PROSIDING SEMINAR NASIONAL III TAHUN 2017 “Biologi, Pembelajaran, dan Lingkungan Hidup Perspektif Interdisipliner” Diselenggarakan oleh Prodi Pendidikan Biologi-FKIP bekerjasama dengan Pusat Studi Lingkungan dan Kependudukan (PSLK) Universitas Muhammadiyah Malang, tanggal 29 April 2017 UJI EFEKTIVITAS Bacillus sp. UNTUK MENURUNKAN DAYA TETAS TELUR NEMATODA PURU AKAR (Meloidogyne incognita) PADA AKAR TEMBAKAU (Nicotiana tabacum) An Analysis of the Effectiveness of Bacillus sp. toLower the Hatching Eggs of Nematodes Root Knot (Meloidogyne incognita) on Tobacco Roots (Nicotiana tabacum) Irvani Eka Suciyananda1, Sri Wahyuni2, Wahyu Prihanta3,Kristiana Sri Wijayanti4 1,2,3) Universitas Muhammadiyah Malang 4) Balai Penelitian Tanaman Serat dan Pemanis(BALITTAS) e-mail korespondensi: [email protected] ABSTRAK Meloidogyne incognita merupakan nematoda parasit pada tanaman yang menyebabkan kerugian ekonomi dan gagal panen sekitar 5% dari total keuntungan yang di dapat. Nematoda ini menyebabkan gall atau puru pada sistem perakarannya, selain itu tanaman yang terserang Meloidogyne incognita daunnya mengalami klorosis, layu dan banyak yang gugur, tanaman kerdil, akar lebih sedikit, dan bila tanaman yang terserang hebat atau parah maka tanaman yang terserang akan mati. Beberapa laporan penelitian di luar negeri menunjukkan bahwa nematoda Meloidogyne incognita dapat menyebabkan kerusakan tanaman tembakau sebesar 40%-100% dan menyebabkan kerugian terhadap hasil panen tembakau. Pengendalian Upaya pengendalian nematoda pada umumnya dilakukan secara kimiawi dengan menggunakan nematisida sintetik dan dapat menimbulkan dampak negatif terhadap hasil pertanian dan lingkungan. Untuk mengantisipasi hal tersebut perlu dilakukan penelitian tentang pengendalian nematoda non-kimiawi salah satumya yaitu dengan bakteri antagonis. Penelitian ini dilakukan untuk mengetahui pengaruh pemberian bakteri Bacillus sp. terhadap penetasan telur nematoda puru akar (Meloidogyne incognita). Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Fitopatologi BALITTAS pada tanggal 24 Oktober s/d 08 Desember 2016. Metode yang digunakan adalah metode The Only Posttest Control Group Design. Pengumpulan data melalui observasi eksperimen. Hasil penelitian dari bulan Oktober s/d Desember menunjukkan bahwa bakteri Bacillus sp. memiliki potensi untuk menekan penetasan telur nematoda puru akar (Meloidogyne incognita). Enzim kitinase yang dihasilkan oleh bakteri menyebabkan lisis pada kulit telur M. incognita terutama pada juvenil 1, sehingga menghambat penetasan telur atau membunuh juvenil 1. Kata Kunci: Meloidogyne incogita, pengendali hayati, Bacillus sp. ABSTRACT Meloidogyne incognita is a kind of endoparasite living which cause economic loss and crop failure around 5% of the total profit. This nematoda leads to the gall on the Plant Root system. Besides, the leaves of plants which affected by Meloidogyne incognita will undergo chlorosis, wilting and deciduous, cannot grow up effectively (stunted), less roots, and when the effects of Meloidogyne incognita are intense, then the affected plants will die. Some overseas research reports indicate that the nematode Meloidogyne incognita can cause damage to tobacco crops by 40% 100% and caused losses to the harvest of tobacco. The controlling measures of nematode are generally carried out chemically by using synthetic nematicide, may cause negative impacts on agriculture and the environment. In order to anticipate the need, it is necessary to do