gen tidak
menyusun protein secara langsung. Jembatan antara DNA dan sintesis protein
adalah RNA. Basa nukleotida yang menyusun RNA adalah A, G, C, dan U. RNA
pada umumnya tersusun atas untai tunggal. DNA dan RNA terbentuk dari
kelompok basa nitrogen yang berbeda yaitu purin dan pirimidin. Dua purin yang
terdapat paling banyak dalam DNA adalah adenin dan guanine, sedangkan basa
pirimidin yang umum adalah sitosin dan timin.
DNA terdiri dari gula pentose, basa nitrogen dan fosfat
Gambar 1. Gambar DNA
B. Aliran Informasi Genetik (Sentral Dogma).
Sejak tahun 1944 telah diketahui bahwa DNA merupakan partikel
pembawa informasi genetik. Alur informasi genetik yang terjadi pada sel hidup
meliputi tiga tahap yaitu tahap replikasi, transkripsi dan translasi. Alur informasi
genetik (Sentral Dogma) adalah proses transkripsi DNA menjadi mRNA dan
translasi menjadi sebuah polipeptida. Maksudnya adalah semua informasi yang
terdapat pada DNA, kemudian akan digunakan untuk menghasilkan molekul RNA
5
melalui transkripsi, dan sebagian informasi pada RNA tersebut akan digunakan
untuk menghasilkan protein melalui proses yang disebut translasi.
Pada tahun 1956, Francis H. Crick memperkenalkan diagram alur yang
menggambarkan fungsi DNA dalam perjalanan informasi genetik yang disebut
sentral dogma (Watson, et al. dalam T. Milanda, 1994).
3
2
1
Replikasi
TRANSKRIP
SI
TRANSLASI
mRNA
DNA
PROTEIN
TRANSKRIPSI
BALIK
Skema 2. Dogma sentral aliran informasi genetik (Marks, et al., 2000)
Keterangan:
1.
Tahap replikasi
Replikasi merupakan pembentukan DNA rangkap ganda yang komplemen
satu dengan yang lainnya dan persis seperti DNA semula. Replikasi DNA
bersifat semikonservatif, yaitu kedua untai tunggal DNA bertindak sebagai
cetakan untuk pembuatan untai-untai DNA baru, seluruh untai tunggal hasil
cetakan dipertahankan dan untai yang baru dibuat dari nukleotida –
nukleotida.
6
Gambar 2. Macam - macam replikasi DNA
Proses replikasi DNA
Mula-mula, heliks ganda dibuka menjadi dua untai tunggal oleh enzim
helikase (9) dengan bantuan topoisomerase (11) yang mengurangi tegangan untai
DNA. Untaian DNA tunggal dilekati oleh protein-protein pengikat tunggal (10)
untuk mencegahnya membentuk heliks ganda kembali. Primase (6) membentuk
oligonukleotida RNA yang disebut primer (5) dan molekul DNA polimerisase (3
dan 8) melekat pada seuntai tunggal DNA dan bergerak sepanjang untaian
tersebut memperpanjang primer, membentuk untaian tunggal DNA baru yang
disebut leading strand (2) dan lagging strand (1). DNA polymerase yang
membentuk lagging strand harus mensintesis segmen – segmen polinukleotida
discontinue (disebut fragmen Okazaki (7)). Enzim DNA ligase (4) kemudian
menyambungkan potongan – potongan lagging strand tersebut.
Gambar 3. Proses replikasi DNA
7
Garpu replikasi
1. Leading strand: sintesis DNA terjadi secara kontinu.
2. Lagging strand: sintesis DNA terjadi melalui pembentukan utas-utas
pendek. Lagging strand: disintesis secara tidak kontinu. Primase
mensintesis primer RNA pendek, yang diperpanjang oleh DNA
polymerase, membentuk fragmen Okazaki.
Untaian ini disintesis dalam segmen – segmen yang disebut fragmen
Okazaki. Pada untaian ini, primase membentuk primer RNA. DNA
polimerisasi dengan demikian dapat menggunakan gugus OH 3’ bebas
pada primer RNA tersebut untuk mensitesis DNA dengan arah 5’  3’.
Fragmen primer RNA tersebut lalu disingkirkan (misalnya dengan RNase
H dan DNA Polimerisasi 1) dan deoksiribonukleotida baru ditambahkan
untuk mengisi celah-celah yang tadinya ditempati oleh RNA. DNA ligase
lalu menyambungkan fragmen – fragmen Okazaki tersebut sehingga
sintesis lagging strand menjadi lengkap.
pembentukan leading
dan lagging strand
garpu replikasi yang
mensintesis DNA (untaian
ganda)
Pembentukan fagmen
Okazaki
Gambar 4. Beberapa peristiwa dalam proses replikasi DNA
8
Gambar 5. Arah replikasi DNA
Enzim yang terlibat dalam proses replikasi DNA adalah
1. Polimerase DNA : enzim yang berfungsi mempolimerisasi nukleotidanukleotida
2. Ligase DNA : enzim yang berperan menyambung DNA utas lagging
3. Primase DNA : enzim yang digunakan untuk memulai polimerisasi DNA
pada lagging strand
4. Helikase DNA : enzim yang berfungsi membuka jalinan DNA double
heliks.
