LAPORAN isolasi dna fix
advertisement
BAB I PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang DNA adalah asam nukleat yang mengandung materi genetik dan berfungsi untuk mengatur perkembangan biologis seluruh bentuk kehidupan secara seluler. DNA terdapat pada nukleus, mitokondria, dan kloroplas. Perbedaan ketiganya adalah DNA nukleus berbentuk linier dan berasosiasi sangat erat dengan protein histon, sedangkan DNA mitokondria dan kloroplas berbentuk sirkular dan tidak berasosiasi dengan protein histon. Selain itu DNA mitokondria dan kloroplas memiliki ciri khas, yaitu hanya mewariskan sifat-sifat yang berasal dari garis ibu. Sedangkan DNA nukleus memiliki pola pewarisan sifat dari kedua orangtua. Dilihat dari organismenya, struktur DNA prokariot tidak memiliki protein histon dan berbentuk sirkular, sedangkan DNA eukariot berbentuk linier dan memiliki protein histon. Isolasi DNA adalah suatu tekhnik yang digunakan untuk memperoleh DNA murni, yaitu tanpa protein dan RNA dari suatu sel dalam jaringan. isolasi DNA dapat dilakukan melalui tahapantahapan antara lain: preparasi ekstrak sel, pemurnian DNA dari ekstrsk sel dan presipitasi DNA. Meskipun isolasi DNA dapat dilakukan dengan berbagai cara, akan tetapi pada setiap jenis atau bagian tanaman dapat memberikan hasil yang berbeda, hal ini dikarenakan adanya senyawa polifenol dan polisakarida dalam konsentrasi tinggi yang dapat menghambat pemurnian DNA Pada proses isolasi DNA ini, sel eukariotik harus dihancurkan terlebih dahulu melalui cara mekanik dan enzimatis. 1.2 Tujuan - Mengetahui Definisi Isolasi DNA - Mengetahui metode dan tahapan dalan isolasi DNA - Mengetahui manfaat isolasi DNA 1.3 Manfaat Mahasiswa dapat mengetahui dan melakukan proses-proses yang berkaitan langsung untuk melakukan isolasi DNA. BAB II TINJAUAN PUSTAKA 2.1 Definisi Isolasi DNA Isolasi DNA merupakan langkah mempelajari DNA.salah satu prinsip isolasi DNA yaitu dengan sentrifugasi.sentrifugasi merupakan teknik untuk memisahkan campuran berdasarkan berat molekul komponennya.molekul yang mempunyai berat molekul besar akan berada di bagian bawah tabung dan molekul ringan akan berada pada bagian atas tabung (Mader, 1993). Isolasi DNA merupakan kegiatan yang dapat dilakukan melalui tahapan-tahapan antara lain: preparasi ekstrak sel, pemurnian DNA dari ekstrsk sel dan presipitasi DNA. Meskipun isolasi DNA dapat dilakukan dengan berbagai cara, akan tetapi pada setiap jenis atau bagian tanaman dapat memberikan hasil yang berbeda, hal ini dikarenakan adanya senyawa polifenol dan polisakarida dalam konsentrasi tinggi yang dapat menghambat pemurnian DNA (Jamilah, 2005). DNA isolation is the most important step in molecular biology analysis. Several DNA isolation techniques which are developed were expensive. Arti: Isolasi DNA merupakan tahap terpenting dalam analisis biologi molekuler. Teknik-teknik isolasi DNA yang telah dikembangkan sangat mahal dan memerplukan waktu yang lama. (Listanto,1996) 2.2 Macam-macam Metode Isolasi DNA 1.Teknik Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) Teknik pengujian polimorfisme DNA berdasarkan pada amplifikasi dari segmen-segmen DNA acak yang menggunakan primer tunggal yang sekuen nukleotidanya ditentukan secara acak.Primer tunggal ini biasanya berukuran 