Ekstraksi Senyawaan Bioaktif Daging Buah Dillenia indica Dalam

Ekstraksi Senyawaan Bioaktif Daging Buah Dillenia indica Dalam Pelarut
Polar Sebagai Antibakteri Escherichia coli
Ir. Rita Arbianti, MSi, Ir. Tania Surya Utami, MT, dan Meiliza Sumestry
Jurusan Teknik Gas dan Petrokimia Universitas Indonesia, Depok 16424, Indonesia
E-mail: [email protected]
Kata Kunci – aktivitas antibakteri, Dillenia indica, ekstraksi, isolasi, triterpenoid
Abstrak
Dillenia indica merupakan tumbuhan tingkat tinggi yang berbuah lebat sepanjang tahun. Alangkah baiknya
jika manfaat buah tersebut dapat diketahui secara spesifik. Penelitian yang telah ada pada genus Dillenia yang
lain, yaitu Dillenia papuana, menunjukkan bahwa spesies tersebut memiliki aktivitas antibakteri Escherichia coli
yang disebabkan oleh senyawa triterpen jenis oleanen. Bau khas yang ditimbulkan oleh senyawa terpena tersebut
juga didapatkan pada buah Dillenia indica. Selain itu, buah ini telah dimanfaatkan secara tradisional sebagai obat
sakit perut. Untuk mengetahui aktivitas antibakteri senyawaan biaktif polar dalam daging buah Dillenia indica,
dilakukan ekstraksi dengan pelarut etanol-air. Selanjutnya dilakukan isolasi fraksi-fraksi yang terdapat di dalam
ekstrak kasar tersebut. Fraksi-fraksi beserta ekstrak kasar yang diperoleh akan diuji aktivitas antibakterinya
dengan metode difusi paper disc. Hasil isolasi berupa 7 fraksi (fraksi A-G) sementara hasil uji difusi paper disc
memperlihatkan bahwa hanya fraksi B dan E yang memiliki aktivitas antibakteri.
Abstract
Dillenia indica is a higher plant which produces abundant amount of fruits all year. It will be best if the usage
of that fruit be known specifically. The existing research on another species of Dillenia, that is Dillenia papuana,
informed that that species has antibacterial activity for Escherichia coli from the oleanene-type triterpenoids. The
characteristic smell of terpene is found in the Dillenia indica’s fruit. Moreover, the traditional usage of the fruit is
as a medicine for stomachache. To observe the antibacterial activity of the polar bioactive compounds in Dillenia
indica’s fruit, extraction with ethanol-water is conducted. From that crude extract, isolation of the fractions it has
is being done. To analyze the antibacterial activity of the crude extract as well as the fractions, paper disc
diffusion method is used. The result of the isolation is 7 fractions (fraction A-G). Meanwhile, the result of paper
disc diffusion method shows that only fraction B and E have the antibacterial activity.
Pendahuluan
Dillenia indica merupakan salah satu spesies
tumbuhan tingkat tinggi dari genus Dillenia.
Spesies genus ini yang lain, yaitu Dillenia papuana,
telah diteliti aktivitas antibakterinya terhadap
bakteri Bacillus subtilis, Escherichia coli, dan
Microccocus luteus. Hasil penelitian tersebut
menunjukkan bahwa ekstrak daun dan batang
Dillenia papuana dalam petroleum eter memiliki
aktivitas antibakteri untuk ketiga bakteri tersebut.
Aktivitas tersebut dikarenakan adanya ikatan
ganda, gugus karboksilat, dan gugus keton pada
rangka oleanen senyawa triterpenoid [1].
Senyawa terpena ini memiliki bau khas yang
juga dimiliki oleh buah Dillenia indica. Adanya
bau khas tersebut serta kesamaan genus,
memberikan kemungkinan bahwa buah Dillenia
indica mengandung senyawa terpena. Daging buah
Dillenia indica telah dimanfaatkan secara
tradisional sebagai obat sakit perut [2]. Bakteri
penyebab sakit perut yang paling dikenal adalah
Escherichia coli. Berdasarkan uraian tersebut,
diperkirakan daging buah Dillenia indica memiliki
aktivitas antibakteri Escherichia coli.
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui
aktivitas antibakteri senyawaan bioaktif polar
daging buah Dillenia indica. Hal ini dilakukan
dengan mengekstraksi daging buah Dillenia indica
dalam etanol-air. Kemudian dilakukan isolasi
fraksi-fraksi dati ekstrak kasar tersbut, yang pada
akhirnya akan diuji aktivitas antibakterinya dengan
metode difusi paper disc.