5. Single strand DNA-binding protein : menstabilkan DNA induk yang
terbuka
2.
Tahap Transkripsi
Transkripsi adalah sintesis RNA dibawah arahan DNA. Keduanya
menggunakan bahasa yang sama sehingga informasi dari DNA disalin begitu
saja dari satu molekul ke molekul yang lain (basa T pada DNA disalin
menjadi basa U pada RNA). Untai tunggal DNA bertindak sebagai template
9
untuk penyusunan sekuen nukleotida RNA (seperti pada proses replikasi
DNA, perbedaannya pada replikasi DNA yang disusun pada template induk
adalah sekuen nukleotida DNA). Fungsi ini disebut fungsi heterokatalis
DNA karena DNA mampu mensintesis senyawa lain yaitu RNA. Sebuah
rantai DNA digunakan untuk mencetak rantai tunggal mRNA dengan bantuan
enzim RNA polimerase. Enzim tersebut menempel pada kodon permulaan,
umumnya adalah kodon untuk asam amino metionin.
Bagi gen pengkode protein, molekul RNA tersebut merupakan
transkrip dari instruksi penyusunan-protein dari gen (RNA ini dapat
dihasilkan dalam jumlah yang banyak melalui proses transkripsi). Tipe
molekul RNA semacam ini disebut messenger RNA (mRNA) karena
molekul ini membawa pesan genetik dari DNA menuju mesin pensintesaprotein dalam sel. (Transkripsi merupakan istilah umum untuk sintesis
berbagai tipe RNA dari template DNA dan ada berbagai tipe RNA yang
dihasilkan melalui transkripsi).
Pertama-tama, ikatan hidrogen di bagian DNA yang disalin terbuka.
Akibatnya, dua utas DNA berpisah. Salah satu polinukleotida berfungsi
sebagai pencetak atau sense, yang lain sebagai gen atau antisense. Misalnya
pencetak memiliki urutan basa G-A-G-A-C-T, dan yang berfungsi sebagai
gen memiliki urutan basa komplemen C-T-C-T-G-A. Karena pencetaknya GA-G-A-C-T, maka RNA hasil cetakannya C-U-C-U-G-A. Jadi, RNA C-U-CU-G-A merupakan hasil kopian dari DNA C-T-C-T-G-A (gen), dan
merupakan komplemen dari pencetak.
10
Hasil (produk) yang didapatkan pada tahap transkripsi adalah:
1.
messenger RNA (mRNA) berfungsi sebagai pembawa pesan yang
mengagkut informasi dalam sebuah gen kepada ribosom
2.
transfer RNA (tRNA) bertindak sebagai adapter (penyetaraan translasi
informasi didalam rangkaian nukleotida mRNA menjadi asam amino
yang spesifik.
3.
ribosom RNA (rRNA) berfungsi mesin pemmbentukan protein dari
cetakan mRNA.
Ketiga produk RNA ini mengambil bagian pada proses selanjutnya dalam
tahap translasi.
Komponen yang terlibat pada tahap transkripsi adalah
1.
DNA yang terdiri atas basa nukleotida Adenin (A), Guanin (G), Timin
(T), Sitosin (S).
2.
Enzim RNA polimerase
3.
Prekusor (bahan yang ditambahkan sebagai peninduksi).
Tahapan dalam proses transkripsi pada dasarnya terdiri dari 3 tahap :
1.
Inisiasi (pengawalan).
Transkripsi tidak dimulai disembarang tempat pada DNA, tetapi
dibagian hulu (upstream) dari gen yaitu promoter. Salah satu bagian
terpenting dari promoter adalah kotak Pribnow (TATA box). Di dalam suatu
promoter sudah terdapat signal tempat mulainya transkripsi. Selain itu
promoter juga menentukan untai DNA mana yang akan dijadikan template
untuk ditranskripsi (DNA memiliki dua untai berbetuk helix – double helix).
11
Inisiasi dimulai ketika holoenzim RNA polimerase menempel pada
promoter. Tahapannya dimulai dari pembentukan kompleks promoter
terbuka, penggabungan beberapa nukleotida awal dan perubahan konfirmasi
RNA polymerase karena struktur sigma dilepas dari kompelks holoenzim.
