1274 IDENTIFIKASI GEN PADA KEDELAI
advertisement
Prosiding Seminar Nasional II Tahun 2016, Kerjasama Prodi Pendidikan Biologi FKIP dengan Pusat Studi Lingkungan dan Kependudukan (PSLK) Universitas Muhammadiyah Malang Malang, 26 Maret 2016 IDENTIFIKASI GEN PADA KEDELAI MUTAN NODUL SUPER SS2-2 DAN JENIS LIARNYA BERDASARKAN KATEGORI FUNGSIONAL Identification Of Genes In Nodul Supernodulating Soybean Mutant Ss2-2 And Its Wild Type Based On Their Functional Categories Puji Lestari, Tri Zulchi P. Hariyadi, dan Nurwita Dewi Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumber Daya Genetik Pertanian-Balitbangtan Jl. Tentara Pelajar 3A Bogor 16111, Telp. 0251-8337975; email: [email protected] Abstrak Gen yang terkait dengan interaksi simbiosis antara rhizobium dan kedelai nodul super perlu diteliti. Oleh karena itu, tujuan penelitian ini adalah untuk menentukan kategori fungsional masing-masing transkrip/gen yang terlibat dalam asosiasi simbiosis pada kedelai mutan nodul super SS2-2 dan tipe liarnya, Sinpaldalkong 2. Template cDNA dua genotipe kedelai tersebut yang diinokulasi dengan Bradyrhizobium japonicum 110 diamplifikasi dengan teknik cDNA-AFLP. Semua fragmen polimorfik diisolasi, TA kloning dan sekuensing, kemudian sekuen yang dihasilkan dikelompokkan berdasarkan fungsinya (http: mips.gsf.de/). Dari total 97 transkrip yang diidentifikasi, 60 gen spesifik pada tipe liarnya dan 37 gen hanya ditemukan di mutan nodul super SS2-2. Total 35 gen dengan nilai signifikan yang diidentifikasi secara diferensial mengkodekan protein dikelompokkan ke dalam 8 kelas fungsional yang berbeda. Gen-gen tersebut sebagian besar dikategorikan dalam metabolisme dan energi (13 gen), dan homolog dengan EST (12 gen), dan sisanya tergolong transkripsi, sinyal transduksi, rantai transpor, protein destination, cell rescue/defense dan unknown function protein. Gen diferensial dengan kategori fungsionalnya antara SS2-2 dan kedelai normalnya memfasilitasi untuk memahami mekanisme simbiosis fiksasi nitrogen biologis pada kedelai nodul super. Kata kunci: cDNA-AFLP, fragmen-transkrip, fiksasi nitrogen, kedelai nodul super, SS2-2 Abstract Genes associated with symbiotic interactions between rhizobium and the supernodulating soybean is needed to be investigated. Therefore, this study aimed to determine the functional categories of each transcript involved in the symbiotic association in the supernodulating soybean mutant SS2-2 and its wild type, Sinpladalkong 2. Initially, cDNA templates of the two genotypes inoculated with Bradyrhizobium japonicum 110 were amplified with cDNA-AFLP assay. All polymorphic fragments were isolated, TA cloned and sequenced, then the resulting sequences were categorized according to their function (http:mips.gsf.de/). Of total 97 transcripts that were identified, 60 genes were specific in the wild type and 37 genes were only found in supernodulating soybean mutant SS2-2. Total 35 genes with significant values were identified as being differentially regulated encoded proteins belonging to 8 different functional classes. Majority genes were categorized as metabolism and energy (13 genes), and EST homology (12 genes), and the rest belonged to transcription, signal transduction, transport chain, protein destination, cell rescue/defense and unknown function protein. The differential genes with their functional categories between SS2-2 and normal soybean facilitate to understand the symbiotic mechanism in biological nitrogen fixation in supernodulating soybean. Keywords: cDNA-AFLP, gene, nitrogen fixation, nodul supernodulating soybean, SS2-2 1274 Prosiding Seminar Nasional II Tahun 2016, Kerjasama Prodi Pendidikan Biologi FKIP dengan Pusat Studi Lingkungan dan Kependudukan (PSLK) Universitas Muhammadiyah Malang Malang, 26 Maret 2016 PENDAHULUAN Kedelai merupakan salah satu komoditas pertanian penting yang perlu diteliti lebih dalam dan ditingkatkan produktivitas maupun karakter agronomis lainnya untuk