1
Latar Belakang Teori
Pada metode ini, agar yang telah diinokulasi
dengan bakteri diberi lubang dan diisi dengan
senyawa uji. Alternatif lainnya adalah dengan
meletakkan cangkir porselen kecil, kadang
disebut fish spines, di atas medium agar dan
cangkir ini diisi dengan senyawa uji.
Kelemahannya yang lain adalah tidak dapat
mengindikasikan apakah senyawa uji bersifat
bakteriostatik atau bakterisida serta tidak
mengindikasikan konsentrasi inhibisi minimum
(konsentrasi minimum yang dibutuhkan untuk
menghambat pertumbuhan bakteri) dari senyawa
uji tersebut. Keuntungan metode ini adalah
penggunaan sampel yang sedikit dalam skrining
dan kemungkinan pengujian lima atau enam
komponen tiap piringan untuk satu jenis bakteri
uji [5].
2. Metoda Dilusi
Metode ini termasuk metode kuantitatif yang
memberikan informasi lebih spesifik, terutama
mengenai potensi aktivitas antibakteri dalam
senyawa sampel. Pada metoda ini, senyawa uji
dilarutkan dalam media cair dan dibuat dengan
gradasi konsentrasi dari yang besar sampai kecil
kemudian ditambahkan dengan inokulum [4].
Metoda ini didasarkan pada hambatan larutan
senyawa uji (larutan sampel) terhadap
pertumbuhan biakan bakteri dalam media cair
dengan membandingkannya dengan larutan
tanpa senyawa uji (larutan kontrol). Dasar
pengamatannya adalah dengan membandingkan
kekeruhan media pertumbuhan larutan sampel
terhadap kekeruhan media pertumbuhan larutan
kontrol. Metode ini dapat dilakukan dengan dua
cara, yaitu [14]:
a. Teknik Pengenceran Tabung
Teknik ini menggunakan beberapa tabung
kultur, masing-masing tabung mengandung
medium dengan konsentrasi senyawa uji
berbeda. Tabung-tabung tersebut diinokulasi
dengan bakteri uji dan diinkubasi.
Pengamatan dilakukan secara visual yaitu
dengan membandingkan kekeruhan larutan
sampel dengan kekeruhan larutan kontrol.
b. Teknik Penipisan Lempeng
Pada metode ini, senyawa uji diencerkan
secara serial dalam media agar cair kemudian
dituang ke dalam cawan petri dan dibiarkan
membeku. Seteleh itu, medium diinokulasi
dengan cara menggores dengan bakteri uji
dan diinkubasi pada suhu dan waktu tertentu.
Keuntungan metode ini adalah Konsentrasi
Hambatan Minimum (KHM) dapat diketahui
dan merupakan satu-satunya metode yang dapat
menentukan apakah agen antibakteri yang diuji
berjenis bakteriostatik atau bekterisida pada
bakteri yang diuji. Kelemahan metode ini adalah
Antibakteri
Antibakteri adalah obat pembasmi bakteri,
khususnya bakteri yang merugikan manusia atau
yang bersifat patogen yang bisa berasal dari
senyawa alami, sintetik, maupun semisintetik [3].
Antibakteri dapat dibagi menjadi dua kelompok
berdasarkan sifat toksisitas selektifnya, yaitu [4]:
• Bakteriostatik, yaitu antibakteri yang akan
menghambat
pertumbuhan
bakteri
yang
menginfeksi tubuh sehingga jumlah sel bakteri
yang hidup tidak bertambah. Tetapi pertumbuhan
bakteri akan berlangsung kembali bila kontak
dengan obat dihentikan.
• Bakterisida, yaitu antibakteri yang akan
membunuh bakteri yang menginfeksi tubuh
dengan cara lisis. Dengan demikian bakteri tidak
dapat bereproduksi kembali meskipun kontak
dengan obat dihentikan.
Pengujian aktivitas antibakteri yang ada dapat
diklasifikasikan menjadi [5]:
1. Metoda Difusi
Metode ini termasuk pengujian secara kualitatif
dan digunakan pada skrining awal ekstrak atau
senyawa untuk mengidentifikasikan keberadaan
zat yang menghambat bakteri tetapi metode ini
tidak memberikan banyak informasi lain
mengenai senyawa tersebut. Pada metode ini,
senyawa uji akan ditentukan aktivitas
antimikrobanya dengan berdifusi pada lempeng
agar yang telah diinokulasi dengan mikroba uji.