10 basa.PCR dilakukan pada suhu anealing yang rendah yang memungkinkan primer menempel pada beberapa lokus pada DNA. Aturan sederhana untuk primer adalah terdiri atas 18- 28 susunan basa dengan persentase G+C 50-60% (Istanti,1999) 2. Metode CTAB Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide (CTAB) merupakan metode yang umum digunakan dalam ekstraksi DNA genom tanaman yang banyak mengandung polisakarida dansenyawa polifenol (Ardiana,2009) Menghasilkan pita DNA yang berukuran tebal dan dapat memisahkan DNA dari polisakarida karena adanya perbedaan karakteristik kelarutan (differensial of solubility). Disamping deperoleh fragmen DNA, dengan metode CTAB juga akan diperoleh RNA dengan pita tipis yang terletak jauh berada di bawah pita DNA. Keberadaan pita RNA tergantung bahan yang diekstraksi (Prasetyo, 2008). 3. Phenol:chloroform Mengunakan senyawa Phenol-choloroformisoamyl alcohol, Metode standard untuk ekstraksi DNA,Akhir-akhir ini ditinggalkan, karena sifat toksik phenol. (Barnum 2005) 4. SaltingOut Menggunakan garam konsentrasi tinggi (NaCl 6 M), untuk medenaturisasi protein menggunakan Proteinase K untuk denaturasi protein. (Barnum 2005). 5. Guanidine isothiocyanate Metode ini lebih cepat dibanding dua metode sebelumnya, Thiocyanate bersifat toksik, untuk lisis dinding sel , Memerlukan chloroform untuk denaturasi protein. (Barnum 2005). 6. Silica Gel Silica gel dapat mengikat DNA dengan perantaraan garam/buffer tertentu (NaI), Cepat, tetapi recovery DNA kurang (Barnum 2005). 7. PCR (Polymerase Chain Reaction) Merupakan suatu teknik perbanyakan (amplifikasi) potongan DNA secara in vitro pada daerah spesifik yang dibatasi oleh dua buah primer oligonukleotida.Primer yang digunakan sebagai pembatas daerah yang diperbanyak adalah DNA untai tunggal yang urutannya komplemen dengan DNA templatnya. Proses tersebut mirip dengan proses replikasi DNA secara in vivo yang bersifat semi konservatif (Giri, 2004) 2.3 Tahapan Isolasi DNA Pada prinsipnya isolasi DNA sel harus dipecah terlebih dahulu dengan beberapa agensia, baik secara fisik kimia atau dengan mempergunakan enzim tertentu. Pemecahan dengan cara fisik misalnya dengan menggunakan alat sonikator, yaitu merupakan alatb yang menghasilkan suara ultra tinggi. Pemecahan dengan alat ini biasanya cukup fektif untuk memecah sel bacteri, tetapi kurang efektif untuk memecah sek eukaryote. Pemecahan sel juga dapat dilakukan dengan menggunakan enzim lisozim yang dapat memecah dinding sel. Seringkali penggunaan enzim ini dikombinasikan dengan perlakuan fisik, misalnya dengan pemansan sehingga sel lebih mudah pecah. Senyawa lain yang sering digunakan untuk memecah sel untuk isolasi DNA adalah CTAB (Cetyl Trimetyl Ammonium Bromide). Setelah sel pecah selanjunya dilakukan isolasi dan pemurnian DNA. Untuk mengisolasi suatu fragmen DNA tertentu, DNA genom kemudian dipotong dengan menggunakan enzin endonuclease restriksi, enzim ini enzim yang dapat memotong molekul DNA di bagian tertentu. Hasil potongan dengan enzim tertentu akan menghasilkan ujungujung DNA yang sama sesuai dengan titik potong oleh enzim. Selain dengan menggunkan enzin endonuclease restriksi, DNA genom juga dapat dipotong-potong secara mekanis, misalnya menggunakan alat sonikator.Hasil potongan dengan alat