PCR DAN RT-PCR GENOM JATI - Institut Teknologi Bandung

PCR DAN RT-PCR GENOM JATI
(Tectona grandis L.f.) MENGGUNAKAN
PRIMER YANG DIRANCANG DARI
GEN FLO Antirrhinum, ALF-Petunia,
NFL 2-Nicotiana DAN GEN HOMOLOG
LEAFYIFLORICA ULA JATI
TESIS MAGISTER
Oleh:
TJEUW JULIANA
20699034
BIDANG KHUSUS GENETIKA DAN BIOLOGI MOLEKULER
PROGRAM STUDI BIOLOGI
PROGRAM PASCA SARJANA
INSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG
2001
ABSTRAK
Gen LEAFY (LFY) Arabidopsis maupun gen homolog LFY pads
tumbuhan lain merupakan salah satu gen yang berperan pada inisiasi
pembungaan. Penelitian sebelumnya telah berhasil mengisolasi dan
mengkarakterisasi bagian hilir cDNA gen homolog LFY/FLO Jati. Hal
ini mendorong dilakukannya penelitian ini yang bertujuan untuk
mengisolasi dan mengkarakterisasi bagian hulu gen homolog LFY/FLO
pada Jati (Tectona grandis L.f.) dengan pendekatan PCR dan RT-PCR.
Metoda yang digunakan adalah isolasi DNA din RNA kuncup bunga
Jati, perancangan primer yang terdiri dari sepasang primer yang tidak
didegenerasi dengan primer (FLY-1)"forward" dari bagian hulu gen
FLO-Antirrhinum dan primer (FLY-1) "reverse" dari bagian hilir gen
homolog LFY/FLO pada Jati serta perancangan sepasang primer FLY-2
"forward" dan FLY-2"reverse" yang didegenerasi dari sikuen asam
amino gen FLO (Antirrhinum), ALF (Petunia), NFL 2 (Nicotiana).
Primer-primer tersebut kemudian digunakan untuk amplifikasi PCRDNA dan cDNA model-I dan II . Rantai pertama cDNA model-I
terdiri dari cDNA-1 yang disintesis dari RNA dengan menggunakan
"reverse trancriptase" dan primer FLY-1R serta cDNA-2 yang disintesis
dari RNA dengan menggunakan "reverse transcriptase" dan FLY-2R,
sedangkan rantai pertama cDNA-II disintesis dari RNA yang
menggunakan "reverse transcriptase" dan adapter primer (oligo T).
Amplifikasi DNA dan cDNA model I berhasil dilakukan dengan
kombinasi primer FLY-1F, FLY-1R dan FLY-2F, dan diperoleh sikuen
dengan panjang sekitar 800 pb dan 1200 pb. Amplifikasi cDNA modelII yang dilakukan dengan UAP (primer amplifikasi universal) dan FLY2F dan berhasil diperoleh sikuen dengan ukuran sekitar 900 pb. Seluruh
amplikon tersebut kemudian dikloning dan disikuensing. Hasil sikuen
tersebut bila dibandingkan dengan "database" pada "GenBank"
menunjukkan kesamaan dengan gen-gen lain pada tumbuhan dan bukan
dengan bagian hulu dari gen LFY - Arabidopsis maupun gen homolog
LFY pada tanaman lainnya. Analisis lebih lanjut "open reading frame"
sikuen DNA dan cDNA model I ukuran 800 pb dan sikuen spesifik pada
perbatasan ekson dan intron menunjukkan adanya satu ekson dengan 2
"open reading frame" yang diapit oleh 2 intron dan pada sikuen cDNA
model II ditemukan potongan sikuen ekson dan segmen 3' mRNA yang
tidak ditranslasi.
vi
DAFTAR ISI
Halaman
PEDOMAN PENGGUNAAN TESIS
iii
UCAPAN TERIMA KASIH
iv
ABSTRAK
vi
ABSTRACT
vii
DAFTAR ISI
viii
DAFTAR TABEL
xi
DAFTAR GAMBAR
xiii
DAFTAR LAMPIRAN
xv
BAB L PENDAHULUAN
Latar Belakang
1.1.
1.2.
1
Tujuan Penelitian
5
BAB IL KAJIAN PUSTAKA
2.1.
Transisi ke Pembungaan
2.2.
Gen-Gen Pembungaan
6
dan Interaksinya
10
2.3.
Gen-Gen homolog LEAFY
17
2.4.
Disain Primer
22
2.4.1.
Disain primer spesifik
23
2.4.2.
Disain primer terdegenerasi
24
BAB IIL BAHAN DAN CARA KERJA
3.1.
Bahan
27
3.2.
Cara Kerja
27
viii
'
3.2.1.
Pengambilan bahan
27
3.2.2.
Penghilangan aktivitas RNAse
27
3.2.3.
Diagram alir cara kerja
28
3.2.4.
Disain primer
29
3.2.5.
Isolasi RNA
31
3.2.6.
Elektroforesis RNA
33
3.2.7.
Sintesis untai cDNA pertama
34
3.2.8.