Dasar pengamatannya adalah dengan melihat
ada atau tidaknya zona hambatan pertumbuhan
mikroba uji. Daerah hambatan tersebut berupa
daerah bening yang terbentuk di sekeliling
senyawa uji. Metode ini dapat dilakukan dengan
tiga cara [4]:
a. Teknik Disc (Cakram)
Metode ini melibatkan cakram kertas yang
telah diberikan senyawa uji dengan
konsentrasi tertentu dan dikeringkan. Disc
tersebut diletakkan pada permukaan medium
agar yang telah diinokulasi dengan mikroba
uji lalu diinkubasi pada suhu tertentu selama
selang waktu tertentu. Dengan metode ini,
dapat diketahui senyawa mana yang efektif
untuk mikroba tertentu sekaligus senyawa
mana yang tidak efektif.
b. Teknik Parit (ditch)
Metode ini dilakukan dengan memindahkan
satu strip agar dari sisi cawan petri dan
diganti dengan agar yang mengandung
senyawa uji. Bisa juga dilakukan dengan
meletakkan satu strip kertas saring yang telah
dibasahi oleh senyawa uji ke atas medium
agar yang telah diinokulasi dengan bakteri.
c. Teknik Lubang atau Sumur (hole atau well)
2
hasil yang diperoleh hanya valid untuk kondisi
eksperimen tertentu saja.
rupa sehingga komponen-komponennya harus
menunjukkan dua dari ketiga sifat tersebut.
Penelitian ini menggunakan dua macam
kromatografi, yaitu kromatografi lapisan tipis
(KLT) dan kromatografi kolom. Dalam KLT, data
yang diperoleh berupa waktu retensi (Rf) yaitu
perbandingan jarak yang ditempuh senyawa dengan
jarak yang ditempuh pelarut. Penjelasan mengenai
Rf dapat dilihat pada Gambar 1.
Ekstraksi
Prinsip dasar ekstraksi padat-cair adalah
distribusi suatu zat terlarut dalam larutan yang
berbeda fasa yaitu fasa cair dengan fasa padat [6].
Prinsip dasar pada metode ini berdasarkan pada
kelarutan. Untuk memisahkan zat terlarut yang
diinginkan atau menghilangkan komponen zat
terlarut yang tak diinginkan dari fasa padat, maka
fasa padat dikontakkan dengan fasa cair. Pada
kontak dua fasa tersebut, zat terlarut terdifusi dari
fasa padat ke fasa cair sehingga terjadi pemisahan
dari komponen padat.
Kinerja ekstraksi padat-cair dipengaruhi oleh
beberapa faktor yaitu [7]:
• Ukuran partikel
Ukuran partikel padat harus dibuat sekecil
mungkin untuk meningkatkan luas kontak antara
padat dan cair.
• Konsentrasi ekstraktan
Dengan konsentrasi lebih besar, maka partikelpartikel akan lebih banyak untuk dapat menarik
senyawa yang ingin diekstraksi.
• Suhu
Temperatur yang digunakan tidak boleh terlalu
rendah namun juga tidak boleh terlalu tinggi. Bila
temperatur terlalu rendah maka kinerja proses
ekstraksi akan turun. Sebaliknya pada suhu yang
terlalu tinggi, ekstraksi menurun karena air
menguap dan konsentrasi larutan akan naik.
• Waktu
Peningkatan waktu akan meningkatkan persentase
ekstraksi karena meningkatnya kemungkinan
kontak antara partikel cair dengan padat.
• Kecepatan pengadukan
Kecepatan pengadukan akan mempengaruhi
homogenisasi konsentrasi pada ekstraktan tersebut
sehingga persentase ekstraksi akan meningkat.
Gambar 1. Penentuan waktu retensi (Rf)
Metodologi Penelitian
Preparasi Sampel dan Ekstraksi
Sebanyak 2 kg daging buah Dillenia indica
yang telah dikupas dan dibuang bijinya dipotong
kecil-kecil lalu dihaluskan dengan blender beserta
300 ml air. Hasil blender tersebut direndam dalam
satu liter etanol selama satu minggu pada suhu
lingkungan dengan pengocokan rutin harian, lalu
disaring. Residunya berupa ampas daging buah
direndam sekali lagi dengan satu liter etanol selama
seminggu dengan perlakuan yang sama seperti
ekstraksi pertama. Ekstrak yang diperoleh masih
mengandung banyak pelarut sehingga harus
dipekatkan dengan menggunakan rotary vacuum
evaporator pada temperatur 40°C. Hasil pemekatan
ini disebut ekstrak kasar dan disimpan dalam botol
coklat yang ditutup rapat dengan alumunium foil.
Kromatografi
Dalam penelitian ini, dibutuhkan isolasi
senyawa dari daging buah Dillenia indica. Isolasi
tersebut
dilakukan
dengan
kromatografi.
Kromatografi merupakan suatu cara pemisahan
fisik dengan unsur-unsur yang akan dipisahkan
terdistribusikan antara dua fasa, satu dari fasa-fasa
ini membentuk lapisan stasioner dengan luas
permukaan yang besar dan fasa lainnya merembes
melewati atau melalui lapisan stasioner tersebut [8].