mekanis adalah molekul DNA yang ujungnya tidak beraturan. (Yuwono,2006) 2.4 Manfaat Isolasi DNA Visualisasi DNA dengan elektroforesis gel. Peninjauan pola fragmen DNA hasil pemotongan secara enzimatik melaluiteknik Hibridisasi Southern Isolasi DNA genomik dalam rangka pembuatan pustaka genomik. Isolasi plasmid atau DNA fage dalam prosedur rutin peminakan DNA. Isolasi DNA yang diperlukan sebagai cetakan (template) dalam prosedur perbanyakan DNA secara in vitro melalui teknik PCR. (Arumingtyas, 2012) BAB III METODOLOGI 3.1 Alat dan Bahan Fungsi 3.1.1 Alat yang digunakan : Mortar :menghaluskan bahan Pistil :alat untuk menghaluskan bahan Tips : Ujung dari mikropipet, mendetialkan pengambilan dan pengeluaran sampel Gelas ukur : mengukur bahan cairan buffer yang akan digunakan Tubes 1,5 ml: wadah/tabung unutk pengamatan Tissue : pembersih alat dan pengelap Gunting : menggunting bahan (penisah bahan dari tulang daun) Spatula : memindahkan bahan dari mortar Mikro pipet : untuk mengambil bahan cair Erlenmeyer : wadah dari bahan cair Microwave : memanaskan bahan Mesin PCR : untuk replikasi Oven : memanaskan bahan dan mengeringkannya Vortex : untuk menghomogenkan campuran Timbangan analitik : mengukur berat bahan Stirrer : mengaduk bahan dengan cairan pH meter : mengukur ph Mesin elektroforesis : untuk mengelektroforesis bahan Centrifuge : untuk menghomogenkan larutan Autoclafe : untuk menyeterilkan bahan Lemari es : untuk menginkubasi bahan pengamatan Pipet :mengambil bahan cair 3.1.2Bahan yang digunakan Daun - Belimbing : Bahan yang diamati - bayam : Bahan yang diamati - sawi hijau : Bahan yang diamati CTAB : melisis membran sel HCl : untuk mencuci DNA EDTA : sebagai penyangga Merkaptho etanol : sebagai penyangga Nitrogen cair : membantu proses penggerusan PVP (polivinipirolidone) : memisahkan fase organic & fenol CHISAM (chloroform isoamil alcohol) : untuk mengurangi kontaminasi protein Buffer pencuci: untuk mencuci DNA Betha-Mertacaptoethanol : menghilangkan kontaminan polisakarida Ethidium bromide : mengurangi kontaminan RNA PROMEGA : sebagai penyangga SRR : sebagai penyangga Isopropanol dingin : untuk presipitasi 3.2 Langkah Kerja + dokumentasi Timbang 0.1 gr sampel daun Masukan dalam mortar dan tambahkan sedikit PVPdan tambahkan nitrogen cair. Gerus cepat sampai halus (jangan sampai mencair). Campur buffer ekstraksi dengan karbon (0.5 % w/v) dan mercaptoe ethanol 4 µl (kocok sebelum digunakan) Masukan 1 ml kedalam tube ukuran 1.5 ml dan tutup kembali tube Beri label Tube berisi buffer reaksi Segera vortex sampai homogen Inkubasi 65o C 30 menit (balik tube tiap 15 menit) Kaluarkan tube dan dinginkan Sentrifuge 10000 rpm (10 menit) Ambil supernatan Pindahkan ke tube baru Tambah 500 µl CHISAM Vortex sampai homogeny Centrifuge 10000 rpm (10 menit) Pindahkan supernatan ke tube baru 1.5 ml Tambah 500 µl CHISAM Centrifuge 10000 rpm (10 menit) Pindahkan supernatan ke tube baru 1.5 ml Tambah 300 µl isopropanol dingin secara perlahan Bolak-balik tube perlahan Inkubasi dalam freezer (30 menit) Keluarkan tube ( biarkan hingga tidak terlalu dingin ) Sentrifuse (8000 rpm) selama 10 menit Buang supernatan dan tambahkan buffer pencuci 500 µl pada pellet dalam tube kemudian vortex Sentrifuse pada 9000 rpm (10 menit) Buang supernatan