mendukung ketahanan pangan di dunia termasuk Indonesia. Berbagai pendekatan dilakukan untuk mendapatkan varietas unggul, mutasi baik secara kimia maupun fisik. Salah satu hasil mutasi kedelai adalah mutan nodul super maupun nodul hyper (Lee et al., 1997; Takahashi et al., 2003) Berbagai investigasi telah dilakukan dalam level genetik maupun morfo-agronominya agar pemanfaatannya optimal baik untuk pemuliaan maupun sumber plasma nutfah (Lestari et al., 2006a,b,c; Tanabata et al., 2013; Tanabata & Ohyama, 2014). Kedelai mutan nodul super SS2-2 telah dikembangkan di Korea menggunakan Ethyl methanesulfonate (EMS) dan menunjukkan karakter yang berbeda dengan kedelai normal. SS2-2 memiliki jumlah nodul lebih banyak, akar pendek dan ukuran tanaman lebih kecil dibandingkan dengan jenis liarnya. SS2-2 juga menunjukkan fenotipe simbiosis novel terkait nodul ontogeni yang cepat pada awal perkembangan, namun demikian endosimbiosis lengkap dan pembentukan ikatan pembuluh nodul juga ditemukan pada mutan ini (Lestari et al., 2006b). Pada tahap awal pertumbuhan, mutan nodul super memiliki karbohidrat rendah, yang mungkin menjadi penyebab menguningnya daun, namun kandungan karbohidrat stabil sama seperti yang ditemukan di jenis liarnya pada tahap pertumbuhan berikutnya. Hal menarik adalah adanya fenomena pleiotropy dimana adanya gen tunggal yang dapat menyebabkan beberapa perubahan fenotipe mutan. Namun demikian mekanismenya sampai sekarang masih kurang dipahami (Dudley et al., 2005). Ha & Lee (2001) juga membuktikan bahwa ada sedikit perbedaan pada tingkat genom antara SS2-2 dan jenis liarnya. Pemetaan genetik pada populasi segregasi nodul super pada mutan SS2-2 dan nitrat-toleran simbiosis (NTS) mengungkapkan bahwa lokus yang sama mengendalikan nodulasi jenis super pada kedua mutan ini (Nishimura et al., 2002; Nakamura et al., 2010). cDNA-AFLP merupakan salah satu teknik efisien yang banyak dimanfaatkan untuk identifikasi gen pada berbagai spesies tanaman meskipun dengan sedikit informasi tingkat molekuler (Simoes-Araujo et al., 2002). Penerapan teknik cDNA-AFLP diharapkan menjadi metode powerful dan dapat diulang deteksinya (Bachem et al., 1998) pada transkrip terkait nodulasi pada SS2-2 yang diekspresikan diferensial, termasuk identifikasi fragmen spesifik yang terkait dengan nodul super. Karena itu, penelitian ini bertujuan untuk menentukan kategori fungsional masing-masing transkrip terlibat dalam asosiasi simbiosis dalam kedelai mutan nodul super SS2-2 dan jenis liarnya, Sinpladalkong 2. METODE PENELITIAN Bahan materi tanaman dan prosedur inokulasi bakteri Mutan nodul super SS2-2 (Lee et al., 1997) dan jenis liarnya Sinpaldalkong 2, diteliti dengan teknik cDNA-AFLP dalam studi ini. Biji kedelai disterilkan dan digerminasi pada 1% agar, suhu 30°C selama 3 hari. Hasil germinasi dipindahkan ke pot yang berisi vermikulit steril di rumah kaca. Bibit yang tumbuh diinokulasi 4 hari kemudian dengan Bradyrhizobium japonicum USDA 110 sebanyak108 cfu/mL. Satu minggu setelah 1275 Prosiding Seminar Nasional II Tahun 2016, Kerjasama Prodi Pendidikan Biologi FKIP dengan Pusat Studi Lingkungan dan Kependudukan (PSLK) Universitas Muhammadiyah Malang Malang, 26 Maret 2016 inokulasi, daun sehat dipanen dan dibekukan dalam nitrogen cair, dan disimpan pada suhu -80°C sampai digunakan untuk ekstraksi RNA total. Isolasi poli (A)+ RNA dan sintesis cDNA RNA total diisolasi dari 0,5 g jaringan tanaman menggunakan reagen Trizol (Invitrogen Corp, Carlsbad, CA) dan poly(A)+ mRNA (1 mg) diisolasi menggunakan Oligotex mRNA Spin-Kolom (Qiagen, Valencia, CA) . Untai ganda cDNA kemudian disintesis dari poli (A)+ mRNA menggunakan kit sintesis cDNA (Roche Corp, Basel, Swiss), diikuti ekstraksi dengan fenol/kloroform/isoamil alkohol, diendapkan dengan etanol dan diresuspensi dalam air bebas RNase. Analisis cDNA-AFLP Reaksi AFLP dan analisis PAGE produk cDNA-AFLP dilakukan seperti yang dijelaskan oleh Bachem et al. (1998) dan Vos et al. (1995). Semua