Pemisahan secara kromatografi memanfaatkan
sifat fisika umum dari molekul. Sifat utama yang
terlibat adalah kecenderungan molekul untuk larut
dalam cairan (kelarutan), kecenderungan molekul
untuk melekat dalam cairan (adsorbsi), dan
kecenderungan molekul untuk menguap (keatsirian)
[9]. Pada sistem kromatografi, campuran yang akan
dipisahkan ditempatkan dalam keadaan sedemikian
Isolasi
Proses isolasi berlangsung dengan dua macam
kromatografi, yaitu kromatografi lapisan tipis
(KLT) dan kromatografi kolom. KLT digunakan
untuk mengetahui jumlah minimal komponen
dalam ekstrak kasar serta sistem pengelusi yang
paling tepat untuk kromatografi kolom. Selain itu,
KLT juga digunakan untuk mengetahui Rf dari
fraksi-fraksi hasil isolasi ekstrak kasar dengan
menggunakan kromatografi kolom.
Dalam KLT, mula-mula dilakukan penjenuhan
developing chamber (berupa beaker glass) dengan
pelarut dan kertas saring, lalu ditutup rapat. Pelarut
ini merupkan fasa gerak dalam kromatografi dan
3
dicari
dengan
metode
trial-error
untuk
menghasilkan pengembangan terbaik dalam KLT.
Sementara itu, dilakukan persiapan penotolan
sampel ke fasa diam KLt berupa plate KLT. Plate
ini adalah lapisan tipis silika gel di atas lempengan
alumunium. Plate dipotong seukuran 7 cm x 0,8
cm, lalu dibuat garis pada jarak 0,5 cm dari dasar
plate sebagai garis origin, yaitu tempat sampel
ditotolkan. Sampel ditotolkan pada garis orogin
dengan mikrocap sehingga diameter totolan hanya
1,5 mm. Setelah plate dipastikan kering, plate
dimasukkan dalam developing chamber sampai
pelarut berada di garis depan, yaitu sejauh 0,5 cm
dari puncak plate. Plate dikeluarkan dari
developing chamber dan dikeringkan, lalu
divisualisasikan dengan lampu UV.
Kromatografi
kolom
digunakan
untuk
memisahkan senyawa-senyawa dalam ekstrak kasar
menjadi beberapa fraksi. Prosedur kerjanya mulamula adalah membuat kemasan kolom, yaitu
mengisi kolom dengan fasa diam. Fasa diam berupa
silika gel 250 µm sebanyak 80 gr dan dibuat
lumpuran dalam etanol. Lumpuran ini dimasukkan
dalam kolom dan diketuk-ketuk sehingga tidak
terbentuk gelembung udara. Sampel dicampur
dengan sedikit silika gel sehingga berbentuk
butiran, lalu diletakkan di dalam kertas saring dan
ditaruh di bagian atas kolom.
Fasa gerak untuk kromatografi kolom adalah
campuran etanol-kloroform dengan kepolaran
dinaikkan secara gradien, sebagaimana terdapat
pada Tabel 1. Tampungan dilakukan tiap 5 ml, lalu
dilihat Rf-nya dengan KLT. Tampungan dengan Rf
sama disatukan sebagai satu fraksi.
Uji Aktivitas Antibakteri
Uji aktivitas antibakteri dilakukan dengan
metode difusi paper disc. Cara kerjanya mula-mula
adalah memuat media untuk kultur bakteri. Media
dibuat dengan 2,1 gr Mueller Hinton dicampur 100
ml air suling yang diaduk homogen. Lalu 18 ml
media tersebut diambil untuk media cair, sebagai
media inokulum bakteri. Sementara media sisa,
dicampur dengan 1,5 gr agar sebagai media padat
tempat lapisan pembenihan bakteri nantinya.
Pembuatan inokulum bakteri dilakukan dengan
temperatur inkubasi lingkungan dengan waktu
inkubasi 24 jam. Strain bakteri yang digunakan
adalah bakteri Escherichia coli ATCC 25922.
Sampel, ekstrak kasar dan 7 fraksi hasil
kromatografi, diencerkan konsentrasinya dengan
etanol sehingga menjadi 25 mg/ml. Kontrol positif
yang digunakan adalah kloramfenikol, suatu
senyawa antibakteri yang telah teruji secara klinis
dan beredar di pasaran, dengan konsentrasi 25
mg/ml. Sementara kontrol negatifnya adalah etanol.
Sebanyak 10 µl sampel dengan konsentrasi 25
mg/ml tersebut ditetskan ke atas paper disc dengan
diameter 5 mm. Paper disc harus benar-benar
kering sebelum ditanamkan ke lapisan pembenihan
bakteri.
