17 III. METODE 3.1. Waktu dan Tempat Penelitian

17
III. METODE
3.1. Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilaksanakan selama delapan bulan yang dimulai pada bulan
Mei sampai dengan bulan Desember 2010. Penelitian dilakukan di kandang Mitra
Maju yang beralamat di Jalan Manunggal Baru No. 1, Desa Tegalwaru,
Kecamatan Ciampea, Kabupaten Bogor. Analisis sampel darah dilakukan di
Laboratorium Fisiologi, Departemen Anatomi, Fisiologi, dan Farmakologi (AFF),
Fakultas Kedokteran Hewan Institut Pertanian Bogor.
3.2. Alat dan Bahan
Alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain spuid, seperangkat
alat ultrasonography (USG), tabung reaksi, gelas objek, hemositometer, selotip,
marker, kertas label, tabung kapiler, alat penghitung, adam mikrohematokrit
reader, penyumbat tabung kapiler, alat sentrifugasi, tambang, dan mikroskop
cahaya.
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini di antaranya 16 domba betina,
hormon Prostaglandin (PGF2α), hormon Pregnant Mare Serum Gonadotropin
(PMSG) dan human Chorionic Gondadotropin (hCG), pengencer Hayem, alkohol
70%, antikoagulan Ethilen Diamine Tetraasetate (EDTA), kertas saring, sediaan
ekstrak temulawak plus (ekstrak temulawak, vitamin A, vitamin B kompleks, dan
vitamin D), dan selang penanda.
3.3. Tahap Persiapan
3.3.1. Hewan Percobaan
Hewan coba yang digunakan dalam penelitian ini ialah 16 domba betina
lokal yang telah dewasa kelamin. Domba-domba tersebut berasal dari Priangan
Timur dan memiliki kisaran bobot badan antara 20-25 kg.
3.3.2. Aklimatisasi Domba
Sebelum mendapat perlakuan, domba penelitian dipelihara selama dua
minggu untuk diaklimatisasikan. Tujuan aklimatisasi ialah untuk memberikan
kesempatan agar domba-domba tersebut menyesuaikan diri terhadap lingkungan.
18
Selama aklimatisasi, domba diberikan antibiotik, antelmintik, dan vitamin B
kompleks. Pemberian antibiotik, antelmintik, dan vitamin bertujuan untuk
mendapatkan kondisi domba yang sehat dan bebas dari penyakit.
3.3.3. Kandang, Pakan, dan Minum
Kandang yang digunakan dalam penelitian ini ialah kandang kelompok
dengan konstruksi kandang panggung dengan ketinggian 50 cm dari permukaan
tanah. Pakan domba perlakuan yang diberikan terdiri atas hijauan dan singkong.
Hijauan diberikan pada pagi dan sore hari, sedangkan pada siang hari diberikan
singkong. Pemberian air minum dilakukan secara tidak terbatas atau ad libitum.
3.4. Tahap Pelaksanaan
3.4.1. Rancangan Percobaan
Rancangan percobaan yang digunakan dalam penelitian ini ialah
rancangan acak lengkap (RAL) pola faktorial 2 x 2. Faktor pertama ialah
superovulasi sedangkan faktor kedua ialah pemberian ekstrak temulawak plus.
Selanjutnya, domba penelitian dibagi ke dalam empat kelompok perlakuan yang
masing-masing kelompok terdiri atas empat ekor domba. Rancangan percobaan
dalam penelitian ini disajikan pada Tabel 1.
Tabel 1 Pembagian kelompok domba perlakuan
Perlakuan
Tidak disuperovulasi
Disuperovulasi
Tidak diberi ekstrak
Kontrol (4 ulangan)
SO (4 ulangan)
Diberi ekstrak
TM (4 ulangan)
SO dan TM (4 ulangan)
3.4.2. Superovulasi
Perlakuan superovulasi diawali dengan sinkronisasi estrus terlebih dahulu
terhadap semua domba pada setiap kelompok perlakuan. Sinkronisasi estrus
dilakukan
dengan
menyuntikkan
hormon
PGF2α
(LutalyseTM)
secara
intramuskular sebanyak dua kali. Dosis PGF2α yang diberikan berkisar 5-15
19
mg/kg bobot . Penyuntikan PGF2α kedua dilakukan dengan selang waktu 11 hari
dari penyuntikan pertama. Kelompok domba superovulasi (SO) dan kelompok
domba yang dicekok ekstrak temulawak plus sekaligus disuperovulasi (TM SO)
mendapat perlakuan superovulasi dengan penyuntikan secara intramuskular
menggunakan hormon PMSG dan hCG yang disuntikkan sesaat setelah
penyuntikan PGF2α yang kedua.
