BAB II Tinjauan Pustaka
advertisement
BAB II TINJAUAN PUSTAKA 2.1 Sereal Sereal berasal dari keluarga serealia atau kelompok bahan makanan sumber karbohidrat. Di antaranya, kelompok biji-bijian yang dapat dikonsumsi (beras, gandum, jagung, oat, barley), pisang, dan kentang. Sereal sebagai sumber karbohidrat merupakan salah satu bahan baku yang bermanfaat untuk mengoptimalkan tumbuh kembang bayi dan balita . Pemberian sereal untuk bayi harus sudah dalam olahan bertekstur halus seperti tepung yang dapat diencerkan dengan susu formula atau ASI. (Utami, Yeti P. 14:2012) 2.2 Vitamin Vitamin adalah komponen tambahan makanan yang berperan penting dalam gizi manusia. Vitamin merupakan senyawa-senyawa organik tertentu yang diperlukan dalam jumlah kecil tetapi esensial untuk reaksi metabolisme dalam sel. Kebanyakan vitamin ini tidak dapat disintesis oleh tubuh. Beberapa diantaranya masih dapat dibentuk oleh tubuh, namun kecepatan pembentukannya sangat kecil sehingga jumlah yang terbentuk tidak dapat memenuhi kebutuhan tubuh. Oleh karenanya tubuh harus memperoleh vitamin dari makanan sehari-hari (Poedjiadi, Anna :1994). Dalam bahan pangan hanya terdapat vitamin dalam jumlah yang relatif sangat lambat dan terdapat dalam bentuk yang berbeda-beda, diantaranya ada yang berbentuk provitamin atau calon vitamin (precursor) yang dapat diubah dalam tubuh menjadi vitamin yang aktif (Winarno, F.G., 119:1992) Hampir semua vitamin yang kita kenal sekarang telah berhasil diidentifikasi sejak tahun 1930. Vitamin tersebut pada umumnya dapat dikelompokkan ke dalam dua golongan utama yaitu vitamin yang larut dalam 3 Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com) 4 BAB II Tinjauan Pustaka lemak yang meliputi vitamin A, D, E dan K dan vitamin yang larut dalam air yang terdiri dari vitamin C dan B (Winarno, F.G., 119:1992). Apabila vitamin yang larut dalam lemak terlalu banyak di konsumsi maka akan tersimpan dalam tubuh dan memberikan gejala tertentu (hipervitaminosis) yang membahayakan. Kekurangan vitamin juga dapat menyebabkan defisiensi, tetapi biasanya gejala penyakit akan hilang apabila kecukupan vitamin tersebut terpenuhi (Poedjiadi, Anna :1994). 2.3 Niasin (Vitamin B3) Niasin (bahasa Inggris: niacin, nicotinic acid vitamine) adalah suatu senyawa asam nikotinat dan nikotinamida yang ditemukan pada tahun 1937, yang berfungsi untuk mencegah penyakit pelagra. Sekitar tahun 1956, niasin mulai digunakan pertama kali untuk menurunkan kadar kolesterol dan mencegah serangan jantung. Niasin berfungsi dengan baik untuk meningkatkan HDL (High Density Lipoprotein), menurunkan kadar LDL (Low Density Lipoprotein) dan trigliserida, namun penggunaan yang berlebihan dapat berakibat gagal hati (http://id.wikipedia.org/wiki/Niasin). 2.3.1 Sifat Niasin (Vitamin B3) Sifat Fisikokimia Rumus molekul : C6H5NO2 Berat molekul : 123.11 g/molekul Rumus struktur : Gambar 2.1 Struktur asam nikotinat (A) Sumber : (Purwaningsih, Ika, et al :2009) Kelarutan : larut dalam air dan alkohol, sedikit larut dalam air dingin dan larut pada suhu yang tidak lebih dari 1200C. Laporan Tugas Akhir Verifikasi metode Uji Penetapan kadar Niasin (Vitamin B3) dalam Sereal secara Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry (LC-MS/MS) Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com) 5 BAB II Tinjauan Pustaka Niasin tahan terhadap larutan alkali, larutan asam, panas atau suhu tinggi, cahaya dan oksidasi. Selain itu, Niasin ini dapat stabil dalam keadaan kering. Niasin sangat mudah diserap oleh usus kecil, dan beberapa cadangan dapat disimpan dalam tubuh. Triptofan merupakan prekursor niasin, sehingga ransum yang mengandung jumlah triptofan cukup dapat mencukupi keperluan niasin (Winarno, F.G., 139:1992). Berikut merupakan