PENGUJIAN KONSENTRASI GEL AGAROSA 1

Volume 5, Nomor 9, Oktober 2015
ISSN 2085-7764
JURNAL KESEHATAN
RAJAWALI
Jurnal Ilmu-Ilmu Kesehatan
JURNAL ENAM BULANAN
Hubungan Cara Menyusui Dengan Kejadian Payudara Bengkak Pada Ibu
Nifas Di Puskesmas Parongpong Periode Mei Tahun 2015
Gambaran Penilaian Status Gizi Riwayat Kehamilan Pada Ibu Bersalin
Dan Berat Badan Bayi Baru Lahir Di Puskesmas Melong Asih Kota Cimahi
Tahun 2014
Pola Asuh, Kecerdasan Emosional, Dan Anak Usia Pra Sekolah (3-6
Tahun) Di Tk-Nurul Ikhlas Cibiru Bandung
Peran Bidan Dalam Mendukung Pemberian Air Susu Ibu
Pengujian Konsentrasi Gel Agarosa 1% Dan 1,2% Pada Elektroforesis DNA
Mycobacterium Tuberculosis
Perbandingan Hasil Pemeriksaan Hitung Jenis Leukosit Menggunakan
Metode Manual Dengan Laser-Based Flowcytometry
Diterbitkan oleh
Sekolah Tinggi Ilmu Kesehatan
(STIKes Rajawali Bandung)
JURNAL KESEHATAN RAJAWALI
Jurnal Ilmu-Ilmu Kesehatan
Volume 5, Nomor 9, Oktober 2015
ISSN 2085-7764
Jurnal Kesehatan Rajawali merupakan jurnal ilmu-ilmu kesehatan yang memuat naskah hasil
penelitian bidang ilmu keperawatan, kebidanan dan analis kesehatan. Diterbitkan 6 bulan
sekali pada bulan Maret dan Oktober
Penanggungjawab
Tonika Tohri. S.Kp., M.Kes
Pemimpin Redaksi
Eny Kusmiran, S.Kp., M.Kes
Wakil Pimpinan Redaksi
Ally Kafesa, S.ST.,M.Si
Redaksi Pelaksana
Iga Retia, S.ST
Redaksi
Rustandi, dr., M.P.H.
H. Rachmat Sobarna, dr., Sp.O.G.
Handarini, S.Pd.,M.Si
Istianah S.Kep. Ners
Erni Hernawati, S.S.T.,M.M
Sekretaris Redaksi
Artha Kusumawardani, S.ST
Humas
Faruk Rasyid, S.E.
Tata Usaha
Fotuho Woruwu, S.E.
Alamat Redaksi
Sekolah Tinggi Ilmu Kesehatan Rajawali
Jalan Rajawali Barat Nomor 38 Bandung
Email: [email protected]
Vol.5, No.9, Oktober 2015;19-23
PENGUJIAN KONSENTRASI GEL AGAROSA 1% DAN 1,2%
PADA
ELEKTROFORESIS
DNA
Mycobacterium
Tuberculosis
Suyarta Efrida Pakpahan
ABSTRACT
Introduction: Tuberculosis (TB) is an infectious disease caused by Mycobacterium tuberculosis.
Indonesia as the country with the highest number of TB patients to 4th in the world after India, China,
and South Africa (WHO). Failure prevention of tuberculosis, one of which caused by errors in the
diagnostic process. The purpose of this study to determine the concentration of 1% agarose gel to
produce quality tape / band DNA better than the concentration of 1.2% agarose gel electrophoresis of
DNA Mycobacterium tuberculosis. This research method is experimental study, in which as many as
15 samples used sputum samples with positive test results on microscopic examination Ziehl Neelsen.
Research data obtained are then processed by descriptive statistical tests. The result of data
processing obtained on average processing image J at a concentration of 1% agarose gel that is
higher than 0.57 cm2 on 1.2% agarose gel concentration is 0.42 cm2.The conclusions of this study
there are differences in test results between agarose gel concentration of 1% to 1.2% agarose
electrophoresis of Mycobacterium tuberculosis DNA.