Inokulum bakteri sebanyak 8 ml dimasukkan
ke dalam media padat dan dikocok agar homogen.
Lalu, dituangkan ke dalam cawan petri dan
ditunggu hingga mengeras. Cawan petri ini
merupakan lapisan pembenihan bakteri.
Setelah lapisan pembenihan bakteri mengeras,
paper disc ditanamkan ke dalamnya. Untuk melihat
hasil ujinya, harus diinkubasi terlebih dahulu pada
temperatur lingkungan dengan waktu inkubasi 8-24
jam. Hasil uji berupa daerah bening yang terbentuk
disekeliling paper disc yang mengandung senyawa
antibakteri. Data yang diperoleh berupa diameter
daerah hambat seperti terlihat pada Gambar 2.
Tabel 1. Perbandingan fasa gerak kromatografi
kolom
Tampungan ke1-6
7-12
13-18
19-24
25-30
31-36
37-42
43-48
49-54
55-60
61-66
67-72
73-78
79-84
83-90
91-104
Etanol (ml)
30
28
26
24
22
20
18
16
14
12
10
8
6
4
2
0
Kloroform (ml)
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
26
28
30
Gambar 2. Penentuan diameter daerah hambat
4
Hasil Penelitian dan Pembahasan
laboratorium sederhana serta jumlah sampel yang
diperlukan hanya sedikit.
Sistem pelarut untuk KLT dapat dipilih dari
pustaka jika komponen dalam sampel telah
diketahui. Tetapi karena dalam penelitian ini
komponen penyusun sampel belum diketahui, maka
sistem pelarut dicari dengan cara trial-error. Dalam
beberapa kasus, pelarut tunggal dapat memberikan
hasil yang memuaskan, tetapi lebih sering
dibutuhkan pencampuran dua pelarut atau lebih.
Ketika pelarut melewati totolan sampel,
kesetimbangan akan terjadi pada tiap komponen
dalam campuran, yaitu antara molekul komponen
yang diadsorb oleh penyerap dengan molekul yang
ada pada pelarut. Pada prinsipnya, komponen akan
berbeda dalam hal kelarutan dan kekuatan adsorbsi
pada penyerap sehingga beberapa komponen akan
terbawa lebih ke atas daripada komponen yang lain
[11].
Molekul yang sangat polar akan berinteraksi
dengan kuat pada ikatan polar Si-O dari penyerap
dan akan cenderung berikatan atau teradsorb ke
dalam partikel-partikel penyerap. Sementara
molekul yang kurang polar tidak terikat begitu kuat.
Molekul kurang polar akan cenderung bergerak
menaiki penyerap lebih cepat daripada molekul
polar [11].
Kromatografi
kolom
dilakukan
untuk
mengisolasi komponen-komponen dalam ekstrak
kasar menjadi beberapa fraksi, dan selanjutnya akan
diuji aktivitas antibakterinya. Penelitian ini
menggunakan kromatografi kolom karena metode
ini menggunakan prinsip pemisahan berdasarkan
polaritas senyawa Hasil kromatografi kolom dapat
dilihat pada Tabel 2.
Ektraksi
Hasil ekstraksi berupa 100 ml resin kental
berwarna coklat karamel seberat 128 gr. Hasil
ekstraksi ini disebut ekstrak kasar.
Metode ektraksi padat-cair digunakan karena
bahan baku yang digunakan berupa daging buah
yang berwujud padat. Selain itu, proses ekstraksi
padat-cair ini merupakan proses pemisahan yang
paling mudah, sederhana, dan cepat. Metode ini
juga tidak memiliki resiko membuat senyawa
menjadi rusak, sebagaimana mungkin terjadi bila
menggunakan distilasi, serta dapat mengambil
seluruh senyawa polar, tidak seperti metode aerasi
yang hanya mengambil senyawa yang dapat
diambil oleh udara saja [10].
Proses penghancuran dengan blender bertujuan
untuk memperbesar luas permukaan kontak pada
saat dilakukan ekstraksi nanti. Sementara
penambahan air diperlukan untuk melakukan
penghancuran dengan blender. Ekstraktan yang
digunakan adalah etanol, karena ekstrak yang
diharapkan akan diperoleh berupa fasa aqueous
yaitu senyawa-senyawa polar.
Isolasi
Hasil sistem pengembang yang diperoleh
adalah kloroform:etanol = 2:1. Hasil KLT dapat
dilihat pada Gambar 3.
Tabel 2. Hasil isolasi sampel dengan kromatografi
kolom
A
Tampungan
ke97-104
B
89-96
minyak
Gambar 3. Hasil KLT
C
77-88
minyak
Hasil yang diperoleh melalui KLT dalam
penilitian ini menunjukkan satu spot yang besar.