stabilitas dari berbagai jenis vitamin. Tabel 2.1 Stabilitas berbagai jenis vitamin Stabilitas Vitamin Netral Asam Basa Udara/O2 Cahaya Panas Vitamin A S* TS* S TS TS TS Asam Askorbat TS S TS TS TS Ts Biotin TS S TS TS TS TS Karoten S TS S TS TS TS Kolin S S S TS S S Vitamin B12 S S S TS TS S Vitamin D S S TS TS TS TS TS TS TS TS TS TS Vitamin K S TS TS S TS S Niasin S S S S S S Asam Pentotenat S TS TS S S Ts Vitamin B6 S S S S TS TS Riboflavin S S TS S TS TS TS S TS TS S TS S S S TS TS TS Folat Tiamin Tokoferol Keterangan : * TS = Tidak stabil ; S =Stabil Sumber : (Purwaningsih, Ika, et al :2009) 2.3.2 Sumber Niasin (Vitamin B3) Niasin terkandung dalam sebagian besar makanan hewani dan nabati. Misalnya pada hati, daging (ayam/sapi), telur, kacang‐kacangan, susu, alpukat, gandum dan kentang manis. Laporan Tugas Akhir Verifikasi metode Uji Penetapan kadar Niasin (Vitamin B3) dalam Sereal secara Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry (LC-MS/MS) Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com) ikan, 6 BAB II Tinjauan Pustaka Gambar 2.2 Sumber niasin (vitamin B3) Sumber : (http://id.wikipedia.org/wiki/Niasin) Kandungan niasin dari beberapa jenis sumber makanan dijelaskan dalam tabel berikut: Tabel 2.2 Kandungan niasin dalam beberapa jenis sumber makanan Sumber Makanan Selai Kacang hijau Kacang putih Daging sapi Daging ginjal sapi Daging liver sapi Daging ayam gelap Daging ayam segar Jagung Haddock Susu Jamur Kacang Kacang Kentang Bayam Gandum Ragi Niasin (mg/100 g) 3.1 0.5 2.4 4.4 6.4 13.6 5.2 10.7 2.2 3 0.1 4.2 17.2 2.9 1.5 0.6 4.3 36.7 Sumber : (Purwaningsih, Ika, et al :2009) 2.3.3 Manfaat Niasin (Vitamin B3) Niasin berperan dalam reaksi metabolisme karbohidrat, lemak, dan protein. Dengan enzim yang berbeda, niasin terlibat dalam 50 reaksi kimia yang berbeda untuk menghasilkan energi, metabolisme lemak, kolesterol, dan karbohidrat, serta pembuatan beberapa senyawa penting lainnya, seperti hormon seks dan adrenalin. Niasin merupakan vitamin yang dapat mencegah penyakit jantung dengan menurunkan kadar kolesterol, dan Laporan Tugas Akhir Verifikasi metode Uji Penetapan kadar Niasin (Vitamin B3) dalam Sereal secara Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry (LC-MS/MS) Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com) 7 BAB II Tinjauan Pustaka memperbaiki aliran darah pada kasus terjadinya penyumbatan pembuluh darah perifer (http://gafuri46.wordpress.com/tag/sifat-niasin/). Kekurangan vitamin ini dapat menyebabkan kejang-kejang, keram otot, gangguan sistem pencernaan, muntah-muntah, dan mual (http://id.wikipedia.org/wiki/Vitamin). Kekurangan niasin yang parah setelah beberapa bulan akan mengakibatkan pelagra (kulit kasar) dengan gejala spesifik; sakit tenggorokan, lidah dan mulut serta terjadi dermatitis yang sangat khas yaitu simetris terutama pada bagian badan yang tidak tertutup seperti tangan, lengan, siku, kaki, kulit serta leher. Mula-mula kulit berwarna merah, bengkak, lunak dan menyerupai sunburn. Bila keadaan tersebut berlanjut maka kulit akan bersisik dan kadang-kadang terjadi luka (Winarno, F.G., 139:1992). 2.4 Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry (LC-MS/MS) Liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) merupakan salah satu teknik analitik yang menggabungkan kemampuan pemisahan fisik dari High Performance Liquid Chromatography (HPLC) dengan kemampuan analisis massa (spektrometri massa). Liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) merupakan teknik yang digunakan untuk banyak aplikasi yang memiliki sensifitas tinggi dan selektivitas. Suatu campuran senyawa akan dipisahkan dengan liquid chromatography (LC) kemudian diidentifikasi dan diukur dengan spektrometri massa. 