601 Uji tumbuh beberapa isolat bakteri Vibrio - BPPBAP

601
Uji tumbuh beberapa isolat bakteri Vibrio... (Endang Susianingsih)
UJI TUMBUH BEBERAPA ISOLAT BAKTERI Vibrio BERPENDAR
YANG DIISOL ASI DARI LOKASI BERBEDA
Endang Susianingsih dan Koko Kurniawan
Balai Riset Perikanan Budidaya Air Payau
Jl. Makmur Dg. Sitakka No. 129, Maros 90512, Sulawesi Selatan
E-mail: litkan ta_0 [email protected]; e_ sis@yah oo.com
ABSTRAK
Di antara beberapa bakteri patogen, spesies vibrio sudah dikenal sebagai penyakit vibriosis ada udang
penaeid. Bakteri vibrio adalah salah satu penyebab pnyakit yang cukup banyak menyerang hewan budidaya
seperti udang windu. Beberapa spesies ikan dan kekerangan bahkan juga karang. Beberapa spesies vibrio
berpendar seperti Vibrio cholerae (biotype Albensis), V.fischeri, V. harveyi, V. logei, V. splendidus, V.meditteranev,
Photobacterium leiognathi, dan P. phosporeum diketahui berhubungan erat dengan beberapa kejadian penyakit
pada lingkungan pembesaran hewan budidaya. Vibrio harveyi merupakan bakteri yang membutukan sodium
klorida untuk hidupnya, berbentuk curve-rod dan termasuk dalam kelompok bakteri gram negatif yang
banyak ditemukan pada lingkungan perairan serta dapat memendarkan cahaya sendiri pada kondisi tertentu.
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui kurva pertumbuhan dari beberapa isolat bakteri vibrio berpendar
yang diisolasi dari lokasi berbeda setelah ditumbuhkan pada media spesifik dengan penambahan rifampisin.
Tiga isolat bakteri yang digunakan adalah bakteri isolat 1 (Banyuwangi), isolat 2 (Negare-Bali), serta isolat 3
(Gondol-Bali). Pembuatan mutan resisten rifampisin diakukan dengan menggunakan dosis 50 dan 100 mg/
L. Hasil penelitian menunjukkan bahwa isolat 1 dan 2 memperlihatkan puncak pertumbuhan pada jam ke4 kemudian mengalami penurunan, sedangkan isolat 3 mengalami puncak pertumbuhan pada jam ke-6.
Pengetahuan mengenai puncak pertumbuhan bakteri ini dapat dijadikan acuan pada uji patogenisitas.
KATA KUNCI:
uji tumbuh, vibrio berpendar, lokasi berbeda
PENDAHULUAN
Pertumbuhan merupakan suatu proses yang bersifat irreversible artinya tidak dapat dibalik
kejadiannya. Pertumbuhan didefinisikan sebagai pertambahan kuantitas, konstituen seluler dan
struktur organisme yang dapat dinyatakan dengan ukuran, diikuti pertambahan jumlah, pertambahan
ukuran sel, pertambahan berat atau massa, dan parameter lain. Pertumbuhan bakteri dipengaruhi
oleh beberapa faktor
1. suhu, umumnya bakteri tumbuh baik pada suhu antara 25°C-35°C;
2. Kelembaban, lingkungan lembab dan tingginya kadar air sangat menguntungkan untuk
pertumbuhan bakteri;
3. Sinar Matahari, sinar ultraviolet yang terkandung dalam sinar matahari dapat mematikan bakteri;
4. Zat kimia, antibiotik, logam berat dan senyawa-senyawa kimia tertentu dapat menghambat
bahkan mematikan bakteri.