Dimana tahapan yang terjadi pada inisiasi adalah:
a) enzim RNA polimerase menyalin gen
b) pengikatan RNA polimerase terjadi pada tempat tertentu yaitu tepat
didepan gen yang akan ditranskripsi.
c) empat pertemuan antara gen (DNA) dengan RNA polimerase disebut
promoter.
d) kemudian RNA polimerase membuka double heliks DNA.
e) salah satu utas DNA berfungsi sebagai cetakan.
2.
Elongasi (pemanjangan)
Proses selanjutnya adalah elongasi (pemanjangan). Pemanjangan
disini adalah pemanjangan nukleotida. Setelah RNA polymerase menempel
pada promoter, maka enzim tersebut akan bergerak sepanjang molekul DNA,
menguraikan dan meluruskan heliks. RNA polimerase bergerak sepanjang
DNA, membuka untaian double helix-nya untuk dipasangkan dengan
nukleotida RNA. Suatu enzim menambahkan untai nukleotida yang baru
terbentuk sehingga untai RNA ini memanjang. RNA nukleotida yang baru
tersebut terlepas dari template DNA, dan dua untai DNA yang terpisah
menyatu kembali menjadi doublehelix.
Dalam pemanjangan, nukloetida ditambahkan secara kovalen pada
ujung 3’ molekul RNA yang ditambahkan adalah Urasil (U) dan seterusnya.
12
Laju pemanjangan maksimim molekul transkripsi RNA berkisar antara 30 –
60 nukleotida per detik. Kecepatan elongasi tidak konstan.
3. Terminasi (pengakhiran)
Terminasi juga tidak terjadi disembarang tempat. Transkripsi berakhir
ketika menemui nukleotida tertentu berupa stop kodon. Selanjutnya RNA
terlepas dari DNA templat menjadi ribosom. mRNA sebagai pembawa
informasi dari DNA menuju ribosom, ditranskripsi dari untai template suatu
gen.
Enzim
RNA
polimerase
memisahkan
dua
untai
DNA
dan
menggabungkan nukleotida RNA dengan basa pasangannya pada template
DNA. Sekuen nukleotida yang spesifik pada untai DNA menandai tempat
dimana transkripsi gen bermula dan berakhir. Sekuen DNA dimana RNA
polimerase menempel dan memulai transkripsi dikenal sebagai promoter
(pada bacteria signal
yang mengakhiri transkripsi dikenal sebagai
terminator). Untai DNA yang ditranskripsi ke dalam molekul RNA disebut
unit transkripsi.
Selama transkripsi, gen menentukan urutan dari basa sepanjang
molekul mRNA (Gambar 5). Untuk tiap-tiap gen, hanya satu dari dua untai
DNA yang ditranskripsi. Untai ini disebut template strand karena untai
tersebut menyediakan pola atau cetakan urutan nukleotida dalam transkrip
RNA. Molekul mRNA merupakan komplemen dari DNA template karena
basa RNA disusun berdasarkan aturan pasangan basa. Pasangannya adalah
serupa dengan yang dihasilkan pada replikasi DNA tetapi U pada RNA
menggantikan T dan berpasangan dengan A, serta nukleotida dari mRNA
mengandung ribose bukan deoxyribose. Seperti pada sintesis untai baru DNA,
13
molekul RNA yang disentesis dari template DNA juga disusun dengan arah
antiparalel. Sebagai contoh, basa triplet DNA adalah ACC (dibaca 3’- ACC5’) menjadi template bagi tersusunnya 5’-UGG-3’ mRNA. Basa triplet pada
mRNA ini disebut kodon, dan pada umumnya tertulis dengan arah 5’-3’.
Pada contoh diatas UGG merupakan kodon bagi asam amono tryptophan
(Trp). Istilah kodon juga digunakan untuk basa triplet DNA pada untai nontemplate.
Gambar 6. Tiga kode DNA (kodon)
Synthesis of an RNA Transcript
Terdapat tiga tahap transkripsi (Figure 6) yaitu inisiasi, elongasi, dan
terminasi.
14
Gambar 7. Tiga tahap transkripsi
15
3.
Translasi
Translation adalah sintesis polipeptida yang terjadi melalui arahan
dari mRNA. Sel harus menterjemahkan urutan molekul basa RNA ke dalam
urutan asam amino polipeptida. Tempat terjadinya penerjemahan/translasi
adalah ribosom yaitu suatu komponen partikel yang memfasilitasi
penggabungan
asam
polipeptida.Translasi
amino
merupakan
yang
suatu
berurutan
proses
menjadi
rantai
penerjemahan
urutan
nukleotida yang ada pada molekul mRNA menjadi rangkaian asam-asam
amino yang menyusun suatu polipeptida atau protein. Yang diperlukan dalam
proses translasi adalah mRNA, ribosom, tRNA, dan asam amino.
