III. METODOLOGI PENELITIAN A. WAKTU DAN

III. METODOLOGI PENELITIAN
A. WAKTU DAN TEMPAT PENELITIAN
Penelitian ini dilaksanakan mulai bulan April sampai bulan November 2009
bertempat di Laboratorium Bioindustri Teknologi Industri Pertanian, FATETA IPB.
Beberapa laboratorium penunjang antara lain Laboratorium Instrumentasi Teknologi
Industri Pertanian IPB dan Laboratorium Dasar dan Ilmu Terapan Teknologi Industri
Pertanian IPB.
B. BAHAN DAN ALAT
Bahan baku yang digunakan dalam penelitian ini adalah pod kakao yang
diperoleh dari Kabupaten Rangkas Provinsi Banten dan enzim selulase komersial
untuk proses hidrolisis. Mikroorganisme yang digunakan untuk fermentasi adalah S.
cerevisiae, nutrien untuk pertumbuhan meliputi PDA, NPK, ZA dan bahan kimia
untuk keperluan analisa meliputi H2SO4 pekat, fenol 5%, dan larutan DNS. Alat-alat
yang digunakan dalam penelitian ini adalah oven, timbangan analitik, inkubator,
outoclave, labu erlenmeyer, pH meter, shaker, mikropipet, spektrofotometer dan
refraktometer.
C. METODE PENELITIAN
Penelitian ini dilakukan dalam empat tahap, yaitu tahap pertama karakterisasi
bahan baku. Tahap kedua degumming dan delignifikasi. Tahap ketiga hidrolisis dan
tahap keempat fermentasi. Diagram alir penelitian proses produksi bioetanol dari
hidrolisat fraksi selulosa pod kakao melalui hidrolisis enzimatis dapat dilihat pada
Lampiran 1.
1. Karakteristik Pod kakao
Karakteristik pod kakao meliputi analisis kadar air, lemak, protein, abu,
karbohidrat, serat kasar serta analisis komponen serat kasar yang meliputi selulosa,
hemiselulosa dan lignin dengan menggunakan metode van soest. Prosedur analisis
dapat dilihat pada Lampiran 2.
2. Degumming dan Delignifikasi
Tepung pod kakao setelah ditambah dengan air akan terlihat adanya lendir
atau gum, lendir yang ada pod kakao ini akan berpengaruh pada kerja enzim saat
hidrolisis, untuk menghilangkan lendir dilakukan proses degumming, yakni
pencucian tepung pod kakao dengan Ca(OH)2. Hilangnya lendir pada tepung pod
kakao akan memudahkan enzim atau air berpenetrasi sehingga kerja enzim lebih
efektif. Konsentrasi substrat terbaik untuk hidrolisis enzimatis adalah 5%. Hal ini
berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh Ashadi (1988).
Tahap delignifikasi dilakukan dengan menggunakan senyawa NaOH 0,68%
dan H2O2 30% (Gould, 1974). Pod kakao yang digunakan pada proses degumming
dan delignifikasi ini sebanyak 50 g. Proses delignifikasi dilakukan secara berurutan
dengan cara penambahan NaOH pada awal delignifikasi (24 jam pertama) kemudian
penambahan H2O2 pada reaksi selanjutnya (24 jam kedua). Diagram alir proses
degumming dan delignifikasi disajikan pada Lampiran 3. Pada tahap ini juga
dilakukan analisis hasil delignifikasi yang meliputi kandungan lignin, selulosa dan
hemiselulosa yang dianalisa dengan metode van Soest (Apriyantono et al., 1989).
3. Hidrolisis
Pada tahap ini dilakukan hidrolisis terhadap fraksi selulosa pod kakao secara
enzimatis dengan menggunakan enzim selulase komersial dengan perlakuan
perbedaan konsentrasi enzim selulase komersial yang digunakan dan lama waktu
hidrolisis. Sebelum digunakan untuk hidrolisis, enzim selulase komersial diuji nilai
aktivitas enzimnya dengan menggunakan analisa FP-Ase. Prosedur pengujian
aktivitas enzim disajikan pada Lampiran 4.
Konsentrasi enzim yang digunakan sebesar 10, 20, 30, dan 40 IU/g substrat
(serat kasar) serta waktu hidrolisis selama 4, 8, 12, 24, 36, 48 dan 60 jam. Hasil
hidrolisis yang diperoleh dilakukan pengukuran konsentrasi total gula, gula
pereduksi, nilai derajat ekuivalen dan dianalisis komposisi sakaridanya secara
kualitatif menggunakan kromatografi kertas. Prosedur Analisis dan Kurva standar
dari total gula dan gula pereduksi disajikan pada Lampiran 5. Prosedur analisa jenis
gula dengan menggunakan kromatografi kertas disajikan pada Lampiran 6.