Di antara beberapa bakteri patogen, spesies vibrio sudah dikenal sebagai penyebab penyakit
vibriosis pada udang penaeid. Bakteri vibrio adalah salah satu penyebab penyakit yang cukup banyak
menyerang hewan budidaya seperti udang windu (Karunasagar et al., 1994), beberapa spesies ikan
dan kekerangan (Austin & Zhang, 2006) bahkan juga karang (Ben-Haim et al., 2003). Beberapa spesies
Vibrio berpendar seperti Vibrio cholerae (biotype albensis), V. fischeri, V. harveyi, V. logei, V. splendidus, V.
mediterranei (Farmer & Hickman-Brenner, 1992), V. orientalis (Yang et al., 1983), Photobacterium leiognathi
dan P. Phosphoreum diketahui berhubungan erat dengan beberapa kejadian penyakit pada lingkungan
pembenihan dan pembesaran hewan budidaya.
Penyakit vibriosis pada budidaya udang dapat menyebabkan penurunan produksi yang cukup
besar. Seperti diketahui bahwa kemampuan bakteri dalam menginfeksi inangnya juga dipengaruhi
Prosiding Forum Inovasi Teknologi Akuakultur 2011
602
oleh kepadatan bakteri dalam media budidaya. Sehingga jika keberadaan bakteri dapat dideteksi
sebelum jumlahnya mencapai quorum, usaha pencegahan dapat dilakukan, misalnya dengan
menghambat pertumbuhan bakteri agar sifatnya tidak berubah dari saprofit menjadi patogen.
Penelitian yang dilakukan oleh Defoirdt (2007) menyimpulkan bahwa kemampuan bakteri Vibrio
untuk melakukan quorum sensing sangat dipengaruhi oleh populasi bakteri tersebut di alam. Populasi
104 cfu/mL merupakan populasi minimal yang memungkinkan bakteri vibrio dapat berkomunikasi
secara seluler baik dengan sesamanya dalam satu spesies (interspesies) maupun dengan jenis vibrio
patogen lainnya (intraspesies).
Berdasarkan hal tersebut di atas pengetahuan mengenai kemampuan tumbuh bakteri Vibrio sp.
berpendar ini menjadi satu hal yang perlu diketahui. Selain dapat dijadikan acuan untuk mengetahui
tingkat patogenisitasnya juga dapat digunakan untuk mendeteksi adanya kontaminasi bakteri tersebut
sehingga akan sangat membantu dalam penanganan dan pencegahan awal yang tepat waktu untuk
mengurangi kematian udang.
BAHAN DAN METODE
Penelitian ini terdiri atas 2 tahap menggunakan 3 isolat bakteri Vibrio sp. berpendar yaitu isolat
1 yang diisolasi dari Banyuwangi, isolat 2 dari Negare Bali, dan isolat 3 dari Gondol, Bali. Masingmasing tahapan tersebut adalah sebagai berikut:
1. Pembuatan mutan dari masing-masing isolat bakteri;
2. Uji pertumbuhan mutan masing-masing isolat bakteri.
Pembuatan Mutan dari Masing-masing Isolat Bakteri Uji
Pembuatan mutan dari masing-masing isolat dimaksudkan untuk merubah sifat bakteri tersebut
dari sensitif terhadap suatu antibiotik menjadi resisten. Hal ini bertujuan untuk memberikan penanda
pada bakteri agar mudah dikenali pada saat isolasi ulang bakteri tersebut pada prosedur postulat
Koch.
-
-
-
Proses pembuatan mutan tersebut dilakukan dengan cara:
Isolat bakteri yang akan diuji (isolat 1, 2, dan 3) masing-masing diinokulasi ke dalam media
tumbuh Nutrient Broth (NB), yang dibuat dengan cara melarutkan sebanyak 8 g NB ke dalam 1 L
aquadest steril dan diberi penambahan NaCl sebanyak 1,5 %, dihomogenkan dan kemudian
dibagi ke dalam 6 tabung reaksi masing-masing sebanyak 10 mL. Sterilisasi terhadap media
tersebut dilakukan dengan menggunakan autoclave pada suhu 121°C tekanan 1 atm selama 15
menit. Setelah steril dan suhunya telah sesuai dengan suhu ruang, inokulasi masing-masing
bakteri uji dilakukan dengan memasukkan sebanyak 1 ose bakteri ke dalam media NB tersebut.