kombinasi primer adalah kemungkinan sekuen EcoRI dan MseI dengan basa selektif satu, dua atau tiga. Produk amplifikasi selektif dipisahkan dengan elektroforesis non-denaturasi pada 13% running gel dengan 5% stacking gel poliakrilamida. DNA di-staining dalam larutan Vistra-Green pada konsentrasi 10000× dalam dimetilsulfoksida (Amersham, Piscataway, NJ), dan pita DNA divisualisasikan dengan transilluminator UV. Isolasi fragmen-transkrip Pita DNA polimorfik dielusi dari gel dengan memotong gel yang mengandung pita yang diinginkan, direndam selama 1 jam dalam buffer TE dan digerus sampai halus. Supernatan jernih di-reamplifikasi menggunakan Taq polimerase (Vivagen, Korea) dengan primer yang sama untuk amplifikasi selektif dalam 30 siklus PCR (94 °C, 30 s; 68 °C, 1 menit; 72 °C, 2 menit) dengan ekstensi akhir 1 menit pada 72 °C. Produk cDNAPCR dimurnikan menggunakan Kit AccuPrep ™ PCR (Bioneer). Kloning dan analisis sekuen Fragmen hasil amplifikasi dikloning menggunakan vektor pGEM (Promega, Madison, WI) dan ditransformasi kedalam sel kompeten Escherichia coli JM109 (Sambrook & Russell, 2001). Fragmen disekuensing menggunakan primer universal (M13) forward dan reverse dengan sequencer ABI3700 (Applied Biosystems). Hasil sekuen dianalisis menggunakan Seqscape v.2.0 (Applied Biosystems). Analisis homologi sekuen dibandingkan dengan database menggunakan program BLASTX dan BLASTN (http://www.ncbi.nih.gov/BLAST). Semua transkrip yang didiidentifikasi kemudian dikategorikan berdasarkan fungsi biologinya (http: mips.gsf.de/). HASIL DAN PEMBAHASAN Kategori fungsional fragmen-transkrip Total 97 gen yang diidentifikasi pada kedelai nodul super SS2-2 dan jenis liarnya Sinpaldalkong 2 dikelompokkan dalam 8 kelas fungsional berbeda (Tabel 1). Sebanyak 37 gen diketahui spesifik hanya ditemukan pada mutan SS2-2 dan 60 gen pada Sinpaldalkong 2. Dari total transkrip, 35 transkrip menunjukkan nilai E tinggi dan dipilih untuk dianalisis lebih lanjut. 35 gen ini kemungkinan terkait degan simbiosis di kedelai nodul super. Gen diferensial pada 2 genotipe kedelai ini mendukung studi sebelumnya yang menggunakan 1276 Prosiding Seminar Nasional II Tahun 2016, Kerjasama Prodi Pendidikan Biologi FKIP dengan Pusat Studi Lingkungan dan Kependudukan (PSLK) Universitas Muhammadiyah Malang Malang, 26 Maret 2016 pendekatan proteomik (Salavati et al., 2012). Jumlah gen dengan signifikan tinggi dalam setiap kategori diringkas dalam Tabel 1. Fragmen-transkrip terpilih yang menunjukkan signifikansi dengan nlai E tinggi dan homolog dengan gen yang sudah dikenal pada Sinpaldalkong 2 dan SS2-2 disajikan pada Tabel 2. Fragmen-transkrip dipilih dari hasil studi sebelumnya (Lestari et al., 2006a). Pathway yang mengatur simbiosis dan sinyal transduksi antara Sinpaldalkong 2 dan SS2-2 mungkin berbeda. Gen-gen berbeda terlibat dalam metabolisme dan energi, organisasi seluler dan biogenesis, dan transkripsi dan kelas fungsi lainnya. Hasil ini relevan dengan gen-gen yang diidentifikasi sebelumnya di kedelai nodul super dan kedelai normal (Salavati et al., 2012). Beberapa fragmen-transkrip menunjukkan homologi tinggi dengan faktor transkripsi, faktor pertahanan/ketahanan dan transporter yang ditemukan lebih sedikit di SS2-2 daripada Sinpaldalking 2. Fragmen-transkrip tersebut mungkin berkontribusi dalam mengendalikan simbiosis rhizobium dengan kedelai nodul super dan kedelai normal. Metabolisme dan energi Perkembangan nodul dan fungsinya memerlukan translokasi fotosintat pada jaringan baru dan muda tanaman (Lin et al., 2010). Pada Sinpaldalkong 2, carboxylase (26sin2 dan 46sin3) terlibat dalam menyediakan oksaloasetat. Seperti yang diharapkan, induksi kuat gen asimilasi nitrogen terdeteksi dalam jaringan daun satu minggu setelah inokulasi dengan B. japonicum. Pathway nodulasi (Lim et al., 2011) melibatkan enzim seperti piruvat dehidrogenase (20sin1), glutamat sintase (46sin1) dan reduktase leghemoglobin (73sin1). Enzim tersebut mungkin menyediakan