research on non-chemical nematode control such as by using the antagonistic bacteria. The aimed of this research is to find out the effect of bacteria Bacillus sp on hatching eggs of nematode root knot (Meloidogyne incognita). This research was conducted at the Laboratory of Phytopathology BALITTAS on October 24th to December 8th, 2016. The method used is The Only Posttest Control Group Design. The data was collected through observation experiment. The results of the October to December showed that the bacteria Bacillus sp. is potential in suppressing the nematoda root knot (Meloidogyne incognita) hatching eggs. Chitinase enzyme which produced by the bacterium causes lysis on the eggshell of M. incognita mainly on juvenile 1, thus inhibiting hatching eggs or kill juvenile 1. Keywords: Meloido gyneincogita, biological control, Bacillus sp. Nematoda parasit tanaman dapat menyebabkan kerusakan hampir mencapai 100%. Hal ini akan menyebabkan tanaman puso dan petani gagal panen.Meloidogyne incognita merupakan salah satu nematoda parasit pada tanaman. Meloidogyne incognita merupakan nematoda patogen yang menyebabkan kerugian ekonomi dan gagal panen sekitar 5% dari total keuntungan yang di dapat. Nematoda ini merupakan nematoda yang berkembang sangat cepat dan mempunyai daya tekan tinggi terhadap pertumbuhan tanaman dengan gejala khas terlihat pada akar, yaitu berupa bintil-bintil yang disebut dengan puru akar (Whitehead, 1998 dalam Prasasti, 2012). Selain terbentuknya gall atau puru pada sistem perakarannya, tanaman yang terserang Meloidogyne incognita daunnya mengalami klorosis, tanaman kerdil, daunnya mengalami klorosis, layu dan banyak yang gugur, tanaman kerdil, akar lebih sedikit, Suciyananda et al,Uji Efektivitas Bacillus sp available at http://research-report.umm.ac.id/index.php/ 106 PROSIDING SEMINAR NASIONAL III TAHUN 2017 “Biologi, Pembelajaran, dan Lingkungan Hidup Perspektif Interdisipliner” Diselenggarakan oleh Prodi Pendidikan Biologi-FKIP bekerjasama dengan Pusat Studi Lingkungan dan Kependudukan (PSLK) Universitas Muhammadiyah Malang, tanggal 29 April 2017 dan bila tanaman yang terserang hebat atau parah maka tanaman yang terserang akan mati (Prasasti, 2012). Nematoda ini parasita di berbagai tanaman, khususnya pada tanaman yang dapat hidup di tanah berpasir yang memiliki temperature hangat (Munshid, et al., 2013). Beberapa tanaman perkebunan, seperti jahe, kenaf, kopi, lada, nilam, cengkeh, tebu, teh, tembakau, lengkuas, temulawak, dan kapulaga tidak luput dari serangan nematoda Meloidogyne incognita (Mustika, 2005). Salah satu tanaman perkebunan yang bernilai ekonomis tinggi adalah tembakau. Tembakau cerutu merupakan komoditas ekspor nonmigas yang memberikan kontribusi tunggi terhadap devisa negara Indonesia. Kualitas tembakau cerutu sangat menentukan harga legalnya. Nematoda Meloidogyne incognita merupakan salah satu dari sekian banyak jasad pengganggu tanaman tembakau. Beberapa laporan penelitian di luar negeri menunjukkan bahwa nematoda Meloidogyne incognita dapat menyebabkan kerusakan tanaman tembakau sebesar 40%-100% (Natawegina, 1983). Upaya pengendalian nematoda pada umumnya dilakukan secara kimiawi dengan menggunakan nematisida sintetik. Nematisida yang sering digunakan untuk mengendalikan NPA biasanya berupa fumigan dan non-fumigan (Luc et al., 1990 dalam Prasasti, 2012). Penggunaan nematisida dapat menimbulkan dampak negatif terhadap hasil pertanian dan lingkungan, terutama apabila penggunaan nematisida terlalu