LAPORAN TTKHKP DAN BADAN POM

advertisement
Ringkasan Pengkajian Keamanan Pangan Jagung PRG Event MIR604
I.
Pendahuluan
Jagung PRG event MIR604 adalah produk perusahaan Syngenta yang diklaim
dikembangkan untuk memberikan manfaat bagi ketahanan terhadap serangga hama
penggerek akar jagung (corn rootworm) Coleopteran. Jagung PRG event MIR604
menghasilkan protein mCry3A dan enzim PMI (phosphomannose isomerase).
Jagung PRG event MIR604 telah dinyatakan aman sebagai pangan dan atau pakan
di 10 negara yaitu Australia (2006), Taiwan (2007), Kanada (2007), Jepang (2007),
Korea (2007), Meksiko (2007), Filipina (2007), Amerika Serikat (2007), Rusia (2007)
dan Cina (2008).
Berdasarkan Peraturan Kepala Badan POM Nomor HK.00.05.23.3541 Tahun 2008
tentang Pedoman Pengkajian Keamanan Pangan Produk Rekayasa Genetik,
TTKHKP telah melakukan pengkajian keamanan pangan jagung PRG event MIR604
terhadap informasi genetik dan informasi keamanan pangan yang terdiri atas
kesepadanan substansial, alergenisitas, dan toksisitas sebagaimana diuraikan di
bawah ini.
II.
II.1
Informasi Genetik
Elemen Genetik
Jagung PRG event MIR604 mengandung dua gen interes yaitu gen mCry3A dan
gen PMI. Gen mCry3A memproduksi protein mCry3A, yang bertanggung jawab
dalam ketahanan terhadap beberapa spesies serangga hama penggerek akar
jagung Coleopteran (Diabrotica virgifera virgifera Le Conte, D. longicornis barberi
Smith and Lawrence, dan D. virgifera zeae Krysan and Smith). Gen PMI
(phosphomannose isomerase) bertanggung jawab sebagai marka seleksi. Promoter
yang digunakan untuk gen mCry3A adalah MTL (metallothionein-like Zea mays)
yang merupakan promoter spesisfik yang dapat mengarahkan ekspresi gen interes
khusus pada akar tanaman jagung (Zea mays), dengan terminator NOS (nopaline
synthase) dari Agrobacterium tumefaciens. Sedangkan promoter untuk gen PMI
adalah ZmUbilInt (polyubiquitin Zea mays) dengan terminator NOS.
II.2
Sumber Gen Interes
Gen mCry3A berasal dari Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis; dan gen PMI
berasal dari Escherichia coli. Bacillus thuringiensis telah digunakan sebagai
pestisida hayati yang aman oleh petani sejak tahun 1958.
II.3
Sistem Transformasi
Jagung PRG event MIR604 dirakit menggunakan plasmid vektor pZM26 melalui
teknik transformasi dengan mediasi vektor Agrobacterium tumefaciens pada eksplan
immature embryos tanaman jagung.
II.4
Stabilitas Genetik
1
Analisis stabilitas genetik integrasi gen interes dari jagung PRG event MIR604 pada
beberapa generasi dilakukan dengan Southern blot fingerprint. Pola hibridisasi
(hybridization pattern) jagung PRG event MIR604 selama tiga generasi silang balik
(BC4, BC5 dan BC6) telah diidentifikasi. Hasilnya menunjukkan bahwa gen sisipan
TDNA dari pZM26 yang diinkorporasikan ke dalam jagung PRG event MIR604
adalah stabil untuk enam generasi silang balik (BC6). Selanjutnya, tingkat
kandungan protein mCry3A dan enzim PMI dalam jagung PRG event MIR604
diketahui stabil untuk empat generasi silang balik secara berturut-turut (over four
successive backcross generations). Stabilitas genetik pewarisan sifat ketahanan
serangga hama pada jagung PRG event MIR604 mengikuti prinsip segregasi
Mendel.
Data hibridisasi Southern blot memberikan konfirmasi bukti yang mendukung
analisis PCR TaqMan® bahwa jagung PRG event MIR604 mengandung kopi tunggal
(single copy) dari gen mCry3A dan gen PMI. Selain itu, berdasarkan analisis
Southern blot ditemukan hasil yang penting yaitu tidak mengandung sekuen vektor
backbone yang berada dalam pZM26. Stabilitas genetik jagung PRG event MIR604
dilaporkan dalam bentuk company report Syngenta Biotechnology dengan judul
Molecular Characterization of Event MIR604 Maize (Corn) Expressing a Modified
Cry3A Bacillus thuringiensis Protein oleh Hope Hart and Scott Rabe pada tahun
2004.