Kering anginkan pellet ±20 menit Tambahkan buffer TE 50-100 µl dan larutka pellet DNA dengan mengetukan tube perlahan Tambah 1 µl RNAse , inkubasi dalam oven (37oC selama 30 menit) ISOLAT DNA Simpan dalam Freezer Dokumentasikan analisis 3.3 Analisis Perlakuan Timbang 0.1 gr sampel daun kamudian daun dimasukan dalam mortar dan tambahkan sedikit PVPdan tambahkan nitrogen cair., hati-hati alam proses pengambilan nitrogen cair. Kkemuudian setelah nitrogen cair di letakan dalam mortar, kakukan penggerusan secara cepat sampai halus (jangan sampai mencair). Lalu campur buffer ekstraksi dengan karbon (0.5 % w/v) dan mercaptoe ethanol 4 µl (kocok sebelum digunakan). Setelahnya masukan 1 ml kedalam tube ukuran 1.5 ml dan tutup kembali tube dan jangan lupa beri laleb pada tiap tube, (Tube berisi buffer reaksi), pada tube yang telah berisi buffer reaksi, masukan gerusan bahan daun yang telah halus dengan menggunakan spatula, masukan secara perlahan dan usahakan jangan sampai ad abahan yang jatuh, kemudian setelah bahan masuk dan bercampur dengan buffer reaksi segera vortex bahan sampai homogen. Inkubasi 65o C 30 menit (balik tube tiap 15 menit). Setelah itu keluarkan tube dan dinginkan, lalau sentrifuge dengan kecepatan 10000 rpm (10 menit). Setelah disentrifuge ambil supernatan dari bagian yang ada pada tube yang telah mengalami beberapa pemisahan bagian. Lalu pindahkan ke tube baru dengan ukuran 1.5 ml dan Tambah 500 µl CHISAM kemudian Vortex lagi sampai homogeny. Centrifuge lagi dengan kecepatan 10000 rpm (10 menit). Lalu pindahkan supernatan ke tube baru 1.5 ml dan tambah 500 µl CHISAM lagi-lagi bahan di Centrifuge 10000 rpm (10 menit). Dan lagi-lagi dipindahkan supernatan ke tube baru 1.5 ml dan tambah 300 µl isopropanol dingin secara perlahan-lahan. Bolak-balik tube secara perlahan kmudian Inkubasi dalam freezer (30 menit), setelahnya keluarkan tube ( biarkan hingga tidak terlalu dingin ), lalu Sentrifuse (8000 rpm) selama 10 menit. Dan buang supernatan dan tambahkan buffer pencuci 500 µl pada pellet dalam tube kemudian vortex. Sentrifuse pada 9000 rpm (10 menit) kemudian buang supernatan. Kering anginkan pellet ±20 menit Dan terakhir tambahkan buffer TE 50-100 µl dan larutka pellet DNA dengan mengetukan tube perlahan Tambah 1 µl RNAse , inkubasi dalam oven (37oC selama 30 menit). ISOLAT DNA pun di dapatkan jangan lupa Simpan dalam Freezer, Dokumentasikan dan laporan pun siap menunggu untuk dikerjakan dan dikumpulkan BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1 Hasil (Dokumentasi dan Keterangan) No 1 Gambar Keterangan Sampel yang digunakan adalah daun bayam Hasilnya : DNA tidak terlihat 2 Sampel yang digunakan adalah daun belimbing Hasilnya : DNA terlihat 3 Sampel yang digunakan adalah daun sawi hijau Hasilnya : DNA tidak terlihat 4.2 Pembahasan di banding dengan literature Dari hasil praktikum dapat disimpulkan bahwa dari ketiga hasil yang didapat dapat dilihat bahwa benang-benang yang terlihat jelas hanya di sampel no dua (daun belimbing), hal ini dikarenakan untuk sampel daun belimbing baru saja dipetik dan masih muda. Sehingga memungkinkan untuk lebih terlihat DNA nya Sedangkan pada kedua sampel lainya , DNA tidak terlihat, hal ini dikarenakan kedua sampel lainya merupakan sampel dari kelompok