berlebihan. Pengendalian dengan menggunakan bakteri antagonis merupakan alternatif pengendalian yang potensial. Harni dan Munif (2012) menggunakan bakteri endofit Bacillus sp. untuk mengendalikan Meloidogyneincognita pada tanaman lada. Bacillus sp. terbukti mempunyai aktivitas enzim kitinase, serta mampu menekan tingkat kerusakan akar (Manan et al., 2015). Enzim kitin dan antibiotik lainnya diproduksi oleh Bacillus yang dapat digunakan untuk menekan pertumbuhan mikroorganisme antagonis (Dorherty & Preece, 1988 dalam Dawar, et al., 2008). Berdasarkan hal tersebut penelitian ini dilakukan untuk mengetahui pengaruh pemberian bakteri Bacillus sp. terhadap penetasan telur nematoda puru akar (Meloidogyne incognita). METODE PENELITIAN Lokasi dan Waktu Penelitian Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Fitopatologi BALITTAS (Balai Penelitian Tanaman Pemanis dan Seart). Penelitian berlangsung dari 24 Oktober – 8 Desember 2017. Bahan dan Alat Alat dan bahan yang digunakan adalah isolate Bacillus yang diperoleh dari laboratorium Fitopatologi BALITTAS. Telur nematoda Meloidogyne incognita yang didapat dari akar tomat yang telah diinfeksi nematoda Meloidogyne incognita dari akar tembakau. Media biakan mikroba, autoclave, mikroskop binocular, petridish, labu Erlenmeyer, timbangan, botol scott, shaker, dan LAF. Rancangan Percobaan Rancangan yang digunakan adalah Rancangan Acak Lengkap. Adapun perlakuan yang dicoba adalah: O P1 O1 O P2 O2 O P3 O3 O P4 O4 O P5 O5 O P0 OK Keterangan : O : Telur Meloidogyne incognita P1,2,3,4,5 : Jenis perlakuan (Isolat Bacillus sp. BN 1, BN 2, BN 3, BN 4, BN 5) P0 : Tanpa adanya perlakuan O1,2,3,4,5 :Observasi pada kelompok perlakuan OK : Observasi pada kelompok control Pelaksanaan Penelitian a. Infestas Meloidogyne incognita Infestasi Meloidogyne incognita dilakukan dengan mengambil telur nematoda puru akar pada akar tomat yang sebelumnya telah diinfeksi nematoda puru akar dari tanaman tembakau. Infestasi dilakukan menggunakan metode dari Hussey & Barker (1973). b. Kultur Bacillus sp. Bakteri Bacillus sp. dikulturkan pada media TSA selama 48 jam. Kemudian memindahkan koloni tunggal Bacillus sp. ke dalam 100 ml media TSB dan men-shaker selama 48 jam dengan kecepatan 150 rpm dan suhu 300C. Mensentrifugasi kultur bakteri Bacillus sp dengan kecepatan 5400 rpm selama 15 menit. Menyaring hasil sentrifugasi dengan syringe filter 0,22 µm. c. Perlakuan Menyiapkan telur nematoda sejumlah 50-56 telur dalam tiap petridish kecil. Mengambi sebanyak 5 ml kultur bakteri yang sudah disentrifuge ke dalam petridish kecil berisi telur nematoda. Menyimpan petridish di dalam inkubator dengan suhu 250C. d. Uji Kitinase Uji kitinase ini dilakukan untuk membuktikan bahwa Bacillus sp. menghasilkan enzim kitinase yang dapat mendegradasi kulit telur nematoda. Uji ini dilakukan dengan menanam isolate tunggal Bacillus sp. pada media kitin dan mendiamkan semalam 2 minggu pada suhu ruang. e. Pengamatan Pengamatan dilakukan setiap 24 jam selama 7 hari. Indikator yang diamati dalam penelitian ini adalah jumlah telur nematoda puru akar (Meloidogyne incognita) yang tidak menetas dan jumlah juvinel hidup dan mati selama waktu pengamatan tersebut. Pengamatan uji kitinase dengan cara melihat zona bening yang terbentuk disekitar bakteri koloni Bacillus sp. f. Analisis Data Suciyananda et al,Uji Efektivitas Bacillus sp available at http://research-report.umm.ac.id/index.php/ 107 PROSIDING SEMINAR NASIONAL III TAHUN 2017 “Biologi, Pembelajaran, dan