Berdasarkan hasil pengkajian informasi genetik disimpulkan bahwa:
a. jagung PRG event MIR604 mengandung satu kopi gen mCry3A dan gen PMI;
b. jagung PRG event MIR604 tidak mengandung sekuen vektor backbone yang
berada dalam pZM26;
c. dua gen interes (mCry3A dan PMI) yang diintroduksikan ke jagung PRG event
MIR604 masih stabil sampai enam generasi silang balik; dan
d. dua gen interes (mCry3A dan PMI) yang diintroduksikan ke jagung PRG event
MIR604 diwariskan mengikuti hukum Mendel.
III.
Informasi Keamanan Pangan
III.1
Kesepadanan Substansial
Hasil pengkajian kesepadanan substansial jagung PRG event MIR604 secara
lengkap dilaporkan dalam company report No. SSB-111-04 A2, berjudul
“Compositional Analysis of Grain and Whole Plants from Transgenic Maize (Corn)
Event MIR604” (C.Kramer, 2005).
Dalam pengkajian tersebut, komposisi biji jagung dan seluruh bagian tanaman
jagung (forage) dari jagung PRG event MIR604 dan jagung non PRG diperoleh dari
jagung yang ditanam pada tahun 2002 di 3 lokasi di USA dan yang ditanam pada
tahun 2003 di 7 lokasi di USA. Semua sampel tahun 2002 dianalisis oleh WoodsonTenent Laboratory Inc., Goldston NC. Sedangkan semua sampel tahun 2003
dianalisis oleh Covance Laboratories Inc., Madison, WI.
Secara lengkap komponen jagung dianalisis dalam pengkajian ini, yaitu komponen
proksimat termasuk total dietary fiber (TDF), neutral detergent fiber (NDF), acid
detergent fiber (ADF), mineral (kalsium, fosfor, kalium, natrium, besi, tembaga, dan
seng), vitamin (β-karoten, α-, β-, δ-, γ-tokoferol serta vitamin larut dalam air seperti
asam folat, tiamin, riboflavin, niasin, asam pantotenat, piridoksin, dan vitamin C),
2
asam amino, asam lemak, metabolit sekunder seperti asam ferulat, asam p-kumarat,
furfural, inositol, asam fitat, rafinosa, dan inhibitor tripsin.
Dari hasil analisis ditemukan bahwa untuk penanaman tahun 2002 komposisi jagung
PRG event MIR604 umumnya tidak berbeda dengan jagung non PRG. Untuk
penanaman tahun 2003, ada sedikit perbedaan misalnya kadar protein biji jagung
PRG event MIR604 lebih tinggi sekitar 4-7% dibandingkan dengan jagung non PRG,
juga untuk kadar air (3% lebih tinggi) dan kalsium (4-10% lebih tinggi). Umumnya
nilai rata-rata masih berada dalam kisaran komposisi yang dilaporkan dalam
pustaka, seperti yang dilaporkan OECD (2002).
Dari hasil pengkajian kesepadanan substansial dapat disimpulkan bahwa jagung
PRG event MIR604 sepadan secara substansial dengan jagung non PRG.
III.2
Alergenisitas
Analisis sekuen asam amino telah dilakukan terhadap protein mCry3A yang
dihasilkan dari gen mCry3A dan enzim PMI yang dihasilkan dari gen PMI. Hasilnya
dilaporkan sebagai company report, yaitu:
1. “Modified Cry3A Protein as Expressed in Transgenic Maize Event MIR604:
Assessment of Amino Acid Homology with Known Toxins”, oleh Jennifer
Zawodny. Penelitian dilakukan di Syngenta Seeds, Inc. Product Registration
Group, Post Office Box 12257, 3054 Cornwallis Road, Research Triangle Park,
North Carolina, USA 27709-2257.
2. “Phosphomannose Isomerase Protein as Expressed in Transgenic Maize Event
MIR604: Assessment of Amino Acid Homology with Known Toxins”, oleh
Jennifer Zawodny. Penelitian dilakukan di Syngenta Seeds, Inc. Product
Registration Group, Post Office Box 12257, 3054 Cornwallis Road, Research
Triangle Park, North Carolina, USA 27709-2257.
Uji bioinformatik menggunakan data alergen yang tersimpan di NCBI maupun Bank
Data Syngenta dengan menggunakan program SWISSPROT, BLASTP dan FASTA.
Sekuen protein mCry3A juga di-screen dan dibandingkan pada setiap peptida dari
80 asam amino dan pada segmen 8 asam amino dengan protein alergen untuk
melacak keberadaan epitop pengikatan terhadap IgE.