sebelumnya yang diambil lebih dahulu dibanding sampel daun belimbing. Selain itu kegagalan isolat lainnya pada kedua sampel ialah pada saat diletakkan pada freezer dan adanya human error. Human error pun dapat disebabkan oleh adanya kesalahan saat pengambilan supernatant atau saat pemberian larutan lainnya. Hal ini sesuai literatur yang didapat, menurut Zubaidah (2004) menyatakan bahwa isolasi DNA dapat dilakukan dengan berbagai cara, akan tetapi pada setiap jenis maupun bagian tanaman dapat menimbulkan masalah berbeda, antara lain karena adanya senyawa polifenol dan polisakarida dalam konsentrasi tinggi yang dapat menghambat pemurnian DNA dan juga mempengaruhi enzimenzim seperti polimerase, ligase, endonuklease restriksi, atau enzim untuk kegiatan molekuler lain yang dapat menyebabkan DNA tidak dapat digunakan untuk aplikasi penelitian.Selain itu disebabkan adanya faktor internal dan eksternal. BAB V PENUTUP 5.1 Kesimpulan Dari hasil praktikum dapat di simpulkan bahwa pada pengamatan bahwa DNA terlihat pada sampel daun belimbing. Hal ini dikarenakan untuk pengambilan sampel daun belimbing dipetiknya baru mendekati saat pratikum dibandingkan pengambilan sampel lainnya 5.2 Saran Untuk praktikum - Alat yang digunakan perlunya pembaharuan mengenai jenis alat yang digunakan. - Waktu untuk pratikum lebih diperhatikan lagi, agar pratikan bisa mengikuti sampai tahapan terakhir Untuk assiten : - Sudah baik, lebih ditingkatkan lagi penjelasannya mbak , biar kita tidak bingung DAFTAR PUSTAKA Ardiana, Dwi Wahyuni.2009.Teknik Isolasi DNA Genom Tanaman Pepaya dan Jeruk dengan Menggunakan Modifikasi Bufer CTAB. Teknisi Litkayasa Nonkelas pada Balai Penelitian Tanaman Buah Tropika, Sumatera Barat.B uletin Teknik Pertanian Vol. 14 No. 1, 2009: 1216.5hal Arumingtyas, EL. 2011. Isolasi DNA dan RAPD. Disampaikan pada Pelatihan Giri, Rahman EA . 2004. Regulasi Ekspresi Gen Pada Organisme Bakteri. Bandung : KPP Bioteknologi Bandung. Istanti, Annie. 1999. Biologi Sel. Malang: jurusan Biologi FMIPA UM Jamilah. 2005. Pengaruh Berbagai Macam Detergen, Penambahan Enzim, dan Ekstrak Nanas (Ananas comusus (L) Merr) Terhadap Hasil Isolasi DNA Berbagai Macam Buah Sebagai Topik Praktikum Matakuliah Genetika. Skripsi tidak diterbitkan. Malang: Universitas Negeri Malang Listanto, E; pardal,s.j; Wang, k. 1996. Jurnal Bioteknologi Pertanian, Indonesian Journal of Agricultural Biotechnologi. Metode sederhana isolasi DNA dari tanaman jagung transgenic untuk polymerase chain reaction. Balai penelitian Bioteknologi Tanaman Pangan. Bogor Mader,S.S.1993.Biology.Wm.C Brown Publishers: Lowa Prasetyo, A. 2008. Karakterisasi virus pada tanaman jarak pagar (Jatropha curcas L.). Fakultas Pertanian Universitas Gadjah Mada. Skripsi.(Tidak Dipublikasikan) Barnum, 05 Barnum, Susan R. 2005. Biotechnology an Introduction, 2nd edition. USA : Thomson Brooks/Cole. Utami, Annisa.dkk .2012. Variasi metode isolasi DNA daun temulawak (cucurma xanthorrhiza). Prosiding seminar nasional kimia Unesa. Surabaya Yuwono, Triwibowo.2006. Bioteknolgi Pertanian. Gadjag Mada University Press. Yogyakarta Zubaidah, 2004.Isolasi dan karakterisasi Gen Perbaikan DNA Baru pada Bakteri Radioresisten Deinococcus radiodurans.Prosiding Seminar Nasional Sains dan Teknik Nuklir, Bandung, Juni 2004.