Lingkungan Hidup Perspektif Interdisipliner” Diselenggarakan oleh Prodi Pendidikan Biologi-FKIP bekerjasama dengan Pusat Studi Lingkungan dan Kependudukan (PSLK) Universitas Muhammadiyah Malang, tanggal 29 April 2017 Data hasil pengamtan dianalisis dengan analisis ragam satu jalur dengan bantuan analisis komputer SPSS 21. Apabila hasil analisis menunjukkan beda nyata, maka dilanjutkan dengan uji beda nyata Duncan dengan taraf nyata 5%. tersebut sesuai dengan hasil uji kitin yang dilakukan pada ke-5 isolat Bacillus sp. Isolat Bacillus sp. yang dapat mensekresikan enzim-enzim kitinolitik ekstraseluler akan membentuk zona bening pada media padat yang mengandung kitin. HASIL DAN PEMBAHASAN Berdasarkan hasil penenlitian dan analisis data jumlah mortalitas telur nematoda Meloidogyne incognita menunjukkan bahwa pemberian berbagai isolat Bacillus sp. (BN 1, BN 2, BN 3, BN 4, BN 5) dengan lama perlakuan selama 7 hari mempunyai perbedaan pengaruh yang nyata terhadap tingkat mortalitas telur nematoda Meloidogyne incognita. Pengaruh pemberian berbagai isolat Bacillus sp pada setiap perlakuan menunjukkan jumlah penetasan telur yang berbeda-beda. Perbedaan ini disebabkan karena pada tiap-tiap isolat Bacillus sp. menghasilkan enzim kitinase dengan jumlah yang berbeda-beda. Enzim kitinase yang dihasilkan oleh bakteri endofit dan organisme lainnya berperan penting dalam pengendalian patogen karena enzim ini dapat mendegradasi dinding sel patogen yang tersusun dari senyawa kitinase (Tuminem, 2015). Woo-Jin et al., (2002) melaporkan enzim kitinase yang dihasilkan oleh bakteri Paenibacillus illinosensis KJA-424 terbukti secara signifikan menurunkan persentase penetasan telur M. incognita. Kitinase adalah enzim yang mengkatalis pemecahan senyawa polimer kitinase pada ikatan glikosidik β-1,4. Enzim ini dihasilkan oleh bakteri dan organisme lainnya dan telah banyak digunakan sebagai agensia biokontrol karena dapat mendegradasi dinding sel patogen yang tersusun dari kitinase seperti pada cendawan dan nematoda (Pratiwi et al., 2015). Selain itu,Bacillus sp. dan Pseudomonas termasuk dalam bakteri PGPR. PGPR telah diindentifikasi sebagai pengendali biologi yang digunakan untuk pengendalian penyakit tanaman tanpa efek negatif dalam penggunaannya, baik terhadap manusia maupun lingkungan (Jhonsson et al., 1998 dalam Wijayanti, 2015). Bacillus dapat dengan cepat mengoloni akar tanaman sehingga patogen terhalang dalam mencapai permukaan akar. Bakteri antagonis ini juga menggasilkan hormon auksin yang merangsang pertumbuhan akar. Penggunaan PGPR dapat mempertimbangkan keseimbangan mikroorganisme di daerah rhizosfer. Hasil aplikasi isolat Bacillus sp. perlakuan paling baik ditunjukan pada perlakuan BN 5, dimana jumlah rata-rata telur nematoda yang tidak menetas sebanyak 47,82 dan terendah pada perlakuan BN 3 dengan rata-rata telur nematoda yang tidak menetas sebanyak 42,68. Hal ini menunjukkan bahwa perlakuan kultur filtrat bakteri Bacillus sp. memberikan pengaruh sangat nyata terhadap penetasan telur Meloidogyne incognita dibandingkan dengan perlakuan kontrol (aquadest). Hasil pengujian Gambar 1. Grafik pengaruh pemberian berbagai isolat Bacillus sp. selama 7 hari terhadap jumlah penetasan telur Nematoda Meloidogyne incognita. Menurut Faath (1994) dalam Soeka (2011), perbedaan laju degradasi kitin dapat ditunjukkan dengan penampakkan areal bening di sekeliling koloni pada agaragar yang mengandung kitin. Selanjutnya isolat-isolat yang menunjukkan positif aktivitas