2.4.1 Liquid Chromatography (LC) atau Kromatografi Cair Kromatografi adalah suatu teknik pemisahan campuran berdasarkan perbedaan kecepatan perambatan komponen dalam medium tertentu. Pada kromatografi, komponen – komponennya akan dipisahkan antara dua buah fase yaitu fase diam dan fase gerak. Fase diam akan menahan komponen campuran sedangkan fase gerak akan melarutkan zat komponen campuran. Komponen yang mudah tertahan pada fase diam akan tertinggal. Sedangkan komponen yang mudah larut dalam fase gerak akan bergerak lebih cepat. Laporan Tugas Akhir Verifikasi metode Uji Penetapan kadar Niasin (Vitamin B3) dalam Sereal secara Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry (LC-MS/MS) Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com) 8 BAB II Tinjauan Pustaka High Performance Liquid Chromatography (HPLC) merupakan metode pemisahan yang dikembangkan dari asas proses pemisahan adsorpsi dan partisi ke arah yang lebih luas yaitu proses pemisahan yang berdasarkan afinitas, filtrasi gel, dan ion yang berpasangan yang prosesnya tetap dilaksanakan di dalam kolom yang disertai pemakaian pelarut dengan tekanan tinggi. Dasar pemisahan HPLC adalah perbedaan kecepatan migrasi dari komponen-komponen sampel yang terjadi karena adanya perbedaan kesetimbangan distribusi dalam fasa diam dan fasa gerak untuk senyawa-senyawa yang berbeda. (http://netsains.net/2011/09/mengenal-kromatografi-dan-hplc/). 2.4.1.1 Prinsip Kerja Prinsip kerja HPLC yaitu pemisahan komponen-komponen sampel dengan cara melewatkan sampel pada suatu kolom, yang selanjutnya dilakukan pengukuran kadar masing-masing komponen-komponen tersebut dengan suatu detektor. Kerja detektor bermacam-macam, tetapi pada dasarnya membandingkan respon dari komponen sampel dengan respon dari larutan standar. Untuk analisis dengan HPLC diperlukan standar dengan tingkat kemurnian yang tinggi, biasanya disebut HPLC grade. Demikian pula dengan fase geraknya. Komponen HPLC terdiri dari: tandon (reservoir) cairan fase gerak, pompa, sistem injeksi, kolom, detektor dan komputer/integrator untuk pengolahan data. Secara skematik, komponen HPLC dapat digambarkan seperti pada gambar 2.3 Laporan Tugas Akhir Verifikasi metode Uji Penetapan kadar Niasin (Vitamin B3) dalam Sereal secara Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry (LC-MS/MS) Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com) 9 BAB II Tinjauan Pustaka Gambar 2.3 Sistem HPLC Sumber : (PT. Besha Analitika :2007) a. Tandon (Reservoir) Reservoir terbuat dari gelas atau stainless steel. Jumlahnya bisa satu, dua atau lebih. Reservoir yang baik disertai degassing system yang berfungsi untuk menghilangkan oksigen dalam pelarut. Degassing dilakukan dengan mengalirkan gas inert dengan kelarutan yang sangat kecil, misalnya helium. b. Pompa Pompa HPLC umumnya bekerja pada tekanan yang tinggi. Fungsi pompa adalah untuk memompa fase gerak (pelarut) ke dalam kolom dengan aliran yang konstan dan reproducible. Pompa harus memenuhi persyaratan: Dapat memberi tekanan sampai 6000 psi (360 atm). Dapat memberikan fluktuasi tekanan yang minimum. Dapat mengalirkan fase gerak dengan kecepatan 0,1 -10 ml/ menit. Dapat mengalirkan fase gerak dengan reprodusibilitas yang tinggi. Tahan terhadap korosi (biasanya terbuat dari baja atau teflon). (http://kuliahitukeren.blogspot.com/2011/01/alat-hplc-high-performanceliquid.html) Laporan Tugas Akhir Verifikasi metode Uji Penetapan kadar Niasin (Vitamin B3) dalam Sereal secara Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry (LC-MS/MS) Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com) 10 BAB II Tinjauan Pustaka Ada beberapa jenis pompa dalam HPLC yaitu reciprocating pump, displacement pump dan pneumatic pump. c. Injektor Bagian ini merupakan tempat sampel