Keywords: Concentration of agarose gel, Mycobacterium tuberculosis.
PENDAHULUAN
Penyakit Tuberkulosis (TB) merupakan penyakit menular yang disebabkan oleh Mycobacterium
tuberculosis. Penyakit ini merupakan penyebab utama kematian akibat penyakit infeksi di seluruh
dunia setelah HIV. Di Indonesia, penyakit ini masih menjadi masalah kesehatan di masyarakat. Hal ini
dibuktikan dengan Indonesia sebagai negara dengan pasien TB terbanyak ke-4 didunia setelah India,
Cina, dan Afrika Selatan (WHO) 1.
Kegagalan penanggulangan penyakit tuberkulosis, salah satunya dikarenakan kesalahan pada
proses diagnosis. Pada umumnya metode diagnosis penyakit tuberkulosis dilakukan secara
konvensional seperti pemeriksaan mikroskopis dan kultur. Namun, metode tersebut memiliki banyak
kelemahan. Pada pemeriksaan mikroskopis hasil pemeriksaan yang didapatkan kurang sensitif dan
tidak spesifik terhadap spesies bakteri M. tuberculosis. Pemeriksaan mikroskopik memerlukan bakteri
2
minimal 10.000 sel/ml . Pemeriksaan kultur merupakan metode gold standar, tetapi memerlukan
3
waktu yang cukup lama (paling cepat sekitar 6 minggu) untuk mendapatkan hasil pemeriksaan .
Dalam mengatasi keterbatasan cara diagnosis tersebut, sejumlah penelitian mengembangkan metode
berdasarkan pada amplifikasi DNA menggunakan metode PCR.
Metode PCR merupakan metode yang cepat, sensitif dan spesifik jika dibandingkan dengan
pemeriksaan kultur. Tahap pertama yang dilakukan dalam metode PCR adalah proses isolasi DNA.
Isolasi DNA ini digunakan untuk memperoleh DNA murni yang dilakukan dengan proses melisiskan
membran sel, yang dilanjutkan dengan tahap ekstraksi dan pemisahan DNA dari berbagai komponen
4
sel yang tidak diinginkan seperti protein dan RNA . Setelah proses isolasi DNA, kemudian
konsentrasi DNA diukur menggunakan spektrofotometer untuk mengetahui kemurnian DNA yang
dilakukan pada panjang gelombang 260nm-280nm. Metode PCR (Polymerase Chain Reaction)
merupakan metode amplifikasi (penggandaan) DNA dengan cepat segmen DNA tertentu yang spesifik
5..
Hasil metode PCR selanjutnya divisualisasikan pada elektroforesis Elektroforesis gel agarosa
merupakan metode standar yang digunakan untuk identifikasi, pemisahan, dan purifikasi fragmen
6.
DNA
Konsentrasi gel agarosa yang digunakan dalam proses elektroforesis merupakan salah satu
faktor yang berpengaruh dalam laju migrasi DNA untuk memisahkan molekul DNA berdasarkan berat
7
molekul . Penggunaan gel dengan konsentrasi yang berbeda, dapat menghasilkan perbedaan ukuran
Pengujian Konsentrasi Gel Agarosa 1% dan 1,2% Pada Elektroforesis DNA Mycobacterium tuberculosis
(Suyarta Efrida Pakpahan) |
19
Vol.5, No.9, Oktober 2015;19-23
fragmen DNA. Molekul DNA berbanding terbalik dengan konsentrasi gelnya yaitu konsentrasi gel
agarosa yang rendah memberikan resolusi yang baik untuk fragmen yang besar antara band yang
dekat ukurannya8.
Penelitian mengenai hasil elektroforesis DNA menggunakan Mycobacterium tuberculosis telah
dilakukan oleh Bahar dan Chintia. Pada kedua penelitian tersebut, terdapat perbedaan metode isolasi
DNA dan konsentrasi gel agarosa yang digunakan pada saat elektroforesis yakni isolasi DNA dengan
metode boom yang dilanjutkan elektroforesis menggunakan konsentrasi gel agarosa 1% oleh dan
isolasi DNA metode salting out dengan elektroforesis menggunakan konsentrasi gel agarosa 1,2% 8,9.
