STUDI AKTIVITAS ANTIBAKTERI DAN IDENTIFIKASI FRAKSI
advertisement
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id STUDI AKTIVITAS ANTIBAKTERI DAN IDENTIFIKASI FRAKSI TERAKTIF DAUN MIMBA (Azadirachta indica A. Juss) Disusun oleh : RISKHA KURNIA MURTI M0306055 SKRIPSI Ditulis dan diajukan untuk memenuhi sebagian persyaratan mendapatkan gelar Sarjana Sains FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS SEBELAS MARET SURAKARTA Oktober, 2011 commit to user i Ý®»¿¬» ÐÜÚ º·´»- ©·¬¸±«¬ ¬¸·- ³»--¿¹» ¾§ °«®½¸¿-·²¹ ²±ª¿ÐÜÚ °®·²¬»® ø¸¬¬°æññ©©©ò²±ª¿°¼ºò½±³÷ perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id commit to user ii Ý®»¿¬» ÐÜÚ º·´»- ©·¬¸±«¬ ¬¸·- ³»--¿¹» ¾§ °«®½¸¿-·²¹ ²±ª¿ÐÜÚ °®·²¬»® ø¸¬¬°æññ©©©ò²±ª¿°¼ºò½±³÷ perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id STUDI AKTIVITAS ANTIBAKTERI DAN IDENTIFIKASI FRAKSI TERAKTIF DAUN MIMBA (Azadirachta indica A. Juss) RISKHA KURNIA MURTI Jurusan Kimia, Fakultas MIPA. Universitas Sebelas Maret ABSTRAK Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui aktivitas antibakteri fraksi daun mimba (Azadirachta indica A. Juss) terhadap beberapa bakteri patogen dan mengidentifikasi fraksi teraktifnya. Serbuk daun mimba dimaserasi dengan etanol dan difraksinasi dengan kromatografi vakum cair berturut-turut menggunakan eluen heksana, etil asetat, dan etanol. Aktivitas antibakteri dilakukan dengan metode difusi agar, kemudian fraksi teraktif antibakteri ditentukan berdasarkan Diameter Daerah Hambat (DDH). Fraksi teraktif antibakteri ditentukan Konsentrasi Hambat Minimum (KHM) dan nilai bandingnya terhadap amoksisilin dan kloramfenikol. Selanjutnya fraksi ini diidentifikasi menggunakan skrining fitokimia dan Kromatografi Gas-Spektrofotometer Massa (GC-MS). Fraksi daun mimba hasil pemisahan KVC mempunyai aktivitas antibakteri terhadap Staphylococcus epidermidis, Bacillus cereus, dan Shigella flexneri. Fraksi etil asetat menunjukkan fraksi teraktif antibakteri terhadap semua bakteri uji. Fraksi etil asetat memiliki KHM 0,075% terhadap bakteri Staphylococcus epidermidis, 0,05% terhadap bakteri Bacillus cereus dan Shigella flexneri. Aktivitas antibakteri fraksi etil asetat dibandingkan dengan amoksisilin adalah 0,01% untuk bakteri S. epidermidis, 0,02% untuk bakteri B. cereus, dan 0,02% untuk bakteri S. flexneri, sedangkan dibandingkan dengan kloramfenikol adalah 0,04% untuk bakteri S. epidermidis, 0,02% untuk bakteri B. cereus, dan 0,06% untuk bakteri S. flexneri. Identifikasi dengan skrining fitokimia menunjukkan bahwa fraksi etil asetat mengandung senyawa alkaloid, terpenoid, steroid, tanin (polifenolik), antrakuinon, dan asam lemak. Hasil GC-MS menunjukkan bahwa fraksi etil asetat mengandung senyawa asam palmitat, etil linoleolat, asam stearat, trans-fitol, DOF (di oktil ftalat), dan dimungkinkan 1 senyawa golongan asam lemak serta 5 senyawa golongan triterpenoid. Kata Kunci : Azadirachta indica A. Juss, fraksi etil asetat, aktivitas antibakteri, identifikasi fraksi teraktif commit to user iii Ý®»¿¬» ÐÜÚ º·´»- ©·¬¸±«¬ ¬¸·- ³»--¿¹» ¾§ °«®½¸¿-·²¹ ²±ª¿ÐÜÚ °®·²¬»® ø¸¬¬°æññ©©©ò²±ª¿°¼ºò½±³÷ perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id STUDY OF ANTIBACTERIAL ACTIVITY AND IDENTIFICATION THE MOST ACTIVE FRACTION OF NEEM LEAVES (Azadirachta indica A. Juss) RISKHA KURNIA MURTI Department of Chemistry. Faculty of Mathematics and Natural Sciences Sebelas Maret University ABSTRACT The purpose of this research was to evaluate antibacterial activity of Neem (Azadirachta indica A. Juss) leaves fraction against some pathogenic bacterial and to identificate the most active fraction. Leaves powder of Neem was macerated with ethanol and factionated by vacuum liquid chromatography using hexane, ethyl acetate and ethanol as eluent, respectively. The antibacterial activity of the fraction was evaluated by diffusion method, then the most active fraction of antibacterial was evaluated by zone of inhibition. The most active fraction of antibacterial was evaluated for Minimum Inhibitory Concentration (MIC) and equivalent value, compared with amoxicillin and chloramphenicol, then identified using phytochemical screening and Gass Chromatography-Mass Spectroscopy (GC-MS). The fraction of Neem leaves fractionated by vacuum liquid chromatography had antibacterial activity against Staphylococcus epidermidis, Bacillus cereus, and Shigella flexneri. The ethyl acetate fraction showed the most active fraction of antibacterial against all bacterial tested. The ethyl acetate fraction had MIC 0.075% against Staphylococcus epidermidis 0.05% against Bacillus cereus and Shigella flexneri. The antibacterial activity of ethyl acetat fraction compared to amoxicillin was 0.01% for S. epidermidis, 0.02% for B. cereus, and 0.02% for S. flexneri. Then compared to chloramphenicol was 0.04% for S. epidermidis, 0.02% for B. cereus, and 0.06% for S. flexneri. Identification using phytochemical screening showed that the ethyl acetate fraction contained alkaloids, terpenoids, steroids, tannins (polyphenolics), anthraquinones, and fatty acid. The result of GC-MS showed that the ethyl acetate fraction contained palmitic acid, ethyl linoleolate, stearic acid, trans-phytol, DOP (di octyl phthalate), and suggested 1 class of compound fatty acid and 5 classes of compound triterpenoids. Keywords : Azadirachta incica A. Juss, ethyl acetate fraction, antibacterial activity, identification the most active fraction commit to user iv Ý®»¿¬» ÐÜÚ º·´»- ©·¬¸±«¬ ¬¸·- ³»--¿¹» ¾§ °«®½¸¿-·²¹ ²±ª¿ÐÜÚ °®·²¬»® ø¸¬¬°æññ©©©ò²±ª¿°¼ºò½±³÷ perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id MOTTO “ Sesungguhnya sesudah kesulitan itu ada kemudahan. Maka apabila kamu telah selesai dari sesuatu urusan, kerjakanlah dengan sungguh-sungguh urusan yang lain” “ Bacalah apa yang telah diwahyukan kepadamu, yaitu Al-Quran dan dirikanah Sholat. Sesungguhnya Sholat itu mencegah perbuaan keji dan mungkar” “ Tugas kita bukanlah untuk berhasil. Tugas kita adalah untuk mencoba, karena di dalam mencoba kita menemukan dan belajar membangun kesempatan untuk berhasil” commit to user v Ý®»¿¬» ÐÜÚ º·´»- ©·¬¸±«¬ ¬¸·- ³»--¿¹» ¾§ °«®½¸¿-·²¹ ²±ª¿ÐÜÚ °®·²¬»® ø¸¬¬°æññ©©©ò²±ª¿°¼ºò½±³÷ perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id PERSEMBAHAN Karya kecilku ini kupersembahkan untuk : “Bapak dan Ibu” atas kasih sayang, dukungan, motivasi, dan doa yang tiada henti… “Rima”…terimakasih atas supportnya selama ini… …thanks for everything…keep spirit!!! commit to user vi Ý®»¿¬» ÐÜÚ º·´»- ©·¬¸±«¬ ¬¸·- ³»--¿¹» ¾§ °«®½¸¿-·²¹ ²±ª¿ÐÜÚ °®·²¬»® ø¸¬¬°æññ©©©ò²±ª¿°¼ºò½±³÷ perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id KATA PENGANTAR Segala puji syukur penulis panjatkan kehadirat Alloh SWT atas limpahan rahmat dan karunia dan ridho-Nya sehingga skripsi yang berjudul “Studi Aktivitas Antibakteri dan Identifikasi Fraksi Teraktif Daun Mimba (Azadirachta indica A. Juss) ini dapat terselesaikan dengan baik. Dalam kesempatan kali ini penulis mengucapkan banyak terima kasih kepada semua pihak yang telah banyak membantu sehingga penulis dapat menyelesaikan penulisan skripsi ini, khususnya kepada : 1. Bapak Ir. Ari Handono Ramelan, M.Sc.,PhD selaku Dekan FMIPA UNS. 2. Bapak Dr. Eddy Heraldy, M.Si selaku Ketua Jurusan Kimia FMIPA UNS. 3. Ibu Nestri Handayani, M.Si, Apt selaku pembimbing I yang telah memberikan bimbingan dan arahan selama menyelesaikan skripsi. 4. Bapak M. Widyo Wartono, M.Si selaku pembimbing II yang telah memberikan bimbingan dan arahan selama menyelesaikan skripsi. 5. Bapak Dr. rer.nat Fajar Rakhman Wibowo, M.Si selaku pembimbing akademik yang telah memberikan saran dan motivasi kepada penulis selama masa studi. 6. Bapak I.F. Nurcahyo, M.Si. selaku Ketua Laboratorium Kimia Dasar FMIPA UNS dan Bapak Tjahjadi Purwoko, M.Si. selaku Ketua Sub Laboratorium Biologi Laboratorium Pusat FMIPA UNS. 7. Seluruh Dosen Jurusan Kimia FMIPA UNS atas ilmu yang berguna dalam penyusunan skripsi ini. 8. Para Laboran di Laboratorium Kimia FMIPA UNS dan Sub Laboratorium Biologi atas bantuan dan kerjasamanya dengan baik. 9. Bapak, Ibu dan Rima, terimakasih atas motivasi, dukungan, dan doanya selama ini, sehingga terciptalah karya kecil ini. 10. Untuk teman-teman seperjuangan “Anne, Marsih, Idul, Isna, Ester, Eva, Mb Esmy” terimakasih atas kebersamaan dan persabatannya selama ini. Untuk “Ovi, Nurul” terimakasih atas bantuannya. commit to user vii Ý®»¿¬» ÐÜÚ º·´»- ©·¬¸±«¬ ¬¸·- ³»--¿¹» ¾§ °«®½¸¿-·²¹ ²±ª¿ÐÜÚ °®·²¬»® ø¸¬¬°æññ©©©ò²±ª¿°¼ºò½±³÷ perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id 11. Teman-teman Kimia’06, kakak dan adik tingkat yang tidak mungkin disebutkan satu persatu, terimakasih atas semua dukungan dan persahabatannya selama ini. 12. Semua pihak yang telah membantu penulis dalam pelaksanaan serta penyusunan skripsi ini yang tidak dapat penulis sebutkan satu- persatu. Penulis menyadari bahwa skripsi ini masih jauh dari kata sempurna. Oleh karena itu penulis sangat mengharapkan kritik dan saran yang membangun demi kesempurnaan skripsi ini. Akhirnya penulis berharap semoga skripsi ini bisa memberikan manfaat dan dapat menambah pengetahuan bagi para pembaca pada umumnya dan penulis pada khususnya. Surakarta, Oktober 2011 Riskha Kurnia Murti commit to user viii Ý®»¿¬» ÐÜÚ º·´»- ©·¬¸±«¬ ¬¸·- ³»--¿¹» ¾§ °«®½¸¿-·²¹ ²±ª¿ÐÜÚ °®·²¬»® ø¸¬¬°æññ©©©ò²±ª¿°¼ºò½±³÷ perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id DAFTAR ISI HALAMAN JUDUL ................................................................................ i HALAMAN PENGESAHAN .................................................................... ii HALAMAN PERNYATAAN ................................................................... iii ABSTRAK ................................................................................................ iv ABSTRACT ............................................................................................. v MOTTO .................................................................................................... vi HALAMAN PERSEMBAHAN ................................................................ vii KATA PENGANTAR .............................................................................. viii DAFTAR ISI ............................................................................................ x DAFTAR TABEL ..................................................................................... xiii DAFTAR GAMBAR ................................................................................. xiv DAFTAR LAMPIRAN ............................................................................. xiv BAB I. PENDAHULUAN ........................................................................ 1 A. Latar Belakang Masalah ................................................................. 1 B. Perumusan Masalah ........................................................................ 3 1. Identifikasi Masalah .............................................................. 3 2. Batasan Masalah ................................................................... 4 3. Rumusan masalah ................................................................. 4 C. Tujuan Penelitian .......................................................................... 5 D. Manfaat Penelitian ......................................................................... 5 BAB II. LANDASAN TEORI ................................................................... 6 A. Tinjauan Pustaka ........................................................................... 6 1. Mimba (Azadirachta indica A. Juss) ..................................... 6 a. Klasifikasi Tanaman .......................................................... 6 b. Deskripsi Tanaman ........................................................... 7 c. Manfaat Tanaman ............................................................. 7 d. Kandungan Kimia Tanaman ................................................ 7 2. Bakteri dan Klasifikasi Bakteri Uji ....................................... 11 3. Metode Pengujian Aktivitas Antibakteri ............................... 15 commit to user ix Ý®»¿¬» ÐÜÚ º·´»- ©·¬¸±«¬ ¬¸·- ³»--¿¹» ¾§ °«®½¸¿-·²¹ ²±ª¿ÐÜÚ °®·²¬»® ø¸¬¬°æññ©©©ò²±ª¿°¼ºò½±³÷ perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id 4. Antibiotik ............................................................................. 16 5. Konsentrasi Hambat Minimum (KHM) dan Uji Banding .. .... 19 6. Ekstraksi ............................................................................... 20 7. Skrining Fitokimia ............................................................. ..... 20 8. Kromatografi Vakum Cair (KVC) ......................................... 21 9. Kromatografi Gas-Spektrofotometer Massa (GC-MS) ........... 21 B. Kerangka Pemikiran ...... ................................................................ 22 C. Hipotesis ....................................................................................... 23 BAB III. METODOLOGI PENELITIAN .................................................. 25 A. Metode Penelitian .......................................................................... 25 B. Tempat dan Waktu Penelitian ........................................................ 25 C. Alat dan Bahan .............................................................................. 25 1. Alat ....................................................................................... 25 2. Bahan ................................................................................... 26 D. Prosedur Penelitian ........................................................................ 26 1. Identifikasi Sampel ............................................................... 26 2. Preparasi dan Ekstraksi Sampel ............................................. 27 3. Pengujian Golongan Senyawa Ekstrak Etanol ....................... 27 4. Pengujian Aktivitas Antibakteri Ekstrak Etanol ..................... 