biomarker pencemaran insektisida organofosfat dalam tanah

BAB III
METODOLOGI PENELITIAN
Untuk
mengetahui
pengaruh
dan
bioindikator
pencemaran
insektisida
organofosfat terhadap jumlah dan keanekaragaman organisme tanah pertanian
terutama bakteri tanah, dilakukan tahapan penelitian seperti tampak pada Gambar
3.1.
Identifikasi Masalah
Survey
Pendahuluan
Wawancara Pola
Penggunaan
Insektisida
Penentuan Lokasi
Sampling
Sampling
Pemeriksaan
Parameter
Insitu
Pengawetan
Sampel
Analisa
Laboratorium
Pengukuran
Residu Insektisida
Total Plate Count
dan Identifikasi
Bakteri Dominan
Analisis Data
Kesimpulan
Gambar 3.1 Tahapan Penelitian
3-1
3-2
3.1
Identifikasi masalah
Identifikasi masalah pada penelitian ini dititikberatkan pada kemungkinan
timbulnya permasalahan terhadap keanekaragaman bakteri yang terdapat didalam
tanah akibat pemaparan insektsida organofosfat dalam tanah pertanian.
3.2
Pemilihan Daerah Studi Dan Pola Pemakaian Penyemprotan Pestisida
Daerah yang dijadikan objek penelitian ini diambil dari dua jenis pertanian yaitu
pertanian organik dan non organik. Lahan pertanian non organik yang dijadikan
objek penelitian berlokasi di daerah lahan pertanian Desa Sukapura, Kecamatan
Sukasari, Kabupaten Bandung dan sebagai pembanding pengambilan sampel
dilakukan di Pertanian Organik Cisarua Bogor. Perbedaan pada kedua daerah
studi ini adalah dari penggunaan insektisida. Pada lahan pertanian di Desa
Sukapura digunakan insektisida jenis organofosfat sedangkan pada pertanian
organik Cisarua tidak digunakannya insektisida.
Identifikasi pola pemakaian insektisida organofosfat di lahan pertanian non
organik Desa Sukapura, Kecamatan Sukasari, Kabupaten Bandung dilakukan
dengan cara wawancara dengan petani pengolah lahan untuk mengetahui jenis
insektisida
organofosfat
yang
digunakan,
dosis
formulasi
dan
periode
penyiramannya.
3.3
Penentuan Titik Sampling
Pengambilan sampel tanah dengan metode acak stratifikasi. Penentuan lokasi dan
titik pengambilan sampel tanah berdasarkan pada luas dan kondisi tanah.
Pengambilan sampel tanah juga berdasarkan penggunaan lahannya. Titik
pengambilan sampelnya dapat dilihat pada Gambar 3.3 dan Gambar 3.4.
Untuk menentukan posisi pengambilan sampel tanah (petak lahan) digunakan alat
GPS (Global Positioning System) ketelitian posisi alat ini mencapai 20 m.
Penentuan titik sampling pemetaan lahan dilakukan dengan menggunakan alat
“GPS MAP 60” untuk menentukan posisi bumi batas persil setiap lahan. Setiap
3-3
koordinat bumi dari titik batas persil petak lahan direkam ke dalam memori alat,
kemudian ditransfer ke komputer dengan menggunakan program “Expert GPS”.
Gambar 3.2 Alat Receiver GPS (GPS MAP 60)
Gambar 3.3 Titik Sampling Lahan Desa Sukapura, Kecamatan Kertasari,
Kabupaten Bandung
3-4
Gambar 3.4 Titik Sampling Lahan Pertanian Organik
3.4
Pengambilan sampel tanah
Sampel tanah diambil pada kedalaman 0-10 cm dengan menggunakan alat ”Soil
Sampler”. Sampel tanah yang diambil di lapangan haruslah representatif, artinya
sampel tanah tersebut harus dapat mewakili suatu areal atau luasan tertentu.