Hal ini menandakan masih banyak komponen yang
berada dalam fraksi tersebut tetapi dengan Rf yang
sangat berdekatan sehingga sulit melakukan
pemisahan yang sempurna. Fraksi dengan Rf lebih
besar menunjukkan fraksi yang kurang polar karena
berinteraksi kurang kuat dengan penyerap yang
bersifat polar. Dengan demikian fraksi tersebut
terbawa oleh pelarut (fasa gerak) ke atas.
Metode yang digunakan untuk isolasi adalah
KLT karena dengan KLT, pemisahan senyawa yang
amat berbeda seperti senyawa organik alam dapat
dilakukan beberapa menit dengan peralatan
D
57-76
minyak
E
51-56
minyak
F
G
22-50
1-21
minyak
minyak
Fraksi
Ekstrak
Kasar
Wujud
Warna
minyak
kuning
kecoklatan
kuning
oranye
pucat
kuning
oranye
kuning
oranye
kuning
keputihan
kuning
kuning
oranye
Total
Coklat
karamel
minyak
%
Berat
0,11
0,12
0,40
2,11
0,05
3,08
0,53
6,40
128 gr
Yang paling penting dalam kromatografi
kolom adalah pemilihan pelarut pengelusi sebagai
fasa geraknya. Ada tiga pendekatan yang dapat
5
dipakai untuk menentukan pelarut pengelusi,
diantaranya adalah pendekatan sistem KLT dan
pemakaian elusi landaian. Penggabungan kedua
pendekatan ini menghasilkan metode yang
diterapkan dalam penelitian ini.
Jika menggunakan sistem pelarut seperti pada
KLT, akan dijumpai beberapa masalah antara lain,
penyerap untuk kolom harus benar-benar serupa
dengan KLT. Hal ini tidak mungkin dalam
penelitian ini karena produsen plate KLT dan
penyerap kolom berbeda. Masalah kedua adalah
ukuran penyerap KLT dengan kolom harus sama.
Hal ini juga jelas berbeda karena ukuran penyerap
KLT terlalu kecil untuk kromatografi kolom
gravitasi.
Pada pengelusi landaian, pelarut pengelusi
dialirkan mulai dari yang nonpolar, yaitu etanol,
menuju pelarut polar, yaitu kloroform, secara
bertahap. Penelitian menggunakan perbedaan 2 ml
dalam total 30 ml pelarut sebagaimana dapat dilihat
pada Tabel 1. Penggabungan kedua metode ini
diperlukan untuk menghasilkan pemisahan yang
lebih baik. Penggunaan volume eluen sebanyak 30
ml dilakukan untuk memastikan seluruh komponen
pada kepolaran tersebut telah benar-benar keluar
kolom.
Ukuran partikel penyerap untuk kolom
biasanya lebih besar daripada KLT, terutama untuk
kolom gravitasi yaitu 63-250 µm. Penelitian ini
menggunakan fasa diam silika gel dengan ukuran
250 µm. Silika gel merupakan penyerap yang
paling banyak dipakai.
Sifat penyerap bergantung pada pH dan tingkat
keaktifannya. Permukaan polar seperti silika gel
berfungsi
melalui
titik-titik
permukaan
teroksigenasi, terutama gugus hidroksi. Gugus ini
menarik molekul sampel akibat campuran yang
rumit dari interaksi dipol-dipol dan ikatan hidrogen.
Jika semua titik telah diduduki oleh air, maka
permukaan tak dapat berfungsi sebagai penyerap
atau dikatakan terdeaktivasi. Permukaan dapat
diaktivasi dengan pemanasan pada suhu 100°C
selama 1 jam [9] sebagaimana dilakukan dalam
penelitian ini. Karena penyerap yang digunakan
adalah silika gel, maka pH-nya sudah netral.
coli untuk menguji aktivitas senyawaan bioaktif
polar dari daging buah Dillenia indica karena
bakteri ini merupakan bakteri penyebab timbulnya
infeksi pada usus seperti diare. Dalam pengujian
digunakan bakteri ATCC yang berarti bakteri ini
merupakan standar internasional. Hal ini dilakukan
agar mudah melakukan perbandingan dengan hasil
penelitian lain [5].
Tabel 3. Diameter daerah hambat sampel terhadap
E. coli
Zat Uji (Sampel)
Ekstrak kasar
Fraksi A
Fraksi B
Fraksi C
Fraksi D
Fraksi E
Fraksi F
Fraksi G
Kloramfenikol
Etanol
Diameter Daerah
Hambat (mm)
I
II
III
6,5
7
6
6
20
22
23
-
Ket: DDH dihitung dengan mengikutsertakan ukuran paper disc,
sementra tanda – berarti sama sekali tidak terbentuk daerah
bening.