diinjeksikan yang selanjutnya dibawa fase gerak masuk ke dalam kolom. Ada tiga jenis sistem injeksi, yaitu : Syringe Injection Injeksi menggunakan syringe yang dapat memompakan sampel dengan tekanan sampai 1500 psi. Sampel dapat lanhsung diinjeksikan ke dalam kolom atau digunakan katup injeksi. Stop Flow Injection Termasuk jenis syringe injection, hanya injeksinya dengan cara memasukkan sampel ke dalam ruang injeksi (atau disebut mixing chamber), sementara itu aliran fase gerak dihentikan. Setelah sampel masuk lalu fase gerak dialirkan kembali dan sampel akan terbawa. Auto sampler (disebut juga Auto Injector) Terdiri dari suatu sistem yang dikendalikan oleh control system. Sampel ditaruh dalam wadah seperti tabung kecil bertutup. Tutup dapat ditembus oleh jarum pengisap. Sampel disedot secara otomatis dengan sistem pompa yang untuk selanjutnya dimasukkan ke dalam aliran fase gerak. (http://kuliahitukeren.blogspot.com/2011/01/alat-hplc-high-performanceliquid.html) d. Kolom (Column) Kolom merupakan jantung kromatografi, karena berhasil atau gagalnya suatu analisis tergantung pada pemilihan kolom dan kondisi percobaan yang sesuai. (Bella, Lisa : 2009). Kolom terbuat dari stainless steel atau dari gelas. Laporan Tugas Akhir Verifikasi metode Uji Penetapan kadar Niasin (Vitamin B3) dalam Sereal secara Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry (LC-MS/MS) Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com) 11 BAB II Tinjauan Pustaka e. Detektor Detektor merupakan bagian yang berfungsi untuk mendeteksi adanya komponen sampel dalam aliran yang keluar dari kolom. Detektor yang digunakan harus sesuai dengan jenis zat yang dianalisis. Suatu detektor HPLC yang ideal harus mempunyai karakteristik sebagai berikut : • Mempunyai respon terhadap solut yang cepat dan reprodusibel. • Mempunyai sensitifitas yang tinggi, yakni mampu mendeteksi solut pada kadar yang sangat kecil. • Cukup stabil dan menghasilkan perulangan yang baik. • Mempunyai sel volume yang kecil sehingga mampu meminimalkan pelebaran pita. • Sinyal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi zat terlarut pada kisaran yang luas. • Tidak peka pada perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak. (Gandjar, Ibnu Gholib et al, 388 : 2011) f. Rekorder Hasil pembacaan detektor diolah oleh suatu processor dan dikirim ke rekorder yang selanjutnya akan membuat suatu tampilan. Dalam kromatografi tampilan ini disebut kromatogram. Untuk HPLC dilengkapi seperangkat software yang dapat menghitung luas kromatogram dan bahkan sekaligus menghitung kadarnya.(http://kuliahitukeren.blogspot.com/2011/01/alat-hplc-highperformance-liquid.html). 2.4.1.2 Fase Gerak Fase gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran pelarut yang dapat bercampur yang secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi. Daya elusi dan resolusi ini ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase diam dan sifat komponen-komponen sampel. Untuk fase normal (fase diam lebih polar daripada fase gerak), kemampuan elusi meningkat dengan meningkatnya polaritas pelarut. Sementara untuk fase Laporan Tugas Akhir Verifikasi metode Uji Penetapan kadar Niasin (Vitamin B3) dalam Sereal secara Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry (LC-MS/MS) Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com) 12 BAB II Tinjauan Pustaka terbalik (fase diam kurang polar daripada fase gerak), kemampuan elusi menurun dengan meningkatnya polaritas pelarut. (Gandjar, Ibnu Gholib et al, 381 : 2011) 2.4.1.3 Elusi Gradien dan Isokratik Elusi dapat dilakukan dengan cara isokratik atau dengan cara gradien. Elusi isokratik adalah sistem elusi yang dilakukan dengan satu macam atau lebih fase gerak dengan perbandingan tetap. Sedangkan elusi gradien adalah sistem elusi yang dilakukan dengan campuran fase gerak yang perbandingannya berubah-ubah dalam waktu tertentu (komposisi fase gerak berubah-ubah selama elusi). (Bella, Lisa : 2009). 