Analisis perbandingan sekuen asam amino dengan data NCBI menunjukkan bahwa
protein mCry3A tidak homolog dengan protein toksin atau alergen pada keseluruhan
sekuen dan sekuen peptida 80 asam amino. Sedangkan pada enzim PMI, terdapat 1
lokasi yang mirip dengan suatu alergen alfa parvalbumin (110 asam amino dari
katak Rana). Sekuen asam amino “DLSDKETT” yang mirip tersebut terdapat pada
posisi 327-334 pada enzim PMI jagung PRG event MIR604 dan posisi 77-84 pada
sekuen alergen alfa parvalbumin. Uji selanjutnya dilakukan di laboratorium Hilger
(penemu parvalbumin). Hasil pengujian menggunakan enzim PMI dari E. coli
rekombinan menunjukkan tidak ada cross reactivity diantara IgE serum pasien yang
alergi terhadap katak dengan enzim PMI.
Karakterisasi protein mCry3A dan enzim PMI yang diproduksi dari E. coli
rekombinan dan jagung PRG meliputi uji imunoreaktivitas, berat molekul, status
glikosilasi, dan sekuen asam amino N-terminal. Pengujian dilakukan di laboratorium
Syngenta yang menerapkan Good Laboratory Practice. Kedua protein diekstrak dan
dimurnikan dengan berbagai kromatografi kolom. Pengujian kualitas dan kuantitas
3
protein dilakukan dengan metoda Bradford, SDS-PAGE, ELISA, Western blot, uji
aktivitas enzimatik maupun bioassay, analisis glikosilasi dengan DIG detection kit,
dan sekuen asam amino dengan Edman degradation. Uji daya cerna dilakukan
dengan menggunakan simulated gastric fluid (SGF) dan simulated intestine fluid
(SIF).
Enzim PMI yang diproduksi dari E. coli berbeda pada 16 asam amino di N-terminal
yang sifatnya non fungsional. Namun demikian karakteristik biokimiawi,
imunoreaktivitas, aktivitas biologi dan reaksi enzimatik kedua enzim PMI (E. coli dan
jagung PRG) sama.
Rata-rata protein mCry3A adalah 0,0001% dari protein total (kurang dari 1 µg protein
mCry3A per gram pipilan atau kurang dari 1 ppm). Pada semua fase pertumbuhan,
kandungan protein rata-rata adalah 3–23 µg/g (daun), 2–4 µg/g (akar) dan 0,9-11
µg/g (seluruh tanaman). Ekspresi protein mCry3A pada galur inbred lebih tinggi dari
hibrida. Enzim PMI berkisar antara 0-0,4 µg/g. Pada biji kurang dari 0,14 µg/g dan
pada inbred mirip dengan hibrida.
Hasil analisis stabilitas terhadap protein mCry3A dan enzim PMI menunjukkan
bahwa protein mCry3A stabil sampai empat generasi dan rata-rata kandungan
mCry3A adalah 2,3 – 3,1 µg/g dan enzim PMI juga stabil selama beberapa generasi.
Uji daya cerna protein mCry3A dari jagung PRG event MIR604 dan E. coli
rekombinan dengan SGF yang mengandung pepsin menunjukkan degradasi cepat.
Dalam 2 menit tidak ada lagi protein 67 kD yang utuh. Sedangkan uji daya cerna
enzim PMI asal E. coli rekombinan dalam SGF setelah 1 menit tidak ditemukan
molekul PMI yang utuh.
Uji stabilitas panas pada suhu 4C, 25C, 37C, 65C, 95C menunjukkan bahwa
pada suhu 95C protein mCry3A diinaktivasi (denaturasi atau degradasi) dan pada
suhu 65C terjadi kehilangan bioaktivitas. Uji enzim PMI menunjukkan bahwa pada
suhu 37C selama 30 menit masih stabil, dan pada suhu lebih dari 55C enzim PMI
tidak stabil serta aktivitas protein turun menjadi 3% setelah inkubasi pada suhu
65C.
Dari hasil pengkajian alergenisitas dapat disimpulkan bahwa protein mCry3A dan
enzim PMI tidak menunjukkan adanya potensi dapat menimbulkan alergi.
III.3
Toksisitas
Uji toksisitas oral akut terhadap protein mCry3A telah dilakukan pada mencit, dan
hasilnya dilaporkan sebagai company report yaitu “Acute Oral Toxicity of Modified
Cry3A Protein (mCry3A-0102) in the Mouse”, oleh Ian Johnson. Penelitian dilakukan
di Central Toxicology Laboratory, Alderley Park, Macclesfield, Cheshire, United
Kingdom, SK10 4TJ.
Kelompok mencit perlakuan (strain APfCD-1) yang terdiri dari 5 ekor jantan dan 5
ekor betina menerima dosis tunggal secara cekok(gavage) protein mCry3A-0102
sebanyak 2632 mg per kg BB. Berdasarkan hasil analisis, protein mCry3A-0102
yang diuji mengandung sekitar 90,3% protein Cry3A (berat per berat), sehingga
dosis yang diberikan adalah sekitar 2377 mg protein Cry3A per kg berat badan.