Dalam melakukan proses translasi, sel menginterpretasikan pesan
genetik ke dalam pembentukan polipeptida. Pesan tersebut terdapat dalam
rangkaian kodon pada molekul mRNA, sedangkan interpreter-nya adalah
transfer RNA (tRNA). Fungsi tRNA adalah mentransfer asam amino dari
sitoplasma menuju ribosom. Ribosom merangkai asam amino yang dibawa
oleh tRNA menjadi rangkaian polipeptida (Gambar 8).
16
Gambar 8. Konsep dasar tahap translasi.
Kunci dari translasi pesan genetik menjadi rangkaian asam amino
tertentu adalah bahwa tiap-tiap molekul tRNA mentranslasikan kodon mRNA
ke dalam asam amino tertentu. tRNA yang masuk ke dalam ribosom
membawa asam amino pada ujungnya sedangkan pada ujung yang lainnya
terdapat triplet nukleotida yang disebut antikodon, yang berpasangan dengan
kodon mRNA.
Seperti halnya pada tahap transkripsi, tahap translasi ini juga dibagi tiga
tahap:
1.
Inisiasi
Tempat terjadinya penerjemahan/translasi adalah ribosom yaitu suatu
komponen partikel yang memfasilitasi penggabungan asam amino yang
berurutan menjadi rantai polipeptida. Ribosom tersusun atas dua sub unit
yaitu subunit besar dan subunit kecil (Gambar 9).
17
Gambar 9. Susunan ribosom dan anatomi dari fungsi ribosom.
Subunit ribosom tersusun atas protein dan molekul RNA yang disebut
ribosomal RNA (rRNA). Setiap ribosom memiliki selain memiliki tempat
untuk mengikat mRNA juga memiliki tempat untuk mengikat tRNA yaitu sisi
P, sisi A, dan sisi E. Sisi P mengikat tRNA yang membawa rangkaian
polipeptida, sisi A mengikat tRNA yang membawa asam amino berikutnya
yang akan dirangkai, sisi E adalah tempat keluarnya tRNA.
Inisiasi diawali dengan mengumpulnya mRNA, tRNA yang membawa
asam amino pertama, dan dua subunit ribosom. Subunit ribosom kecil
mengikat mRNA dan tRNA yang membawa asam amino metionin, kemudian
subunit ribosom besar menempel. Secara keseluruhan komponen ini disebut
sebagai translation initiation complex. Suatu protein yang disebut initiation
factor dibutuhkan untuk menjaga translation initiation complex tetap
menyatu.
Pertama tRNA mengikat asam amino menyebabkan tRNA teraktivasi
(dinamakan peristiwa amino-asilasi). Proses amino-asilasi ini dikatalis oleh
enzim tRNA sistetase. Kemudian ribosom mengalami pemisahan menjadi
subunit besar dan kecil. Subunit kecil dapat menempel pada mRNA dengan
kodon awal tempat menempel : 5’ – AGGAGG – 3’. Urutan tempat
18
menempelnya subunit kecil disebut urutan Shine-Dalgamo. Subunit kecil
dapat menempel pada mRNA bila ada IF-3. Pembentukan kompleks IF2/tRNA-fMet dan IF-3/mRNA-fMet disebut asam amino N-formilmetionin
dan memerlukan banyak GTP sebagai sumber energi. tRNA-fMet kemudian
menempel pada kodon pembuka P subunit kecil. Pada proses IF-1 dan IF-2
dilepas dan GTP dihidrolisis menjadi GDP, dan siap melakukan elonganasi.
2.
Elongasi
Perbedaan pada proses transkripsi, pada translasi asam amino yang
dipanjangkan. Tahapan yang dilakukan pada proses elongasi, pertama adalah
pengikatan tRNA pada sisi A yang ada pada ribosom. Yang saling berikatan
membentuk ikatan peptida. Pada elongasi translasi, asam amino ditambahkan
satu persatu ke asam amino sebelumnya. Setiap penambahan asam amino
membutuhkan protein yang disebut elongation factor. Elongasi berlangsung
dalam siklus yang terdiri atas tiga tahap yaitu pengenalan kodon,
pembentukan ikatan peptide, dan translokasi (Gambar 10).
Gambar 10. Tahap elongasi
19
3.
Terminasi
Translasi akan berakhir pada salah satu dari tiga kodon terminasi
(UAA, UGA, UAG) yang ada pada mRNA mencapai posisi A pada ribosom.
Ketiga sinyal penghentian ini disebut release factor (RF) pada kodon
terminasi (stop kodon). Tahap akhir translasi adalah terminasi (Gambar 11).