30 5. Pemisahan Ekstrak Etanol ...................................................... 31 6. Pengujian Aktivitas Antibakteri Fraksi-Fraksi Hasil Pemisahan KVC ..................................................................................... 32 7. Pengujian Golongan Senyawa Fraksi Teraktif Antibakteri ..... 32 8. Kromatografi Gas-Spektrofotometer Massa (GC-MS) ........... 32 E. Teknik Analisa dan Pengumpulan Data ......................................... 33 BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN .................................................. 34 A. Identifikasi Sampel ....................................................................... 34 B. Persiapan dan Ekstraksi Sampel .................................................... 34 C. Pengujian Golongan Senyawa Ekstrak Etanol ............................... 36 D. Pengujian Aktivitas Antibakteri Ekstrak Etanol .............................. 36 E. Pemisahan Ekstrak Etanol ............................................................. 38 commit to user x Ý®»¿¬» ÐÜÚ º·´»- ©·¬¸±«¬ ¬¸·- ³»--¿¹» ¾§ °«®½¸¿-·²¹ ²±ª¿ÐÜÚ °®·²¬»® ø¸¬¬°æññ©©©ò²±ª¿°¼ºò½±³÷ perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id F. Pengujian Aktivitas Antibakteri Fraksi-Fraksi Hasil Pemisahan KVC ............... ........................................................................................ 39 G. Penetapan KHM dan Nilai Banding .................. ............................. 40 1. Penetapan KHM Fraksi Etil Asetat ......................................... 40 2. Penetapan KHM Amoksisilin dan Kloramfenikol .................. 42 3. Penetapan Nilai Bandung Fraksi Etil Asetat dengan Amoksisilin dan Kloramfenikol .................................................................. 45 H. Pengujian Golongan Senyawa Fraksi Teraktif Antibakteri ............ 46 I. Kromatografi Gas-Spektrofotometer Massa (GC-MS) ................... 48 BAB V. PENUTUP .................................................................................. 58 A. Kesimpulan ................................................................................... 58 B. Saran ............................................................................................ 58 DAFTAR PUSTAKA ................................................................................ 59 LAMPIRAN LAMPIRAN ........................................................................ 66 commit to user xi Ý®»¿¬» ÐÜÚ º·´»- ©·¬¸±«¬ ¬¸·- ³»--¿¹» ¾§ °«®½¸¿-·²¹ ²±ª¿ÐÜÚ °®·²¬»® ø¸¬¬°æññ©©©ò²±ª¿°¼ºò½±³÷ perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id DAFTAR TABEL Tabel 1. Hasil Skrining Fitokimia (Uji Tabung) Ekstrak Etanol .............. . 35 Tabel 2. Hasil Skrining Fitokimia (Uji KLT) Ekstrak Etanol ................. .. 36 Tabel 3. Hasil Pengujian Aktivitas Antibakteri Ekstrak Etanol ................ 37 Tabel 4. Hasil Pemisahan Kromatografi Vakum Cair Ekstrak Etanol Daun Mimba ....................................................................................... 39 Tabel 5. Hasil Pengujian Aktivitas Antibakteri Fraksi-Fraksi Hasil Pemisahan KVC ............................................................................................. 39 Tabel 6. Hasil Uji Penetapan KHM Fraksi Etil Asetat ............................ .. 41 Tabel 7. Hasil Uji Penetapan KHM Amoksisilin .................................... .. 43 Tabel 8. Hasil Uji Penetapan KHM Kloramfenikol ................................ .. 44 Tabel 9. Hasil Penetapan Nilai Banding Fraksi Etil Asetat terhadap Amoksisilin dan Kloramfenikol ............................................... ... 46 Tabel 10. Hasil Skrining Fitokimia (Uji Tabung) Fraksi Etil Asetat ........... 47 Tabel 11. Hasil Skrining Fitokimia (Uji KLT) Fraksi Etil Asetat .............. . 47 Tabel 12. Fragmentasi Senyawa Puncak 3 Dibandingkan dengan Standar ...................................................................................................... 50 Tabel 13. Fragmentasi Senyawa Puncak 4 Dibandingkan dengan Standar ...................................................................................................... 52 Tabel 14. Fragmentasi Senyawa Puncak 6 Dibandingkan dengan Standar ................................................................................. .................... 53 Tabel 15. Fragmentasi Senyawa Puncak 7 Dibandingkan dengan Standar ................................................................................. .................... 54 Tabel 16. Fragmentasi Senyawa Puncak 9 Dibandingkan dengan Standar ................................................................................. .................... commit to user xii Ý®»¿¬» ÐÜÚ º·´»- ©·¬¸±«¬ ¬¸·- ³»--¿¹» ¾§ °«®½¸¿-·²¹ ²±ª¿ÐÜÚ °®·²¬»® ø¸¬¬°æññ©©©ò²±ª¿°¼ºò½±³÷ 56 perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id DAFTAR GAMBAR Gambar 1. Tanaman Mimba (Azadirachta indica A.Juss) ...................... 6 Gambar 2. Bakteri Staphylococcus epidermidis ...................................... 12 Gambar 3. Bakteri Bacillus cereus .......................................................... 13 Gambar 4. Bakteri Shigella flexneri......................................................... 15 Gambar 5. Struktur Kimia Amoksisilin ................................................... 16 Gambar 6. Struktur Kimia Kloramfenikol ............................................... 17 Gambar 7. Kromatogram GC Fraksi Etil Asetat Daun Mimba ................. 49 Gambar 8. Spektra Senyawa 1 ................................................................. 50 Gambar 9. (a) Spektra Senyawa 3…………………………………. ........ 50 (b) Spektra Massa Senyawa Asam Palmitat ………………….. 50 Gambar 10. (a) Spektra Senyawa 4…………………………………. ........ 51 (b) Spektra Massa Senyawa Etil Linoleolat..………………….. 51 Gambar 11. Senyawa Puncak 5 ................................................................ 52 Gambar 12. (a) Spektra Senyawa 6…………………………………. ........ 53 (b) Spektra Massa Senyawa Asam Stearat..………………….. 53 Gambar 13. (a) Spektra Senyawa 4…………………………………. ........ 54 (b) Spektra Massa Senyawa Etil Linoleolat..………………… 54 Gambar 14. Spektra Senyawa 8 ................................................................ 55 Gambar 15. (a) Spektra Senyawa 9 ......................................................... 55 (b) Spektra Massa Senyawa DOP......................................... ... 55 Gambar 16. Spektra Senyawa 10................................................................. 56 Gambar 17. Spektra Senyawa 11................................................................. 56 Gambar 18. Spektra Senyawa 12............................................................. .... 57 commit to user xiii Ý®»¿¬» ÐÜÚ º·´»- ©·¬¸±«¬ ¬¸·- ³»--¿¹» ¾§ °«®½¸¿-·²¹ ²±ª¿ÐÜÚ °®·²¬»® ø¸¬¬°æññ©©©ò²±ª¿°¼ºò½±³÷ perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id DAFTAR LAMPIRAN Lampiran 1. Diagram Alir Prosedur Penelitian………………………..….. 66 Lampiran 2. Hasil Determinasi Tanaman Mimba......................................... 69 Lampiran 3. Perhitungan Rendemen Ekstrak Etanol dan Fraksi-Fraksi Hasil Pemisahan KVC……………………………………………… 70 Lampiran 4. Hasil Pengujian Aktivitas Antibakteri Ekstrak Etanol Daun Mimba....................................................................................... 72 Lampiran 5. Out Put Analisa One way ANOVA Pengaruh Variasi Bakteri pada Masing-Masing Konsentrasi Ekstrak Etanol…………… 73 Lampiran 6. Hasil Pengujian Aktivitas Antibakteri Fraksi-Fraksi Hasil Pemisahan KVC………………………………………………. 76 Lampiran 7. Out Put Analisa One way ANOVA Pengaruh Variasi Fraksi pada Masing-Masing Bakteri pada Uji Aktivitas Antibakteri FraksiFraksi Hasil Pemisahan KVC................................................... 78 Lampiran 8. Hasil Pengujian Penetapan KHM Fraksi Etil Asetat………… 84 Lampiran 9. Analisa One Way ANOVA Pengaruh Variasi Bakteri pada Masing-Masing Konsentrasi Fraksi terhadap Penentuan KHM Fraksi Etil Asetat…………………………………………….. 85 Lampiran 10. Hasil Pengujian Penetapan KHM Amoksisilin........................ 88 Lampiran 11. Analisa One Way ANOVA Pengaruh Variasi Konsentrasi Amoksisilin pada Masimg-Masing Bakteri Pada Uji Penetapan KHM Amoksisilin.................................................................... 89 Lampiran 12. Analisa One Way ANOVA Pengaruh Variasi Bakteri Pada Masing-Masing Konsentrasi Amoksisilin pada Uji Penetapan KHM Amoksisilin.................................................................... 94 Lampiran 13. Perhitungan Nilai Banding Fraksi Etil Asetat terhadap Amoksisilin.............................................................................. 97 Lampiran 14. Hasil Pengujian Penentuan KHM Kloramfenikol.................... 102 commit to user xiv Ý®»¿¬» ÐÜÚ º·´»- ©·¬¸±«¬ ¬¸·- ³»--¿¹» ¾§ °«®½¸¿-·²¹ ²±ª¿ÐÜÚ °®·²¬»® ø¸¬¬°æññ©©©ò²±ª¿°¼ºò½±³÷ perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id Lampiran 15. Analisa One Way ANOVA Pengaruh Variasi Konsentrasi Kloramfenikol pada Masing-Masing Bakteri pada Uji Penetapan KHM Kloramfenikol ........................................................... 103 Lampiran 16. Analisa One Way ANOVA Pengaruh Variasi Bakteri pada Masing-Masing Konsentrasi Kloramfenikol terhadap Penentuan KHM Kloramfenikol ........................................................... 108 Lampiran 17. Perhitungan Nilai Banding Fraksi Etil Asetat Terhadap Kloramfenikol ..................................................................... 111 Lampiran 18. Hasil Uji KLT Ekstrak Etanol dan Fraksi Etil Asetat……….. 115 Lampiran 19. Analisis GC-MS Ekstrak Etil Asetat Daun Mimba………..... 116 commit to user xv Ý®»¿¬» ÐÜÚ º·´»- ©·¬¸±«¬ ¬¸·- ³»--¿¹» ¾§ °«®½¸¿-·²¹ ²±ª¿ÐÜÚ °®·²¬»® ø¸¬¬°æññ©©©ò²±ª¿°¼ºò½±³÷ perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id BAB I PENDAHULUAN A. Latar Belakang Masalah Pemanfaatan tanaman obat untuk mengobati suatu penyakit semakin diminati seiring dengan semakin meningkatnya perhatian masyarakat dunia terhadap gerakan “kembali ke alam” (back to nature), tidak terkecuali masyarakat Indonesia. Hal ini dikarenakan efek samping dari tanaman obat jauh lebih aman dibandingkan obat-obat kimia (Djauharia dan Hernani, 2004). Namun supaya obat tradisional dapat diterima dalam pengobatan modern, beberapa persyaratan yang harus dipenuhi, terutama adalah kandungan zat aktifnya. Sehingga khasiat dan tingkat keamanannya dapat diketahui dengan mudah (Atamini, 2001). Mimba (Azadirachta indica A. Juss) merupakan tanaman yang banyak ditemukan di Negara Tropis, salah satunya adalah Indonesia. Di Indonesia tanaman mimba tumbuh di Jawa Tengah, Jawa Timur, Jawa Barat, Bali dan Nusa Tenggara (Herawati, 2004). Tanaman ini memiliki manfaat yang sangat banyak bagi kehidupan manusia. Daun mimba dimanfaatkan untuk penambah nafsu makan, disentri, borok, malaria dan antibakteri (Sudarsono dkk., 2002). Selain itu daun mimba juga dapat digunakan untuk menurunkan gula darah (Csurhes, 2008), menurunkan total kolesterol dalam darah, LDL- dan VLDL-kolesterol, trigliserid dan total lipid dalam serum (Chattopadhyay dkk., 2005). Khasiat daun mimba dipengaruhi oleh kandungan metabolit sekundernya. Daun mimba diketahui mengandung senyawa golongan terpenoid, flavonoid, alkaloid, saponin, tanin (Biu dkk., 2009), asam lemak (Khan dkk., 2010), steroid dan triterpenoid (Aslam dkk., 2009). Ekstrak etanol dari biji mimba dilaporkan mengandung asam palmitat, asam stearat, asam oleat, etil oleat, asam oktadekanoat, etil ester oktadekanoat dan ester dioktil heksadioat (Suirta dkk., 2007). Penelitian lain menyebutkan bahwa ekstrak air daun mimba mengandung senyawa azadirachtin A, B, D, H, I, desacetylnimbin, azadiradione, nimbin, salanin, azadirone, nimbolin, nimbinen, dan nimbolide (Sadeghian, 2007). commit to user 1 Ý®»¿¬» ÐÜÚ º·´»- ©·¬¸±«¬ ¬¸·- ³»--¿¹» ¾§ °«®½¸¿-·²¹ ²±ª¿ÐÜÚ °®·²¬»® ø¸¬¬°æññ©©©ò²±ª¿°¼ºò½±³÷ perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id 2 Hasil uji aktivitas antibakteri ekstrak etanol daun mimba yang dilakukan terhadap bakteri Staphylococcus aureus menunjukkan bahwa pada konsentrasi 10%, 20%, 30%, 40% dan 50% dengan DDH rata-rata 0,580; 0,670; 0,818; 0,972; 1,013 cm (Nugraheni, 2007). Selain itu Pritima dan Pandian (2008) juga menyebutkan bawa ekstrak daun mimba mampu menghambat Bacillus cereus, Enterococcus faecalis, Eschericihia coli, Kleibsiella pneumoniae, Neisseria gonohorreae, Proteus mirabilis, dan Staphylococcus aureus. Menurut ElMahmood (2010) ekstrak heksan biji mimba memiliki KHM 6,25 mg/ml terhadap bakteri E. coli, 50 mg/ml terhadap P. aeruginosa, 12,5 mg/ml terhadap S. pyogenes, dan 12,5 mg/ml terhadap S. aureus. Sedangkan aktivitas antibakteri fraksi daun mimba terhadap bakteri Staphylococcus epidermidis, Bacillus cereus, dan Shigella flexneri belum pernah dilakukan penelitian secara ilmiah. Staphylococcus epidermidis merupakan bakteri gram positif yang menyebabkan penyakit melalui kemampuannya berkembang biak dan menyebar luas dalam jaringan (Jawetz dkk., 2005). Bakteri ini terdapat pada kulit, selaput lendir, bisul, jerawat dan luka. Bacillus cereus merupakan bakteri gram positif yang dapat tumbuh pada makanan dan menghasilkan enterotoksin yang menyebabkan keracunan makanan. Bakteri ini kadang-kadang dapat menyebabkan penyakit meningitis, endokarditis, endoftalmitis, konjugtivis atau gastroenteritis akut. Shigella flexneri merupakan bakteri yang menyebabkan penyakit disentri basiler, yaitu suatu penyakit yang ditandai dengan peradangan usus, terutama kolon dan disertai nyeri perut, tenesmus dan buang air besar yang sering mengandung darah dan lendir (Plezar dkk., 1986). Selain itu juga dapat menyebabkan demam tinggi, nyeri kepala, dan kejang-kejang. Penyakit infeksi sampai saat ini masih menjadi masalah utama kesehatan masyarakat Indonesia. Pengobatan terhadap penyakit infeksi biasanya digunakan antibiotik sintetis dan telah banyak dikembangkan. Namun penggunaan antibiotik sintetis ini kadang-kadang memberikan efek samping terhadap tubuh yang tidak diinginkan (Aliero dkk., 2008). Situasi ini menunjukkan perlunya dilakukan penelitian untuk