2.4.2 Mass Spectrometry (MS/MS) Mass Spectrometer (MS) adalah instrumen yang menyusun molekul gas (ion) berdasarkan massanya. Ada beberapa jenis Mass Spectrometer, tetapi semuanya harus memiliki komponen yang berfungsi: a. mengionisasi sampel; b. mengakselerasi ion di daerah listrik; c. mengdispersi ion sesuai massanya; d. mendeteksi ion untuk menghasilkan sinyal listrik yang sesuai. Mass Spectrometer tergantung pada aliran ion gas yang melewati daerah listrik dan medan magnet sampai ke detektor untuk dievakuasi. Tekanan dalam proses ionisasi tidak lebih dari 10-3 Pa (sekitar 10-5 torr). Hal ini membutuhkan pemompaan ion yang efisien dan berkelanjutan, selanjutnya ion ditangkap oleh nitrogen cair. Spektometri massa bekerja dengan mengionisasi atom-atom atau molekul-molekul, kemudian menyeleksi dan mendeteksi ion-ion berdasarkan perbandingan massa terhadap muatannya. Komponen-komponen yang utama dalam proses ini adalah sumber ion untuk menghasilkan ion-ion dan penganalisis massa untuk menyeleksi ion-ion. Untuk massa dari ion yang akan ditentukan, ion tersebut harus melalui penganalisis maasa untuk ke detektor. Penghubung (interface) antara kromatografi cair dan spektrometri massa merupakan bagian yang sangat vital. Alat penghubung (interface) Laporan Tugas Akhir Verifikasi metode Uji Penetapan kadar Niasin (Vitamin B3) dalam Sereal secara Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry (LC-MS/MS) Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com) 13 BAB II Tinjauan Pustaka menggunakan teknik ionisasi dengan tekanan atmosfer (API, Atmospheric Pressure Ionization). Pengenalan tentang teknik ionisasi dengan tekanan atmosfer sangat memperluas jumlah dari campuran yang dapat dianalisis dengan LC/MS dengan sukses. Secara umum, teknik API (Atmospheric Pressure Ionization) yang digunakan adalah ESI (Electrospray Ionization), APCI (Atmospheric Pressure Chemica Ionization) dan APPI (Atmospheric Pressure Photoionization). Secara umum, ESI (Electrospray Ionization) lebih disukai untuk campuran yang bersifat ion atau sangat polar, tidak stabil terhadap suhu tinggi atau yang memiliki berat molekul lebih dari 100. APCI (Atmospheric Pressure Chemical Ionization) dan APPI (Atmospheric Pressure Photoionization) lebih cocok digunakan untuk campuran yang bersifat kurang polar. Penganalisis massa atau mass analyzer memisahkan ion-ion berdasarkan pada perbandingan massa terhadap muatannya. Proses penyeleksian memiliki perbedaan tergantung pada jenis spektometri massanya yaitu triple quadrupole, ion trap dan time of flight. Triple quadrupole merupakan jenis analisis massa yang menggunakan osilasi medan listrik yang digunakan untuk menyeleksi ion yang stabil atau tidak stabil yang melewati radio frequency (RF) quadrupole. Triple quadrupole merupakan jenis analisis massa yang terdiri dari dua pasang batang yang mana arus searah (DC) dan radio frequency (RF) diterapkan. Triple quadrupole memiliki tiga spektrometer massa quadrapole. Qudrapole pertama bertindak sebagai mass filter, yang mengirimkan ion masuk ke quadrapole kedua. Qudrapole kedua terdapat tempat terjadinya tumbukan dimana ion mengalami pemecahan. Qudrapole ketiga juga bertindak sebagai mass filter, yang mengirimkan ion hasil pemecahan ke detektor. Qudrapole mass filter dapat diopersikan dalam mode scan atau SIM (Select Ion Monitoring). Ion trap (perangkap ion) merupakan sebuah perangkap ion tunggal yang berfungsi sebagai penganalisis. Pada ion trap, ion yang terpilih dikelurkan dari perangkap dan masuk ke dalam detektor. Analisis massa