Dua hari setelah penyuntikan PGF2α yang kedua, domba berada dalam
kondisi estrus, semua kelompok perlakuan domba dicampur dengan domba
pejantan yang telah dipilih. Pencampuran domba jantan dengan domba betina
dilakukan selama dua hari. Pencampuran dengan pejantan dilakukan dengan
membagi 16 domba menjadi dua kelompok dengan masing-masing kelompok
terdiri atas 8 betina dan 1 jantan. Tiga puluh hari setelah pencampuran dengan
pejantan, dilakukan pemeriksaan kebuntingan menggunakan USG.
3.4.3. Pemberian Ekstrak Temulawak Plus
Kelompok yang mendapat perlakuan pencekokan ekstrak temulawak plus
ialah kelompok domba yang hanya diberi ekstrak temulawak plus (TM) dan
domba yang dicekok ekstrak temulawak plus dan disuperovulasi (TM SO).
Kelompok
tersebut
mulai
mendapatkan
perlakuan
pencekokan
setelah
kebuntingan berumur satu bulan. Pencekokan dilakukan sekali seminggu dengan
dosis 1 mg per kg bobot badan.
3.4.4. Pengambilan Sampel
Pengambilan sampel darah pertama dilakukan sebelum domba diberikan
perlakuan. Setelah itu, sampel darah diambil kembali setiap bulan selama lima
bulan. Pengambilan darah dilakukan melalui vena jugularis menggunakan spuid
sebanyak kurang lebih 5 ml kemudian langsung dimasukkan ke dalam tabung
reaksi yang telah dilapis antikoagulan EDTA. Tabung tersebut kemudian langsung
ditutup menggunakan sumbat dan diberi label sesuai kode perlakuan. Sampel
darah tersebut kemudian dimasukkan ke dalam kotak pendingin dan dibawa ke
laboratorium fisiologi untuk dilakukan pemeriksaan darah.
20
3.4.5. Penghitungan Eritrosit, Hematokrit, dan Hemoglobin
Penghitungan
eritrosit
dilakukan
secara
manual
dengan
metode
hemositometer. Metode ini diawali dengan menghisap darah menggunakan pipet
eritrosit sampai skala 0,5. Kemudian, pipet dibersihkan dari noda darah yang
menempel menggunakan tisu. Setelah itu, ujung pipet dimasukkan ke dalam
cairan pengencer hayem dan menghisap larutan tersebut sampai batas tera 101.
Aspirator dilepas, pipet diangkat, ujungnya ditutup dengan jempol, dan
pangkalnya ditutup dengan jari tengah. Pipet diposisikan mendatar dan
dihomogenkan dengan membuat gerakan memutar angka 8. Setelah homogen,
cairan tetesan pertama dan kedua dibuang. Selanjutnya, hasil pengenceran
dituangkan ke dalam kamar hitung dengan menyentuhkan ujung pipet eritrosit
pada tepi kaca penutup. Kemudian, kamar hitung didiamkan beberapa menit agar
sel-sel darah merah mengendap pada dasar kamar hitung. Langkah berikutnya,
melihat kamar hitung di bawah mikroskop dengan pembesaran objektif 40 kali.
Jumlah sel yang dihitung adalah di lima kotak, yaitu pada pojok kanan atas dan
bawah, pokok kiri atas dan bawah, serta satu kotak yang tepat berada di tengah.
Jumlah sel darah merah ialah jumlah dari penghitungan lima kotak tadi dikalikan
dengan 10.000 per mm3.
Penghitungan nilai hematokrit atau Pack Cell Volume (PCV) dilakukan
menggunakan Adam Mikrohematocrit Reader. Tabung mikro yang digunakan
adalah tabung mikro dengan panjang 7 cm dan diameter 0,1 mm. Sampel darah
diambil dengan menempelkan bagian ujung dari tabung mikro tersebut ke dalam
darah. Posisi ujung tabung mikro hampir mendatar dan bagian ujung tabung yang
lain dikosongkan kira-kira 1 cm. Bagian ujung tabung disumbat. Setelah itu,
tabung mikro yang berisi sampel darah tersebut disentrifuse selama 4-5 menit
dengan kecepatan 10.000 rpm. Hasil sentrifugasi dibaca menggunakan Adam
Mikrohematocrit Reader.
Pengukuran nilai hemoglobin dilakukan dengan menggunakan metode
Sahli. Metode ini dilakukan dengan menambahkan HCl ke dalam tabung
kemudian ditambahkan dengan sampel darah dan ditambahkan secara perlahan
sejumlah aquades hingga warna yang terbentuk sama dengan kontrol. Kadar
hemoglobin diperoleh dengan membaca skala yang tertera pada tabung Sahli.
21
3.5. Variabel yang Diamati
Variabel yang diamati dalam penelitian ini terdiri atas jumlah sel darah
merah, nilai hematokrit (PCV), dan kadar hemoglobin.
3.6. Analisis Data
Data yang diperoleh dianalisis menggunakan metode analisis General
Linear Model (GLM) multivariate untuk melihat interaksi dari masing-masing
faktor perlakuan yang diberikan.