mengembangkan obat antibakteri baru yang berasal dari tanaman. commit to user Ý®»¿¬» ÐÜÚ º·´»- ©·¬¸±«¬ ¬¸·- ³»--¿¹» ¾§ °«®½¸¿-·²¹ ²±ª¿ÐÜÚ °®·²¬»® ø¸¬¬°æññ©©©ò²±ª¿°¼ºò½±³÷ perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id 3 Penelitian in bertujuan untuk mengetahui aktivitas antibakteri fraksi daun mimba terhadap Staphylococcus epidermidis, Bacillus cereus, dan Shigella flexneri dan mengidentifikasi komponen kimia fraksi teraktifnya. Hasil dari penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi dan bukti ilmiah untuk mengembangkan antibiotik baru dari bahan alam khususnya daun mimba. B. Perumusan Masalah 1. Identifikasi Masalah Tanaman mimba merupakan tanaman obat tradisional Indonesia yang tumbuh di Jawa Tengah, Jawa Timur, Jawa Barat, Bali dan Nusa Tenggara. Tanaman ini mempunyai kandungan kimia yang berbeda-beda pada setiap bagiannya. Biji mimba dilaporkan mengandung senyawa golongan asam lemak, sedangkan daun mimba mengandung senyawa golongan terpenoid. Penelitian uji aktivitas antibakteri tanaman mimba menunjukkan bahwa pada setiap bagiannya mempunyai aktivitas antibakteri yang berbeda-beda. Isolasi senyawa daun mimba dapat dilakukan dengan metode maserasi, shokletasi, dan perkolasi. Penggunaan pelarut yang berbeda pada waktu isolasi akan menghasilkan senyawa yang berbeda, sehingga akan mempengaruhi aktivitas antibakteri yang dihasilkan. Dari hal tersebut perlu diperhatikan cara isolasi senyawa daun mimba dengan pelarut yang tepat. Beberapa penelitian menunjukkan bahwa daun mimba mempunyai aktivitas antibakteri, sehingga perlu dilakukan pengujian untuk mengetahui potensi ekstrak tersebut terhadap beberapa bakteri patogen. Bakteri yang digunakan untuk pengujian aktivitas antibakteri sangat beragam antara lain Salmonella typhimurium, Shigella flexneri, Pseudomonas aeruginosa dan Proteus mirabilis untuk bakteri gram negatif. Sedangkan untuk bakteri gram positif antara lain Staphylococcus epidermidis, Bacillus cereus, Streptococcus pyogenes, Bacillus subtilis dan Enterococcus faecalis. Uji potensi suatu zat antibakteri bertujuan untuk mengetahui potensi zat tersebut apabila dibandingkan dengan suatu zat pembanding yaitu antibiotik sintetik. Beberapa antibiotik sintetik yang sering digunakan adalah antibiotik commit to user Ý®»¿¬» ÐÜÚ º·´»- ©·¬¸±«¬ ¬¸·- ³»--¿¹» ¾§ °«®½¸¿-·²¹ ²±ª¿ÐÜÚ °®·²¬»® ø¸¬¬°æññ©©©ò²±ª¿°¼ºò½±³÷ perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id 4 golongan penisilin dan turunannya. Untuk mengetahui potensi zat antibakteri dilakukan dengan mencari nilai banding zat tersebut terhadap antibiotik sintetik yang digunakan. 2. Batasan Masalah Berdasarkan identifikasi masalah di atas, maka masalah dalam penelitian ini dibatasi pada : 1. Penelitian ini menggunakan daun tanaman mimba yang berasal dari daerah Klaten, Jawa Tengah. 2. Isolasi senyawa pada daun mimba dilakukan dengan cara maserasi menggunakan pelarut etanol, kemudian dilanjutkan pemisahan dengan Kromatografi Vakum Cair (KVC) menggunakan pelarut heksana, etil asetat, dan etanol secara berurutan. 3. Bakteri yang digunakan untuk pengujian aktivitas antibakteri fraksi daun mimba adalah Staphylococcus epidermidis, Bacillus cereus, dan Shigella flexneri serta dilakukan penentuan Konsentrasi Hambat Minimum (KHM) terhadap fraksi teraktif antibakterinya. 4. Uji potensi fraksi teraktif antibakteri daun mimba dilakukan dengan mencari nilai banding antara fraksi tersebut terhadap amoksisilin dan kloramfenikol. 3. Rumusan Masalah Berdasarkan batasan masalah di atas, maka perumusan masalah dalam penelitian ini adalah sebagai berikut : 1. Apakah fraksi daun mimba hasil pemisahan KVC mempunyai aktivitas antibakteri terhadap Staphylococcus epidermidis, Bacillus cereus, dan Shigella flexneri dan fraksi mana yang teraktif antibakteri dilihat dari parameter DDH (Diameter Daerah Hambat)? 2. Bagaimana potensi antibakteri fraksi teraktif antibakteri daun mimba dibandingkan dengan amoksisilin dan kloramfenikol? 3. Komponen kimia apa sajakah yang terkandung dalam fraksi teraktif antibakteri daun mimba? commit to user Ý®»¿¬» ÐÜÚ º·´»- ©·¬¸±«¬ ¬¸·- ³»--¿¹» ¾§ °«®½¸¿-·²¹ ²±ª¿ÐÜÚ °®·²¬»® ø¸¬¬°æññ©©©ò²±ª¿°¼ºò½±³÷ perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id 5 C. Tujuan Penelitian 1. Mengetahui aktivitas antibakteri fraksi daun mimba hasil pemisahan KVC dan mengetahui fraksi teraktif daun mimba terhadap Staphylococcus epidermidis, Bacillus cereus, dan Shigella flexneri. 2. Mengetahui potensi antibakteri fraksi teraktif daun mimba dibandingkan dengan amoksisilin dan kloramfenikol. 3. Mengetahui komponen kimia fraksi teraktif daun mimba. D. Manfaat Penelitian 1. Segi praktis, dapat memberikan informasi ilmiah untuk pengembangan obat tradisional terutama tentang khasiat daun mimba sebagai antibakteri. 2. Segi teoritis, diharapkan dapat bermanfaat untuk ilmu pengetahuan, yaitu memberikan informasi tentang analisis kulitatif tentang aktivitas antibakteri fraksi teraktif daun mimba terhadap bakteri Staphylococcus epidermidis, Bacillus cereus, dan Shigella flexneri dan komponen kimia fraksi teraktifnya. commit to user Ý®»¿¬» ÐÜÚ º·´»- ©·¬¸±«¬ ¬¸·- ³»--¿¹» ¾§ °«®½¸¿-·²¹ ²±ª¿ÐÜÚ °®·²¬»® ø¸¬¬°æññ©©©ò²±ª¿°¼ºò½±³÷ perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id BAB II LANDASAN TEORI A. Tinjauan Pustaka 1. Mimba (Azadirachta Indica A. Juss) Mimba (Azadirachta Indica A. Juss) adalah tanaman asli dari India yang saat ini telah banyak dibudidayakan di Indonesia, tanaman ini memiliki banyak manfaat bagi manusia (Kardinan dan Agus, 2003). Mimba tumbuh di daerah panas, di ketinggian 1-700 meter dari permukaan laut dan tahan tekanan air (Kardinan, 2000). Tanaman mimba dapat dilihat pada Gambar 1. Gambar 1. Tanaman Mimba a. Klasifikasi tanaman Divisio : Spermatophyta Subdivisio : Angiospermae Kelas : Dycotiledonae Ordo : Rutales Family : Meliaceae Genus : Azadirachta Jenis : Azadirachta indica A. Juss (sinonim : Melia azadirachta) (Rukmana dan Oesman, 2002) commit to user 6 Ý®»¿¬» ÐÜÚ º·´»- ©·¬¸±«¬ ¬¸·- ³»--¿¹» ¾§ °«®½¸¿-·²¹ ²±ª¿ÐÜÚ °®·²¬»® ø¸¬¬°æññ©©©ò²±ª¿°¼ºò½±³÷ perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id 7 b. Deskripsi tanaman Mimba merupakan pohon dengan ketinggian 10-15 m. Batang tegak, berkayu, berbentuk bulat, permukaan kasar, percabangan simpoidal dan berwarna cokelat. Daun majemuk, letak berhadapan, berbentuk lonjong, tepi bergerigi, ujing lancip, pangkal meruncing, pertulangan menyirip, panjang 5-7 cm, lebar 3-4 cm, tangkai daun panjangnya 8-20 cm dan berwarna hijau. Bunga majemuk, berkelamin dua, letak di ujung cabang, tangkai silindris, panjang 815 cm. Kelopak berwarna hijau. Mahkota halus dan berwarna putih. Benang sari silindris dan berwarna putih kekuningan. Putik lonjong dan berwarna cokelat muda. Buah bulat telur dan berwarna hijau. Biji bulat, diameter sekitar 1 cm, dan berwarna putih. Akar tunggang. Mimba tumbuh baik didaerah panas, di ketinggian 1-700 m, dan tahan cekaman ait. Di daerah yang banyak hujan bagian vegetatif sangat subur, tapi sulit untuk menghasilkan biji (generatif). Perbanyakan melalui biji (Kardinan, 2000). c. Manfaat Tanaman Tanaman mimba mempunyai beberapa kegunaan antara lain digunakan untuk pembangkit selera makan, obat disentri, borok, malaria. Minyaknya digunakan untuk mengobati eksema, kepala kotor, kudis, dan kulitnya untuk mengatasi gangguan lambung (Mardisiswojo dan Rajakmangunsudarso, 1985). Sudarsono dkk. (2002) mengatakan bahwa daun mimba digunakan untuk penambah nafsu makan, menanggulangi disentri, borok, malaria dan antibakteri. Beberapa penelitian lain juga menyebutkan bahwa daun mimba dapat menurunkan gula darah, menyembuhkan penyakit kulit (Csurhes, 2008), memiliki efek gastro protektif pada mukosa lambung terhadap ulkus peptikum (Ofusori dkk., 2008), menurunkan total kolesterol dalam darah, LDL dan VLDL-kolesterol, trigliserid dan total lipid dalam serum (Chattopadhyay dkk., 2005). d. Kandungan Kimia Tanaman Dari beberapa penelitian daun mimba diketahui mengandung senyawa golongan terpenoid, flavonoid, alkaloid, saponin, tanin (Biu dkk., 2009), asam lemak (Khan dkk., 2010), steroid dan triterpenoid (Aslam dkk., 2009). commit to user Ý®»¿¬» ÐÜÚ º·´»- ©·¬¸±«¬ ¬¸·- ³»--¿¹» ¾§ °«®½¸¿-·²¹ ²±ª¿ÐÜÚ °®·²¬»® ø¸¬¬°æññ©©©ò²±ª¿°¼ºò½±³÷ perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id 8 1. Terpenoid Terpenoid berasal dari molekul isoprene (CH2=C(CH 3)-CH=CH 2 dan kerangka karbonnya dibangun oleh penyambungan dua atau lebih satuan C 5 ini. Terpenoid ini dibagi menjadi beberapa macam, yaitu monoterpena dan siskuiterpena (C 10 dan C 15) yang mudah menguap dan biasanya menjadi komponen utama penyusun minyak atsiri, triterpenoid dan steroid (C30) yang tidak mudah menguap, dan pigmen karotenoid (C 40). Mekanisme terpenoid sebagai antibakteri tidak begitu jelas, tetapi kemungkinan berhubungan dengan pengrusakan membran sel oleh senyawa lipofilik (Cowan, 2000). Senyawa terpenoid yang berhasil diisolasi dari bagian daun tanaman mimba antara lain azadirachtin A, B, D, H, I, desacetylnimbin, azadiradione, nimbin, salanin, azadirone, nimbolin, nimbinene, dan nimbolide (Shadeghian, 2007). Senyawa-senyawa tersebut masuk dalam golongan triterpenoid. Senyawa triterpenoid lain yang berhasil diisolasi dari biji mimba dan kulit batang mimba yaitu nimonol, epoxyazadirodione, azadirechterpinol A, azaditerpinol B (Moslem dan El-Kholie, 2009; Trag dkk., 2005). Minyak atsiri bunga mimba juga diketahui mengandung sejumlah -candinen, copaen, -cububen, dan fitol (Aromdee dan Sriubolmas, 2005). Senyawa steroid yang pernah diisolasi dari kulit batang mimba adalah stigmas-5,7dien- -ol- -D-glukosida (Trag dkk., 2005), selain itu Govind (2011) juga -sitosterol. Terpenoid dapat menghambat aktivitas enzim autolisin dengan cara membentuk interaksi yang kuat dengan sisi aktif dari residu enzim autolisin (Daisy dkk., 2008). 2. Flavonoid Flavonoid merupakan golongan senyawa yang digambarkan sebagai deretan senyawa C6-C 3-C6, yang artinya kerangka karbonnya terdiri atas dua gugus C 6 (cincin benzene tersubstitusi) disambungkan oleh rantai alifatik tiga-karbon. Sesuai dengan struktur kimianya yang termasuk commit to user Ý®»¿¬» ÐÜÚ º·´»- ©·¬¸±«¬ ¬¸·- ³»--¿¹» ¾§ °«®½¸¿-·²¹ ²±ª¿ÐÜÚ °®·²¬»® ø¸¬¬°æññ©©©ò²±ª¿°¼ºò½±³÷ perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id 9 flavonoid yaitu flavonol, flavon, flavanon, katekin, antosianidin dan kalkon (Harborne, 1984). Pengelompokan flavonoid dibedakan berdasarkan cincin heterosiklik-oksigen tambahan dan gugus hidroksil yang tersebar menurut pola yang berlainan pada rantai C3.(Robinson, 1995). Bunga tanaman mimba dilaporkan mengandung senyawa flavanon terprenilasi antara lain 5,4 -dihydroxy-7-metoxy-8-prenylflavanone, 5,7,4 trihydroxy-3,8 -diprenylflavanone, 5,7,4 -trihydroxy-8-prenylflavanone, 5,7,4 -trihydroxy-3 -5 -diprenylflavanone (Nakahara dkk., 2003). Tanaman mimba juga disebutkan mengandung flavonoid rutin dan quersetin yang mempunyai aktivitas antiborok dan antiinflamatori (Dorababu dkk., 2006). Aktivitas antibakteri flavonoid dimungkinkan karena kemampuan flavonoid membentuk kompleks dengan ekstraseluler, protein terlarut dan dinding sel bakteri dan semakin lipofilik suatu flavonoid, berarti semakin merusak membran mikroba (Cowan, 2000). 3. Alkaloid Alkaloid merupakan golongan senyawa aktif tumbuhan yang mengandung atom nitrogen yang sering kali terdapat dalam cincin heterosiklik. Penggolongan alkaloid didasarkan pada sistem cincinnya, misalnya piridina, piperidina, indol, isokuinolina, dan tropana. Senyawa ini biasanya terdapat dalam tumbuhan sebagai garam berbagai senyawa organik dan sering diisolasi dalam bentuk garamnya dengan asam hidrokloroda dan asam sulfat (Robinson, 1995). Di dalam penelitian Muhtadi (2008) tanaman mimba dilaporkan mengandung senyawa alkaloid jenis -karbolin, antara lain 4-metoksi-1vinil-karbolin dan 4,8-dimetoksi-1-vinil karbolin. Mekanisme alkaloid menjadi senyawa antibakteri berhubungan dengan tingginya senyawa aromatik quarterner dari alkaloid. commit to user Ý®»¿¬» ÐÜÚ º·´»- ©·¬¸±«¬ ¬¸·- ³»--¿¹» ¾§ °«®½¸¿-·²¹ ²±ª¿ÐÜÚ °®·²¬»® ø¸¬¬°æññ©©©ò²±ª¿°¼ºò½±³÷ perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id 10 4. Saponin Saponin merupakan glikosida terpenoid dan sterol (Robinson, 1995), terdiri dari gugus gula yang berikatan dengan aglikon atau sapogenin. Saponin mempunyai sifat polar, jadi saponin dapat larut dalam air dan etanol, tetapi tidak larut dalam eter. Saponin dapat berfungsi sebagai antibakteri karena adanya gugus monosakarida dan turunannya (Cheeke, 2000). 5. Tanin Tanin merupakan golongan senyawa aktif tumbuhan yang bersifat fenol, artinya mempunyai rasa sepat dan mempunyai kemampuan menyamak kulit. Tanin bisa dijumpai dalam jumlah banyak pada tumbuhan berpembuluh, dalam angiospermae terdapat khusus dalam jaringan kayu (Harborne, 1984). Secara kimia senyawa tanin dibagi menjadi 2 golongan utama yaitu tanin terkondensasi yang biasanya terdapat dalam paku-pakuan dan gimnospermae, serta tersebar luas dalam angiospermae, khususnya pada tumbuhan berkayu. Jenis tanin yang kedua adalah tanin terhidrolisis yang biasa ditemukan pada tumbuhan berkeping dua. Tanin bersifat antibakteri melalui aktivitas molekulnya yaitu membentuk kompleks dengan protein melalui ikatan hydrogen dan ikatan hidrofobik (Cowan, 2000). 6. Asam lemak Asam lemak yang ditemukan di alam, biasanya merupakan monokarboksilat dengan rantai tidak bercabang dan mempunyai jumlah atom karbon genap (Winarno, 2002). Asam lemak terdapat dua golongan yaitu asam lemak jenuh dan asam lemak tidak jenuh sederhana dengan panjang rantai C16 atau C18 (Harborne, 1984). Asam lemak tidak jenuh berbeda dalam jumlah dan posisi ikatan rangkapnya, serta dalam bentuk molekul keseluruhannya dengan asam lemak jenuh (Winarno, 2002). Biji mimba dilaporkan mengandung senyawa-senyawa asam lemak antara lain asam palmitat, asam stearat, asam oleat, etil oleat, asam commit to user Ý®»¿¬» ÐÜÚ º·´»- ©·¬¸±«¬ ¬¸·- ³»--¿¹» ¾§ °«®½¸¿-·²¹ ²±ª¿ÐÜÚ °®·²¬»® ø¸¬¬°æññ©©©ò²±ª¿°¼ºò½±³÷ perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id 11 oktadekanoat, etil ester oktadekanoat, ester dioktil heksadioat (Suirta dkk., 2007). Penelitian lain juga menyebutkan bahwa kulit buah mimba mengandung senyawa etil palmitat, etil oleat, metil 14-metil pentadekanoat (Siddiqui dkk., 2003). Kemampuan asam lemak sebagai antibakteri dikarenakan asam lemak bersifat hidrofobik, sehingga dapat menyebabkan kerusakan struktur membran sel bakteri dan membran menjadi permeabel, kemudian akan menyebabkan kerusakan membran sitoplasma, sehingga terjadi koagulasi pada nukleoid (Nalina dan Rahim, 2007; Hornitzky, 2003). 