Hingga saat ini belum diketahui bagaimana perbedaan hasil elektroforesis DNA Mycobacterium
tuberculosis menggunakan metode isolasi DNA yang sama dan menggunakan konsentrasi gel
agarosa 1% dan 1,2% pada saat elektroforesis. Berdasarkan latar belakang diatas, penulis
bermaksud melakukan penelitian ”Pengujian Konsentrasi Gel Agarosa 1% dan 1,2% pada
Elektroforesis DNA Mycobacterium tuberculosis.
METODE PENELITIAN
Penelitian ini dilakukan untuk menentukan konsentrasi gel agarosa yang dapat menghasilkan
band/pita yang jelas pada saat visualisasi menggunakan alat elektroforesis pada pemeriksaan bakteri
Mycobaterium tuberculosis.
Kriteria Sampel yang digunakan adalah sampel sputum dengan hasil pemeriksaan positif
pada pemeriksaan mikroskopis pewarnaan Basil Tahan Asam (BTA). Sampel yang digunakan
sebanyak 15 sampeli dari Puskesmas Melong Asih dan Puskesmas Cibeureum serta dari RSAU Dr.
M. Salamun.
Sputum dicampur dengan larutan NaOH 1N dengan perbandingan 1:1. didiamkan selama 30
menit. Dari campuran tersebut diambil 1,5 mL, masukkan ke dalam tabung eppendorf dicentrifuge
selama 5 menit pada kecepatan 11.000xg lalu pellet diambil kemudian ditambahkan 250 l buffer lisis
dan 5 l proteinase K diinkubasi pada suhu 55ºC selama 1jam kemudian diinkubasi kembali pada
suhu ruang selama 5 menit, lalu ditambahkan 300 l fenol. Selanjutnya divortex selama 5 menit,
disentrifuge 5 menit pada kecepatan 14.000xg. Selanjutnya dipindahkan fase atas A l (sesuai
banyaknya fase atas yang terbentuk, minimal 200 l). Fase atas(A) + (0,1xA) l NaOAC +(1,4xA) l
etanol absolut lalu dibolak-balik perlahan lalu campuran tersebut disimpan pada suhu -20ºC selama
30 menit. Campuran kemudian disentrifuge selama 15 menit pada kecepatan 14.000xg sehingga
terbentuk supernatan dan filtrat. Selanjutnya dekantasi supernatan tambahkan 200 l etanol 70%,
sentrifuge 5 menit dengan kecepatan 10.000xg. Supernatan dibuang keringkan dengan menggunakan
alat speed vac. DNA dilarutkan dengan menambahkan 25 l H2O free RNAse. DNA diukur
konsentrasinya menggunakan alat spektrofotometer. Agar didapatkan hasil elektroforesis yang baik,
diperlukan proses isolasi DNA yang benar. Konsentrasi DNA yang layak diamplifikasi 1,8-2,0. Hasil
isolasi DNA tersebut kemudian diamplifikasi menggunakan metode PCR (Polymerase Chain Reaction)
dan divisualisasikan dengan metode elektroforesis menggunakan dua konsentrasi gel agarosa yang
berbeda yaitu konsentrasi gel agarosa 1% dan 1,2%.
Pembuatan gel agarosa; agarosa serbuk ditimbang sesuai dengan konsentrasi yang akan
dibuat (1,0% dan 1,2%) dilarutkan dalam buffer TAE 1x dipanaskan pada hotplate hingga mendidih
dan berwarna jernih. Setelah mendidih, gel didinginkan hingga suhu ±55ºC lalu ditambahkan Cybr
green sebanyak 1,5 l dan dihomogenkan. Gel selanjutnya dimasukkan kedalam cetakan yang telah
disisipkan sisir elektroforesis dibagian sisi-sisinya. Gel dibiarkan membeku (± selama 30 menit).