Elongasi akan berjalan terus menerus hingga kodon “stop” pada mRNA
mencapai sisi A pada ribosom. Protein yang disebut release factor terikat
secara langsung pada kodon “stop” di sisi A.
Gambar 11. Tahap terminasi dari translasi.
Selama translasi, sekuen dari kodon di sepanjang untai mRNA di
terjemahkan (translasi/dekode) ke dalam sekuen asam amino yang menyusun
rantai polipeptida. Gambar 12 menunjukkan hubungan antara kodon dan
protein yang disintesis.
20
Gambar 12. Hubungan antara kodon dan protein yang disintesis
21
Gambar 13. Tahap translasi
22
Gambar 14. Tahap sintesis protein
23
KODE GENETIK
Masing – masing protein mengandung asam amino dalam jumlah tertentu
yang tersusun secara tepat menjadi suatu sekuens. Gen - gen tersusun dari kodonkodon yang masing - masing menspesifik sebuah asam amino spesifik melalui
molekul mRNA . Sebuah kodon terdiri atas sebuah gugus tiga nukleotida (triplet
nukleotida. Urutan sekuen DNA dan mRNA adalah sebagai berikut:
Kodon
1
2
3
4
5
Sekuen cetakan DNA
3’ TAC
CCG
ATA
TCA
GCC AAG 5’
Sekuens kodon mRNA 5’AUG
GGC
UAU
AGU
CGG UUC 3’
Asam amino
Gly
Tyr
Ser
Arg
Met
6
Leu
Dalam pembentukan asam amino diawali oleh asam amino metionin (AUG) dan
diakhiri oleh kodon stop (UAA, UAG, UGA).
C. STUKTUR DNA
DNA adalah polimer dari nukleotida-nukleotida. Nukleotida-nukleotida
dalam DNA dihubungkan satu dengan yang lainnya oleh ikatan fosfodiester, yaitu
ikatan yang terjadi antara Carbon katida dari satu nukleotida terdiri dari sebuah
gula pantosa (deoksiribosa), satu buah fosfat dan satu basa nitrogen. Basa nitrogen
tersebut berikatan dengan carbon pertama dari gula deoksiribosa, sedangkan fosfat
berikatan dengan karbon kelima dari gula yang sama.
Basa nitrogen yang menyusun nukleotida dikelompokan menjadi 2 yaitu:
1.
Purine, yaitu basa nitrogen yang strukturnya berupa dua cincin.
Termasuk diantaranya adalah : adenin dan guanin.
24
2.
Primidin, yaitu basa nitrogen yang strukturnya berupa satu cincin.
Termasuk diantaranya adalah : citosin dan timin.
Gambar 15. Basa Nitrogen
Beda DNA dengan RNA adalah
DNA  RNA
Pembeda
Gula
deosiribosa
Ribose
Basa nitrogen
A,C,G,T
A,G,C,U
Untaian
Ganda
Tunggal
Prokariot
sitoplasma
sitoplasma
Eukariot
Inti
Inti dan sitoplasma
Penyimpan informasi
Hasil transkripsi
Tabel 1. Beda DNA dan RNA
Bentuk susunan DNA dan RNA
25
Gambar 16. (a) Perbandingan nukleotida RNA dan DNA dan (b)
Perbandingan struktur tiga dimensi DNA dan RNA
Gambar 17. Struktur kimia dari DNA.
Setiap molekul DNA terdiri dari sub unit deoksiribonukleotida
monofosfat. Setiap unit tersebut tersusun dari kelompok fosfat yang berikatan
dengan gula pada atom karbon no. 5 dengan karbon no.3 dari gula berikutnya
disebut ikatan fosfodiester (Wolf, 1993)
26
Hukum Chargaff:
Chargaff meneliti proporsi relatif dari purin dan purimidin dalam suatu DNA dari
sejumlah organisma. Hasil penelitiannya menunjukkan bahwa dalam DNA dari
organisma apapun jumlah A=T dan C=G. Dengan menggunakan difraksi sinar X
diketahui bahwa DNA mempunyai susunan helix.
Watson dan Crick:
Watson dan Crick menemukan bahwa DNA berbentuk doubel helix. Setiap
molekul DNA terdiri dari dua rantai polinukleotida yang tersusun secara anti
paralel membentuk struktur duobel helix.
Gambar 18. DNA doubel helix. (a) Pengaturan gula, kelompok fosfat dan basa
dalam DNA. (b) Letak atom-atom dan ikatan-ikatan dalam DNA. Basabasa berpasangan dalam posisi mendatar, (c) Diagram yang menunjukkan
DNA dalam konformasi B (Wolf, 1993).
27
Komponen Penyusun DNA double heliks
1.