Kelompok mencit kontrol (strain APfCD-1) yang terdiri dari 5 ekor jantan dan 5 ekor
betina, diberi cekokan larutan karboksi-metil-selulosa 1% (berat/volume), yang
digunakan sebagai pelarut protein.
4
Pengujian dilaksanakan selama 14 hari setelah pemberian dosis; dan pengamatan
dilakukan terhadap berat badan, konsumsi ransum (pakan) serta ada/tidaknya gejala
toksisitas. Pada akhir percobaan, semua mencit dimatikan; kemudian organ otak,
hati, ginjal dan limfa diambil untuk dilakukan pengujian histopatologis post mortem.
Pengujian diselesaikan pada tanggal 11 Nopember 2003.
Hasil pengujian menunjukkan bahwa tidak dijumpai kematian dan tanda-tanda klinis
yang buruk pada mencit dengan dosis 2632 mg protein mCry3A-0102 per kg berat
badan, yang setara dengan 2377 mg protein Cry3A per kg berat badan mencit. Oleh
karena itu disimpulkan bahwa protein mCry3A-0102 (Cry3A) tidak menimbulkan efek
toksik pada mencit.
Uji toksisitas oral akut terhadap enzim PMI hasilnya dilaporkan sebagai company
report yaitu “Phosphomannose Isomerase (Sample PMI-0198): Acute Oral Toxicity
Study in Mice“ oleh Janice O Kuhn. Penelitian dilakukan di STILLMEADOW Inc.,
12852 Park One Drive, Sugar Land, TX 77478.
Pengujian dilakukan pada mencit putih (albino mice, strain HSD:ICR). Kelompok
perlakuan terdiri dari 7 ekor jantan dan 6 ekor betina, yang diberi larutan protein
PMI-0198 secara cekok (gavage) dengan dosis 5050 mg/kg berat badan.
Berdasarkan hasil analisis, protein yang diuji mengandung sekitar 60% enzim
fosfomanosa isomerase (basis berat). Protein yang diuji diberikan dua kali dengan
jarak pemberian sekitar 1 jam, dengan konsentrasi 20% (berat/volume), yang
dilarutkan dalam larutan karboksi-metil-selulosa 0,5%. Kelompok kontrol yang terdiri
dari 6 ekor mencit jantan dan 5 ekor mencit betina, diberi cekokan larutan karboksimetil-selulosa 0,5% sebanyak 25,25 ml/kg berat badan.
Pengujian dilaksanakan selama 14 hari setelah pemberian dosis; dan pengamatan
dilakukan terhadap berat badan, konsumsi ransum (pakan) serta ada/tidaknya gejala
toksisitas. Pada akhir percobaan, semua mencit dimatikan (dengan CO 2 over-dose);
kemudian organ otak, hati, ginjal dan limfa diambil untuk dilakukan pengujian
histopatologis post mortem. Pengujian diselesaikan pada tanggal 11 Agustus 1999.
Hasil pengujian menunjukkan tidak ada kematian mencit selama percobaan
berlangsung dan tidak ditemukan adanya gejala toksisitas secara klinis, demikian
pula tidak ditemukan adanya abnormalitas pada organ dalam mencit. Disimpulkan
bahwa pada dosis 5050 mg per kg berat badan mencit, enzim PMI-0198 tidak
menimbulkan efek toksik pada mencit.
Dari hasil pengkajian toksisitas dapat disimpulkan bahwa protein mCry3A dianggap
tidak toksik dan enzim PMI termasuk dalam golongan zat yang tidak toksik
(practically non toxic).
IV.
Kesimpulan
Atas dasar beberapa uraian tentang informasi genetik dari gen mCry3A yang berasal
dari Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis; dan gen PMI yang berasal dari
Escherichia coli yang disisipkan dalam jagung PRG event MIR604; analisis
kesepadanan substansial antara komposisi jagung PRG event MIR604 dengan
jagung non PRG; serta analisis alergenisitas dan pengujian toksisitas dari protein
mCry3A dan enzim PMI, disimpulkan bahwa jagung PRG event MIR604 dapat
dinyatakan aman untuk dikonsumsi sebagai bahan pangan.
5
Disarankan bahwa selama jagung PRG event MIR604 belum memperoleh sertifikat
aman lingkungan, maka jika ditemukan adanya biji jagung yang tumbuh (tanaman
volunteer) harus segera dimusnahkan. Meskipun demikian, karena hal ini terkait
dengan aspek keamanan lingkungan, saran ini dapat diabaikan apabila jagung PRG
event MIR604 telah memperoleh sertifikat keamanan lingkungan.
6
Download