sistem efisien untuk menurunkan konsentrasi oksigen bebas sekaligus menyalurkan oksigen yang cukup ke sel yang terinfeksi. Enzim terkait dinding sel, endo-β-1,4-glukanase (17sin3) tampaknya terlibat dalam pertumbuhan infeksi dan ragam fisiologis dalam pembelahan sel (Salavati et al., 2012). Fragmen-transkrip ini mungkin berperan dalam ontogeni dan perkembangan nodul. Beberapa gen metabolisme primer dominan di SS2-2. Karbon berperan awal proses yang disertai dengan perubahan dalam ekspresi serangkaian gen yang berhubungan dengan metabolism karbon dan nitrogen. Fragmen-transkrip juga mungkin terlibat dalam biosintesis nitrogen. Sementara beberapa gen yang terlibat dalam proses metabolisme lainnya terkait dengan nodulasi juga ditemukan di SS2-2, terutama terkait dengan hidrolisis komponen dinding sel dan pathway flavonoid. Sejumlah gen yang berhubungan dengan sumber energi dan metabolisme tampaknya kurang ditemukan di SS2-2 dibandingkan di Sinpaldalkong 2. Gen-gen ini adalah kandidat terkait asosiasi simbiosis (Pislariu et al., 2012). Hasil ini menunjukkan bahwa beberapa anggota famili multigene dalam kondisi tertekan secara bersamaan mengaktivasi anggota lainnya (Yahyaoui et al., 2004). 1277 Prosiding Seminar Nasional II Tahun 2016, Kerjasama Prodi Pendidikan Biologi FKIP dengan Pusat Studi Lingkungan dan Kependudukan (PSLK) Universitas Muhammadiyah Malang Malang, 26 Maret 2016 Tabel 1. Transkrip dengan nilai E signifikan yang dikelompokkan berdasarkan kategori fungsi pada SS2-2 and Sinpaldalkong2. Kategori fungsional Jumlah fragmen-transkrip SS2-2 Sinpaldalkong2 Metabolisme dan energi 2 9 Faktor transkripsi 0 3 Sinyal transduksi 0 3 Membrane transport chain 1 3 Protein destination 0 1 Cell rescue/defence 1 1 Unknown function protein 2 2 EST-homology 9 13 Faktor transkripsi Sepuluh transkrip di Sinpaldalkong 2 dan 3 transkrip dari SS2-2 mungkin memberikan kontribusi dalam proses transkripsi. Beberapa faktor transkripsi, seperti likebZip dan PHD finger protein (44sin1) dan receptor protein kinase homolog (48sin1) terdeteksi pada Sinpaldalkong 2. Gen-gen ini penting mengingat perannya sebagai regulator utama yang memungkinkan untuk mengontrol set gen yang terkait dengan program perkembangan simbiosis. Gen-gen sinyal transduksi Hanya 3 gen dengan nilai E tinggi ditemukan di Sinpaldalkong 2 (17sin1, 24sin3 dan 80sin1) tapi tidak di SS2-2. Gen tersebut diduga berpotensi terlibat dalam mekanisme pengaturan simbiosis. Dalam nodul kedelai normal, berbagai gen sinyal ditemukan, terutama pengkodean protein kinase (Pislariu et al., 2012) sebagai bagian dari protein regulator transkripsi. Beberapa dari gen-gen tersebut terlibat dalam autoregulasi nodulasi (Searle et al., 2003). Kinase protein dan protein fosfatase diharapkan akan mengungkapkan sifat dari sistem signaling. Rantai membran transportasi Gen yang memainkan peran dalam fotosintesis juga diidentifikasi dalam studi ini dan lebih banyak diidentifikasi pada Sinpaldalkong 2. Gen yang diamati mengkodekan protein fotosistem IID1 (2sin3) dan plasma membrane-type calsium ATPase (49sin1). Famili protein ini kemungkinan bertindak sebagai donor elektron primer ke kloroplas dalam fotosistem. Plasma membrane-type calsium ATPase berfungsi untuk mengeliminasi kalsium, sebagai regulator penting menentukan konsentrasi kalsium (Bonza et al., 2000). Pada saat yang sama, transporter di up-regulasi dalam SS2-2, misalnya transposase (12S5). Gen transporter tersebut mungkin terkait dengan fungsi nodul akar sebagai sumber karbon dan energi di mutan nodul super dan kedelai normal. Protein destination dan cell rescue/defence Hanya satu fragmen-transkrip, sulfhidril-pra-endopeptidase diekspresikan pada V. mungo (26sin3) yang terdeteksi hanya di tipe liar (Sinpaldalkong 2). Sebuah gen (17S2) mengkodekan protein yang berhubungan dengan pertahanan ditemukan di SS2-2. 