Dua rantai polinukleotida tersebut tersusun dalam “a coiled double helix”.
2.
Rantai gula dan fosfat membentuk rangka luar dari helix.
3.
Basa nitrogen-basa nitrogen yang melekat pada gula menonjol ke dalam
pusat helix.
4.
Jarak antara 2 strand adalah 1,1 nm yang diisi oleh basa nitrogen
5.
Jarak antara 2 basa adalah 3,4 A
6.
Setiap putaran dalam helix terdapat 10 basa
7.
Setiap putaran dalam helix mempunyai jarak 34 A
8.
Kedua stran (rantai polinukleotida) anti paralel artinya suatu rantai
mempunyai arah yang berlawanan dengan rantai pasangannya. Misalnya
suatu stran berakhir dengan gugus 5 fosfat sedang rantai pasangannya
berakhir dengan gugus 3 OH (hidroksil).
9.
Kedua rantai polinukleotida komplementer artinya urutan nukleotida pada
suatu rantai menentukan urutan nukleotida pada rantai pasangannya.
10.
Antara satu basa nitrogen dengan basa pasangannya dihubungkan oleh
ikatan hidrogen.
11.
Dua ikatan hidrogen antara A dan T
Tiga ikatan hidrogen antara C dan G
12.
Basa nitrogen A hanya dapat berpasangan dengan T, sedangkan C dengan
G
28
Gambar 19. (a) Ikatan antara nukleotida-nukleotida membentuk asam nukleat
dalam DNA dan (b) RNA (Wolf, 1993).
29
Gambar 20. Diagram skematis yang menunjukkan ikatan hidrogen antara Adenin dengan
Timin dan antara Guanin dengan Citosin (Wolf, 1993).
D. ISOLASI DNA
Isolasi DNA adalah suatu proses untuk memisahkan DNA dari suatu sel
makhluk hidup baik dari inti, mitokondria maupun kloroplas. Isolasi DNA
merupakan langkah yang tepat untuk mempelajari DNA seperti mengetahui urutan
basa purin dan pirimidinnya. Prinsip-prinsip dalam melakukan isolasi DNA ada
dua, yaitu sentrifugasi dan presipitasi. Sentrifugasi merupakan teknik untuk
memisahkan campuran berdasarkan berat molekul komponennya. Molekul yang
mempunyai berat molekul besar akan berada di bagian bawah tabung dan molekul
ringan akan berada pada bagian atas tabung. Hasil sentrifugasi akan menunjukkan
dua macam fraksi yang terpisah, yaitu supernat pada bagian atas dan pelet pada
bagian bawah (Campbell dkk. 2002 : 115). Presipitasi merupakan langkah yang
dilakukan untuk mengendapkan suatu komponen dari campuran (Albert dkk. 1994
: 254)
Isolasi DNA memilika beberapa tahapan, yaitu :
1. Isolasi sel
2. Lisis dinding dan membran sel
30
3. Ekstraksi dalam larutan
4. Purifikasi
5. Presipitasi
Isolasi sel bertujuan untuk memisahkan sel dari jaringan selanjutnya
dinding dan membran sel dilisis dengan dua cara yaitu mekanik dan enzimatik.
Ekstraksi DNA dalam larutan bertujuan memisahkan DNA dari larutan. DNA
yang diperoleh kemudian dipurifikasi untuk memisahkan DNA dari kontaminan.
Tahap terakhir dari isolasi DNA yaitu presipitasi yang bertujuan untuk
mengendapkan DNA dari supernatannya.
Proses isolasi DNA pada umumnya memiliki prinsip isolasi yang hampir
sama dengan cara sentrifugasi dan presipitasi seperti yang dikemukakan Zubaidah
(2004) dan Jamilah (2005) menyatakan bahwa isolasi DNA dapat dilakukan
melalui tahapan-tahapan antar lain : preparasi ekstrak sel, pemurnian DNA dari
ekstrak sel da presipitasi DNA. Secara umum dapat dilihat pada skema berikut :
31
ISOLASI DNA
GEN
Dipecah:
Enzim dan mekanik
DNA
dilepaskan
disuspensi
MEDIA
pemanasan
- saline- EDTA
-
- detergen (SDS)
- enzim
- NaCl
Pengendapan DNA
protease
sentrifugase (10.000g)
Campuran
Campuran membentuk 3 lapisan
alcohol/etanol/isoamilalkohol
dan kromofom (deproteinasi)
Lap bawah
(fase organik)
Lap atas
(fase air)
LAP AIR
Lap interfase
(protein terdaturasi)
ENDAPAN DNA
Skema 2. Proses Isolasi DNA
Pada tahap awal isolasi DNA, sel dari organisme dipecah (dapat dilakukan
secara mekanik atau menggunakan enzim). Selanjutnya DNA yang diperoleh
disuspensikan kedalam media tertentu lalu diendapakn. Pengendapan DNA dapat
dilakukan dengan menggunakan larutan saline-EDTA, detergen (SDS), NaCl,
pemanasan, enzim protase dan sentrifugasi. Pada tahap selanjutnya ditambahkan
campuran yang terdiri dari tiga lapisan yaitu lapisan bawah, lapisan atas dan
lapisan interface (tergantung dari DNA yang diinginkan). Misalnya DNA pada
32
pisang ditemukan pada lapisan interface dan DNA pada darah ditemukan pada
lapisan bawah (saepudin dan siswati, 2011).