Gambar 4. Hasil uji aktivitas antibakteri
Uji Aktivitas Antibakteri
Hasil yang diperoleh dari uji aktivitas
antibakteri dengan metode difusi paper disc (kertas
cakram) berupa diameter daerah hambat yang
ditandai dengan daerah bening di sekitar paper disc.
Hasil pengukuran diameter daerah hambat dapat
dilihat pada Tabel 3 sementara gambarnya dapat
dilihat pada Gambar 4.
Daging
buah
Dillenia
indica
telah
dimanfaatkan secara tradisional sebagai obat sakit
perut [2] tanpa diketahui secara pasti senyawa apa
yang memiliki aktivitas antibakteri tersebut.
Penelitian ini menggunakan bakteri Escherichia
Ada tidaknya aktivitas antibakteri dari sampel
dapat dilihat dengan mengukur diameter daerah
bening yang terbentuk disekitar paper disc. Ide
dasar dari pengujian dengan difusi adalah senyawa
sampel dalam paper disc akan berdifusi ke agar.
Sebuah zona bening akan terbentuk pada saat
konsentrasi molekul yang berdifusi itu cukup untuk
menghambat pertumbuhan bakteri. Senyawa
antibakteri dari paper disc akan menghasilkan
gradien penurunan konsentrasi ke arah luar zona
hambat. Ketika konsentrasi senyawa telah cukup
untuk dapat menghambat pertumbuhan bakteri,
6
berarti semakin berpotensi sebagai zat antibakteri,
ada beberapa hal yang harus diperhatikan. Pertama,
konsentrasi senyawa di paper disc. Semakin
konsentrat paper disc, berarti semakin konsentrat
pula senyawa pada jarak tertentu dari paper disc.
Kedua, lamanya waktu difusi senyawa ke media
agar. Semakin lama difusi terjadi, semakin tinggi
konsentrasi pada arah gradien daerah yang
terbentuk. Kemampuan berdifusi senyawa sampel
juga sangat mempengaruhi pembentukan daerah
hambat ini. Misalkan suatu senyawa antibakteri
yang
sangat
berpotensi
ternyata
hanya
menghasilkan diameter daerah hambat yang kecil,
semata-mata dikarenakan ketidakmampuannya
berdifusi dalam media agar.
Konsentrasi bakteri di dalam lapisan
pembenihan juga mempengaruhi hasil pengujian.
Semakin konsentrat bakteri di dalam media tersebut
tentunya diperlukan konsentrasi zat antibakteri
yang lebih besar lagi. Sehingga untuk sampel
dengan konsentrasi yang sama, aktivitas antibakteri
yang sama, tetapi diuji pada media dengan
konsentrasi bakteri yang berbeda, diameter daerah
hambat yang dihasilkan juga akan berbeda.
Walaupun hasil penelitian ini hanya
memberikan diameter yang kecil, tetapi sebenarnya
sampel memiliki sedikit aktivitas antibakteri.
Mungkin saja konsentrasi yang membuatnya
memiliki aktivitas yang cukup untuk membunuh
bakteri berada di atas 25 mg/mL.
Selain itu, dari hasil pengujian, ternyata ekstrak
kasar sama sekali tidak memberikan diameter
daerah hambat. Sementara fraksi penyusunnya
yaitu fraksi B dan E, memperlihatkan adanya
sedikit aktivitas antibakteri. Hal ini menunjukkan
bahwa dengan adanya pencampuran berbagai
senyawa, justru akan menghilangkan potensi
aktivitas antibakteri. Oleh karena itu, ada
kemungkinan jika fraksi-fraksi tersebut dimurnikan,
atau diisolasi sehingga benar-benar hanya ada 1
senyawa murni, maka aktivitas antibakterinya akan
lebih besar.
pertumbuhan itu akan dihalangi. Hal tersebut akan
menghasilkan zona teramati yang mengarah keluar
dari paper disc hingga jarak tertentu dimana
tercapai konsentrasi minimum yang dibutuhkan
untuk menghambat bakteri [13].
Metode yang digunakan adalah difusi dengan
paper disc karena penelitian ini hanya
menginginkan data kualitatif, yaitu ada atau tidak
aktivitas antibakteri pada sampel. Selain itu,
metode ini juga hanya memerlukan penggunaan
sampel sedikit saja dan memungkinkan pengujian
lima atau enam sampel dalam satu cawan petri
untuk satu jenis bakteri [5].
Media yang digunakan ada dua, yaitu media
padat dan media cair. Media padat dihasilkan
dengan menambahkan agar, polisakarida kompleks
dari berbagai spesies rumput laut, pada larutan
Mueller Hinton. Media padat membuat bakteri
berada di permukaan medium. Sementara media
cair merupakan bentuk lebih mobile dari kultur, dan
sangat berguna untuk membuat inokula bakteri
yang konsentrat [12]. Media cair ini diinkubasi agar
sel bakteri dapat melakukan replikasi dan
menghasilkan pertumbuhan kultur yang cukup
untuk pengujian antibakteri.