Setelah titik sampling diketahui maka sampel tanah diambil dengan menggunakan
botol vial yang steril dan plastik bersegel. Untuk mendapatkan sampel tanah yang
representatif digunakan ”Metode Komposit Terganggu”. Satu sampel komposit
yang mewakili satu petak lahan, terdiri dari 5 sampel tanah individu, diambil pada
permukaan yakni pada kedalaman 0-10 cm. Parameter–parameter seperti
temperatur, pH, dan kelembaban, serta cuaca dicatat. Untuk mengambil kelima
sampel individu, digunakan metode sistematik (sistem diagonal) seperti
ditunjukkan pada Gambar 3.5 dan cara pengambilan sampelnya dapat dilihat pada
Gambar 3.6.
3-5
Gambar 3.5 Pengambilan sampel komposit dengan metode sistematik
Gambar 3.6 Cara pengambilan sampel dilapangan
3.5
Pengawetan sampel tanah
Sampel tanah segar yang diambil diawetkan pada plastik bersegel kemudian
disimpan di dalam cool box selama perjalanan dari lapangan ke laboratorium. Di
laboratorium, disimpan pada suhu 3-5°C serta diusahakan tidak terpapar sinar
matahari. Hal ini dilakukan agar menghambat aktivitas metabolisme dan
mencegah terjadinya fotodegradasi serta volitilisasi residu insektisida dari sampel
tanah.
3.6
Metode Analisis Residu insektisida organofosfat
a. Metode Ekstraksi yang digunakan adalah Metode ekstraksi insektisida dari
tanah yang digunakan adalah Metode Shaker. Metode ini adalah
penyederhanaan dari Metode 5-1 yang dibakukan oleh Komisi Pestisida
3-6
pada tahun 1997, sebagai metode standar untuk menganalisis multiresidu
pestisida organoklor dan organofosfat dalam berbagai matriks hasil
pertanian. Validitas dan reabilitas dari metode yang disederhanakan ini
dapat diuji dengan membuat recovery sample atau sampel yang diperkaya,
untuk mendapatkan nilai perolehan kembali.
Prinsip kerjanya adalah Residu senyawa organofosfat dari cuplikan tanah
diekstraksi dengan pelarut organik aseton. Residu terlarut dibersihkan
secara kromatografi pada kolom kromatografi Florisil, dielusi dengan
campuran n-heksan dan aseton. Setelah dipekatkan, residu dalam eluat
ditetapkan secara kromatografi gas.
b. Metode Analisis Gas Kromatografi atau Chromatograph Gas (CG)
Konsentrasi residu dihitung dengan cara mengukur puncak kromatogram.
Analisis kuantitatif ini dilakukan dengan membandingkan tinggi atau luas
puncak kromatogram dari senyawa klorpirifos yang dianalisis dengan
tinggi atau luas puncak kromatogram dari reference atau standar baku
kemudian dimasukkan rumus perhitungan (Komisi Pestisida, 1997):
Tinggi contoh
vol. sampel terekstraksi
× konsentrasi standar ×
Tinggi standar
berat contoh
Analisis kromatografi gas dilakukan di Laboratorium Residu Bahan Agro
Kima, Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan
Sumber Daya Genetik Pertanian, Bogor.
Gambar 3.7 Gas Kromatografi
3-7
3.7
Analisis Sifat Fisik – Kimia Tanah
Pengukuran pH dan temperatur dan juga kadar air pada titik pengambilan sampel.
Untuk mengetahui kemungkinan insektisida organofosfat terdegradasi dalam
tanah dan juga kondisi lingkungan yang mendukung pertumbuhan bakteri.
3.8
Perhitungan Total plate count bakteri tanah
Perhitungan koloni dilakukan dengan cara lempeng pembiakan (Plate Count).
Hasil hitungan yang dapat dianggap adalah 30 – 300 koloni pada setiap lempeng
pembiakan dengan tingkat pengenceran tertentu (Usman, 1986). Sedangkan
menurut Salle (1961), perhitungan dengan menggunakan plate count beragam dari
200.000 hingga 100.000.000 per gram tanah.