1278 Prosiding Seminar Nasional II Tahun 2016, Kerjasama Prodi Pendidikan Biologi FKIP dengan Pusat Studi Lingkungan dan Kependudukan (PSLK) Universitas Muhammadiyah Malang Malang, 26 Maret 2016 Fragmen-transkrip yang berkaitan dengan respon pertahanan mungkin penting untuk melawan patogen (Shirasu & Schulze-Lefert, 2003). Unknown function protein Dua transkrip terkait dengan EST dari protein yang belum diketahui fungsinya. Fragmen tersebut mungkin sangat spesifik untuk nodulasi dan asosiasi simbiotik. Fragmentranskrip tersebut meliputi nodulin (65S2) serta diduga putative senescence-associated protein (9S1), dan hanya ditemukan di SS2-2. EST homologi Jenis genotipe liar sebagai sumber mutan didentifikasi memiliki fragmen-transkrip yang homolog dengan klon cDNA seperti dalam Triticum aestivum, bit gula dan lain-lain. Namun beberapa transkrip di SS2-2 menunjukkan homologi yang tinggi dengan klon cDNA di Gossypium arboreum, akar Medicago truncatula, Nicotiana tabacum, daun Oryza sativa. Mereka dapat mewakili gen-gen yang belum dikarakterisasi. Gen-gen potensial terkait simbiosis Teknik cDNA-AFLP memungkinkan identifikasi gen-gen potensial yang terlibat dalam supernodulasi mutan dan kedelai normal yang bersimbiosis dengan rhizobium. Gen dengan ekspresi berbeda mungkin memberikan informasi yang berguna pada program simbiosis mikroba-kedelai (Santaella et al., 2004), terutama 2 gen kinase (48sin1,17sin1), dan 2 nodulin (51S3 dan 65S2), serta leghemoglobin (73sin1). Transkrip 17sin1 memiliki 378 basa dan menunjukkan homologi tinggi dengan kinase dalam A. thaliana (Gambar 1). Daerah conserve mungkin bagian dari wilayah domain yang mempengaruhi beberapa program simbiosis dalam tanaman. Mutasi basa tunggal di SS2-2 merubah transversi lisin (AAG) menjadi kodon stop (TAG) (Lestari et al., 2006a). Mutasi titik ini mengarahkan untuk menghasilkan truncated protein (Searle et al., 2003) dan mungkin berpengaruh terhadap perkembangan akar dan nodul. Kinase-like protein dan receptor-like kinase mungkin terlibat dalam jalur sinyal transduksi dan terkait dengan reseptor membran plasma (Gresshoff et al., 2003). Receptor kinase yang ditemukan dalam penelitian ini mungkin salah satu reseptor kinase yang mengatur regulasi nodul akar di SS2-2, dikenal sebagai gen GmNARK seperti dilansir oleh Searle et al. (2003). Dua transkrip, 51sin3 dan 65S2 menunjukkan homologi tinggi dengan nodulin (clone GmN36b-fragmen) dan nodulin-like (G.max), masing-masing. Meskipun gen ini memiliki fungsi yang berbeda, namun 51sin3 dan 65S2 homolog berdasarkan sekuen asam amino (Gambar 2). Gen nodulin mungkin memiliki ekspresi transien dan penting dalam fiksasi nitrogen simbiotik (Trevaskis et al., 2002; Nakamura et al., 2010). Gen ini terlibat dalam tahap awal perkembangan nodul, seperti pembelahan sel kortikal dan inisiasi nodul. Dengan demikian, gen nodulin mungkin memainkan peran utama dalam membedakan tahap perkembangan nodul di SS2-2 dan tipe liar (Lestari et al., 2006b; Salavati et al., 2012). 1279 Prosiding Seminar Nasional II Tahun 2016, Kerjasama Prodi Pendidikan Biologi FKIP dengan Pusat Studi Lingkungan dan Kependudukan (PSLK) Universitas Muhammadiyah Malang Malang, 26 Maret 2016 Gambar 1. Analisis penjajaran sekuen parsial transkrip 17sin1 dengan kinase like protein dari Arabidopsis thaliana (CAB80511) menggunakan GENRUNR. Warna biru dan merah: conserved region. Gambar 2. Analsis penjajaran sekun asam mino transkrip 51sin3 and 65S2 yang diduga sebagai nodulin dianalisis dengan GENRUNR. Warna biru dan merah adalah conserved region. Transkrip 73sin1 (ferri leghemoglobin reduktase) mungkin ditemukan dalam sel-sel dalam nodul kedelai untuk memfasilitasi transportasi oksigen (Ott et al., 2005). Sekuen 73sin1 conserve dengan leghemoglobin kedelai. 