dan pemecahan terjadi di ruang yang sama. Time of flight Laporan Tugas Akhir Verifikasi metode Uji Penetapan kadar Niasin (Vitamin B3) dalam Sereal secara Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry (LC-MS/MS) Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com) 14 BAB II Tinjauan Pustaka (TOF) merupakan jenis penganalisi massa yang mempunyai rentang massa yang luas atau lebar dan pengukuran untuk mengidentifikasi suatu senyawa yang tidak dikenal dapat dilakukan dengan sangat akurat dan dapat memisahkan campuran yang berbeda dengan nilai massa yang sama. 2.5 Verifikasi Metode Verifikasi metode adalah suatu proses konfirmasi kembali melalui pengujian dan penyajian bukti yang objektif bahwa persyaratan tertentu untuk suatu maksud khusus dipenuhi. Verifikasi dilakukan terhadap suatu metode standar sebelum diterapkan di laboratorium pada semua metode standar (metode baku) atau metode yang telah di validasi pada waktu mula-mula digunakan dan pada jarak waktu tertentu secara berkala. Verifikasi bermaksud untuk membuktikan bahwa laboratorium yang bersangkutan mampu melakukan pengujian dengan metode tersebut dengan hasil yang valid. Disamping itu untuk membuktikan bahwa laboratorium memiliki data kinerja. Hal ini dikarenakan laboratorium yang berbeda memiliki kondisi dan kompetensi personil serta kemampuan peralatan yang berbeda. Sehingga, kinerja antara satu laboratorium dengan laboratorium lainnya tidaklah sama (Utami, Yeti P. 25-26 : 2012) Verifikasi dilakukan terhadap suatu metode setelah metode tersebut mengalami validasi. Verifikasi adalah proses pembuktian bahwa laboratorium uji mampu mendemonstrasikan bahwa metode analisis yang digunakan memiliki kelayakan kinerja untuk melakukan sebuah penetapan rutin sesuai dengan karakteristik kinerja metode. Hal ini mensyaratkan dilakukannya pengujian terhadap parameter kinerja metode misalnya presisi dan akurasi. Validasi atau verifikasi harus selalu dilakukan sebelum menggunakan metode baru sebagai metode untuk analisis rutin. Pengulangan perlu dilakukan jika dalam tahapan analisis terindikasi perlunya dilakukan modifikasi metode. Verifikasi juga harus dilakukan jika: a. Terjadi pergantian instrumen analisis. b. Terjadi pergantian pereaksi yang spesifik. Laporan Tugas Akhir Verifikasi metode Uji Penetapan kadar Niasin (Vitamin B3) dalam Sereal secara Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry (LC-MS/MS) Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com) 15 BAB II Tinjauan Pustaka c. Terjadi perubahan pada pengaturan laboratorium yang dapat mempengaruhi hasil analisis. d. Metode digunakan pertama kali oleh staf baru. e. Metode telah digunakan dalam waktu yang cukup lama. (http://zonazaenal.wordpress.com/2011/01/02/verifikasi-metode-analisissecara-hplc/). Perbandingan dari tingkat presisi, akurasi dan bias dari suatu hasil pengukuran dapat diilustrasikan pada gambar 2.4 Gambar 2.4 Pola hasil pengukuran analitik a. Presisi dan akurasi tinggi, b. Presisi rendah, akurasi tinggi, c. Presisi tingi, akurasi rendah, d. Presisi dan akurasi rendah Sumber : (http://labdasar.ee.itb.ac.id/lab/EL2140/0809/modul%20baru/Apendiks.pdf) 2.5.1 Linieritas Linieritas adalah kemampuan metode analisis memberikan respon proporsional terhadap konsentrasi analit dalam sampel. Linearitas biasanya dinyatakan dalam istilah variansi sekitar arah garis regresi yang dihitung berdasarkan persamaan matematik data yang diperoleh dari hasil uji analit dalam sampel dengan berbagai konsentrasi analit. Perlakuan matematik dalam pengujian linearitas adalah melalui persamaan garis lurus dengan metode kuadrat terkecil antara hasil analisis terhadap konsentrasi analit (http://netsains.net/2012/04/validasi-metode-syarat-sebuah-laporanpenelitian/). Laporan