Lakukan elektroforesis hasil PCR. Hasil PCR dilihat menggunakan alat UV translluminator/gel
dokumen. Lihat fragmen DNA yang terbentuk dan dibandingkan dengan kontrol positif dan marker
Hind III 281-310 pb. Hasil : Positif : terbentuk pita/band yang sejajar dengan kontrol positif dan ada
diantara 281-310 pb. Negatif : tidak terbentuk pita/band. Luas area ketebalan pita/band DNA yang
terbentuk dari hasil elektroforesis kemudian diolah menggunakan software image J.
HASIL PENELITIAN
Hasil dari grafik dibawah ini menunjukkan luas area pita/band DNA hasil elektroforesis dengan
konsentrasi gel agarosa 1% dan 1,2% lalu diukur menggunakan image J. Penghitungan image J
dilakukan dengan 10 kali pengulangan.
Pengujian Konsentrasi Gel Agarosa 1% dan 1,2% Pada Elektroforesis DNA Mycobacterium tuberculosis
(Suyarta Efrida Pakpahan) |
20
Vol.5, No.9, Oktober 2015;19-23
Data hasil luas area pita/band DNA hasil elektroforesis dengan konsentrasi gel agarosa 1%
dan 1,2% yang telah diolah menggunakan image J, kemudian dilakukan uji statistik deskriptif
menggunakan software SPSS. Tabel 4.2 menunjukkan hasil nilai rata-rata (mean), dan standar
deviasi pada konsentrasi gel agarosa 1% dan 1,2%. Sedangkan tabel 4.3 menunjukkan hasil nilai
tertinggi dan nilai terendah pada konsentrasi gel agarosa 1% dan 1,2%.
Tabel 4.2 Nilai rata-rata dan standar deviasi konsentrasi gel agarosa 1% dan 1,2%.
Konsentrasi Gel
Nilai rata-rata
Standar deviasi
Pengujian Konsentrasi Gel Agarosa 1% dan 1,2% Pada Elektroforesis DNA Mycobacterium tuberculosis
(Suyarta Efrida Pakpahan) |
21
Vol.5, No.9, Oktober 2015;19-23
Agarosa
Konsentrasi 1%
Konsentrasi 1,2%
cm2
0,57
0,42
cm2
0,25
0,14
Tabel 4.3 Nilai tertinggi dan terendah pada konsentrasi gel agarosa 1% dan 1,2%
Konsentrasi Gel
Agarosa
Konsentrasi 1%
Konsentrasi 1,2%
Nilai tertinggi
cm2
0,99
0,73
Nilai terendah
cm2
0,20
0,18
PEMBAHASAN
Secara umum perbedaan hasil elektroforesis dapat dilihat dengan visualisasi secara
langsung. Tetapi untuk memperoleh nilai ketebalan DNA maka hasil elektroforesis selanjutnya difoto
menggunakan alat gel dokumen yang ditunjukkan pada gambar 4.1 dan gambar 4.2, selanjutnya hasil
kemudian diolah menggunakaan software image J. Terdapat beberapa penelitian yang menggunakan
software image J untuk mengukur ketebalan atau kerapatan pita/band DNA. Software image J
digunakan untuk mengukur ketebalan pita/band DNA10. Prinsip pembacaan menggunakan image J
adalah berdasarkan hasil ketebalan pita/band DNA dari sampel menjadi bentuk densitogram sehingga
dapat diketahui luas area puncak masing-masing band DNA yang terpisah11. Hasil elektroforesis yang
didapatkan sesuai dengan nilai pengukuran menggunakan image J, semakin tebal pita/band semakin
besar nilai image J seperti yang dijelaskan pada penelitian Suci11 Pada grafik 4.1 dapat dilihat data
hasil pemeriksaan menggunakan image J. Hasil pengukuran tersebut menunjukkan perbedaan nilai
ketebalan dan tingkat kejelasan pita/band DNA pada konsentrasi gel agarosa 1% yang lebih tinggi
dibandingkan konsentrasi 1,2%. Hasil data dari image J selanjutnya diuji menggunakan uji statistik
deskriptif menggunakan software SPSS.