73sin1 ini mungkin terlibat dalam menentukan konsentrasi leghemoglobin di nodul, seperti didukung penelitian sebelumnya bahwa leghemoglobin total pada mutan hypernodul lebih rendah dari jenis liarnya (Sato et al., 2001; Tanabata & Ohyama, 2014), termasuk SS2-2 (Lestari et al., 2005). Gen-gen yang diidentifikasi ini memberikan petunjuk penting untuk studi fungsional lebih lanjut terkait fiksasi nitrogen dalam kedelai nodul super. Tabel 2. Daftar fragmen-transkrip terseleksi dengan nilai E tinggi spesifik pada SS2-2 dan Sinpaldalkong 2. FragmenPanjang Gen kandidat transkrip bp) Metabolisme danm energi 17sin3 425 Endo-1, 3(4)-beta-glucanase (EC 3.2.1.6) –from garden peaa 20sin1 417 Pyruvate dehydrogenase E1 component beta subunit chloroplast [A. thaliana]a 45sin2 334 Cytochrome P450 [Glycyrrhiza echinata]a 46sin1 236 Putative ferredoxin-dependent glutamate synthase, chloroplast precursor (Oryza 1280 No. Aksesi Homologi (%) NilaiEc JC7226 91 2e-26 NP_174304 94 6e-58 BAA76380 89 3e-23 NP_565665 93 4e-19 Prosiding Seminar Nasional II Tahun 2016, Kerjasama Prodi Pendidikan Biologi FKIP dengan Pusat Studi Lingkungan dan Kependudukan (PSLK) Universitas Muhammadiyah Malang Malang, 26 Maret 2016 46sin3 208 51sin3 230 73sin1 323 25S2 276 41S2 259 Transkripsi 13sin2 336 44sin1 273 48sin1 325 Sinyal transduksi 17sin1 378 24sin3 250 80sin1 250 Transport chain 2sin3 371 49sin1 364 12S5 449 Protein destination 26sin3 306 Cell rescue/Defense 17S2 314 Unknown protein 9S1 346 65S2 343 EST homology 9sin1 346 14sin5 464 26sin1 145 26sin3 13S2 340 406 28S2 110 29S1 83 sativa (japonica cultivar-group)]a Acetyl-coenzyme A carboxylase, carboxyltransferase alpha chain precursor [G. max]a Nodulin (clone GmN36b-fragment) [G. max]a Ferric leghemoglobin reductase-2 precursor [G. max]a Cell wall- associated hydrolase putative Campylobacter lari RM2100a Dihydroflavonol-4-reductase 1 [Medicago truncatula]a T06765 97 6e-20 S34799 100 2e-23 AAC26053 80 6e-26 ZP_003697 73 AAR27014 80 2e-19 97 7e-17 Putative polynucleotide phosphorylase AAF00646 [A. thaliana]a bZIP transcription factor ATB2 [G. AAN03468 a max] Receptor protein kinase homolog T50850 (imported) [G. maxa 89 2e-17 100 6e-17 100 6e-23 Protein kinase like protein [A. thaliana]a Putative zinc finger protein (P. sativum)a Phosphoenolpyruvate carboxylase kinase 4 [G. max]a CAB80511 CAA60828 AA575450 81 94 100 3e-15 5e-12 3e-24 Photosystem II D1 [Zea mays]a Plasma membrane –type calcium ATPase (ACA2) [A.thaliana]a Transposase [Fusarium oxysporum f. sp. Melonis]a NP_043004 CAB38303 98 100 2e-44 6e-23 AAP31248 42 2e-11 Sulfhydryl-pre-endopeptidase (AA-20 to 342) [Vigna mungo]a CAA33753 78 3e-14 Phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase [A. thaliana] a CAB78203 70 1e-12 Putative senescence-associated protein [Pisum sativum]a Nodulin [G. max]a BAB33421 94 2e-24 AAC72337 71 2e-11 26S rRNA gene [Shortia galacifolia]b Partial 28S rRNA gene [Spercheus emarginatus]b EST 00126 Wheat PI137739 induced cDNA [Triticum aestivum]b Leaf cDNA clone [Beta vulgaris]b 7-10 dpa fiber library cDNA [Gossypium arboreum]b Stem library (3-5 leaf stage) cDNA [Oryza sativa]b cDNA clone BY13068 [Nicotiana AY260045 AJ810753 100 100 3e-87 9e-42 CB412173 100 2e-30 BQ585794 BG443763 98 100 1e-45 1e-10 BI807320 99 6e-48 BP528232 97 9e-25 1281 Prosiding Seminar Nasional II Tahun 2016, Kerjasama Prodi Pendidikan Biologi FKIP dengan Pusat Studi Lingkungan dan Kependudukan (PSLK) Universitas Muhammadiyah Malang Malang, 26 Maret 2016 tabacum]b 27S2 310 Pollen PCR-based subtractive library, CN949773 100 8e-47 cDNA clone Peg10CS [Nicotiana tabacum]b 29S2 190 Flower subtracted cDNA library [Acacia CK468533 100 5e-50 mangium]b 26S4 70 Roots cDNA clone [Medicago AJ621860 100 7e-31 b truncatula] 33S1 268 KS04211T70 KS04, cDNA [Capsicum CB185093 99 2e-65 chinense]b 34S1 213 Fg06_05i17_RFg06_AAFC_ECORC_ CN813304 100 1e-41 Fusarium_graminearum_ perithecia Gibberella zeae cDNA clone b 35S2 103 Leaf Solanum phureja x Solanum AJ437598 100 1e-49 tuberosum cDNA cloneb a Analisis homologi fragment-transkrip menggunakan BLASTN b Analisis homologi fragment-transkrip menggunakan BLASTX c Fragmen-transkrip terseleksi dengan nilai E > 1e-10; sin: trasnktip di Sinpaldalkong 2, S:transkrip di SS2-2 PENUTUP Kesimpulan