4. Fermentasi
a) Persiapan media
Media fermentasi berasal dari substrat glukosa hasil hidrolisis selulosa
pod kakao menggunakan enzim selulase. Fermentasi dilakukan pada labu
erlenmeyer 300 ml dengan volume media yang digunakan adalah 200 ml v/v.
Pada media ditambahkan nutrien berupa pupuk NPK sebanyak 0,4 g/100 ml
dan urea sebanyak 0,15 g/100 ml. Substrat glukosa akan menjadi sumber
karbon, sedangkan pupuk merupakan sumber nutrien yaitu fosfor, nitrogen
dan kalium bagi pertumbuhan khamir. Setelah itu dilakukan penyesuaian pH
awal yaitu 4,8 – 5,0 kemudian disterilisasi pada suhu 121 °C selama 15 menit
setelah itu didinginkan hingga suhu 30 °C.
b) Persiapan kultur
Khamir S. cerevisiae diremajakan pada media padat PDA (Potatoe
Dextrose Agar) selama 48 jam pada suhu 30 °C. Setelah itu khamir
ditumbuhkan lagi pada 50 ml media YMGP yang terdiri dari ekstrak yeast 5
g/l, malt 5 g/l, glukosa 10 g/l, dan pepton 5 g/l di dalam labu erlenmeyer 250
ml. Inkubasi dilakukan pada shaker berkecepatan 125 rpm pada suhu 30° C
selama 24 jam. Kultur S. cerevisiae sebanyak 10% dari volume substrat siap
diinokulasi dalam media yang telah disiapkan.
c) Fermentasi
Kultur S. cerevisiae yang telah siap diinokulasi diambil sebanyak 10%
dari volume substrat yang digunakan pada fermentasi. Proses fermentasi
dilakukan dengan menggunakan substrat sirup hidrolisis enzim sebanyak 200
ml pada labu erlenmeyer 300 ml selama 48 jam dan pada 12 jam pertama
digoyang dengan menggunakan shaker pada kondisi suhu ruang dengan
kecepatan 100 rpm. Analisa yang dilakukan meliputi pembentukan CO2,
kadar total gula akhir dan kadar etanol disajikan pada Lampiran 7. Diagram
alir proses pembuatan etanol disajikan pada Gambar 8.
1) Pembentukan CO2
Laju
pembentukan
CO2
selama
fermentasi
diukur
dengan
mengeplotkan jumlah CO2 yang terukur terhadap waktu. Laju pembentukan
CO2 diukur dengan menggunakan labu fermentor yang ditutup dengan sumbat
yang terhubung dengan selang. Selang dihubungkan dengan saluran gas ke
dalam gelas ukur berskala yang diletakkan dalam air. Gas CO2 yang terbentuk
akan menekan air sehingga dapat dibaca dengan skala yang terdapat pada
gelas ukur. Skema pengukukuran laju pembentukan CO2 dapat dilihat pada
Gambar 7.
Selang
Gas CO2
sumbat
Gelas ukur
Selang
untuk
sampling
substrat
air
shaker
Gambar 7. Skema pengukuran laju pembentukan CO2
2) Kadar etanol
Pengukuran
kadar
etanol
dilakukan
dengan
menggunakan
refraktometer merk ATACO. Dari data yang diperoleh dihitung efisiensi
fermentasi, rendemen dan efisiensi penggunaan substrat. Efisiensi fermentasi
merupakan persentase perbandingan antara konsentrasi etanol yang diperoleh
secara aktual dengan konsentrasi etanol secara teoritis berdasarkan jumlah
gula yang dikonsumsi. Rendemen merupakan persentase perbandingan
volume etanol yang diperoleh dengan bobot pod kakao yang digunakan.
Substrat 10%
Penambahan nutrient 0,04 g NPK
dan 0,15 g ZA pada 100 ml sirup
Pengaturan pH = 5
Kultur khamir pada PDA,
inkubasi 48jam, suhu kamar
Inokulasi pada YMGP, 24 jam,
suhu kamar
Starter
Saccharomyces cerevisiae
Sterilisasi 121°C, 15 menit
Inokulasi dengan starter
(10% volume substrat)
Fermentasi
(kondisi anaerobik, suhu kamar)
Analisa produk
Gambar 8. Proses pembuatan etanol