Penumbuhan dan homogenisasi dilakukan menggunakan shaker pada 150 rpm selama 4 jam.
Setelah 4 jam (penentuan 4 jam berdasarkan uji tumbuh yang dilakukan pada isolat bakteri
yang WT/wild type) bakteri tersebut ditanam (diinokulasi) ke dalam media TCBS (Thiosulfat
Ctrate Bile Sucrose Agar). Media TCBSA dibuat dengan cara menimbang sebanyak 89 g TCBSA
dan dilarutkan ke dalam 1.000 mL aquadest steril. Larutan ini kemudian dimasak hingga mendidih
dan disterilkan menggunakan autoclave. Setelah steril dan suhunya telah sesuai dengan suhu
ruang kemudian dituang ke plate (petri dish) steril masing-masing sebanyak 20 mL/plate. Inokulasi
bakteri pada media TCBSA dilakukan dengan cara mengambil sebanyak 100 mikron (0,1 mL)
biakan bakteri dalam NB dan disebarkan secara merata ke media TCBSA tersebut.
Untuk mengetahui sensitifitas bakteri terhadap antibiotik rifampicin, maka dilakukan uji hambatan
menggunakan rifampisin 5, 10, 50, dan 100 mg/L, dengan cara merendam papper disk (kertas
cakram) ke dalam masing-masing konsentrasi rimfampisin kemudian di letakkan (ditempatkan)
pada media TCBSA sesuai penomoran yang telah diberikan (Gambar 1). Sebelumnya dilakukan
penanaman bakteri Vibrio sp. dengan metode sebar pada media TCBS yang akan dijadikan media uji hambat.
603
Uji tumbuh beberapa isolat bakteri Vibrio... (Endang Susianingsih)
Gambar 1. Penempatan kertas cakram yang telah
mengalami perendaman rifampisin pada
konsentrasi 50 dan 100 mg/L
-
Uji resistensi bakteri Vibrio sp. dilakukan dengan menanam biakan bakteri yang telah dipadatkan
melalui proses sentrifugasi pada media TCBS yang telah ditambahkan antibiotik rifampicin 50
dan 100 mg/L. Koloni bakteri Vibrio sp. yang berhasil tumbuh pada media TCBSA +rif 50 mg/L
selanjutnya ditumbuhkan lagi pada media TCBSA + rif 100 mg/L. Koloni bakteri yang tumbuh
pada media TCBSA + rif 100 mg/L selanjutnya diisolasi dan merupakan isolat bakteri Vibrio sp.
resisten rifampicin.
Setelah bakteri mutan (resisten terhadap rifampisin) diperoleh maka selanjutnya dilakukan uji
tumbuh untuk masing-masing isolat bakteri tersebut.
Uji Pertumbuhan Mutan Masing-masing Isolat Bakteri
Uji tumbuh ini dimaksudkan untuk melihat kemampuan tumbuh dari masing-masing isolat
sehingga dapat diketahui pada saat kapan bakteri tersebut berada pada puncak pertumbuhannya.