Tugas Akhir Verifikasi metode Uji Penetapan kadar Niasin (Vitamin B3) dalam Sereal secara Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry (LC-MS/MS) Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com) 16 BAB II Tinjauan Pustaka Linieritas suatu metode merupakan ukuran seberapa baik kurva kalibrasi yang menghubungkan antara respon (y) dengan konsentrasi (x). Linieritas dapat diukur melalui pengukuran tunggal pada konsentrasi yang berbeda-beda. Kurva yang diperoleh dapat digunakan untuk menentukan nilai kemiringan (slope), intersep dan koefisien korelasinya (Gandjar, Ibnu Gholib, et al. 469 : 2011). Hubungan antara respon (y) dan konsentrasi (x) dapat digambarkan dengan persamaan yaitu : = + (2-1) Keterangan : y = respon x = konsentrasi b = koefisien regresi (slope = kemiringan) a = tetapan regresi (intersep) (Gandjar, Ibnu Gholib, et al. 32 : 2011). Berdasarkan Guidance for Method Validation in Chemical Analysis, menyatakan bahwa kriteria yang dapat diterima untuk koefisien korelasi adalah mendekati 1. 2.5.2 Presisi Presisi adalah ukuran yang menunjukkan derajat kesesuaian antara hasil uji individual, yang diukur melalui penyebaran hasil individual dari rata-rata jika prosedur diterapkan secara berulang pada sampel-sampel yang diambil dari campuran yang homogen. Presisi diukur sebagai simpangan baku atau simpangan baku relatif (koefisien variasi) (http://www.chem-is-try.org/artikel_kimia/kimia_analisis/verifikasi-danvalidasi-metoda-di-laboratorium/). Presisi merupakan ukuran keterulangan metode analisis dan biasanya diekspresikan sebagai simpangan baku relatif dari sejumlah sampel yang berbeda signifikan secara staistik. Dokumentasi presisi seharusnya mencakup simpangan baku (standar deviasi, SD), simpangan baku relatif (RSD) dan kisaran kepercayaan. (Gandjar, Ibnu Gholib, et al. Laporan Tugas Akhir Verifikasi metode Uji Penetapan kadar Niasin (Vitamin B3) dalam Sereal secara Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry (LC-MS/MS) Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com) 17 BAB II Tinjauan Pustaka 466 : 2011). Biasanya replikasi 6-15 kali dilakukan pada pengujian presisi pada sampel tunggal untuk masing-masing konsentrasi. Standar deviasi merupakan akar jumlah kuadrat deviasi masingmasing hasil terhadap mean dibagi dengan derajat kebebasannya (degrees of freedom). Persamaan yang digunakan untuk menentukan standar deviasi adalah sebagai berikut : = penetapan ∑( ) ( ) (2-2) Keterangan: X = nilai dari masing-masing pengukuran = rata-rata (mean) dari pengukuran N = frekuensi penetapan N-1 = derajat kebebasan (Gandjar, Ibnu Gholib, et al. 17 : 2011). Standar deviasi relatif (relative standard deviation, RSD) yang juga dikenal dengan koefisien variasi (cv) merupakan ukuran ketetapan relatif dan umumnya dinyatakan dalam persen. Standar deviasi relatif (RSD) dirumuskan dengan persamaan : = × 100% (2-3) Keterangan : RSD = standar deviasi relatif (%) SD = standar deviasi = rata-rata (Gandjar, Ibnu Gholib, et al. 18 : 2011). Pada pengujian dengan HPLC, nilai RSD antara 1-2% biasanya dipersyaratkan untuk senyawa-senyawa aktif dalam jumlah yang banyak sedangkan untuk senyawa-senyawa dengan kadar sekelumit, RSD berkisar antara 5-15% (Gandjar, Ibnu Gholib, et al. 466-467 : 2011). Berikut kriteria nilai simpangan baku relatif (SBR) dapat dilihat pada tabel 2.3. Laporan Tugas Akhir Verifikasi metode Uji Penetapan kadar Niasin (Vitamin B3) dalam Sereal secara Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry (LC-MS/MS) Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com) 18 BAB II Tinjauan Pustaka Tabel 2.3 Kriteria Nilai Simpangan Baku Relatif Nilai SBR Keterangan SBR ≤ 1% Sangat Teliti 1% < SBR ≤ 2% Teliti 2% < SBR ≤ 5% Ketelitian sedang