Isolasi DNA pada Leukosit
•
300 l darah+EDTA di+kan ke dalam 900 l larutan pelisis sel, dibolakbalik sebentar, lalu diinkubasi 10 menit pada RT sambil sekali-sekali
dibolak balik selama inkubasi.
•
Campuran kemudian disentrifus dengan kecepatan 13.000 rpm 1 menit.
•
Supernatan dibuang, pelet dilisis kembali dengan 600 l larutan pelisis sel,
divorteks sebentar, lalu disentrifus kembali selama 1 menit, 13.000 rpm.
•
Supernatan dibuang, didapatkan pelet berwarna putih yang sudah bebas
dari eritrosit.
•
Ke dalam mikrotube ditambahkan 300 l larutan pelisis leukosit dan
nukleus, dipipet up and down sampai homogen.
•
Selanjutnya ditambahkan 1,5 l RNAse, diinkubasi pada suhu 37C, 15
menit – 1 jam.
•
Selanjutnya ditambahkan 100 l larutan penggumpal protein, divorteks 30
detik sampai terbentuk butiran-butiran coklat.
•
Campuran disentrifus selama 3 menit, 13.000 rpm, sampai terbentuk
endapan coklat di dasar mikrotube.
•
Supernatan dipindahkan ke mikrotube baru yang telah diisi dengan 900 l
alkohol absolut.
•
Tabung dibolak balik beberapa kali sampai terlihat benang-benang DNA
yang melayang-layang dalam alkohol.
33
•
Tabung disentrifus 1 menit, 13.000 rpm untuk mengendapkan DNA di
dasar tabung.
•
Alkohol absolut dibuang, DNA dicuci dengan 900 l alkohol 70%.
•
Tabung disentrifus 1 menit, 13.000 rpm, alkohol dibuang.
•
DNA dikering anginkan dengan posisi tabung terbalik.
•
Setelah DNA benar-benar kering, DNA dilarutkan dalam 100 l buffer TE
atau akuades steril.
34
BAB III
PENUTUP
A. KESIMPULAN
1. Gen mempunyai sifat-sifat sebagai berikut:
a. Mengandung informasi genetik.
Hal ini dibuktikan dari percobaan Fred Griffith (1928) yang
menunjukkan DNA bakteri dapat memindahkan informasi genetik
melalui proses yang disebut transformasi.
b. Tiap gen mempunyai tugas dan fungsi berbeda.
c. Pada waktu pembelahan mitosis dan meiosis dapat mengadakan
duplikasi.
d. Ditentukan oleh susunan kombinasi basa nitrogen.
e. Sebagai materi tersendiri yang terdapat dalam kromosom.
2. Aliran informasi genetik
Skema alur informasi genetic
3
2
1
TRANSKRIPSI
Replikasi
DNA
TRANSLA
SI
mRNA
PROTEIN
TRANSKRIPSI BALIK
3. Struktur DNA
Watson dan Crick menemukan bahwa DNA berbentuk doubel helix.
Setiap molekul DNA terdiri dari dua rantai polinukleotida yang tersusun
secara anti paralel membentuk struktur duobel helix.
35
Gambar DNA doubel helix. (a) Pengaturan gula, kelompok fosfat dan basa dalam
DNA. (b) Letak atom-atom dan ikatan-ikatan dalam DNA. Basa-basa
berpasangan dalam posisi mendatar, (c) Diagram yang menunjukkan DNA
dalam konformasi B (Wolf, 1993).
4. Isolasi DNA
Isolasi DNA merupakan proses pemisahan DNA dari sel baik dari inti sel,
mitokondria. Isolasi DNA dapat dilakukan dengan preparasi ekstrak sel
dan pemurnian sel DNA yang dapat dilakukan dengan cara elektroforesis.
36
DAFTAR PUSTAKA
Elrod, L. Susan & William D. Stansfield. 2002. Schaum’s Outline Teori dan Soal
– Soal Genetika, Edisi Keempat. Erlangga.