kitinase secara kualitatif diukur secara semi-kuantitatif dengan cara membandingkan diameter zona bening disekitar koloni dengan diameter zoan bening lainnya. Hasil perhitungan secara semi-kuantitatif menunjukkan bahwa isolat BN 5 memiliki diameter zona bening paling besar jika dibandingkan dengan diameter zona bening isolat lainnya. Hasil pengamatan secara mikroskopik menunjukkan perkembangan telur nematoda terhambat oleh bakteri dan menyebabkan kerusakan pada kulit telur. Enzim kitinase yang dihasilkan oleh bakteri menyebabkan lisis pada kulit telur M. incognita terutama pada juvenil 1, sehingga menghambat penetasan telur atau membunuh juvenil 1. Lisisnya kulit telur nematoda yang disebabkan oleh aktivitas kitinase berperan penting dalam pengendalian nematoda puru akar (Woo-Jin et al., 2002). Efek merugikan kitinase pada telur nematoda meningkatkan pertahanan tanaman terhadap nematoda parasitis dengan cara manipulasi genetik tumbuhan; 1) penyisipan gen kitinase ke dalam tumbuhan; 2) peningkatan ekspresi gen kitinase dari dalam akar tumbuhan dan; 3) transformasi bakteri rhizosfer dengan gen kitinase yang sesuai (Lobna, 2010). Enzim kitinase berperan dalam pemecahan dinding sel telur dengan mengurangi komponen sel telur tersebut, seperti glucan Suciyananda et al,Uji Efektivitas Bacillus sp available at http://research-report.umm.ac.id/index.php/ 108 PROSIDING SEMINAR NASIONAL III TAHUN 2017 “Biologi, Pembelajaran, dan Lingkungan Hidup Perspektif Interdisipliner” Diselenggarakan oleh Prodi Pendidikan Biologi-FKIP bekerjasama dengan Pusat Studi Lingkungan dan Kependudukan (PSLK) Universitas Muhammadiyah Malang, tanggal 29 April 2017 dan kitin (Woo-Jin et al., 2002). Enzim kitinase adalah enzim yang mampu menghidrolisis kitin menjadi monomernya N-asetil-glukosamin. Enzim tersebut menghidrolisis ikatan β-1,4-glikosida, atau polimer mengalamai deasetilisasi pertama yang selanjutnya dihidrolisis oleh kitosanase (Herdyastuti, et al., 2009). a b Isolat Bacillus sp. berpotensi sebagai agensia biokontrol Meloidogyne incognita karena menghasilkan enzim kitinase yang dihasilkan oleh bakteri endofit dan organisme lainnya. Bakteri ini berperan penting dalam pengendalian patogen karena enzim kitinase yang dihasilkan dapat mendegradasi dinding sel patogen yang tersusun dari senyawa kitinase. Selain itu, Bacillus sp. telah diindentifikasi sebagai pengendali biologi yang digunakan untuk pengendalian penyakit tanaman tanpa efek negatif dalam penggunaannya, baik terhadap manusia maupun lingkungan. DAFTAR RUJUKAN c d Dawar, S., Tariq, M., dan Zaki, M., J. 2008. Aplication of Bacillus species in Control of Meloidogyne javanica (Treub) Chitwood on Cowpea and Mash Bean. Pak. J. Bot. No.40 Vol.1 Hal. 439-444. Harni, R., and Munif, A. 2012. Pemanfaatan Agens Hayati Endofit Untuk Mengendalikan Penyakit Kuning Pada Tanaman Lada. Buletin RISTRI. No.3 Vol.3 Hal. 201-206. Herdyastuti, N., Raharjo, T., J., Mudasir, & Matsjeh. 2009. Chitinase and Chitinolytic Microorganism: Isolation, Characterization and Potential. Indo. J. Chem. N0. 