Beberapa tranksrip dalam studi ini berpotensi terlibat dalam supernodulasi pada mutan SS2-2 dan kedelai normal yang bersimbiosis dengan Bradyrhizobium. Sebagian besar fragmen-transkrip di SS2-2, dan Sinpaldalkong 2 menunjukkan homologi yang tinggi dengan protein tertentu. Jumlah fragmen-transkrip yang diidentifikasi pada tipe liar lebih tinggi daripada SS2-2 di sebagian besar kelas fungsional. Kategori fungsional transkrip dengan E-nilai tinggi termasuk metabolisme dan energi (9 gen), transkripsi (3 gen), sinyal transduksi (3 gen), rantai transportasi (3 gen), protein destination (satu gen), cell rescue/defence (satu gen), unknown function protein (2 gen), dan homologi dengan EST (13 gen) di kedua genotipe. Saran Sekuensing full gen dari transkrip terpilih hasil identifikasi dan pengelompokan perlu dilakukan. Kemudian, studi expresi dari transkrip signifikan dengan E tinggi perlu dilakukan baik secara kuantitatif maupun kualitatif. Hasil studi ekspresi gen yang diinginkan dapat menjadi dasar untuk analisis fungsional dari gen-gen terpilih tersebut. DAFTAR PUSTAKA Bachem, C.W.B., Oomen, R.J.F.J. & Visser, R.G.F. 1998. Transcript imaging with cDNAAFLP: A step-by-step protocol. Plant Molecular Biology Reporter, 16:157-173. Bonza, M.C, Morandini, P, Luoni, L, Geisher, M, Palmgren, M.G. & Michelis, I.D. 2000. At-ACA8 encodes a plasma membrane-localized calcium-ATPase of Arabidopsis with a calmodulin-binding domain at the N terminus. Plant Physiology, 123: 14951506. Dudley, A.M., Janse, D.M., Tanay, A., Shamir, R. & Church, G.M. 2005. A global view of pleiotropy and phenotypically derived gene function in yeast. Molecular Systems Biology. (Published online).Doi:10.1038/msb4100004. 1282 Prosiding Seminar Nasional II Tahun 2016, Kerjasama Prodi Pendidikan Biologi FKIP dengan Pusat Studi Lingkungan dan Kependudukan (PSLK) Universitas Muhammadiyah Malang Malang, 26 Maret 2016 Gresshoff, P.M., Rose, R.J., Sing, M. & Rolfe, B.G.2003. Symbiosis signals. St. Leonards, NSW: Today’s LifeScience. Ha, B.K. & Lee, S.H. 2001. Growth, nitrogen metabolism and nodulation of hypernodulating soybean mutant as affected by soil fertility. Korean Journal of Crop Science, 46: 145-149. Lee, H.S., Y.A. Chae, E.H. Park, Y.W. Kim, K.I. Yun, & S.H. Lee. 1997. Introduction, development, and characterization of supernodulating soybean mutant.I: Mutagenesis of soybean and selection of supernodulating soybean mutant. Korean Journal of Crop Science, 42:247-253. Lestari, P., Van, K., Kim, M.Y. & Lee, S.H. 2005. Symbiotic effectiveness of Bradyrhizobium japonicum USDA 110 in a nodul supernodulating soybean mutant SS2-2. Korean Journal of Crop Science, 50:125-130. Lestari, P., Van, K.,. Kim, M.Y., Hwang, C.H., Lee, B.W. & Lee, S.H. 2006a. Differentially expressed genes related to symbiotic association in a nodul supernodulating soybean mutant and its wild type. Molecular Plant Pathology, 7:235-247. Lestari, P. Van, K., Kim, M. Y. & Lee, S.H. 2006b. Newly featured infection events in a supenodulating soybean mutant SS2-2 by Bradyrhizobium japonicum. Canadian Journal of Microbiology, 52:328-335. Lestari, P., Van, K., Kim, M.Y. & Lee, S.H. 2006c. Nodulation and growth of a nodul supernodulating soybean mutant SS2-2 symbiotically associated with Bradyrhizobium japonicum. Jurnal Agrobiogen, 2(1):8-15. Lim, C.W., Lee, Y.W. & Hwang, C.H. 2011. Soybean nodule-enhanced CLE peptides in roots act as signals in GmNARK-mediated nodulation suppression. Plant and Cell Physiology, 9:1613-1627. Nakamura T., Nakayama N., Yamamoto R., Shimamura S., Kim Y., Hiraga S., Ohyama T., Komatsu S. & Shimada S. 2010. Nitrogen utilization in the nodul supernodulating soy‐ bean variety “Sakukei 4” and its parental varieties, “Enrei” and “Tamahomare.” Plant Production Science, 13:123-131. Nishimura R., Hayashi M., Wu G.J., Kouchi H., Imaizumi-Anraku H., Murakami Y., Kawasaki S., Akao S., Ohmori M., Nagasawa M., Harada K. and Kawaguchi M. 2002. HAR1 mediates systemic