Goodenough & Adisoemarto. 1988. Genetika. Jakarta. Erlangga
Griffith, A.J.F; Miller, J.H; Suzuki, D.T; Lewotin R,C and Gelbart,W.M (1993).
An Introduction to Genetic Analysis. 5th. New York; W.H. Freeman dan
Company. Pp. 541-543.
Kuchel, Philip & Greorgy B. Ralston. 2006. Schaum’s Easy Outline. Erlangga
Poedjiadi, Anna & Supriyanti, Titin F. M. Dasar – Dasar Biokimia. Jakarta:
Universitas Indonesia Press
Reece, Campbell: Mitchell. (2000). Biologi. Edisi kelima. Erlangga
Stryer, Lubert. 1981. Biochemistry. New York. Freemanand Company
Watson, J.D ; Hopkins, N. H: Robert, J..: Steitz, J.A dnd Weiner, A.M. (1987).
Molecular
Biology
of
The
Gene.4th
Ed.
California
The
Benjamin/Cummings Publishing Company. Pp. 571-573
http://google.com/ Expresi Gen (From Gene of Protein) diambil dari Campbell et
al (2009), Biology 8th.
37
INDEKS
1. DNA : Deoxyribo nucleic acid
2. RNA : ribonucleic acid; asam ribonukleat
3. mRNA : messanger RNA sebagai pembawa pesan yang mengagkut informasi
dalam sebuah gen kepada ribosom.
4. tRNA : transfer RNA bertindak sebagai adapter (penyetaraan translasi
informasi didalam rangkaian nukleotida mRNA menjadi asam amino yang
spesifik.
5. rRNA : ribosom RNA berfungsi mesin pemmbentukan protein dari cetakan
mRNA.
6. Doube Heliks : struktur DNA yang seperti pita ganda, dimana menurut
Watson Crick penempatan satu benang dalam cara 3’ →5’ dalam heliks dan
yang lain dalam cara 5’ → 3’. Basa A dan T dikatakan komplementer
demikian juga basa G dan C.
7. Replikasi DNA : pembentukan DNA rangkap ganda yang komplemen satu
dengan yang lainnya dan persis seperti DNA semula.
8. Transkripsi DNA : sintesis RNA dibawah arahan DNA
Untai DNA
Pengkodean→ 5’ – T G G A A T T G T G A G C G G A T A A C A A T T T C A C A C – 3’
Cetakan
Transkip
DNA
→ 3’ –A C C T T A A C A C T C G C C T A T T G T T A A A G T G T G – 5’
→
UGGAAUUGUGAGCGGAUAACAAUUUCACAC
Ingat: A jadi U; T jadi A; C jadi G pada transkripsi DNA menjadi RNA
38
9. Translasi DNA : sintesis polipeptida yang terjadi melalui arahan dari mRNA
yang terjadi pada ribosom.
10. Metionin : kodon awal sintesis protein
11. UAA, UAG, UGA : kodon stop.
12. Leading strand: sintesis DNA terjadi secara kontinu (terus- menerus) pada
arah 5’ → 3’ oleh DNA polimerase.
13. Lagging strand: disintesis secara tidak kontinu. Primase mensintesis primer
RNA pendek, yang diperpanjang oleh DNA polymerase, membentuk fragmen
Okazaki.
14. Polimerase DNA : enzim yang berfungsi mempolimerisasi nukleotidanukleotida
15. Ligase DNA : enzim yang berperan menyambung DNA utas lagging
16. Primase DNA : enzim yang digunakan untuk memulai polimerisasi DNA pada
lagging strand
17. Helikase DNA : enzim yang berfungsi membuka jalinan DNA double heliks.
18. Single strand DNA-binding protein : menstabilkan DNA induk yang terbuka
19. Tempat terjadinya penerjemahan/translasi adalah ribosom yaitu suatu
komponen partikel yang memfasilitasi penggabungan asam amino yang
berurutan menjadi rantai polipeptida.
20. Sisi yang terdapat dalam ribosom:
a. sisi P mengikat tRNA yang membawa rangkaian polipeptida,
b. sisi A mengikat tRNA yang membawa asam amino berikutnya yang akan
dirangkai,
c. sisi E adalah tempat keluarnya tRNA.
39
21. Ikatan Fosfodiester: Setiap unit tersebut tersusun dari kelompok fosfat yang
berikatan dengan gula pada atom karbon no. 5 dengan karbon no.3 dari gula
berikutnya disebut ikatan fosfodiester (Wolf, 1993).
22. Ikatan hidrogen antara Adenin dengan Timin dan antara Guanin dengan
Citosin (Wolf, 1993).
23. Isolasi DNA adalah suatu proses untuk memisahkan DNA dari suatu sel
makhluk hidup baik dari inti, mitokondria maupun kloroplas.
40