SBR > 5% Tidak Teliti Sumber : (AOAC : 2005) Selain itu, berdasarkan Guidance for Method Validation in Chemical Analysis menyatakan bahwa nilai %RSD yang dapat diterima dijelaskan pada tabel 2.4 Tabel 2.4 Hubungan konsentrasi analit yang ditambahkan dengan %RSD yang diperoleh Analit (%w/w) %RSD yang diterima 100 1.3 10 ≤ 100 1.8 1 ≤ 10 2.6 0.1 ≤ 1 3.7 0.01 ≤ 0.1 5.3 0.001 ≤ 0.01 7.5 2.5.3 Akurasi Akurasi adalah ukuran yang menunjukkan derajat kedekatan hasil analisis dengan kadar analit yang sebenarnya. Akurasi dinyatakan sebagai persen perolehan kembali (recovery) analit yang ditambahkan. Akurasi dapat ditentukan melalui dua cara, yaitu metode simulasi (spiked-placebo recovery) atau metode penambahan baku (standard addition method) (http://www.chem-is-try.org/artikel_kimia/kimia_analisis/verifikasi-danvalidasi-metoda-di-laboratorium/). Akurasi merupakan ketelitian metode analisis atau kedekatan antara nilai terukur dengan nilai yang diterima baik nilai konvensi, nilai sebenarnya atau nilai rujukan. Akurasi diukur sebagai banyaknya analit yang diperoleh kembali pada suatu pengukuran dengan melakukan spiking Laporan Tugas Akhir Verifikasi metode Uji Penetapan kadar Niasin (Vitamin B3) dalam Sereal secara Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry (LC-MS/MS) Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com) 19 BAB II Tinjauan Pustaka pada suatu sampel. Untuk pengujian senyawa obat, akurasi diperoleh dengan membandingkan hasil pengukuran dengan bahan rujukan standar (standard reference material, SRM) (Gandjar, Ibnu Gholib, et al. 465:2011). Kecermatan hasil analis sangat tergantung kepada sebaran galat sistematik di dalam keseluruhan tahapan analisis. Oleh karena itu untuk mencapai kecermatan yang tinggi hanya dapat dilakukan dengan cara mengurangi galat sistematik tersebut misalnya menggunakan peralatan yang telah dikalibrasi, menggunakan pereaksi dan pelarut yang baik, pengontrolan suhu, dan pelaksanaannya yang cermat, taat asas sesuai prosedur. Kecermatan ditentukan dengan dua cara yaitu metode simulasi atau persen perolehan kembali (% recovery / spiked-placebo recovery) dan metode penambahan baku (standard addition method). Dalam metode simulasi, sejumlah analit bahan murni (senyawa pembanding kimia CRM atau SRM) ditambahkan ke dalam campuran bahan pembawa sediaan farmasi lalu campuran tersebut dianalisis dan hasilnya dibandingkan dengan kadar analit yang ditambahkan (kadar analit sebenarnya). Dalam metode penambahan baku, sampel dianalisis lalu sejumlah tertentu analit yang diperiksa ditambahkan ke dalam sampel dicampur dan dianalisis kembali. Selisih kedua hasil dibandingkan dengan kadar yang sebenarnya (hasil yang diharapkan). Perhitungan perolehan kembali dapat ditetapkan dengan rumus sebagai berikut : % = × % (2-4) C1 = konsentrasi total sampel yang diperoleh dari pengukuran C2 = konsentrasi sampel sebenarnya C3 = konsentrasi analit yang ditambahkan Berdasarkan Guidance for Method Validation in Chemical Analysis, menyatakan bahwa nilai % recovery yang dapat diterima dijelaskan pada tabel 2.5 Laporan Tugas Akhir Verifikasi metode Uji Penetapan kadar Niasin (Vitamin B3) dalam Sereal secara Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry (LC-MS/MS) Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com) 20 BAB II Tinjauan Pustaka Tabel 2.5 Hubungan konsentrasi analit dengan %recovery Analit (%w/w) %recovery yang diterima 100 95-105 10 ≤ 100 90-110 1 ≤ 10 90-110 0.1 ≤ 1 85-115 0.01 ≤ 0.1 80-120 0.001 ≤ 0.01 75-125 0.0001 ≤ 0.001 70-130 Laporan Tugas Akhir Verifikasi metode Uji Penetapan kadar Niasin (Vitamin B3) dalam Sereal secara Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry (LC-MS/MS) Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