2. Bakteri dan Klasifikasi Bakteri Uji Bakteri merupakan protista tingkat rendah dan banyak tersebar di udara, air, tanah, kulit, dan lain-lain. Suatu sifat taksonomi utama bakteri adalah reaksi pewarnaan gram. Bakteri dibagi menjadi dua golongan yaitu bakteri gram positif dan bakteri gram negatif. Bakteri gram positif adalah bakteri yang tahan terhadap alkohol tetapi dapat mengikat warna pertama pertama (kristal violet) sehingga berwarna ungu. Sedangkan bakteri gram negatif adalah bakteri yang tidak tahan terhadap alkohol sehingga warna pertama yang diberikan luntur dan akan mengikat warna kedua sehingga bakteri berwarna merah (Bonang dkk., 1982). Dalam bekerja, bakteri meningkatkan kemampuannya untuk bertahan dan meningkatkan kemungkinan penyebaran. Bagian di dalam tubuh, dimana bakteri harus menempel atau melekat pada sel inang biasanya adalah sel epitel. Setelah bakteri mempunyai kedudukan yang tetap untuk menginfeksi, mereka mulai memperbanyak diri dan menyebar secara langsung melalui jaringan atau lewat sistem limfatik ke aliran darah. Infeksi sementara atau menetap (Jawetz dkk., 2005). a. Sthapylococcus epidermidis Klasifikasi Kingdom : Bacteria Phylum : Firmicutes Class : Bacilli commit to user Ý®»¿¬» ÐÜÚ º·´»- ©·¬¸±«¬ ¬¸·- ³»--¿¹» ¾§ °«®½¸¿-·²¹ ²±ª¿ÐÜÚ °®·²¬»® ø¸¬¬°æññ©©©ò²±ª¿°¼ºò½±³÷ perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id 12 Order : Bacillales Family : Staphylococcaceae Genus : Staphylococcus Spesies : Staphylococcus epidermidis (Salle, 1961) Staphylococcus epidermidis merupakan bakteri gram positif yang berbentuk bola atau kokus berkelompok yang tidak teratur dan bersifat fakultatif aerobik. Bakteri ini mempunyai diameter 0,8membentuk spora,tidak bergerak dan koloni berwarna putih. Staphylococcus epidermidis terdapat pada kulit, selapu lendir, bisul, jerawat, dan luka. Bakteri ini dapat menimbulkan penyakit melalui kemampuannya berkembang biak dan menyebar luas dalam jaringan (Jawetz dkk., 2005). Secara klinis, bakteri ini menyerang orang-orang yang rentan atau imunitas rendah, seperti penderita AIDS, paseien yang kritis, pengguna obatobat terlarang, bayi yang baru lahir, dan pasien rumah sakit yang dirawat dalam waktu lama. Gambar bakteri Staphylococcus epidermidis ditunjukkan pada Gambar 2. Gambar 2. Staphylococcus epidermidis b. Bacillus cereus Klasifikasi Kingdom : Bacteria Phylum : Firmicutes Class : Bacilli Order : Bacillales commit to user Ý®»¿¬» ÐÜÚ º·´»- ©·¬¸±«¬ ¬¸·- ³»--¿¹» ¾§ °«®½¸¿-·²¹ ²±ª¿ÐÜÚ °®·²¬»® ø¸¬¬°æññ©©©ò²±ª¿°¼ºò½±³÷ perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id 13 Family : Bacillaceae Genus : Bacillus Species : Bacillus cereus (Salle, 1961) Bacillus cereus merupakan bakteri yang berbentuk batang besar, tergolong dalam gram positif, dan bersifat fakultatif aerob. Kebanyakan anggota spesies ini adalah organisme saprofit yang lazim terdapat dalam tanah, air, udara, dan tumbuh-tumbuhan. Bakteri ini menggunakan sumber nitrogen dan karbon sederhana untuk energi dan pertumbuhannya. Bacillus cereus dapat tumbuh pada makanan dan menghasilkan enterotoksin yang menyebabkan keracunan makanan. Keberadaan B. Cereus dalam jumlah besar (lebih dari 106 organisme/g) dalam makanan merupakan indikasi adanya pertumbuhan dan pembelahan sel bakteri secara aktif dan berpotensi membahayakan kesehatan. Organisme ini kadang-kadang dapat menimbulkan penyakit pada orang dengan fungsi imun yang terganggu (misalnya meningitis, endokarditis, endoftalmitis, konjungtivis, atau gastroenteritis akut). Gejala keracunan bahan makanan yang tercemar oleh bakteri Bacillus cereus dibedakan menjadi dua yaitu mual disertai muntah dan kejang perut yang hebat disertai diare. Spora bakteri ini resisten terhadap perubahan lingkungan, tahan terhadap panas kering dan desinfektan kimia tertentu dalam waktu yang cukup lama dan dapat bertahan selama bertahun-tahun pada tanah yang kering (Jawetz dkk., 2005). Gambar bakteri Bacillus cereus ditunjukkan pada Gambar 5. Gambar 3. Bacillus cereus commit to user Ý®»¿¬» ÐÜÚ º·´»- ©·¬¸±«¬ ¬¸·- ³»--¿¹» ¾§ °«®½¸¿-·²¹ ²±ª¿ÐÜÚ °®·²¬»® ø¸¬¬°æññ©©©ò²±ª¿°¼ºò½±³÷ perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id 14 c. Shigella flexneri Klasifikasi Kingdom : Bacteria Phylum : Proteobacteria Class : Gamma Proteobacteria Order : Enterobacteriales Family : Enterobacteriaceae Genus : Shigell Species : Shigella flexneri (Salle, 1961) Shigella flexneri merupakan bakteri gram negatif, berbentuk batang dan bersifat fakultatif aerobik. Genus Shigella dapat tumbuh pada suhu 37°C dan sensitif terhadap panas dan tahan terhadap konsentrasi garam 5-6%. Koloni shigella cembung, bundar, transparan dengan diameter sampai kira-kira 2 mm dalam 24 jam (Jawetz dkk., 2005). Habitat bakteri ini adalah terbatas pada saluran pencernaan manusia dan primata lainnya dimana sejumlah spesies menimbulkan shigellosis atau sering disebut disentri basiler. Disentri basiler merupakan salah satu dari berbagai gangguan yang ditandai dengan peradangan usus, terutama kolon dan disertai nyeri perut, tenesmus dan buang air besar yang sering mengandung darah dan lendir (Plezcar dkk., 1986). Shigella flexneri dapat membentuk enterotoksin yang dapat diresorpsi ke dalam darah dan menimbulkan gejala hebat seperti demam tinggi, nyeri kepala, dan kejang-kejang. Genus Shigella mempunyai susunan antigen yang kompleks. Terdapat banyak tumpang tindih dalam sifat serologic berbagai spesies dan sebagian besar kuman ini mempunyai antigen O yang juga dimiliki oleh kuman enteric lainnya. Antigen somatik O dari Shigella adalah lipopolisakarida. Gambar bakteri Shigella flexneri ditunjukkan pada gambar 4. commit to user Ý®»¿¬» ÐÜÚ º·´»- ©·¬¸±«¬ ¬¸·- ³»--¿¹» ¾§ °«®½¸¿-·²¹ ²±ª¿ÐÜÚ °®·²¬»® ø¸¬¬°æññ©©©ò²±ª¿°¼ºò½±³÷ perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id 15 Gambar 4. Shigella flexneri 3. Metode Pengujian Aktivitas Antibakteri Antibakteri adalah zat yang membunuh atau menekan pertumbuhan atau reproduksi bakteri (Dorland, 2002). Zat antibakteri dapat diperoleh dari hasil fermentasi, sintetik dan dapat diperoleh dari hasil isolasi tanaman. Metode pengujian aktivitas antibakteri yang biasa dilakukan adalah metode difusi agar, dilusi dan turbidimetri. Metode difusi agar dibagi menjadi dua bagian yaitu metode perforasi (lubang) dan metode gores silang. a. Metode lubang (perforasi) Bakteri uji yang umurnya 18-24 jam disuspensikan ke dalam media agar pada suhu sekitar 45°C. Suspensi bakteri dituangkan ke dalam cawan petri steril. Setelah agar memadat, dibuat lubang-lubang dengan diameter 6-8 mm. Kedalam lubang tersebut dimasukkan larutan zat yang akan diuji aktivitasnya udian diinkubasikan pada suhu 37°C selama 18-24 jam. Aktivitas antibakteri dapat dilihat dari daerah bening yang mengelilingi lubang perforasi. b. Metode gores silang Zat yang akan diuji diserapkan kedalam kertas saring dengan cara meneteskan pada cakram kertas kosong larutan antibakteri sejumlah volume tertentu dengan kadar tertentu juga. Kertas saring diletakkan diatas permukaan agar padat, kemudian digores dengan suspensi bakteri 90% pada agar mengenai/melalui kertas saringnya, diinkubasi selama 18-24 jam pada suhu 37°C. Aktivitas antibakteri dapat dilihat dari daerah bening yang tidak ditumbuhi bakteri di dekat kertas saring. commit to user Ý®»¿¬» ÐÜÚ º·´»- ©·¬¸±«¬ ¬¸·- ³»--¿¹» ¾§ °«®½¸¿-·²¹ ²±ª¿ÐÜÚ °®·²¬»® ø¸¬¬°æññ©©©ò²±ª¿°¼ºò½±³÷ perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id 16 4. Antibiotik Beberapa infeksi disebabkan oleh bakteri yang secara umum dianggap patogen tidak menampakkan gejala (asimptomatik). Suatu penyakit terjadi jika bakteri atau reaksi imunologi yang ditimbulkannya menyebabkan suatu bahaya bagi seseorang. Maka untuk menghambat daya infeksi agar tidak berkelanjutan lebih tinggi, bahkan kematian, perlu adanya antibakteri atau antibiotik sebagai obatnya (Jawetz dkk., 2005). Antibiotik adalah zat-zat kimia yang dihasilkan oleh fungi dan bakteri yang memiliki khasiat mematikan atau menghambat pertumbuhan bakteri, sedangkan toksisitasnya bagi manusia relatif kecil. Antibiotik dapat dibuat dengan cara fermentasi, semi sintetis dan sintesis. Penggunaan antibiotika khususnya berkaitan dengan penyakit infeksi. Amo -laktam dengan spektrum luas, digunakan untuk pengobatan infeksi pada saluran nafas, saluran empedu dan saluran seni, gonorhoe, gastroenteritis, meningitis dan infeksi karena Salmonella sp., seperti demam tipoid (Siswandono dan Soekardjo, 2000). Amoksisilin mempunyai spektrum antibiotik serupa dengan ampisilin. Beberapa keuntungan amoksisilin dibanding ampisilin adalah absorbsi obat dalam saluran cerna lebih sempurna, sehingga kadar darah dalam plasma dan saluran seni lebih tinggi. Efek terhadap Bacillus dysentery amoksisilin lebih rendah dibanding ampisilin karena lebih banyak obat yang diabsorbsi oleh saluran cerna (Siswandono dan Soekardjo, 2000). Amoksisilin dapat juga menyebabkan gangguan-gangguan usus dan kulit tetapi lebih jarang dibandingkan ampisilin (Tjay dan Rahardja, 2002). Struktur amoksisilin ditunjukkan pada gambar 5. NH2 H NH O HO N O COOH Gambar 5. Struktur kimia amoksisilin commit to user Ý®»¿¬» ÐÜÚ º·´»- ©·¬¸±«¬ ¬¸·- ³»--¿¹» ¾§ °«®½¸¿-·²¹ ²±ª¿ÐÜÚ °®·²¬»® ø¸¬¬°æññ©©©ò²±ª¿°¼ºò½±³÷ perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id 17 Amoksisilin merupakan turunan dari penisilin semi sintetik dan stabil dalam suasana asam lambung. Amoksisilin diabsorpsi dengan cepat dan baik pada saluran pencernaan, tidak tergantung adanya makanan. Amoksisilin terutama diekskresikan dalam bentuk tidak berubah di dalam urin. Ekskresi Amoksisilin dihambat saat pemberian bersamaan dengan probenesid sehingga memperpanjang efek terapi (Siswandono dan Soekardjo, 2000). Kloramfenikol adalah antibiotik yang dihasilkan oleh Steptomyces venezuelae (Perlman, 1970). Antibiotik ini mempunyai spektrum kerja seperti tetrasiklin namun sekarang sudah jarang dipakai. Indikasi kloramfenikol untuk mengobati tifus, paratifus dan menginitis (Mutschler, 1991). Kloramfenikol termasuk antibiotik spesifik untuk bakteri gram negatif dan juga masih sensitif terhadap golongan anaerob. Golongan bakteri yang sensitif terhadap kloramfenikol adalah Streptococcus, Proteus, Klebsiella, Neiseria. OH NO2 C H O H C NH C CH2OH Cl CH Cl Gambar 6. Struktur kimia kloramfenikol Kloramfenikol merupakan penghambat sintesis protein yang kuat pada mikroorganisme. Obat ini menghalangi pelekatan asam amino pada rantai peptide yang baru timbul pada unit 50S pada ribosom, dengan mengganggu daya kerja peptidil transferase. Kloramfenikol pada dasarnya bersifat bakteriostatik, spektrum, dosis serta kadarnya dalam darah mirip dengan tetrasiklin. Resistensi kloramfenikol merupakan akibat dari perusakan obat oleh suatu enzim yang dikendalikan oleh plasmid (Jawetz dkk., 2005). Kloramfenikol kadang menyebabkan gangguan saluran pencernaan, mual, muntah. Efek toksin lain yang jarang terjadi adalah terjadi reaksi hipersensitivitas dan penglihatan yang kabur. Pada pemberian pada jangka waktu yang lama, kloramfenikol menekan perkembangan sel sumsum tulang dan dapat menyebabkan anemia aplastik yang bersifat ireversibel dan biasanya fatal. commit to user Ý®»¿¬» ÐÜÚ º·´»- ©·¬¸±«¬ ¬¸·- ³»--¿¹» ¾§ °«®½¸¿-·²¹ ²±ª¿ÐÜÚ °®·²¬»® ø¸¬¬°æññ©©©ò²±ª¿°¼ºò½±³÷ perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id 18 Pemberian kloramfenikol pada bayi dapat menyebabkan gray sindrome karena mekanisme normal detoksifikasi belum terbentuk (Jawetz dkk., 2005) Antibakteri obat atau senyawa kimia yang digunakan untuk membasmi bakteri, khususnya bakteri yang merugikan manusia. Berdasarkan sifat toksisitas selektif, ada antibakteri yang bersifat menghambat pertumbuhan bakteri, dikenal aktivitas bakteriostatik. Kadar minimal yang diperlukan untuk menghambat pertumbuhan bakteri atau membunuhnya, masing-masing dikenal dengan Kadar Hambat Minimal (KHM) dan Kadar Bunuh Minimal (KBM). Antibakteri tertentu aktivitasnya dapat meningkatkan kemampuan bakterisida. Aktivitas antibakteri dibagi dalam lima kelompok : a. Antibakteri yang menghambat metabolisme sel bakteri Pada mekanisme ini diperoleh efek bakteriostatik. Antibakteri yang termasuk dalam golongan ini adalah sulfonamide, trimetoprim, asam paminosalisilat dan sulfon. Kerja antibakteri ini adalah menghambat pembentukan asam folat, bakteri membutuhkan asam folat untuk kelangsungan hidupnya dan bakteri memperoleh asam folat dengan mensintesis sendiri dari asam para amino benzoat (PABA). Sulfonamid dan sulfon bekerja bersaing dengan PABA dalam pembentukan asam folat. Sedang trimetoprim bekerja dengan menghambat enzim dihidrofolat reduktase (Setiabudy dan Gan, 1995). b. Antibakteri yang menghambat sintesis dinding sel bakteri Dinding sel bakteri terdiri dari peptidoglikan, sintesis peptidoglikan akan dihalangi oleh adanya antibiotik seperti penisilin, sefalosporin, basitrasin, vankomisin, sikloserin. Sikloserin akan menghambat reaksi paling dini dalam proses sintesis dinding sel sedang yang lainnya menghambat di akhir sintesis peptidoglikan, sehingga mengakibatkan dinding sel menjadi tidak sempurna dan tidak mempertahankan pertumbuhan sel secara normal, sehingga tekanan osmotik dalam sel bakteri lebih tinggi daripada tekanan di luar sel maka kerusakan dinding sel bakteri akan menyebabkan lisis, yang merupakan dasar efek bakterisidal pada bakteri yang peka (Setiabudy dan Gan, 1995). commit to user Ý®»¿¬» ÐÜÚ º·´»- ©·¬¸±«¬ ¬¸·- ³»--¿¹» ¾§ °«®½¸¿-·²¹ ²±ª¿ÐÜÚ °®·²¬»® ø¸¬¬°æññ©©©ò²±ª¿°¼ºò½±³÷ perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id 19 c. Antibakteri yang mengganggu membran sel bakteri Sitoplasma dibatasi oleh membran sitoplasma yang merupakan penghalang dengan permeabilitas yang selektif. Membran sitoplasma akan mempertahankan bahan-bahan tertentu di dalam sel serta mengatur aliran keluar-masuknya bahanbahan lain. Jika terjadi kerusakan pada membran ini akan mengakibatkan terhambatnya pertumbuhan sel atau matinya sel (Pelczar dkk., 1986). d. Antibakteri yang menghambat sintesis protein sel bakteri Kehidupan sel bakteri tergantung pada terpeliharanya molekul-molekul protein dan asam nukleat dalam keadaan alamiah. Jika kondisi atau substansi yang dapat mengakibatkan terdenaturasinya protein dan asam nukleat dapat merusak sel tanpa dapat diperbaiki kembali. Suhu tinggi dan konsentrasi pekat beberapa zat kimia dapat mengakibatkan koagulasi (denaturasi) yang bersifat irreversible terhadap komponen-komponen seluler yang vital ini (Pelczar dkk.,1986). e. Antibakteri yang menghambat sintesis atau merusak asam nukleat sel bakteri Protein, DNA, dan RNA berperan penting dalam proses kehidupan normal sel bakteri. Apabila terjadi gangguan pada pembentukan atau pada fungsi zatzat tersebut dapat mengakibatkan kerusakan total pada sel (Pelczar dkk.,1986). 