Didapatkan nilai rata-rata (mean), standar deviasi, nilai tertinggi (maksimum) dan terendah
(minimum) dari konsentrasi gel agarosa 1% dan 1,2% yang ditunjukkan pada Tabel 4.2 dan 4.3. Tabel
4.2 menunjukkan adanya perbedaan rata-rata antara konsentrasi gel agarosa 1% dan 1,2% dengan
selisih nilai mean sebesar 0,15 cm2 dan hasil yang lebih tinggi pada konsentrasi 1% yaitu 0,57 cm2
dan konsentrasi 1,2% yaitu 0,42 cm2. Hasil standar deviasi yang digunakan sebagai ukuran untuk
membandingkan penyebaran dua kelompok pengamatan menunjukkan hasil 0,25 cm2 pada
konsentrasi gel agarosa 1% dan 0,14 cm2 pada konsentrasi gel agarosa 1,2%. Sedangkan pada tabel
4.3 menunjukkan nilai tertinggi (maksimum) pada konsentrasi gel agarosa 1% yaitu 0,99 cm2 lebih
tinggi dibandingkan konsentrasi gel agarosa 1,2% yaitu 0,73 cm2 dan nilai terendah (minimum) pada
konsentrasi gel agarosa 1% yaitu 0,20 cm2 lebih tinggi pula dibandingkan konsentrasi gel agarosa
1,2% yaitu 0,18 cm2.
Hasil penelitian dan pengolahan data menggunakan uji statistik deskriptif yang telah dilakukan
terdapat perbedaan hasil penelitian pengujian konsentrasi gel agarosa 1% dan 1,2% yaitu nilai ratarata, hasil standar deviasi, nilai tertinggi (maksimum) dan nilai terendah (minimum) pada konsentrasi
gel agarosa 1% lebih tinggi dibandingkan konsentrasi gel agarosa 1,2%. Lalu dapat dilihat pula dari
hasil elektroforesis pada gambar 4.1 dan gambar 4.2, maka konsentrasi gel agarosa 1% memberikan
hasil elektroforesis yang lebih baik. Migrasi DNA yang baik dipengaruhi oleh beberapa faktor yaitu
ukuran molekul DNA, konformasi DNA, voltase yang digunakan dan konsentrasi gel agarosa yang
digunakan. Pemisahan molekul-molekul efektif dengan cara menyeleksi terlebih dahulu gel yang
tepat. Hal ini didukung oleh Sambrook yang mengungkapkan bahwa penggunaan konsentrasi
agarosa merupakan salah satu faktor yang berpengaruh dalam laju migrasi DNA dan penggunaan gel
dengan konsentrasi yang berbeda dapat mengatasi perbedaan ukuran fragmen DNA7. Konsentrasi gel
agarosa yang rendah memberikan resolusi yang baik untuk fragmen yang besar antara band yang
dekat ukurannya. Berdasarkan literatur tersebut, fragmen DNA Mycobacterium tuberculosis yang
termasuk fragmen besar dapat menggunakan konsentrasi gel agarosa yang lebih rendah yaitu
konsentrasi gel agarosa 1% untuk memberikan hasil resolusi yang baik .
Pengujian Konsentrasi Gel Agarosa 1% dan 1,2% Pada Elektroforesis DNA Mycobacterium tuberculosis
(Suyarta Efrida Pakpahan) |
22
Vol.5, No.9, Oktober 2015;19-23
Penelitian ini memberikan informasi mengenai pengujian konsentrasi gel agarosa 1% dan
1,2% pada elektroforesis DNA Mycobacterium tuberculosis yang belum pernah dilaporkan
sebelumnya. Informasi tersebut diharapkan dapat menambah referensi dan informasi mengenai
penggunaan konsentrasi gel agarosa yang paling efisien yang dapat digunakan pada elektroforesis
DNA Mycobacterium tuberculosis. Konsentrasi gel agarosa yang lebih rendah, dapat menghasilkan
resolusi yang lebih baik untuk elektroforesis DNA Mycobacterium tuberculosis dan dapat mengurangi
penggunaan agarosa pada proses pembuatan gel agarosa12.