Isolasi DNA
35
3.2.9.
Arnplif kasi cDNA model I dan DNA
37
3.2.10. Amplifikasi cDNA model II
39
3.2.11. Elektroforesis hasil PCR
41
3.2.12. Kloning produk PCR
42
3.2.12.1. Ligasi produk PCR
3.2.13. Transformasi produk ligasi
42
3.2.13.1. Pembuatan sel kompeten
43
3.2.14. Transformasi inang bakteri
44
3.2.15. Isolasi plasmid
45
3.2.16. Pemotongan plasmid
47
3.2.17. Sikuensing
47
43
BAB IV. HASIL DAN PEM 3AHASAN
4.1.
Hasil Isolasi DNA dan RNA Total
48
4.2.
Amphfikasi DNA dengan Cetakan
50
dari DNA dan cDNA Model I
4.3.
Isolasi Plasmid dan Restriksi DNA Sisipan
Plasmid
ix
52
DAFTAR GAMBAR
Gambar
2.1
Halaman
Kemungkinan-kemungkinan perubahan pada
7
kompetensi dan determinasi yang dibutuhkan
untuk pembungaan serta tahapan dimana
signal dapat bereaksi
2.2
Primordia bunga dan zonasi meristem
8
tunas apikal
2.3
Meristem tunas apikal dari potongan logitudinal
9
2.4
Pembentukan primordium organ-organ
10
bunga pada meristem bunga
2.5
Interaksi antara gen-gen inisiasi proses
14
pembungaan atau identitas meristem bunga
dengan gen-gen waktu pembungaan
2.6
Hubungan fimgsional antara LEAFY (LFY),
16
APETALA 1 (API ), CAULIFLOWER (CAL),
danAGAMOUS (AG)
3.1
Pendekatan untuk karakterisai ujung 5' gen
28
homolog LFYIPW Jati
3.2
Disain primer tanpa degenerasi dan dengan
29
dengan degenerasi
4.1
Elektroferogram hasil isolasi DNA dari
48
kuncup bungs jati
4.2
Elektroferogram hasil isolasi RNA dari
kuncup bungs jati
xiii
49
BAB I
PENDAHULUAN
1.1. Latar Belakang
Selama pertumbuhan vegetatif merstem apikal tumbuh
menstabilkan arsitektumya dengan membentuk serangkaian
pengulangan primordia yang berkembang menjadi daun dan atau
cabang yang mempunyai menstem apikalnya sendin. Bersamaan dengan
adanya transisi ke pertumbuhan reproduktif, kebanyakan atau hampir
seluruh menstem apikal berkembang menjadi bungs (Colasanti &
Sundaresan, 2000).
Pads Angiospermae terdapat 2 pola yang berbeda dari
perkembangan reproduktif . Pertama, seluruh menstem vegetatif
yang tidak terbatas ditransformam langsung menjadi meristem bunga
yang terbatas. Kedua, meristem vegetatif ditransformasi dahulu menjadi
merstem perbungaan yang kemudian menghasilkan merstem bunga.
Menstem perbungaan dapat bersifat tak terbatas misalnya pada bunga
Arabidopsis ataupun dapat bersifat terbatas seperti pads bunga matahari.
Meristem bunga selanjutnya melalui serangkaian perkembangan yang
terdiferensiasi menjadi 4 struktur dasar dari organ bunga yaitu sepals
petals, stamen dan karpela (Fosket, 1994; Colasanti & Sundaresan,
2000).
Sebelum meristem bunga terdiferensiasi menjadi organ - organ
bunga, tumbuhan mengalami transisi dari perkembangan vegetatif ke
reproduktif yang disebut sebagai evokasi pembungaan. EvOkasi
pembungaan merupakan hasil ekspresi dan interaksi serarrgkaian gen
1
2
yang mengkode faktor-faktor transkripsi yang kemudian mengkontrol
gen-gen spesifik lain untuk pembentukan meristem bunga dan organorgan bunga. Evokasi pembungaan dipicu oleh sinyal - sinyal dari
lingkungan seperti panjang han, temperatur, juga dipenganihi oleh
sinyal internal seperti usia tumbuhan (Fosket, 1994; Blazquez et al.,
1997; Liljegren et al., 1999).
Transisi dari pertumbuhan vegetatif ke reproduktif telah banyak
dipelajari sebelumnya antara lain melalui pendekatan fisiologi yang
mendeduksi bahwa ads substansi seperti hormon yang membantu
transisi ini, namun biokimia dari senyawa yang dikenal sebagai florigen
ini masih belum jelas. Pada mass ini studi genetika dan molekuler
menawarkan suatu pendekatan baru mengenai mekanisme yang terjadi
pads transisi pertumbuhan vegetatif ke reproduktif (Wagner, 1996;
Colasanti & Sundaresan, 2000).