5. Konsentrasi Hambat Minimum (KHM) dan Uji Banding Konsentrasi Hambat Minimum (KHM) adalah konsentrasi terendah bahan antimikroba yang masih dapat menghambat partumbuhan mikroba. KHM merupakan petunjuk konsentrasi antibiotik yang mampu menghambat pertumbuhan mikroorganisme dan juga memberikan petunjuk mengenai dosis yang diperlukan dalam pengobatan penyakit. Umumnya batas keamanan penggunaan antibiotik untuk pengobatan penyakit adalah sepuluh kali dosis KHM (Lay, 1994). Nilai banding merupakan kesetaraan aktivitas antibakteri ekstrak yang diuji dengan antibakteri sintetik. Uji banding bertujuan untuk mengetahui sejauh mana daya aktivitas antibakteri sampel bila dibandingkan dengan suatu zat commit to user Ý®»¿¬» ÐÜÚ º·´»- ©·¬¸±«¬ ¬¸·- ³»--¿¹» ¾§ °«®½¸¿-·²¹ ²±ª¿ÐÜÚ °®·²¬»® ø¸¬¬°æññ©©©ò²±ª¿°¼ºò½±³÷ perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id 20 pembanding. Uji banding suatu zat antibakteri dilakukan dengan cara membuat suatu grafik atau kurva standar dari zat pembanding, dimana konsentrasi diplotkan terhadap sumbu-x dan diameter hambatan diplotkan terhadap sumbu-y. berdasarkan kurva tersebut dapat diperoleh konsentrasi sampel pada diameter hambatan yang dihasilkan dan nilai diameter hambatan sampel pada konsentrasi yang ditetapkan, sehingga dapat ditetapkan nilai uji banding sampel terhadap zat pembanding, yaitu dengan menggunakan rumus sebagai berikut : Nilai uji banding Konsentrasi sampel dari kurva x 100 % Konsentras i sampel sebenarnya 6. Ekstraksi Ekstraksi dilakukan untuk mengisolasi komponen senyawa kimia yang terdapat dalam suatu tumbuhan. Suirta dkk. (2007) melakukan ekstraksi dengan metode maserasi serbuk biji mimba menggunakan pelarut etanol teknis sampai semua komponen habis terekstraksi. Selanjutnya ekstrak etanol yang diperoleh diuapkan pelarutnya dengan vacuum rotary evaporator sampai diperoleh ekstrak kental etanol. Sokletasi terhadap daun mimba pernah dilakukan Biu dkk. (2009) menggunakan air suling pada suhu 60ºC selama 8 jam. Ekstrak kemudian diletakkan pada nampan aluminium dan disimpan pada suhu kamar (27ºC). 7. Skrining Fitokimia Tujuan penapisan fitokimia sendiri adalah untuk mengetahui kandungan senyawa suatu tumbuhan yang berguna untuk pengobatan (Fransworth, 1966). Senyawa-senyawa tersebut adalah senyawa organik, oleh karena itu penapisan fitokimia biasanya dilakukan terhadap alkaloid, flavonoid, antrakuinon, terpenoid, kumarin, saponin, tanin (polifenolat), dan sebagainya. Skrining fitokimia uji tabung telah dilakukan oleh Biu dkk. (2009) terhadap golongan senyawa terpenoid, flavonoid, alkaloid, saponin, tanin. Senyawa alkaloid dideteksi dengan menggunakan pereaksi Dragendorrf, terpenoid dengan pereaksi Liberman-Buchard, flavonoid dengan uji Pew, saponin dengan commit to user Ý®»¿¬» ÐÜÚ º·´»- ©·¬¸±«¬ ¬¸·- ³»--¿¹» ¾§ °«®½¸¿-·²¹ ²±ª¿ÐÜÚ °®·²¬»® ø¸¬¬°æññ©©©ò²±ª¿°¼ºò½±³÷ perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id 21 uji buih, dan tanin dideteksi dengan pereaksi FeCl 3. Analisis kandungan senyawa dalam fraksi ekstrak metanol kulit kayu mimba dilakukan dengan uji fitokimia KLT menggunakan plat KLT silika GF254. Deteksi senyawa dilakukan dengan reagen penampak noda yang spesifik untuk masing-masing senyawa,selain itu juga diamati pada lampu UV 254 nm dan 366 nm (Muhtadi, 2008). 8. Kromatografi Vakum Cair (KVC) Teknik pemisahan dengan KVC sering digunakan untuk memisahkan fraksi bersasarkan tingkat kepolarannya. Pemisahan ini biasanya dilakukan pada tahap awal pemisahan, misalnya pemisahan terhadap ekstrak mentah yang diperoleh langsung dari proses ekstraksi. Contoh penggunaan metode pemisahan KVC adalah pemisahan ekstrak metanol kulit kayu mimba menggunakan fase diam silika gel GF254. Caranya adalah ekstrak metanol kulit kayu mimba dilarutkan dalam aseton secukupnya dan diimpregnasi ke dalam siliki G 60 (30 mesh-70 mesh). Kemudian sampel yang telah diimpregnasi dimasukkan ke dalam kolom KVC dan dielusi dimulai dengan pelarut heksana-etil asetat dengan perbandingan 1:1, 4:6, 2:8, etil asetat 100%, dan metanol-etil asetat 8-2. Masing-masing fraksi ditampung sebanyak 150 mL, dan setelah dipekatkan, dilakukan analisa KLT menggunakan plat KLT silika GF254 untuk dilakukan penggabungan fraksi-fraksi yang memiliki kromatogram yang sama. Fraksi-fraksi yang diperoleh dilakukan pengujian aktivitas antiplasmodium (Muhtadi, 2008). 9. Kromatografi Gas-Spektrometer Massa(GC-MS) Kromatografi gas berfungsi sebagai alat pemisah berbagai campuran komponen dalam sampel sedangkan spektrofotometer massa berfungsi untuk mendeteksi masing-masing komponen yang telah dipisahkan pada kromatografi gas (Agusta, 2000). Aromdee dan Sriubolmas (2005) pernah menggunakan GC-MS untuk mengidentifikasi kandungan senyawa yang ada dalam minyak atsiri dari bunga mimba. Kolom yang digunakan memiliki panjang 30 m dengan diameter 2,5 mm commit to user Ý®»¿¬» ÐÜÚ º·´»- ©·¬¸±«¬ ¬¸·- ³»--¿¹» ¾§ °«®½¸¿-·²¹ ²±ª¿ÐÜÚ °®·²¬»® ø¸¬¬°æññ©©©ò²±ª¿°¼ºò½±³÷ perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id 22 adalah 40ºC dan setelah 5 menit suhu dinaikkan 3ºC/menit sampai suhu 250ºC dan pada suhu 250ºC ini suhu dipertahankan selama 10 menit. Gas pembawa yang digunakan adalah gas helium dengan tekanan 50 Kpa dan detektor MS dioperasikan pada 70 eV dengan temperatur sumber ion 250ºC. Sedangkan identifikasi komponennya dilakukan dengan membandingkan dengan standar library NIST dan nilai indeks retensi linear (Davies, 1990). B. Kerangka Pemikiran Tanaman mimba (Azadirachta indica A. Juss) merupakan salah satu tanaman obat tradisional. Daun mimba dapat dimanfaatkan untuk penambah nafsu makan, disentri, borok, malaria, dan antibakteri. Daun mimba diketahui mengandung senyawa golongan terpenoid, flavonoid, alkaloid, saponin, tanin, asam lemak, steroid dan triterpenoid. Dari berbagai penelitian dikatahui bahwa ekstrak daun mimba mampu menghambat bakteri yang menyebabkan infeksi pada kulit, mulut, saluran pencernaan, saluran pernafasan, dan saluran kencing. Berdasarkan hal tersebut diperkirakan fraksi daun mimba mampu menghambat pertumbuhan bakteri Staphylococcus epidermidis, Bacillus cereus, dan Shigella flexneri. Staphylococcus epidermidis merupakan bakteri gram positif yang menyebabkan penyakit melalui kemampuannya berkembang biak dan menyebar luas dalam jaringan. Bakteri ini terdapat pada kulit, selaput lendir, bisul, jerawat dan luka. Bacillus cereus merupakan bakteri gram positif yang dapat tumbuh pada makanan dan menghasilkan enterotoksin yang menyebabkan keracunan makanan. Bakteri ini kadang-kadang dapat menyebabkan penyakit meningitis, endokarditis, endoftalmitis, konjugtivis atau gastroenteritis akut. Shigella flexneri merupakan bakteri yang menyebabkan penyakit disentri basiler, yaitu suatu penyakit yang ditandai dengan peradangan usus, terutama kolon dan disertai nyeri perut, tenesmus dan buang air besar yang sering mengandung darah dan lendir. Senyawa-senyawa antibakteri dalam daun mimba dapat diisolasi dengan maserasi menggunakan pelarut etanol. Namun kandungan senyawa yang terdapat commit to user Ý®»¿¬» ÐÜÚ º·´»- ©·¬¸±«¬ ¬¸·- ³»--¿¹» ¾§ °«®½¸¿-·²¹ ²±ª¿ÐÜÚ °®·²¬»® ø¸¬¬°æññ©©©ò²±ª¿°¼ºò½±³÷ perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id 23 dalam ekstrak etanol masih sangat kompleks. Oleh karena itu perlu dilakukan pemisahan menggunakan pelarut dengan kepolaran yang semakin meningkat. Pemisahan dilakukan dengan metode kromatografi vakum cair dan pelarut yang digunakan berturtut-turut adalah heksana, etil asetat, dan etanol. Pemisahan tersebut menyebabkan senyawa-senyawa yang terdapat dalam ekstrak etanol terpisah ke dalam masing-masing fraksi hasil pemisahan dan mempengaruhi aktivitas antibakteri masing-masing fraksi. Dalam hal ini etil asetat merupakan pelarut semi polar sehingga dia dapat menarik senyawa-senyawa metabolit sekunder yang bersifat polar ataupun non polar, sehingga fraksi etil asetat diperkirakan memiliki aktivitas antibakteri yang paling tinggi. Berdasarkan sifat kepolaran senyawa-senyawa kimia yang terdapat dalam daun mimba diperkirakan bahwa fraksi teraktif antibakteri daun mimba mengandung senyawa tanin, terpenoid, steroid, dan asam lemak. Terpenoid, steroid, dan asam lemak merupakan senyawa-senyawa non polar, sehingga diperkirakan dapat tertarik oleh etil asetat yang bersifat semi polar. Tanin merupakan senyawa polar dan diketahui kandungannya dalam daun mimba cukup tinggi. Potensi antibakteri suatu bahan alam dapat diketahui dengan membandingkan aktivitas antibakterinya dengan antibiotik sintesis. Amoksisilin merupakan antibiotik sintetis yang berspektrum luas, sedangkan kloramfeniko l merupakan antibiotik sintesis yang digunakan untuk mengobati infeksi saluran pencernaan. Beberapa penelitian mengenai aktivitas antibakteri dari bahan alam disebutkan bahwa potensi antibakteri bahan alam lebih kecil dibandingkan dengan antibiotik sintesis. C. Hipotesis 1. Fraksi daun mimba hasil pemisahan dengan KVC mempunyai aktivitas antibakteri terhadap bakteri Staphylococcus epidermidis, Bacillus cereus, dan Shigella flexneri dan fraksi teraktif antibakteri daun mimba adalah fraksi etil asetat. commit to user Ý®»¿¬» ÐÜÚ º·´»- ©·¬¸±«¬ ¬¸·- ³»--¿¹» ¾§ °«®½¸¿-·²¹ ²±ª¿ÐÜÚ °®·²¬»® ø¸¬¬°æññ©©©ò²±ª¿°¼ºò½±³÷ perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id 24 2. Potensi antibakteri fraksi teraktif antibakteri daun mimba lebih kecil dibandingkan dengan amoksisilin dan kloramfenikol. 3. Komponen kimia yang terkandung dalam fraksi teraktif antibakteri daun mimba adalah tanin, terpenoid, steroid dan asam lemak. commit to user Ý®»¿¬» ÐÜÚ º·´»- ©·¬¸±«¬ ¬¸·- ³»--¿¹» ¾§ °«®½¸¿-·²¹ ²±ª¿ÐÜÚ °®·²¬»® ø¸¬¬°æññ©©©ò²±ª¿°¼ºò½±³÷ perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id BAB III METODOLOGI PENELITIAN A. Metode Penelitian Penelitian ini dilakukan dengan menggunakan metode eksperimental di laboratorium. Tahap pertama adalah pembuatan serbuk simplisia sampel. Serbuk simplisia sampel dimaserasi dengan menggunakan pelarut etanol. Ekstrak etanol kemudian dipisahkan dengan menggunakan kolom Kromatografi Vakum Cair (KVC) menggunakan eluen dengan tingkat kepolaran semakin meningkat, yaitu heksana, etil asetat dan etanol. Fraksi-fraksi yang diperoleh kemudian dilakukan pengujian aktivitas antibakteri. Fraksi yang memiliki aktivitas antibakteri yang paling tinggi kemudian dilakukan uji golongan senyawa dengan uji tabung lalu ditegaskan dengan Kromatografi Lapis Tipis (KLT) dan analisis data Gas ChromatographyMass Spectroscopy (GC-MS). Penentuan potensi aktivitas antibakteri fraksi teraktif antibakteri dilakukan dengan mencari nilai Konsentrasi Hambat Minimum (KHM) fraksi dan nilai banding fraksi terhadap amoksisilin dan kloramfenikol. B. Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Kimia Dasar FMIPA Universitas Sebelas Maret, Sub. Lab. Biologi Laboratorium Pusat Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Sebelas Maret Surakarta selama bulan November 2010 – Juli 2011. C. Alat dan Bahan 1. Alat Alat yang digunakan pada penelitian ini adalah blender, neraca timbang (Denver INST.TL603D dan Mettler Toledo AT400), vacuum rotary evaporator (Bibby RE 200B), statif dan klem, kolom Kromatografi Vacum Cair (KVC), penyaring Buchner, penangas air, lumping porselen, selang, heating mantle (J.P. SELETA., s.a), selang air, water pump, hotplate-stirer (RCT Basic Labortechnik), commit to user 25 Ý®»¿¬» ÐÜÚ º·´»- ©·¬¸±«¬ ¬¸·- ³»--¿¹» ¾§ °«®½¸¿-·²¹ ²±ª¿ÐÜÚ °®·²¬»® ø¸¬¬°æññ©©©ò²±ª¿°¼ºò½±³÷ perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id 26 oven (Memmert Model 500), autoklaf (Presoclave 75 P-Selecta), perforator diameter 6 mm, cawan petri, jarum ose, pembakar spirtus, spatula logam, laminar air flow (Minihelik II, dwyer), mikropipet 10- hand mixer (Vortex mixer VM 300), incubator (Hotcold M P-Selecta), bejana KLT, botol semprot, lemari asam, pipa kapiler, UV (PUV/BDH), GC-MS (QP2010S SHIMADZHU) dan peralatan gelas lainnya yang biasa digunakan dilaboratorium. 