9 Vol. 1 Hal: 37-47. e Hussey, R.S & Barker, K.R. 1973. A Comparison of Nematodes of Colleting Inocula for Meloidogyne incognita spp. Including a New Technique. Dis. Report. Gambar 2. Hasil uji kitinase pada isolat Bacillus sp.; a. BN 1, b. BN 2, c. BN 3, d. BN 4, e. BN 5. Waktu maksimum yang diperlukan isolat Bacillus sp untuk menekan jumlah penetasan telur nematoda yaitu pada hari ke-2. Lama waktu perlakuan isolat Bacillus sp. yang digunakan dalam pengujian juga memberikan pengaruh nyata dalam menekan penetasan telur Meloidogyne incognita. Aktivitas enzim kitinase mencapai nilai maksimum pada hari kedua (48 jam) dan mengalami penurunan setelah hari ke-3 (72 jam) dan ke-4 (96 jam). Seperti yang dilaporkan oleh Woo-Jin et al., (2002) aktivitas enzim kitinase sama seperti pertumbuhan bakteri yaitu mengalami pertumbuhan yang baik sampai hari ke-3, kemudian akan mengalami penurunan aktivitas enzim yang tajam hingga mencapai setengah dari angka maksimum sebelumnya. Bakteri menghasilkan enzim kitinase maksimal ketika mencapai pH netral yaitu 7. PENUTUP Lobna, M., & Zawam, H. 2010. Efficacy of Some Biocontrol Agents on Reproduction and Development of Meloidogyne incognita Infecting Tomato. Journal of American Science. N0.4 Vol. 11 Hal: 495-509. Manan, Abdul., dan Mugiastuti, Endang. 2015. Potensi Campuran Mikroba Antagonis untuk Mengendalikan Nematoda Puru Akar (Meloidogyne incoqnita) pada Tanaman Tomat. Agrin. No.19 Vol.1 Hal. 1-7. Munshid, H., Simon, S., dan Lal, A., A. 2013. Antagonistic Potential of Bacillus subtilis and Pseudomonas fluorenscens on Meloidogyne incognita of Green Onion (Allium fistulosum). International Journal of Botany and Research (IJBR). ISSN: 2277-4815. No.3 Vol.1 Hal. 15-22. Mustika, Ika. 2005. Konsepsi dan Strategi Pengendalian Nematoda Parasit Tanaman Perkebunan di Indonesia. Balai Penelitian Tanaman Rempah dan Obat. Perspektif. No.4 Vol.1 Hal. 20-32. Natawigena, H. 1983. Pengendalian Terpadu Nematoda Parasit Tanama, Seminar Fitopatologi Regional I PF1. Komisariat Jawa Timur Surabaya. Suciyananda et al,Uji Efektivitas Bacillus sp available at http://research-report.umm.ac.id/index.php/ 109 PROSIDING SEMINAR NASIONAL III TAHUN 2017 “Biologi, Pembelajaran, dan Lingkungan Hidup Perspektif Interdisipliner” Diselenggarakan oleh Prodi Pendidikan Biologi-FKIP bekerjasama dengan Pusat Studi Lingkungan dan Kependudukan (PSLK) Universitas Muhammadiyah Malang, tanggal 29 April 2017 Prasasti, Wulandari Dwi. 2012. Makalah Seminar Umum Strategi Pengendalian Penyakit Nematoda (Meloidogyne incognita) Pada Tanaman Tomat(Solanum lycopersicum L.). Universitas Gajah Mada. Yogyakarta. Pratiwi, R.S., Susanto, T.E., Wardani, Y.A.K., & Sutrisno, A, 2015. Enzim Kitinase dan Aplikasi di Bidang Industri: Kajian Pustaka. Jurnal Pangan dan Agroindustri. Vol.3 No.3. Hal: 878-887. Soeka, Yati Sudaryati dan Sulistiani, 2011. Seleksi, Karakteristik, dan Identifikasi Bakteri Penghasil Kitinase yang Diisolasi dari Gunung Bromo Jawa Timur. Jurnal Natur Indonesia. No.13 Vol.2 Hal. 155-161. Tuminem, Supramana, Sinaga, M.S., & Giyanto. 2015. Potensi Bakteri Endofit Akar Ubi Jalar (Ipomea batatas) Asal Kabupaten Sorong Papua Barat Sebagai Agensia Biokontrol Meloidogyne spp. J. HPT Tropika. Vol.15 No.2 Hal:122-131. Wijayanti, K.S. 2015. Peran Plant Growth Promoting Rhizobacteria (PGPR) Dalam Menginduksi Ketahanan Tanaman Kenaf (Hibiscus cannabinus L.) Terhadap Nematoda Puru Akar (Meloidogyne incognita). Tesis Megister Pertanian. Program Studi Ilmu Tanaman. Pasca Sarjana Fakultas Pertanian Universitas Brawijaya. Woo-Jin J, Soon-Ju J, Kyu-Nam A, Yu-Lan J, Ro-Dong P, Kil-Yong K, Bo-Kyoon S, & Tae-Hwan K. 2002. Effect of chitinase producing Paenibacillus illinoisensis KJA-424 on egg hatching of root knot nematode (Meloidogyne incognita). J. Microbiol. Biotechnol. No.12 Vol.6 Hal. 865–871. Suciyananda et al,Uji Efektivitas Bacillus sp available at http://research-report.umm.ac.id/index.php/ 110