Penemuan mutan - mutan yang kehilangan fimgsmya dimana
bungs digantikan oleh struktur intermediet antara bungs dan tunas
vegetatif menunjukkan keberadaan gen-gen regulator pengendali yang
mengontrol keseluruhan proses insiasi pembungaan atau identitas
meristem bunga. Ada 5 gen regulator pada inisiasi proses pembungaan
yang telah diidentifikasi dengan mutasi dan diklon pada Arabidopsis
yaitu LEAFY (LFY), APETALA 1 (API), CAULIFLOWER (CAL),
APETALA 2 (AP2), dan UNUSUAL FLOWER ORGANS (UFO). Dua
dari gen yang menginisiasi proses pembungaan yaitu LFY dan API
merupakan gen-gen kunci yang berperan penting untuk inisiasi program
pembungaan. Ekspresi konstitutif pada LFY atau API menyebabkan
pembungaan lebih awal, tunas lateral diubah menj adi bungs tunggal dan
3
tunas apikal yang bersifat tidak terbatas digantikan oleh bunga (Hempel
et al., 1997; Sunchan et al., 1998; Pidkowich et al., 1999).
LFY dan API menstabilkan identitas meristem bungs. Aktivitas
gen LFY dan API dapat menekan aktivitas gen pads meristem apikal
yaitu TERMINAL FLOWER 1 (TFLI), yang mengakibatkan transformasi
daun dan tunas menjadi bunga. Hal sebaliknya terjadi bila gen TFL 1
menekan aktivitas gen LFY dan API maka terjadi transformasi bunga
menjadi daun dan tunas vegetatif (Alvarez et al., 1992). LFY dan API
pada Arabidopsis diekspresikan pada primordia bunga yang sangat
muda, namun hanya LFY yang diekspresikan selama fase vegetatif di
primordia daun (Nillson et al., 1998), hanya level ekspresi yang terjadi
sangat rendah, namun mengalami peningkatan selama pembungaan
(Blazquez et al., 1997).
Ekspresi langsung gen identitas meristem bunga secara dramatis
dapat mengurangi waktu yang diperlukan untuk berbunga, misalnya
pada kasus yang ekstrim dimana terjadi peningkatan kebutuhan bunga
yang mendesak. Pada kasus tanaman aspen, yang merupakan basil
persilangan Populus tremula dan Populus tremuloides, diperlukan waktu
8 sampai 10 tahun untuk dapat berbunga. Adanya tanaman transgenik
aspen dengan ekspresi konstitutif dari gen LFY menyebabkan bunga
dapat dihasilkan pada usia 6 sampai 7 bulan. Sebaliknya, inaktivasi gen
yang menentukan nasib meristem bunga dapat menghambat atau
mengeliminasi waktu pembungaan. Konsekuensi regulasi aktivitas gen
identitas meristem pembungaan adalah pengaturan produktivitas
tanaman melalui rekayasa genetika (Gocal, 1998; Weidong et al., 2000).
4
Gen LFYmerupakan pengatur utama untuk perkembangan bungs.
Gen LFY dapat mengaktivasi geri-gen ABC yang maupakan gen-gen
penentu diferensiast shuktur bunga yaitu sepala, petals, stamen dan
karpela (Busch, 1999} Gen LFY pada Arabidopsis dan gen yang
homolog dengan LFY pads tanaman Petunia (ALF), Nicotiana (NFL),
Antirrihinum (FZ.O), Pisum (UNI), Brassica (BOFH) mempunyai
daerah tertentu yang dikonservasi. Daerah ini sangat membantu untuk
mengkarakterisasi gen yang homolog dengan LFY pads tanaman lain
(Souer et al., 1998).
Jati (Tectona grandis Lf) jugs memiliki gen yang homolog
dengan LFY seperti padaArabidopsis dan tanaman lainnya. Dugaan ini
diperkuat oleh peneliian sebelumnya (Etikawad, 2001) yang telah
berhasil mengisolasi dan mengkaraktexisasi 577 nukleotida cDNA gen
yang homolog dengan LFY/ FLO pads jati. Gen yang di peroleh masih
merupakan potongan ujung 3' atau berada di daerah hilir. Penjajaran
577 nukleotida cDNA gen homolog LFY/FLO jati dengan gen homolog
LFYpada tanaman lain menunjukkan bahwa kemungkinan gen homolog
LFYIFLO jati mempunyai cDNA yang berkisar antara 1400 - 1500
nukleotida. Hal ini mendorong ddakukan penelitian benkutnya untuk
mengisolasi dan mengkarakterisasi gen homolog LFY/FLO jati yang
berada di daerah hulu atau ujung 5' sehingga dapat diperoleh gen
homolog LFY/FLO jati yang lebih lengkap.
5
1.2. Tujuan Penelitian
Penelitian nu bertujuan untuk mengisolasi dan mengkaraktensasi
bagian hulu (ujung 5') gen homolog LFY/FLO jati (Tectona grandis
L.f.) dengan mengamplifikasi daerah cDNA dan DNA jati yang
MPn_ menggunakan primer yang dirancang dari gen homolog LFY/FLO jati
dan gen-gen homolog LFYpads FLO (Antirrhinum), ALF (Petunia) don
NLF 2 (Nicotiana).