2. Bahan a. Bahan yang Diteliti Bahan yang diteliti adalah daun mimba yang berasal dari Klaten, Jawa Tengah. b. Bahan-Bahan yang Digunakan Bahan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain etanol 96%, heksana (redestilasi), etil asetat (redestilasi), aseton teknis, akuades, silika GF254, silika adsorb G 60, plat KLT silika GF254 (E. Merck), metanol (pro analisis), H 2SO 4 pekat, asam formiat (pro analisis), asam asetat glasial (pro analisis), serbuk AlCl3, HCL 2M, serbuk NaCl, toluen (pro analisis), dietil amin (pro analisis), serbuk Bismuth nitrat, serbuk KI, Iodin, dietil eter (pro analisis), serbuk SbCl3, kloroform (pro analisis), etanol absolute (pro analisis),serbuk FeCl3, serbuk KOH, benzena (pro analisis), Nutrien Agar (E. Merck), Amoksisilin, Kloramfenikol, Dimetil Sulfoksida (DMSO), dan buffer phospat pH 7 (Merck), dan alkohol 70%. c. Bakteri Uji Bakteri uji yang digunakan dalam penelitian ini adalah Staphylococcus epidermidis, Bacillus cereus, dan Shigella flexneri yang diperoleh dari Universitas Setiabudi, Surakarta. D. Prosedur Penelitian 1. Identifikasi Sampel Daun mimba diperoleh dari Klaten, Jawa Tengah. Daun mimba sebelumnya diidentifikasi di Bagian Biologi, Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada. commit to user Ý®»¿¬» ÐÜÚ º·´»- ©·¬¸±«¬ ¬¸·- ³»--¿¹» ¾§ °«®½¸¿-·²¹ ²±ª¿ÐÜÚ °®·²¬»® ø¸¬¬°æññ©©©ò²±ª¿°¼ºò½±³÷ perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id 27 2. Preparasi dan Ekstraksi Sampel Daun mimba yang sudah kering dihaluskan dengan blender untuk memberoleh simplisia serbuk. Kemudian serbuk daun mimnba dimaserasi dengan pelarut etanol selama 3x24 jam. Ekstrak etanol yang diperoleh selanjutnya diuapkan dengan vacuum rotary evaporator dengan suhu 50ºC sampai diperoleh ekstrak pekat etanol. 3. Pengujian Golongan Senyawa Ekstrak Etanol Skrining fitokimia terhadap ekstrak etanol dilakukan dengan uji tabung dan uji secara KLT. Skrining fitokimia dilakukan terhadap alkaloid, flavonoid, terpenoid dan steroid, antrakuinon, saponin, tanin(polifenolik), dan asam lemak. Metode skrining uji tabung yang digunakan berdasarkan Pedrosa (1978), Harborne (1987), dan Sofiana (2009). a. Alkaloid Ekstrak diambil sebanyak 20 mg, ditambah dengan HCL 2M, dipanaskan diatas penangas air sambil diaduk, kemudian didinginkan hingga suhu ruang. NaCl serbuk ditambahkan, diaduk, dan disaring, kemudian filtrat ditambah HCl 2M sampai volume tertentu. Filtrat dibagi dalam 2 tabung reaksi, tabung 1 ditambah reagen wagner dan tabung lainnya sebagai blangko. Tabung 1 diamati terbentuknya endapan dan dibandingkan dengan larutan blangko pada tabung satunya. Jika tidak terbentuk endapan, berarti bahan tidak mengandung alkaloid dan jika terbentuk endapan berarti bahan mengandung alkaloid. b. Flavonoid Sebanyak 0,3 g ekstrak ditambah dengan methanol 30%, kemudian dipanaskan selama kurang lebih 5 menit. Larutan disaring dan filtrat ditambah dengan larutan H2SO 4. Terbentuknya warna merah mengindikasikan adanya flavonoid. c. Terpenoid dan Steroid 0,1 g ekstrak ditambah dengan 5 mL etanol 30%, lalu dipanaskan selama 5 menit. Larutan disaring dan filtrat yang diperoleh diuapkan. Kemudian filtrat ditambah dengan eter. Lapisan eter diambil dan ditambah dengan Liberman commit to user Ý®»¿¬» ÐÜÚ º·´»- ©·¬¸±«¬ ¬¸·- ³»--¿¹» ¾§ °«®½¸¿-·²¹ ²±ª¿ÐÜÚ °®·²¬»® ø¸¬¬°æññ©©©ò²±ª¿°¼ºò½±³÷ perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id 28 Buchard. Terpenoid dan steroid menunjukkan hasil positif jika terbentuk warna merah sampai ungu atau hijau. d. Antrakuinon Ekstrak ditambah 5 mL H 2SO 4 2 N, lalu dipanaskan sebentar dan didinginkan. Kemudian ditambahkan 10 ml benzene, dikocok dan didiamkan. Lapisan benzene dipisahkan dan disaring. Filtrat berwarna kuning menunjukkan adanya antrakuinon. e. Saponin Ekstrak diambil sebanyak 0,1 g, lalu ditambah dengan 5 mL akuades dan dipanaskan selama kurang lebih 5 menit. Kemudian larutan dikocok dan didiamkan. Jika terbentuk buih yang stabil setinggi kurang lebih 1 cm dan jika ditambah HCl buih tetap stabil maka bahan mengandung saponin. f. Tanin(Polifenolik) 0,1 g ekstrak ditambah dengan 5 mL akuades, kemudian didihkan selama 5 menit. Larutan disaring dan filtrat yang diperoleh ditetesi dengan FeCl3 1%. Jika terbentuk warna biru tua sampai kehitaman berarti bahan mengandung senyawa tanin(polifenolik). g. Asam Lemak 5 mL ekstrak diuapkan sampai kering, lalu ditambahkan 5 mL KOH 0,5 N dalam etanol, direfluks sehingga tidak terlihat tetesan minyak pada permukaan cairan. Etanol dihilangkan dengan cara dipanaskan pada suhu 80ºC. sisa dilarutkan dalam air panas dan diekstraksi dengan eter 2x10 mL. Fraksi air diasamkan dengan HCl dan diekstrak lagi dengan eter. Ekstrak eter diuapkan, jika sisa berminyak maka mengandung asam lemak. Uji KLT menggunakan plat silika gel F254 (E. Merck). Ekstrak ditotolkan pada plat dan dielusi dengan larutan pengembang tertentu, selanjutnya disemprot dengan reagen spesifik dan bercak diamati pada cahaya tampak, UV 254 nm, dan UV 365 nm. Uji KLT yang digunakan berdasarkan metode Wagner (1983) dan Harborne (1996). Uji KLT hanya dilakukan terhadap golongan senyawa yang mempunyai hasil positif terhadap uji tabung. commit to user Ý®»¿¬» ÐÜÚ º·´»- ©·¬¸±«¬ ¬¸·- ³»--¿¹» ¾§ °«®½¸¿-·²¹ ²±ª¿ÐÜÚ °®·²¬»® ø¸¬¬°æññ©©©ò²±ª¿°¼ºò½±³÷ perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id 29 a. Alkaloid Larutan pengembang yang digunakan adalah toluena : etil asetat : dietil amin (7 : 2 : 1). Plat kemudian dideteksi dengan reagen penyemprot pereaksi Dragendorrf. Kemudian plat diamati pada cahaya tampak, UV 254 nm, dan UV 365 nm. Alkaloid akan memberikan warna coklat dibawah sinar tampak dan pada UV 365 nm akan memberikan warna fluorosens kuning atau biru. b. Terpenoid dan Steroid Larutan pengembang yang digunakan untuk analisa terpenoid dan steroid adalah heksana : etil asetat (95% : 5%). Plat kemudian dideteksi dengan reagen penyemprot SbCl3 dalam kloroform untuk steroid dan Liberman Buchard untuk terpenoid. Terpenoid dan steroid akan memberikan warna ungu jika diamati pada cahaya tampak dan dibawah sinar UV 254 nm. c. Antrakuinon Larutan pengembang yang digunakan adalah etil asetat : metanol : air (100 : 13,5 : 10). Plat dikeringkan kemudian disemprot dengan pereaksi KOH etanolik 5%. Selanjutnya plat diamati pada cahaya tampak, UV 254 nm, dan UV 365 nm. Antrakuinon akan memberikan warna kuning pada cahaya tampak dan fluorosens kuning jika diamati pada UV 365 nm. d. Tanin(Polifenolik) Fase gerak yang digunakan adalah etil asetat : metanol : air (100: 13,5 : 10). Deteksi menggunakan reagen penyemprot FeCl3 1%. Kemudian plat diamati pada cahaya tampak, UV 254 nm. e. Asam Lemak Uji asam lemak menggunakan eluen benzene : dietil eter (95% : 5%). Deteksi asam lemak menggunakan reagen penyemprot 0,5 % rodamin B dalam etanol. Kemudian plat diamati pada cahaya tampak, UV 254 nm, dan UV 365 nm. Asam lemak akan memberikan warna ungu pada UV 254 nm dan 365 nm. commit to user Ý®»¿¬» ÐÜÚ º·´»- ©·¬¸±«¬ ¬¸·- ³»--¿¹» ¾§ °«®½¸¿-·²¹ ²±ª¿ÐÜÚ °®·²¬»® ø¸¬¬°æññ©©©ò²±ª¿°¼ºò½±³÷ perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id 30 4. Pengujian Aktivitas Antibakteri Ekstrak Etanol Ekstrak etanol dibuat konsentrasi tertentu dengan pelarut dimetil sulfoksida (DMSO). Pengujian menggunakan metode difusi agar yaitu metode perforasi dengan tahap kerja sebagai berikut : a. Sterilisasi alat Alat-alat yang akan digunakan untuk uji aktivitas antibakteri disterilkan dalam autoklaf dengan suhu 121ºC selama kurang lebih 20 menit. b. Pembuatan media agar miring Sebanyak 1 g NA (Nutrien Agar) dilarutkan dalam 50 mL akuades, lalu larutan tersebut dipanaskan dan distirrer diatas hotplate-stirrer sampai larutan menjadi kuning bening. Kemudian sebanyak 5 mL larutan NA tersebut dimasukkan ke dalam tabung reaksi, tabung reaksi tersebut ditutup dengan kapas dan aluminium foil, kemudian distrelisasi pada suhu 121ºC selama 20 menit. Selanjutnya tabung reaksi diletakkan ditempat yang miring dan dibiarkan memadat pada suhu kamar. c. Pembuatan biakan bakteri Sebanyak 1 ose bakteri uji digoreskan pada media agar miring dengan pola zig zag. Proses ini dilakukan dalam keadaan steril pada ruang isolasi yang telah disinari dengan sinar UV. Biakan diinkubasi selama kurang lebih 18 sampai 24 jam pada suhu 37ºC. d. Pembuatan suspensi bakteri uji Sebanyak 1 ose bakteri dimasukkan kedaalam tabung reaksi yang telah diisi dengan 3 mL akuades steril. e. Pengujian aktivitas antibakteri Sebanyak 3 g NA (Nutrien Agar) dilarutkan dalam 150 mL akuades, lalu larutan tersebut dipanaskan dan distirrer diatas hotplate-stirrer sampai larutan menjadi kuning bening. larutan NA tersebut disterilisasi pada suhu 121ºC kedalam cawan petri steril, kemudian ditambahkan 15 mL larutan NA steril. Cawan petri digoyang supaya bakteri dan larutan NA tarcampur rata dan didiamkan sampai agar memadat. Setelah agar membeku, dibuat lubang commit to user Ý®»¿¬» ÐÜÚ º·´»- ©·¬¸±«¬ ¬¸·- ³»--¿¹» ¾§ °«®½¸¿-·²¹ ²±ª¿ÐÜÚ °®·²¬»® ø¸¬¬°æññ©©©ò²±ª¿°¼ºò½±³÷ perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id 31 sampel yang telah dibuat konsentrasi tertentu menggunakan pelarut DMSO. Langkah ini dilakukan 3 kali pengulangan, kemudian cawan petri dibungkus dengan kertas dan diinkubasi dalam inkubator selama 18-24 jam pada suhu 37ºC. Setelah itu diameter daerah hambat diukur menggunakan jangka sorong. Diameter daerah hambat ini ditunjukkan dengan daerah bening disekitar lubang yang berisi sampel. 5. Pemisahan Ekstrak Etanol Pemisahan ekstrak pekat etanol dilakukan dengan menggunakan Kromatografi Vakum Cair (KVC). Kolom KVC yang digunakan memiliki diameter 6 cm. Sebelum dilakukan pemisahan, perlu dilakukan persiapan kolom KVC dan persiapan sampel. Sebanyak 35 g silika Gel F254 dimasukkan kedalam kolom KVC, silika tersebut dipadatkan dengan cara divakum dan ditekan-tekan. Sebanyak 5 g sampel dilarutkan dengan aseton, lalu diimpregnasi dengan silika adsorb G 60 sebanyak 10 g sampai tercmpur rata. Setelah homogen sampel dibiarkan beberapa saat sampai kering. Proses ini diulangi sebanyak 5 kali untuk memaksimalkan hasil rendemen. Sampel yang sudah kering selanjutnya dimasukkan kedalam kolom KVC yang sebelumnya telah diisi dengan silika Gel F254. Kemudian sampel dielusi dengan menggunakan pelarut heksana, etil asetat dan etanol secara berurutan. Eluen yang digunakan sebanyak 200 mL heksana, 200 mL etil asetat, dan 200 mL etanol. Fraksi-fraksi yang diperoleh dari hasil pemisahan kemudian diuapkan pelarutnya menggunakan vacum rotary evaporator dengan suhu kurang lebih 50ºC. Sehingga diperoleh fraksi pekat heksana, fraksi pekat etil asetat,dan fraksi pekat etanol. commit to user Ý®»¿¬» ÐÜÚ º·´»- ©·¬¸±«¬ ¬¸·- ³»--¿¹» ¾§ °«®½¸¿-·²¹ ²±ª¿ÐÜÚ °®·²¬»® ø¸¬¬°æññ©©©ò²±ª¿°¼ºò½±³÷ perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id 32 6. Pengujian Aktivitas Antibakteri Fraksi-Fraksi Hasil Pemisahan KVC a. Uji aktivitas antibakteri fraksi-fraksi hasil KVC Fraksi-fraksi hasil KVC dilakukan pengujian aktivitas antibakteri menggunakan tahapan kerja seperti pada pengujian aktivitas antibakteri ekstrak etanol untuk mendapatkan fraksi teraktif antibakteri. b. Penetapan KHM fraksi teraktif antibakteri Penetapan KHM dilakukan untuk mengetahui konsentrasi terkecil sampel uji yang masih bisa menghambat pertumbuhan bakteri uji. Penetapan KHM ini dilakukan dengan metode yang sama dengan pengujian aktivitas antibakteri, yaitu dengan melakukan variasi konsentrasi sampel. Penetapan KHM dilakukan terhadap fraksi yang mempunyai aktivitas antibakteri tertinggi. c. Penetapan KHM pembanding Pembanding yang digunakan adalah amoksisilin dan kloramfenikol dengan perlakuan yang sama dengan sampel uji. Tetapi dalam pengenceran Amoksisilin digunakan buffer fosfat pH 7, sedangkan kloramfenikol menggunakan DMSO dalam pengencerannya. 7. Pengujian Golongan Senyawa Fraksi Teraktif Antibakteri Pengujian golongan senyawa dalam fraksi teraktif antibakteri dilakukan dengan metode yang sama dengan ekstrak etanol. 8. Kromatografi Gas-Spektrofotometer Massa (GC-MS) Analisis GC-MS dilakukan untuk mengidentifikasi komponen kimia fraksi teraktif antibakteri daun mimba. Kondisi alat GC-MS adalah sebagai berikut : Jenis pengion : EI (Electron Impact) Jenis kolom : Rastex RXi-5MS Panjang kolom : 30 meter Diameter kolom : 0,25 milimeter Suhu kolom : 60°C Suhu injektor : 310°C commit to user Ý®»¿¬» ÐÜÚ º·´»- ©·¬¸±«¬ ¬¸·- ³»--¿¹» ¾§ °«®½¸¿-·²¹ ²±ª¿ÐÜÚ °®·²¬»® ø¸¬¬°æññ©©©ò²±ª¿°¼ºò½±³÷ perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id 33 E. Teknik Pengumpulan dan Analisis Data Penelitian ini akan dihasilkan berbagai data. Pada tahap pengujian aktivitas antibakteri ekstrak, fraksi-fraksi, amoksisilin, dan kloramfenikol akan diperoleh data diameter hambat untuk masing-masing bakteri uji pada berbagai konsentrasi tertentu. Dari uji aktivitas antibakteri ini dapat diketahui fraksi mana yang mempunyai aktivitas antibakteri paling tinggi terhadap bakteri uji, yaitu didasarkan dari perolehan data diameter hambat. Fraksi yang mempunyai aktivitas antibakteri paling tinggi tersebut kemudian dilakukan uji penentuan KHM (Konsentrasi Hambat Minimum) dan uji banding. Selanjutnya fraksi tersebut dianalisis dengan uji tabung dan KLT (Kromatografi Lapis Tipis) dan GC-MS (Kromatografi Gas-Spektroskopi Massa). Pada penentuan konsentrasi hambat minimum diperoleh data nilai KHM. Pada uji banding potensi fraksi terhadap standar amoksisilin dan kloramfenikol diperoleh nilai potensi fraksi terhadap ketiga bakteri uji. Pada analisis KLT diperoleh golongan senyawa pada fraksi teraktif. Pada analisis GC-MS akan diperoleh data berupa kromatogram GC yang akan diperoleh informasi jumlah senyawa yang terdeteksi dan persentase komponen senyawa sedangkan dari MS akan dilakukan analisis data untuk menentuka struktur senyawa dengan membandingkan dengan data sekunder dari literatur. Data-data diameter hambat dan variasi kosentrasi hasil pengujian aktivitas antibakteri dilakukan analisa menggunakan One Way ANOVA. commit to user Ý®»¿¬» ÐÜÚ º·´»- ©·¬¸±«¬ ¬¸·- ³»--¿¹» ¾§ °«®½¸¿-·²¹ ²±ª¿ÐÜÚ °®·²¬»® ø¸¬¬°æññ©©©ò²±ª¿°¼ºò½±³÷ perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN A. Identifikasi Sampel Identifikasi tanaman mimba yang berasal dari daerah Klaten, Jawa Tengah dilakukan di Bagian Biologi Farmasi, Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada. Hasil identifikasi menunjukkan bahwa sampel yang digunakan adalah Azadirachta indica A. Juss. Hasil determinasi dapat dilihat pada Lampiran 2. B. Preparasi dan Ekstraksi Sampel Daun mimba yang sudah kering dilakukan penyerbukan dengan blender, sehingga diperoleh bentuk serbuk. Luas permukaan simplisia dalam bentuk serbuk lebih luas, sehingga