regulation of symbiotic organ development. Nature, 420: 426-429. Ott, T., van Dongen, J.T., Günther, C., Krusell, L., Desbrosses, G., Vigeolas, H., Bock, V., Czechowski, T., Geigenberger, P. & Udvardi, M.K. 2005. Symbiotic leghemoglobins are crucial for nitrogen fixation in legume root nodules but not for general plant growth and development. Current Biology, 15: 531-535. Pislariu, C.I., Murray, J.D., Wen, J.Q., Cosson, V., Muni, R.R.D., Wang, M., Benedito, V.A. Andriankaja, A., Cheng, X., Jerez, I.T., Mondy, S., Zhang, S., Taylor, M.E., Tadege, M., Ratet, P., Mysore, K.S., Chen, R. & Udvardi, M.K. 2012. A Medicago truncatula tobacco retrotransposon insertion mutant collection with defects in nodule development and symbiotic nitrogen fixation. Plant Physiology, 4:16861699. 1283 Prosiding Seminar Nasional II Tahun 2016, Kerjasama Prodi Pendidikan Biologi FKIP dengan Pusat Studi Lingkungan dan Kependudukan (PSLK) Universitas Muhammadiyah Malang Malang, 26 Maret 2016 Salavati, A., Bushehri, A.A., Taleei, A., Hiraga, S. & Komatsu, S. 2012. A comparative proteomic analysis of the early response to compatible symbiotic bacteria in the roots of a nodul supernodulating soybean variety. Journal of Proteomics, 3:819-832. Sambrook, J. & Russel, D.W. 2001. Molecular Cloning. A laboratory manual. 3rd ed. New York: Cold Spring Harbor. Santaella, M., Suarez, E., Lopez, C., Gonzalez, C., Mosquera, G., Restrepo, S., Tohme, J., Badillo, A. & Verdier, V. 2004. Identification of genes in cassava that are differentially expressed during infection with Xanthomonas axonopodis pv. manihotis. Molecular Plant Pathology, 5:549-558. Sato, T., Onoma, N.,. Fujikake, H., Ohtake, N., Sueyoshi, K. &. Ohyama, T. 2001. Changes in four leghemoglobin components in nodules of hypernodulating soybean (Glycine max L Merr.) mutant and its parent in the early nodule developmental stage. Plant and Soil, 237:129-135. Searle, R., Men, A.E., Laniya, T.S., Buzas, D.M., Iturbe-Ormaetxe, I., Carroll,B.J. & Gresshoff, P.M. 2003. Long-distance signaling in nodulation directed by a CLAVATA1-like receptor kinase. Science, 299:109-112. Shirasu, K.& Schulze-Lefert, P. 2003. Complex formation, promiscuity and multifunctionality: protein interactions in disease resistance pathways. Trend of Plant Science, 8:252-258. Simous-Araujo, J.L.,.Rodrigues, R.L., Gerhardt, L.B.A., Mondego, J.M.C., Alves-Ferreira, M., Rumjanek, N.G. & Margis-Pinheiro, M.. 2002. Identification of differentially expressed genes by cDNA-AFLP technique during heat stress in cowpea nodules. FEBS Letters, 515:44-50. Takahashi, M., Arihara, J., Nakayama, N., Kokubun, M., Shimada, S., Takahashi, K. & Hajika, M. 2003. Breeding of nodul supernodulating soybean cultivar "Sakukei 4". Bulletin of National Institute of Crop Science, 4: 17-28. Tanabata S., Ohtake N., Sueyoshi K., Kawaguchi M. & Ohyama T. 2013. Leaf growth of Lotus japonicus hypernodulation mutant har1-4. Bulletin of Faculty of Agriculture Niigata University, 66(1): 21-24. Tanabata, S. & Ohyama, T. 2014. Autoregulation of nodulation in soybean plants. (On line) (http://dx.doi.org/10.5772/56996, diakses tanggal 25 maret 2016). Trevaskis, B., Colebatch,G.,Desbrosses, G.,Wandrey, M., Mienkoop, S., Saalbach, G. & Udvardi, M. 2002. Differentiation of plant cells during symbiotic nitrogen fixation. Comparative and Functional Genomics, 3:151-157. Vos, P. R., Hogerss, M., Bleeker, M., Reijans, T., Lee, V.D., Hornes, M., Frijters, A. Pot, J., Peleman, J., Kuiper, M. & Zabeau, M. 1995. AFLP: A new technique for DNA fingerprinting. Nucleic Acids Research, 23:4407-4414. Yahyaoui, F.E., Kuster, H., Amor, B.B., Hohnjec, N., Puhler, A., Becker, A., Gouzy, J., Vernie, T., Gough, C., Niebel, A., Godiard, L.& Gamas. P. 2004. Expression profiling in Medicago truncatula identifies more than 750 genes differentially expressed during nodulation, including many potential regulators of the symbiotic program. Plant Physiology, 136:3159-3176. 1284