KESIMPULAN
1. Berdasarkan hasil penelitian dan pengolahan data “Pengujian konsentrasi gel agarosa 1%
dan 1,2% pada elektroforesis DNA Mycobacterium tuberculosis” dapat disimpulkan bahwa:
Rata-rata hasil pengolahan image J pada konsentrasi gel agarosa 1% yaitu 0,57 cm 2 lebih
tinggi dibandingkan pada konsentrasi gel agarosa 1,2% yaitu 0,42 cm2.
2. Terdapat perbedaan hasil pemeriksaan elektroforesis DNA pada konsentrasi gel agarosa 1%
dan 1,2% yaitu pada konsentrasi gel agarosa 1% band DNA terlihat lebih jelas dibandingkan
pada konsentrasi gel agarosa 1,2%.
SARAN
1. Untuk tenaga kesehatan disarankan menggunakan metode diagnosis yang cepat dan tepat untuk
mencegah terjadinya penyebaran penyakit tuberkulosis akibat keterlambatan diagnosis, alternatif
pertama untuk mendeteksi dini penyakit tersebut perlu digunakan metode PCR (Polymerase
Chain Reaction) dengan menggunakan konsentrasi gel agarosa 1% pada tahap visualisasi
elektroforesis.
2. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut disarankan untuk melakukan penelitian konsentrasi gel
agarosa pada Mycobacterium sp. dengan menggunakan sampel darah.
KEPUSTAKAAN
1. World Health Organization. Global Tuberculosis Report 2013. France: World Health Organization;
2013.
2. Lina M, Pratiwi S, Fera I. Sensitivitas metode PCR (Polymerase chain reaction) dalam
mendeteksi isolat klinis Mycobacterium tuberculosis. 2002; 21(1): 7-14.
3. Perhimpunan Dokter Paru Indonesia. Tuberkulosis, pedoman diagnosis & penatalaksanaan di
Indonesia. Jakarta: Perhimpunan Dokter Paru Indonesia; 2006
4. Fatchiyah. Biologi Molekuler Prinsip Dasar Analisis. Jakarta: Erlangga; 2011. p. 112-113.
5. Campbell, A. Biologi Moleculer. Jakarta: Erlangga; 2008. p. 437-438.
6. Sudjadi. Bioteknologi Kesehatan. Yogyakarta: Kanisius; 2008. p. 39-40.
7. Sambrook, Joseph. Moleculer Cloning A Laboratory Manual 3rd ed. New York: Cold Spring
Harbor Laboratory Press; 2007. p. 5.4-5.6.
8. Bahar, Elizabeth. Aplikasi Metoda Loop Mediated Isothermal Amplification (LAMP) Terhadap Gen
MPB64 (Rv3036c) Sebagai Diagnosis Cepat Infeksi M. Tuberculosis. Lampung 2013: 253-257.
9. Chintia, Dewita. Gambaran Hasil Pemeriksaan Mycobacterium tuberculosis Metode Pewarnaan
BTA Ziehl Neelsen dan Metode Polymerase Chain Reaction (PCR)
10. I Nyoman, Rahmat A, Yuniar M. Pusat Ilmu Hayati Institut Teknologi Bandung. Penanda molekul
DNA Mikrosatelit untuk Karakterisasi Bibit Jamur Kuping (Auricularia polytricha [Mont.] sacc.)
2008 Jan 7; 13(1): 12.
11. Suci, Fitriani. Bogor Agricultural University Scientific Repository : Diferensiasi Temulawak, Kunyit,
dan Bangle Berdasarkan Interpretasi Kromatografi Lapis Tipis Menggunakan ImageJ: 2011;
12(5): 4-14.
12. Bintang Maria, Biokimia Teknik Penelitian. Jakarata: Erlangga; 2010; p.37.
13. Lee, S. RESEARCH NOTE. Modified gel preparation for distinct DNA fragment analysis in
agarose gel electrophoresis. 2010. 27(2): 351-354.
Pengujian Konsentrasi Gel Agarosa 1% dan 1,2% Pada Elektroforesis DNA Mycobacterium tuberculosis
(Suyarta Efrida Pakpahan) |
23