memungkinkan interaksi antara sampel dengan pelarut lebih banyak dan senyawa yang terekstrak lebih banyak. Kemudian sebanyak 1,23 kg serbuk daun mimba dimaserasi selama 3x24 jam menggunakan pelarut etanol 96% sebanyak 560 mL. Maserasi merupakan salah satu metode ekstraksi dengan cara perendaman sampel dalam waktu tertentu. Pada proses ini pelarut akan menembus dinding sel sampel dan masuk ke dalam rongga sel yang mengandung senyawa aktif. Hal ini terjadi karena perbedaan konsentrasi senyawa aktif di dalam sel dan di luar sel. Larutan terpekat didesak keluar sel (Anonim, 1986). Penggunaan etanol sebagai pelarut karena alkohol merupakan pelarut universal yang baik untuk mengekstraksi semua golongan senyawa metabolit sekunder (Kristanti, 2008). Kemudian ekstrak etanol yang diperoleh diuapkan pelarutnya menggunakan vacuum rotary evaporator dengan suhu 50ºC, sehingga diperoleh eksrak pekat etanol sebanyak 58,182 g dengan rendemen 4,73%. Perhitungan rendemen dapat dilihat pada Lampiran 3. C. Pengujian Golongan Senyawa Ekstrak Etanol Proses identifikasi senyawa metabolit sekunder yang terdapat dalam ekstrak etanol dilakukan dengan skrining fitokimia. Skrining fitokimia ekstrak etanol yang dilakukan dapat memberikan informasi mengenai ada tidaknya commit to user 34 Ý®»¿¬» ÐÜÚ º·´»- ©·¬¸±«¬ ¬¸·- ³»--¿¹» ¾§ °«®½¸¿-·²¹ ²±ª¿ÐÜÚ °®·²¬»® ø¸¬¬°æññ©©©ò²±ª¿°¼ºò½±³÷ perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id 35 senyawa metabolit sekunder dalam daun mimba yang berpotensi sebagai zat antibakteri. Skrining fitokimia dilakukan dengan uji tabung dan uji penegasan KLT. Uji penegasan KLT hanya dilakukan terhadap senyawa metabolit sekunder yang memberikan hasil positif terhadap uji tabung. Hasil skrining fitokimia dapat dilihat pada Tabel 1. Tabel 1. Hasil Skrining Fitokimia (Uji Tabung) Ekstrak Etanol No. Kandungan Senyawa 1. Alkaloid 2. Flavonoid 3. Trepenoid dan Steroid Warna Hijau 4. Saponin Tidak terbentuk buih Hasil Uji Teori Kesimpulan Warna orange dan Terbentuk endapan Warna hijau kehitaman Terbentuknya suatu endapan1) + Warna merah2) - Warna merah, ungu atau hijau2) Adanya buih yang stabil setinggi ±1 cm2) + - Warna biru Biru tua, hitam2) + kehitaman 3) 6. Antrakuinon Warna kuning keruh Warna kuning + 7. Asam Lemak Sisa berminyak Sisa berminyak2) + 2) Keterangan : (+) = Ada golongan senyawa kimia = Harborne (1987) 3) (-) = Tidak ada golongan senyawa kimia = Sofiana (2009) 5. Tanin(Polifenolik) 1) = Pedrosa (1978) Hasil skrining fitokimia uji tabung menunjukkan bahwa ekstrak etanol mengandung senyawa metabolit sekunder alkaloid, terpenoid, steroid, tanin(polifenolik), antrakuinon, dan asam lemak. Selanjutnya senyawa-senyawa tersebut dilakukan uji penegasan KLT menggunakan eluen yang sesuai dan disemprot dengan reagen penyemprot yang spesifik untuk masing-masing senyawa. Hasil skrining fitokimia uji penegasan KLT dapat dilihat pada Tabel 2. commit to user Ý®»¿¬» ÐÜÚ º·´»- ©·¬¸±«¬ ¬¸·- ³»--¿¹» ¾§ °«®½¸¿-·²¹ ²±ª¿ÐÜÚ °®·²¬»® ø¸¬¬°æññ©©©ò²±ª¿°¼ºò½±³÷ perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id 36 Tabel 2. Hasil Skrining Fitokimia (Uji KLT) Ekstrak Etanol Setelah Dideteksi dengan Pereaksi Spesifik No Kandungan Sinar Tampak UV 254 UV 365 Rf . Senyawa Hasil Teori Hasil Teori Hasil Teori 1. Alkaloid 0,88 Tidak Coklat, terlihat orange1) - Fluoresens Fluoresens biru kuning/biru 1) - Ungu 2) Ungu 2) Hijau, Tanin merah, 4. 0,9 Hijau (Polifenolik) ungu, 1) biru 5. Antrakuinon 0,48 Kuning Kuning 1) Ungu Flouresens1) 0,12 Asam 6. 0,31 Ungu Ungu2) Lemak 0,53 Keterangan : (+) = Ada golongan senyawa kimia (-) = Tidak ada golongan senyawa kimia 2. 3. Kesim pulan Terpenoid 0,18 Ungu Steroid 0,16 Ungu - - + + - - + - - + Ungu Ungu 2) + 1) 2) = Wagner (1983) = Harborne (1996) Hasil skrining fitokimia uji penegasan KLT menunjukkan bahwa di dalam ekstrak etanol mengandung senyawa metabolit sekunder alkaloid, terpenoid, steroid, tanin(polifenolik), antrakuinon, dan asam lemak. Beberapa hasil yang diperoleh ini sama dengan hasil skrining fitokimia ekstrak etanol daun mimba yang dilakukan oleh Aslam dkk. (2009), dan yang sebelumnya dilakukan oleh Nugraheni (2007). D. Pengujian Aktivitas Antibakteri Ekstrak Etanol Ekstrak etanol hasil maserasi dilakukan pengujian aktivitas antibakteri. Pengujian aktivitas antibakteri ini bertujuan untuk mengetahui potensi antibakteri ekstrak etanol awal terhadap bakteri yang digunakan sebelum dilakukan langkah selanjutnya. Pengujian dilakukan terhadap + beberapa konsentrasi dengan menggunakan metode difusi agar khususnya perforasi. Konsentrasi dibuat dengan mengencerkan ekstrak dalam DMSO (Dimetil Sulfoksida) dan konsentrasi yang digunakan adalah 100%, 75%, 50%, dan 25%. Digunakannya DMSO sebagai commit to user Ý®»¿¬» ÐÜÚ º·´»- ©·¬¸±«¬ ¬¸·- ³»--¿¹» ¾§ °«®½¸¿-·²¹ ²±ª¿ÐÜÚ °®·²¬»® ø¸¬¬°æññ©©©ò²±ª¿°¼ºò½±³÷ perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id 37 pelarut dikarenakan DMSO mampu melarutkan ekstrak dengan sempurna. Selain itu DMSO juga tidak mempunyai daya antibakteri terhadap bakteri uji yang digunakan, sehingga tidak mempengaruhi hasil uji antibakteri (Kustyaningsih, 2004). Bakteri yang digunakan pada penelitian ini adalah Staphylococcus epidermidis, Bacillus cereus, dan Shigella Flexneri. Hasil uji menunjukkan bahwa ekstrak etanol daun mimba mampu menghambat pertumbuhan ketiga bakteri uji. Hasil pengujian aktivitas antibakteri dapat dilihat pada Tabel 3, sedangkan hasil pengujian selengkapnya ditunjukkan pada Lampiran 4. Kemampuan suatu zat antibakteri dalam menghambat ataupun membunuh bakteri tergantung pada konsentrasi zat antibakteri (Schlegel dan Schmidt, 1994). Semakin besar konsentrasi zat antibakteri maka semakin besar juga daerah hambat pertumbuhan bakteri. Tabel 3. Hasil Pengujian Aktivitas Antibakteri Ekstrak Etanol Konsentrasi Diameter Daerah Hambat Rata-Rata (mm) (g/mL) S. epidermidis B. cereus S. Flexneri 100 14,02±0,19 14,61±0,05 14,41±0,11 75 13,66±0,09 14,36±0,10 14,08±0,10 50 13,45±0,04 13,97±0,16 13,60±0,30 25 13,05±0,27 13,04±0,34 12,58±0,39 Keterangan : Diameter lubang = 6 mm Dari hasil pengujian aktivitas antibakteri ekstrak etanol selanjutnya dilakukan analisis data statistik untuk mengetahui secara pasti apakah terdapat perbedaan aktivitas antibakteri yang nyata diantara keempat konsentrasi ekstrak etanol diatas. Metode analisa yang digunakan adalah metode One Way ANOVA. Data hasil analisa dapat dilihat pada Lampiran 5. Hasil uji ANOVA menunjukkan bahwa terdapat pengaruh variasi bakteri terhadap penghambatan bakteri uji untuk konsentrasi 100%, 75%, dan 50% karena sig < 0,05. Sedangkan pada konsentrasi 25% variasi bakteri tidak berpengaruh terhadap penghambatan bakteri uji. Selanjutnya untuk mengetahui perbedaan aktivitas antibakteri antar bakteri dilakukan analisa LSD. Hasil analisa LSD disimpulkan bahwa pada konsentrasi 100% bakteri S. epidermidis menunjukkan perbedaan aktivitas yang nyata commit to user Ý®»¿¬» ÐÜÚ º·´»- ©·¬¸±«¬ ¬¸·- ³»--¿¹» ¾§ °«®½¸¿-·²¹ ²±ª¿ÐÜÚ °®·²¬»® ø¸¬¬°æññ©©©ò²±ª¿°¼ºò½±³÷ perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id 38 terhadap semua bakteri uji, sedangkan B. cereus dan S. flexneri hanya menunjukkan perbedaan aktivitas yang nyata terhadap bakteri S. epidermidis saja. Pada konsentrasi 75% bakteri S. epidermidis, B. cereus, dan S. flexneri menunjukka perbedaan aktivitas yang nyata terhadap semua bakteri uji. Pada konsentrasi 50% hanya S. flexneri yang tidak menunjukkan perbedaan aktivitas yang nyata terhadap semua bakteri uji, sedangkan B. cereus menunjukka perbedaan aktivitas yang nyata terhadap S. epidermidis, begitu juga sebaliknya. Pada konsentrasi 25% bakteri S. epidermidis, B. cereus, dan S. Flexneri mempunyai pengaruh yang beda terhadap semua bakteri uji. E. Pemisahan Ekstrak Etanol Berdasarkan hasil uji antibakteri ekstrak etanol, diketahui bahwa ekstrak etanol daun mimba dapat menghambat ketiga bakteri uji, sehingga daun mimba bisa dikembangkan sebagai antibiotik baru. Namun kandungan senyawa ekstrak etanol masih terlalu kompleks, sehingga perlu dilakukan pemisahan untuk mengetahui zat-zat yang aktif sebagai antibakteri. Pemisahan dilakukan dengan KVC (Kromatografi Vakum Cair). KVC merupakan kromatografi yang dimodifikasi dengan pompa vakum untuk mempercepat proses elusi. Dalam penelitian ini digunakan perbandingan antara sampel dengan fase diam adalah 1 : 7. Sebanyak 5 g sampel dilarutkan dengan aseton, kemudian diimpregnasi dengan silika adsorb G 60 sebanyak 10 g dan dibiarkan sampai kering. Selanjutnya sampel dimasukkan pada bagian atas fase diam yang telah dipadatkan. Fase diam yang digunakan disini adalah silika GF254 dan jumlah yang digunakan adalah 35 g. Pemisahan dilakukan sebanyak 5 kali, sehingga jumlah total sampel yang dipisahkan adalah 25 g. Eluen yang digunakan untuk mengelusi sampel adalah heksana, etil asetat, dan etanol. Proses elusi dimulai dengan eluen yang paling non polar sampai polar dan setiap fraksi yang diperoleh ditampung (Hostettman dkk., 1986). Eluen yang digunakan adalah 200 mL heksana, 200 mL etil asetat, dan 200 mL etanol. Hasil fraksinasi ekstrak etanol dapat dilihat pada Tabel 4, sedangkan hasil perhitungan rendemen dapat dilihat pada Lampiran 3. commit to user Ý®»¿¬» ÐÜÚ º·´»- ©·¬¸±«¬ ¬¸·- ³»--¿¹» ¾§ °«®½¸¿-·²¹ ²±ª¿ÐÜÚ °®·²¬»® ø¸¬¬°æññ©©©ò²±ª¿°¼ºò½±³÷ perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id 39 Tabel 4. Hasil Pemisahan Kromatografi Vakum Cair Ekstrak Etanol Daun Mimba Pelarut Heksana Etil asetat Etanol Berat Fraksi (g) 0,480 10,560 8,058 Warna Kuning Hijau kehitaman Coklat kehitaman Persentase (%) 1,92 42,24 32,23 F. Pengujian Aktivitas Antibakteri Fraksi-Fraksi Hasil Pemisahan KVC Fraksi-fraksi hasil pemisahan KVC diuji aktivitas antibakterinya menggunakan metode yang sama dengan pengujian aktivitas antibakteri ekstrak etanol awal. Tujuannya adalah untuk mencari fraksi yang mempunyai aktivitas antibakeri yang paling tinggi untuk selanjutnya dilakukan analisis lebih lanjut. Hasil uji aktivitas antibakteri fraksi-fraksi hasil pemisahan KVC ditunjukkan pada Tabel 5, sedangkan hasil pengujian selengkapnya ditunjukkan pada Lampiran 6. Tabel 5. Hasil Pengujian Aktivitas Antibakteri Fraksi-Fraksi Hasil Pemisahan KVC Konsentrasi (g/mL) DDH (mm) F 100 75 50 25 1 6,00±0,00 6,00±0,00 6,00±0,00 6,00±0,00 S. epidermidis 2 12,74±0,19 12,20±0,16 11,61±0,35 10,72±0,23 3 9,58±0,34 9,24±0,25 8,38±0,14 7,67±0,23 1 6,00±0,00 6,00±0,00 6,00±0,00 6,00±0,00 B. cereus 2 12,76±0,15 12,18±0,14 11,63±0,31 11,13±0,04 3 11,14±0,09 9,72±0,09 8,97±0,21 8,16±0,20 1 6,83±0,12 6,55±0,14 6,23±0,06 6,00±0,00 S. flexneri 2 13,32±0,21 12,75±0,24 12,13±0,11 11,13±0,07 3 8,88±0,13 8,05±0,06 7,67±0,27 7,16±0,23 Keterangan : Diameter lubang = 6 mm F 1 = Fraksi heksana F 2 = Fraksi etil asetat F 3 = Fraksi etanol Hasil uji aktivitas antibakteri fraksi-fraksi hasil pemisahan KVC menunjukkan bahwa fraksi etil asetat mempunyai aktivitas antibakteri paling tinggi dibandingkan dengan fraksi lainnya. Berdasarkan hasil pengujian aktivitas fraksi-fraksi daun mimba hasil pemisahan KVC selanjutnya dilakukan analisis data ststiatik untuk mengetahui secara pasti apakah terdapat pengaruh perbedaan commit to user Ý®»¿¬» ÐÜÚ º·´»- ©·¬¸±«¬ ¬¸·- ³»--¿¹» ¾§ °«®½¸¿-·²¹ ²±ª¿ÐÜÚ °®·²¬»® ø¸¬¬°æññ©©©ò²±ª¿°¼ºò½±³÷ perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id 40 aktivitas antibakteri yang nyata diantara masing-masing fraksi. Hasil pengujian ANOVA yang ditunjukkan pada Lampiran 7 dapat disimpulkan bahwa semua fraksi yaitu fraksi heksana, fraksi etil asetat, dan fraksi etanol terdapat perbedaan yang nyata terhadap ketiga bakteri uji. Kemudian selanjutnya dilakukan pengujian lebih lanjut menggunakan LSD untuk mengetahui perbedaan aktivitas antibakteri antar fraksi. Hasil uji menunjukkan bahwa terdapat perbedaan nyata antara fraksi heksana dengan fraksi etil asetat dan fraksi etanol dalam menghambat pertumbuhan bakteri S. epidermidis, B. cereus, dan S. flexneri. Berdasarkan analisis tersebut dapat disimpulkan bahwa fraksi etil asetat mempunyai aktivitas antibakteri tertinggi dan nyata terhadap bakteri S. epidermidis, B. cereus, dan S. flexneri. Setelah diketahui bahwa fraksi etil asetat yang mempunyai aktivitas antibakteri tertinggi, selanjutnya dilakukan uji penetapan KHM terhadap ketiga bakteri uji tersebut. Berdasarkan hasil pengujian aktivitas antibakteri fraksi-fraksi daun mimba dapat disimpulkan bahwa ekstrak etanol mempunyai aktivitas antibakteri yang lebih besar dibandingkan dengan fraksi-fraksi hasil pemisahan KVC. Jawetz dkk. (2005) menyatakan bahwa aktivitas kerja gabungan beberapa senyawa antibakteri bisa lebih efektif dibandingkan dengan aktivitas kerja dari masing-masing senyawa. G. Penetapan KHM dan Nilai Banding 1. Penetapan KHM Fraksi Etil Asetat Fraksi etil asetat daun mimba diketahui memiliki aktivitas antibakteri tertinggi, sehingga dilakukan penetapan KHM terhadap ketiga bakteri uji. KHM merupakan konsentrasi terkecil zat antibakteri yang masih mampu menghambat pertumbuhan bakteri uji. Penetapan KHM dilakukan dengan memvariasi konsentrasi etil asetat secara menurun. Konsentrasi dimulai dari 0,75% sampai dengan 0,025%. Hasil penetapan KHM fraksi etil asetat dapat dilihat pada Tabel 6, sedangkan hasil pengujian selengkapnya terdapat pada Lampiran 8. commit to user Ý®»¿¬» ÐÜÚ º·´»- ©·¬¸±«¬ ¬¸·- ³»--¿¹» ¾§ °«®½¸¿-·²¹ ²±ª¿ÐÜÚ °®·²¬»® ø¸¬¬°æññ©©©ò²±ª¿°¼ºò½±³÷ perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id 41 Tabel 6. Hasil Uji Penetapan KHM Fraksi Etil Asetat Konsentrasi Diameter Daerah Hambat Rata-Rata (mm) (g/mL) S. epidermidis B. cereus S. Flexneri 0,75 7,80±0,12 7,94±0,01 7,91±0,06 0,5 7,48±0,13 7,66±0,03 7,65±0,10 0,25 7,15±0,02 7,35±0,03 7,34±0,09 0,1 6,96±0,09 7,21±0,08 7,21±0,09 0,075 6,32±0,24 6,93±0,21 6,83±0,20 0,05 6,00±0,00 6,44±0,21 6,83±0,20 0,025 6,00±0,00 6,00±0,00 6,00±0,00 Keterangan : Diameter lubang = 6 mm Hasil uji penetapan KHM menunjukkan bahwa KHM fraksi etil asetat terhadap bakteri Staphylococcus epidermidis adalah 0,075% dengan diameter