Perhitungan Total Plate Count dilakukan dengan cara menghitung jumlah koloni
yang tumbuh diambil pada pengenceran yang menghasilkan jumlah koloni dengan
rentang 30-300sampel. Caranya 1 gram sampel tanah yang telah diambil
diencerkan dalam beberapa tingkat pengenceran. Kemudian dari masing-masing
pengenceran tersebut diambil dalam jumlah tertentu kemudian ditanam pada
media pertumbuhan. Gambar 3.8 merupakan cara pengenceran penanaman pada
agar cawan petri dan untuk perhitungan menggunakan colony counter yang dapat
dilihat pada Gambar 3.9.
3-8
Gambar 3.8 Prosedur pengenceran penanaman pada agar cawan petri
Gambar 3.9 Colony Counter
3-9
3.9
Identifikasi Bakteri Tanah
Sistem identifikasi bakteri adalah kunci untuk mengatur sifat-sifat bakteri dalam
suatu cara sehingga memudahkan identifikasi oganisme secara efisien. Sistem
identifikasi yang ideal sebaiknya mengandung sesedikit mungkin gambaran yang
diperlukan untuk diagnosis yang tepat. Kelompok-kelompok dipecahkan menjadi
sub kelompok atas dasar ada (+) atau tidaknya (-) spora. Proses yang
berkelanjutan mengenai berbagai macam mikroorganisme, menuntun para peneliti
sampai kepada sub kelompok terkecil yang terdiri dari organisme yang telah
dianalisis. Pada tahap awal proses ini, organisme ditetapkan menjadi sub
kelompok berdasarkan ciri khas yang tidak memperlihatkan hubungan simbiosis.
Isolasi langsung dengan menggunakan nutrient agar (NA) dilakukan sebelum
identifikasi bakteri dominan dalam tanah. Caranya sampel tanah diencerkan lalu
ditanam pada media nutrient agar. Setelah diperoleh koloni yang mampu hidup
pada media, maka setiap koloni yang diperoleh diisolasi dengan memperhatikan
morfologi dari koloni yang tumbuh. Koloni-koloni yang tumbuh dominan ditanam
kembali pada media nutrien agar dalam cawan petri dengan teknik menggores
(streak plate). Isolasi ini dilakukan beberapa kali. Setelah beberapa kali
pengulangan ditemukan isolat murni dari bakteri tanah tersebut. Tahap isolasi
merupakan tahap pemurnian dimana tujuannya adalah agar diperoleh koloni
bakteri murni yang tidak dikontaminasi oleh koloni lain. Setelah isolasi dilakukan
dilanjutkan dengan identifikasi isolat. Penyimpanan koloni bakteri dilakukan pada
suhu 40C dan siap untuk digunakan pada pengujian selanjutnya. Identifikasi
bakteri dilakukan terhadap isolat isolat yang diperoleh dengan berpedoman pada
buku Bergey’s determinative bacteriology (Holt, 1994) dan Manual For The
Identification Of Medical Bacteria (Cowan, 1974) dengan melakukan serangkaian
uji morfologi dan biokimia yaitu uji pewarnaan Gram, uji motilitas, pengamatan
bentuk sel, kemampuan tumbuh pada suhu 50C, 200C, dan 300C. Pengamatan
dilakukan juga pada warna koloni, ukuran koloni, bentuk koloni, untuk
menentukan jenis dari bakteri tanah tersebut.
3-10
Gambar 3.10 Uji Biokimia
3.10
Analisis
Analisis dilakukan terdahap residu insektisida organofosfat didalam tanah
kemudian dari hasil pengukuran residu insektisida organofosfat dan hasil
perhitungan total plate count serta jenis bakteri dominan yang berada dalam tanah
dilakukan analisa pengaruh dari insektisida organofosfat terhadap organisme
terutama bakteri dalam tanah dan juga membandingkan jumlah total bakteri sesuai
dengan pengunaan tata guna lahan serta menentukan bioindikator berdasarkan
hasil dari penelitian dan studi literatur.