Uji ini dilakukan dengan cara menginokulasi bakteri uji ke dalam media tumbuh NB yang kemudian
dihomogenkan dengan menggunakan shaker (pengocok) secara terus-menerus pada kecepatan 150
rpm. Pengamatan pertumbuhan dilakukan dengan cara menginokulasi bakteri pada media NB ke
dalam media TCBSA yang telah diberi penambahan rifampisin masing-masing pada konsentrasi 50
dan 100 mg/L. Pengambilan sampel untuk pengamatan pertumbuhan dilakukan dengan interval
N
T 1 1
X X (cfu/mL)
Q V S
setiap 2 jam selama 24 jam. Sampel bakteri yang di inokulasi pada media TCBSA penanamannya
dilakukan dengan menggunakan larutan fisiologis saline solutin (0,85% NaCl) secara berseri
(pengenceran) mengikuti prosedur penanaman bakteri menurut Austin (1993). Bakteri-bakteri yang
telah ditanam pada media TCBSA tersebut pertumbuhannya kemudian dihitung setelah diinkubasi
selama 24 jam untuk setiap waktu pengamatan. Penghitungan dilakukan dengan cara menghitung
setiap koloni bakteri yang tumbuh pada setiap pengenceran yang diberikan berdasarkan rumus:
di mana:
N
T
Q
V
S
=Jumlah bakteri
=Total bakteri pada semua cawan dengan tingkat pengenceran yang sama (cfu)
=Jumlah cawan
=Volume sampel yang diinokulasi
=Tingkat pengenceran
Prosiding Forum Inovasi Teknologi Akuakultur 2011
604
HASIL DAN BAHASAN
Pembuatan Mutan dari Masing-masing Isolat Bakteri Uji
Hasil pembuatan mutan terhadap isolat-isolat bakteri yang akan digunakan menunjukkan bahwa
semua isolat tersebut resisten terhadap rifampisin baik pada konsentrasi 50 maupun 100 mg/L
(Gambar 2). Hal ini ditandai dengan adanya zona hambatan yang ditimbulkan oleh bakteri akibat
pemberian antibiotik rifampisin. Untuk selanjutnya rifampisin yang digunakan pada konsentrasi 100
mg/L. Hal ini dikarenakan rifampisin yang digunakan adalah rifampisin dengan dosis 600 mg/tablet.
Di samping metode uji hambat dengan kertas cakram, dilakukan juga uji mutan dengan metode
sebar.
Isolat Banyuwangi
Isolat Bali
Isolat Bali
Gambar 2. Hasil uji hambat masing-masing isolat bakteri dengan menggunakan kertas cakram
Zona hambatan yang diperlihatkan oleh masing-masing isolat dengan penambahan rifampisin
50 dan 100 mg/L pada media TCBSA yang dibandingkan dengan kontrol dapat dilihat pada Gambar
3, 4, dan 5.
Rif 100 mg/L
Rif 50 mg/L
Kontrol
Gambar 3. Hasil uji hambat bakteri asal Banyuwangi
Uji Pertumbuhan Mutan Masing-masing Isolat Bakteri
Hasil uji pertumbuhan untuk masing-masing isolat dengan interval waktu pengamatan setiap 2
jam pada media NB (Nutrien Broth) dapat dilihat pada Gambar 6.
Dari Gambar 6 terlihat bahwa untuk isolat 1 (kepadatan populasi 10 8 cfu/mL) puncak
pertumbuhannya diperoleh pada jam ke-4, isolat 2 puncak pertumbuhannya diperoleh pada jam ke4 (kepadatan populasi hingga 10 9 cfu/mL) kemudian mengalami penurunan, sedangkan isolat 3
605
Uji tumbuh beberapa isolat bakteri Vibrio... (Endang Susianingsih)
Rif 50 mg/L
Rif 100 mg/L
Kontrol
Gambar 4. Hasil uji hambat bakteri asal Negare, Bali
Rif 100 mg/L
Rif 50 mg/L
Kontrol
Gambar 5. Hasil uji hambat bakteri asala Gondol, Bali
Populasi bakteri (Log cfu/mL)
10
9
8
7
6
5
4
3
1
2
2
1
3
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
Waktu pengamatan (interval waktu 2 jam)
Gambar 6. Pertumbuhan masing-masing isolat bakteri selama waktu pengamatan
Prosiding Forum Inovasi Teknologi Akuakultur 2011
606
mengalami puncak pertumbuhan pada jam ke-6 (dengan kepadatan populasi 10 8 cfu/mL). Hal ini
berarti untuk pengaplikasian ke-3 isolat tersebut untuk uji-uji patogenisitas yang akan dilakukan
dapat digunakan setelah 4-6 jam penumbuhan bakteri pada media pengkayaan. Istilah pertumbuhan
bakteri sebenarnya lebih mengacu kepada pertambahan jumlah sel bukan kepada perkembangan
individu organisme sel. Pengetahuan akan kurva pertumbuhan bakteri sangat penting untuk
menggambarkan karakteristik pertumbuhan bakteri, sehingga akan mempermudah di dalam kultivasi
(menumbuhkan) bakteri ke dalam suatu media, penyimpanan kultivasi, dan penggantian media
(Anonim, 2006). Selanjutnya dikatakan bahwa ada 4 Fase atau tahap pada kurva pertumbuhan
bakteri yaitu:
1 . Fase lambat: Tidak ada pertumbuhan populasi karena sel mengalami perubahan komposisi
kimiawi dan ukuran serta bertambahnya substansi intraseluler sehingga siap untuk membelah
diri.