Pertumbuhan
kultur
dipengaruhi
oleh
temperatur inkubasi karena setiap bakteri memiliki
temperatur optimum bagi pertumbuhannya. Selain
itu, waktu inkubasi juga menentukan pertumbuhan
kultur. Pertumbuhan bakteri dalam kultur bukan
merupakan proses linear. Biasanya, pada 1 jam
pertama, pertumbuhan yang terjadi hanya sedikit.
Setelah fasa yang disebut lag phase tersebut,
kerapatan bakteri meningkat secara logaritmik. Fasa
ini disebut log phase dan biasanya berkisar antara 1
jam sampai 1 hari. Setelah beberapa hari, densitas
populasi kultur akan menurun karena tidak ada
sumber makanan bagi mereka [12]. Kultur terbaik
yang digunakan untuk pengujian aktivitas
antibakteri adalah pada waktu awal log phase.
Untuk bakteri E. coli biasanya waktu inkubasi
adalah 24 jam.
Kontrol positif yang digunakan adalah
kloramfenikol dengan konsentrasi yang sama untuk
memastikan bahwa lapisan pembenihan yang dibuat
berhasil. Kloramfenikol dipilih karena antibakteri
ini dapat berdifusi dengan baik dalam media agar.
Sementara kontrol negatifnya adalah etanol agar
dipastikan bahwa pelarut yang digunakan untuk
mengencerkan sampel tidak mempengaruhi
aktivitas antibakteri sampel.
Waktu pembacaan hasil pengujian aktivitas
antibakteri adalah minimal 8 jam. Hal ini dilakukan
agar senyawa antibakteri dalam sampel memiliki
waktu untuk berdifusi ke dalam agar dan
menghambat pertumbuhan bakteri [13].
Hasil yang diperoleh pada penelitian ini,
ternyata menghasilkan diameter daerah hambat
yang kecil. Walaupun biasanya interpretasi dari
diameter daerah hambat ini adalah semakin besar
Kesimpulan
Hasil pengujian aktivitas antibakteri Escherichia
coli dengan metode difusi paper disc
memperlihatkan bahwa hanya fraksi B (%berat =
0,12%) dan E (%berat = 0,05%) yang memilki
aktivitas antibakteri. Aktivitas antibakteri fraksi B
dan E terlihat berupa diameter daerah hambat
sebesar 6,75 mm dan 6 mm.
Daftar Pustaka
[1]
7
Nick,
Andre
et.
al.
“Antibacterial
Triterpenoids from Dillenia papuana and
Their
Structure-Active
Relationships”.
Phytochemistry vol. 40 No. 6. Elsevier
Science Ltd. 1995.
[2]
[3]
[4]
[5]
[6]
[7]
[8]
“Dillenia indica”. http://www.hindunet.org/
saraswari/Indian%20Lexicon/dillenia.htm
Tanu, Dr. Ian. Farmakologi dan Terapi.
Jakarta: Fakultas Kedokteran Universitas
Indonesia. 1995.
Edwards, David I. Antimicrobial Drug
Action. London: The Macmillan Press Ltd.
1980.
Dey, P. M. dan J.P.Harborne. Methods in
Plant Biochemistry vol. 6. San Diego:
Academic Press Limited. 1991.
Treybal, Robert E. Mass-Transfer Operation.
Singapore: McGraw-Hill Book Co. 1981.
“Preparation of Sample”. http://instruct1.cit.
cornell. edu / courses / biochemprosp / text /
section12.html
[9]
[10]
[11]
[12]
[13]
8
Day, R. A. Dan A. L. Underwood. Analisa
Kimia Kuantitatif. Terj. Drs. R. Soendoro.
Jakarta: Erlangga. 1994.
Gritter, R. et. al. Pengantar Kromatografi.
Terj. Kosasih Padmawinata. Bandung:
Penerbit ITB. 1985.
Robinson. Kandungan Organik Tumbuhan
Tinggi. Terj. Kosasih Padwaminata.Bandung:
Penerbit ITB. 1995.
“Thin Layer Chromatography – TLC“.
http://www.orgchem.colorado.edu/hndbksupp
ort/ TLC/TLC.html
“Culturing Microbes for Antimicrobial
Assays“. http: // instruct1 . cit . cornell . edu/
courses/ biochemprosp/text/section24.html
“Qualitative Assays: The Diffusion Method”.
http:// instruct1 . cit . cornell . edu / courses /
biochemprosp/text/section25.html