2. Logaritma atau eksponensial: Sel membela diri dengan laju yang konstan, massa menjadi dua
kali lipat, keadaan pertumbuhan seimbang.
3. Stationary (tetap): Terjadinya penumpukan racun akibat metabolisme sel dan kandungan nutrien
mulai habis, akibatnya terjadi kompetisi nutrisi sehingga beberapa sel mati dan lainnya tetap
tumbuh. Jumlah sel menjadi konstan.
4. Mati: sel menjadi mati akibat penumpukan racun dan habisnya nutrisi, menyebabkan jumlah sel
yang mati lebih banyak sehingga mengalami penurunan jumlah sel secara eksponensial.
KESIMPULAN
-
Bakteri Vibrio sp. yang diujikan memiliki kemampuan untuk tumbuh pada media spesifik dengan
penambahan rifampisin pada konsentrasi 50 dan 100 mg/L.
Puncak pertumbuhan bakteri Vibrio sp. yang diujikan adalah 4 dan 6 jam.
DAFTAR ACUAN
Anonim. 2006. http/rachdie.blogsome.com/2006/prinsip-pertumbuhan-bakteri/. Diakses tanggal 17
Juli 2011.
Austin,B. & Zhang, X.-H. 2006. Vibrio harveyi: a significant pathogen of marine vertebrates and
invertebrates. Lett. Appl. Microbiol., 43: 119-124.
Ben Haim, Y., Thompson, F.L., Thompson, C.C., Cnockaert, M.C., Hoste, B., Swings, J., & Rosenberg, E.
2003. Vibrio coralliilyticus sp. nov., a temperature-dependent pathogen of the coral Pocillopora
damicornis. Int J. Syst. Evol. Microbiol., 53: 309-315.
Defoirdt, T. 2007. Quorum sensing disruption and the use of short-chain fatty acids and polyhydroxyalkanoates
to control luminescent Vibriosis. PhD thesis, Ghent University, Belgium, 228 pp.
Farmer, J.J. & Hickman-Brenner, F.W. 1992. The genera Vibrio and Photobacterium. In The Prokaryotes
- a Handbook on the Biology of Bacteria: Ecophysiology, Isolation, Identification, Applications,
Balows, A (Ed.). New York, Springer, p. 2,952-3,011.
Karunasagar, I., Pai, R., Malathi, G.R., & Karunasagar, I. 1994. Mass mortality of Penaeus monodon
larvae due to antibiotic-resistant Vibrio harveyi infection. Aquaculture, 128: 203-209.
Yang, Y.K., Yeh, L.P., Cao, Y.H., Baumann, L., Baumann, P., Tang, J.E., & Beaman, B. 1983. Characterization
of marine luminous bacteria isolated off the coast of China and description of Vibrio orientalis sp.
Nov. Curr. Microbiol., 8: 95–100. http://mic.sgmjournals.org 1777 Molecular identification of V.
harveyi-related isolates.