hambat rata-rata 6,32±0,24 mm, sedangkan untuk bakteri Bacillus cereus adalah 0,05% dengan diameter hambat rata-rata 6,44±0,21 mm dan Shigella flexneri adalah 0,05% dengan diameter hambat rata-rata 6,83±0,20 mm. Dari data dapat disimpulkan bahwa fraksi etil asetat mempunyai nilai KHM paling kecil untuk bakteri B. cereus dan S. flexneri. Ini artinya bahwa fraksi etil asetat mempunyai aktivitas antibakteri yang lebih besar terhadap bakteri B. cereus dan S. flexneri dibandingkan dengan bakteri S. epidermidis. Sedangkan potensi fraksi etil asetat terhadap bakteri S. flexneri> B. cereus> S. epidermidis. Adanya perbedaan aktivitas antibakteri tersebut di atas kemungkinan karena adanya perbedaan komponen penyusun dinding sel antara bakteri gram positif dan negatif. Menurut Pelczar dkk. (1986), dinding sel bakteri gram positif relatif lebih sederhana, sehingga senyawa antibakteri lebih mudah masuk ke dalam sel dan menemukan sasaran untuk merusak struktur dinding sel. Sedangkan struktur dinding sel bakteri gram negatif lebih kompleks yang terdiri dari 3 lapisan, yaitu lapisan luar yang berupa lipoprotein, lapisan tengah yang berupa lipopolisakarida, dan lapisan dalam yang berupa peptidoglikan. Lapisan luar yang terdapat dalam bakteri gram negatif berfungsi sebagai lapisan pelindung bakteri terhadap zat-zat yang bersifat racun termasuk zat antibakteri yang dapat menghambat sintesis peptidoglikan. Hal ini menyebabkan bakteri gram negatif lebih resistan terhadap zat antibakeri dibandingkan bakteri gram positif. Selain hal commit to user Ý®»¿¬» ÐÜÚ º·´»- ©·¬¸±«¬ ¬¸·- ³»--¿¹» ¾§ °«®½¸¿-·²¹ ²±ª¿ÐÜÚ °®·²¬»® ø¸¬¬°æññ©©©ò²±ª¿°¼ºò½±³÷ perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id 42 tersebut perbedaan aktivitas antibakteri suatu zat antibakteri tergantung pada tipe ekstrak, spesies tanaman, dan spesies bakteri itu sendiri (Durmas dkk., 2006). Dari hasil diatas di atas kemudian dilakukan analisis statistik untuk mengetahui perbedaan secara pasti antara konsentrasi fraksi dengan bakteri uji. Metode analisa yang digunakan adalah analisa One Way ANOVA, hasilnya ditunjukkan pada Lampiran 9. Hasil uji ANOVA disimpulkan bahwa 0,75% dan 0,5% tidak menunjukkan perbedaan yang nyata. Analisis lebih lanjut menggunakan LSD diketahui bahwa secara umum terdapat perbedaan yang nyata antara konsentrasi satu dengan yang lain. Namun ada beberapa yang tidak menunjukkan perbedaan yang nyata yaitu antara konsentrasi 0,25% dengan 0,1% dan konsentrasi 0,05% dengan 0,025% terhadap bakteri S. epidermidis. Konsentrasi 0,25% dengan 0,1% juga tidak menunjukkan perbedaan yang nyata terhadap bakteri B. cereus. Sedangkan terhadap bakteri S. flexneri konsentrasi 0,25% dengan 0,1% juga tidak menunjukkan perbedaan yang nyata. 2. Penetapan KHM Amoksisilin dan Kloramfenikol Zat pembanding yang digunakan dalam penelitian aktivitas antibakteri daun mimba adalah amoksisilin dan kloramfenikol. Pemilihan amoksisilin sebagai zat pembanding dikarenakan amoksisilin merupakan antibiotik dengan spektrum luas dan biasa digunakan untuk mengobati untuk pengobatan infeksi pada saluran nafas, saluran empedu dan saluran seni, gonorhoe, gastroenteritis, meningitis dan infeksi karena Salmonella sp., seperti demam tipoid (Siswandono dan Soekardjo, 2000). Selain itu Mutschler (1991) menyebutkan bahwa amoksisilin mampu meghambat pertumbuhan bakteri gram positif dan negatif seperti Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Psudomonas aeruginosa, dan Eschericia coli. Hasil uji penetapan KHM amoksisilin ditunjukkan pada Tabel 7, hasil selengkapnya terdapat pada Lampiran 10. Amoksisilin dapat menghambat pertumbuhan bakteri dengan cara menghambat pembentukan mukopeptida yang diperlukan untuk sintesis dinding sel mikroba. Dinding sel bakteri yang terhambat adalah komponen peptidoglikan, commit to user Ý®»¿¬» ÐÜÚ º·´»- ©·¬¸±«¬ ¬¸·- ³»--¿¹» ¾§ °«®½¸¿-·²¹ ²±ª¿ÐÜÚ °®·²¬»® ø¸¬¬°æññ©©©ò²±ª¿°¼ºò½±³÷ perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id 43 yang merupakan komponen dinding sel yang penting dalam menstabilkan sel bakteri (Khan, 2011). Penetapan KHM amoksisilin dilakukan dengan membuat variasi konsentrasi amoksisilin. Pelarut yang digunakan adalah buffer phospat pH 7. Hal ini dikarenakan buffer phospat pH 7 dapat melarutkan amoksisilin dengan sempurna tidak memiliki hambatan terhadap mikroba, sehingga dapat berfungsi sebagai blanko ( Downes dan Ito, 2001). Tabel 7. Hasil Uji Penetapan KHM Amoksisilin Konsentrasi Diameter Daerah Hambat Rata-Rata (mm) ppm (g/mL) S. epidermidis B. cereus S. flexneri 2 2,0.10 -4 10,05±0,07 9,07±0,08 9,83±0,07 1,75 1,75.10 -4 9,57±0,06 8,69±0,06 9,32±0,09 -4 1,5 1,5.10 9,23±0,30 8,42±0,09 8,82±0,08 1,25 1,25.10 -4 9,05±0,08 7,72±0,35 8,29±0,14 1 1,0.10 -4 8,76±0,05 7,92±0,13 7,11±0,04 -5 0,75 7,5.10 7,91±0,04 6,00±0,00 7,15±0,16 0,5 5,0.10 -5 6,85±0,05 6,00±0,00 6,00±0,00 0,25 2,5.10 -5 6,00±0,00 6,00±0,00 6,00±0,00 Keterangan : Diameter lubang = 6 mm Berdasarkan data di atas dapat diketahui bahwa KHM amoksisilin untuk bakteri Staphylococcus epidermidis adalah 5,0.10-5% dengan diameter hambat rata-rata 6,85±0,05 mm, terhadap Bacillus cereus adalah 1,0.10 -4% dengan diameter hambat rata-rata 7,11±0,04 mm, dan terhadap Shigella flexneri adalah 7,5.10 -5% dengan diameter hambat rata-rata 7,15±0,16 mm. Dari data yang diperoleh, selanjutnya dilakukan analisis data statistik menggunakan metode One Way ANOVA. Hasil uji yang terdapat pada Lampiran 12 diketahui bahwa terdapat perbedaan yang nyata untuk semua konsentrasi terhadap ketiga bakteri uji. Analisis lebih lanjut menggunakan LSD diketahui bahwa secara umum terdapat perbedaan yang nyata antara konsentrasi satu dengan yang lain. Beberapa tidak menunjukkan perbedaan yang nyata yaitu antara konsentrasi 5,0.10-5% dengan 2,5.10 -5% terhadap bakteri S. flexneri. Konsentrasi 7,5.10 -5% dengan 5,0.10-5% dan 7,5.10-5% dengan 2,5.10 -5% juga tidak menunjukkan perbedaan yang nyata terhadap bakteri B. cereus. commit to user Ý®»¿¬» ÐÜÚ º·´»- ©·¬¸±«¬ ¬¸·- ³»--¿¹» ¾§ °«®½¸¿-·²¹ ²±ª¿ÐÜÚ °®·²¬»® ø¸¬¬°æññ©©©ò²±ª¿°¼ºò½±³÷ perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id 44 Zat pembanding kedua yang digunakan dalam penelitian ini adalah kloramfenikol. Kloramfenikol dipilih sebagai zat pembanding dikarenakan kloramfenikol mempunyai spektrum kerja antibakteri terhadap bakteri S. pyogenes, S. viridians, Neisseria, Bacillus spp., dan kebanyakan bakteri anaerob lainnya. Selain itu kloramfenikol juga mempunyai spektrum kerja seperti tetrasilkin. Menurut Tjay dan Rahardja (2002), tetrasiklin adalah obat yang digunakan untuk mengobati disentri basiler. Hasil uji penetapan KHM kloramfenikol dapat dilihat pada Tabel 8, sedangkan hasil selengkapnya dapat dilihat pada Lampiran 14. Kloramfenikol bekerja dengan menghambat sintesis protein bakteri. Antibiotik ini terikat pada ribosom sub unit 50S dan menghambat enzim peptida transferase sehingga ikatan peptida tidak terbentuk pada proses sintesis protein bakteri (Gunawan dkk., 2007). Penetapan KHM kloramfenikol dilakukan dengan variasi konsentrasi mulai dari konsentrasi 2,0.10-3% sampai dengan konsentrasi 7,5.10-5%. Pelarut yang digunakan adalah DMSO. Hal ini dikarenakan DMSO mampu melarutkan kloramfenikol dengan sempurna, selain itu DMSO juga tidak menunjukkan penghambatan terhadap ketiga bakteri uji. Tabel 8. Hasil Uji Penetapan KHM Kloramfenikol Konsentrasi Diameter Daerah Hambat Rata-Rata (mm) ppm (g/mL) S. epidermidis B. cereus S. Flexneri 20 2,0.10 -3 13,24±0,10 12,99±0,12 11,18±0,09 15 1,5.10 -3 12,20±0,02 11,60±0,10 10,79±0,09 10 1,0.10 -3 11,62±0,03 11,40±0,10 9,63±0,13 5 5,0.10 -4 9,60±0,02 10,32±0,13 8,94±0,05 -4 2,5 2,5.10 7,91±0,02 9,51±0,08 7,45±0,03 1,25 1,25.10 -4 8,10±0,10 6,00±0,00 6,79±0,03 1 1,0.10 -4 6,00±0,00 6,00±0,00 7,12±0,11 -5 0,75 7,5.10 6,00±0,00 6,00±0,00 6,00±0,00 Keterangan : Diameter lubang = 6 mm Konsentrasi hambat minimum kloramfenikol terhadap bakteri Staphylococcus epidermidis adalah 1,25.10 -4% dengan diameter hambat rata-rata 6,79±0,03 mm, terhadap Bacillus cereus adalah 1,0.10 -4% dengan diameter commit to user Ý®»¿¬» ÐÜÚ º·´»- ©·¬¸±«¬ ¬¸·- ³»--¿¹» ¾§ °«®½¸¿-·²¹ ²±ª¿ÐÜÚ °®·²¬»® ø¸¬¬°æññ©©©ò²±ª¿°¼ºò½±³÷ perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id 45 hambat rata-rata 7,12±0,11 mm, dan terhadap Shigella flexneri 2,5.10 -4% dengan diameter hambat rata-rata 7,45±0,03 mm. Data yang diperoleh di atas, selanjutnya dilakukan analisis data statistik menggunakan metode One Way ANOVA. Tujuannya adalah untuk mengetahui perbedaan secara pasti antara konsentrasi kloramfenikol dengan semua bakteri uji. Dari hasil uji ANOVA dapat disimpulkan bahwa terdapat perbedaan yang nyata untuk semua konsentrasi terhadap ketiga bakteri uji. Analisa lebih lanjut menggunakan LSD diperoleh kesimpulan bahwa secara umum terdapat perbedaan yang nyata antara konsentrasi satu dengan yang lain. Namun konsentrasi 1,0.10 4 % dengan 7,5.10 -5% tidak menunjukkan perbedaan yang nyata terhadap bakteri S. epidermidis. Selain itu antara konsentrasi 1,25.10 -4% dengan 1,0.10 -4%, 1,25.10 4 % dengan 7,5.10-5% dan 1,0.10-4% dengan 7,5.10 -5% juga tidak menunjukkan perbedaan yang nyata terhadap bakteri S. flexneri. 3. Penetapan Nilai Banding Fraksi Etil Asetat terhadap Amoksisilin dan Kloramfenikol Penetapan nilai banding dalam penelitian ini bertujuan untuk mengetahui potensi antibakteri fraksi etil asetat apabila dibandingkan dengan antibiotik sintetis. Antibiotik sitnetis yang digunakan dalam penelitian ini adalah amoksisilin dan kloramfenikol. Perhitungan nilai banding dilakukan dengan cara membuat grafik antara konsentrasi antibiotik vs rata-rata diameter daerah hambat antibiotik untuk masing-masing bakteri uji. Dari grafik didapatkan persamaan garis linier. Kemudian salah satu diameter daerah hambat fraksi etil asetat hasil pengujian aktivitas antibakteri diplotkan pada persamaan garis linier yang diperoleh. Konsentrasi fraksi etil asetat yang digunakan adalah 0,75%. Diameter daerah hambat fraksi etil asetat konsentrasi 0,75% disubstitusikan sebagai nilai y pada persamaan garis linier, sehingga diperoleh nilai x. Nilai x merupakan konsentrasi fraksi etil asetat yang setara dengan antibiotik. Konsentrasi fraksi etil asetat yang setara dengan antibiotik kemudian dibagi dengan konsentrasi fraksi etil asetat yang diplotkan dan dikalikan dengan faktor 100%, sehingga diperoleh nilai banding fraksi etil asetat terhadap antibiotik yaitu amoksisilin dan kloramfenikol. commit to user Ý®»¿¬» ÐÜÚ º·´»- ©·¬¸±«¬ ¬¸·- ³»--¿¹» ¾§ °«®½¸¿-·²¹ ²±ª¿ÐÜÚ °®·²¬»® ø¸¬¬°æññ©©©ò²±ª¿°¼ºò½±³÷ perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id 46 Hasil penetapan nilai banding amoksisilin dan kloramfenikol dapat dilihat pada Tabel 9. Hasil uji penetapan nilai banding faksi etil asetat terhadap amokisilin selengkapnya terdapat pada Lampiran 13, sedangkan terhadap kloramfenikol selengkapnya terdapat pada Lampiran 17. Tabel 9. Hasil Penetapan Nilai Banding Fraksi Etil Asetat terhadap Amoksisilin dan Kloramfenikol Nilai banding fraksi etil asetat terhadap antibiotik Antibiotik S. epidermidis B. cereus S. flexneri Amoksisilin 0,01% 0,02% 0,02% Kloramfenikol 0,04% 0,02% 0,06% Berdasarkan hasil uji penetapan nilai banding diatas disimpukan bahwa nilai banding fraksi etil asetat terhadap amoksisilin untuk bakteri S. epidermidis adalah 0,01%, B. cereus adalah 0,02%, dan untuk S. flexneri adalah 0,02%. Sedangkan nilai banding fraksi etil asetat terhadap kloramfenikol untuk bakteri S. epidermidis adalah 0,04%, B. cereus adalah 0,02%, dan S. flexneri adalah 0,06%. Nilai banding fraksi etil asetat terhadap amoksisilin secara umum lebih kecil dibanding kloramfenikol untuk bakteri semua bakteri uji. Hal ini dikarenakan setiap bakteri mempunyai sifat dan ketahanan yang yang berbedabeda terhadap suatu antibiotik. Berdasarkan hasil penetapan uji banding disimpulkan bahwa fraksi etil asetat mempunyai aktivitas antibakteri yang lebih rendah dibandingkan amoksisilin dan kloramfenikol, namun masih bisa digunakan sebagai alternatif antibakteri baru. H. Pengujian Golongan Senyawa Fraksi Teraktif Antibakteri Hasil uji aktivitas antibakteri fraksi-fraksi pemisahan dengan KVC menunjukkan bahwa fraksi etil asetat memiliki aktivitas antibakteri tertinggi terhadap bakteri Staphylococcus epidermidis, Bacillus cereus, dan Shigella flexneri dibandingkan dengan fraksi yang lainnya. Sehingga dilakukan skrining fitokimia dengan uji tabung dan uji penegasan KLT terhadap fraksi etil asetat. Pada uji KLT plat disemprot dengan reagen penyemprot yang spesifik untuk masing-masing golongan senyawa. Hasil skrining fitokimia commit to user Ý®»¿¬» ÐÜÚ º·´»- ©·¬¸±«¬ ¬¸·- ³»--¿¹» ¾§ °«®½¸¿-·²¹ ²±ª¿ÐÜÚ °®·²¬»® ø¸¬¬°æññ©©©ò²±ª¿°¼ºò½±³÷ uji tabung perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id 47 ditunjukkan pada Tabel 10, sedangkan hasil uji penegasan KLT ditunjukkan pada Tabel 11. Tabel 10. Hasil Skrining Fitokimia (Uji Tabung) Fraksi Etil Asetat No. Kandungan Senyawa 1. Alkaloid 2. Flavonoid 3. Trepenoid dan Steroid Warna Hijau 4. Saponin Tidak terbentuk buih 5. 6. 7. No. 1. 2. 3. 4. 6. 7. Hasil Uji Warna orange dan Terbentuk endapan Warna hijau kehitaman Teori Terbentuknya suatu endapan1) Kesimpulan Warna merah2) - Warna merah, ungu atau hijau2) Adanya buih yag stabil setinggi ±1 cm2) + + - Warna biru Biru tua, hitam2) + kehitaman Antrakuinon Warna kuning keruh Warna kuning + 2) Asam Lemak Sisa berminyak Sisa berminyak + 1) Keterangan : (+) = Ada golongan senyawa kimia = Pedrosa (1978) 2) (-) = Tidak ada golongan senyawa kimia = Harborne (1987) Tanin(polifenolik) Tabel 11. Hasil Skrining Fitokimia (Uji KLT) Fraksi Etil Asetat Setelah Dideteksi dengan Pereaksi Spesifik Sinar Tampak UV 254 UV 365 Kandungan Kesim Rf Senyawa pulan Hasil Teori Hasil Teori Hasil Teori Tidak Coklat, Fluoresens Fluoresens Alkaloid 0,88 + terlihat orange1) biru kuning/biru 1) Terpenoid 0,23 Ungu Ungu 2) + 2) Steroid 0,13 Ungu Ungu + Hijau, Tanin merah, 0,88 Hijau + (polifenolik) ungu, 1) biru Antrakuinon 0,88 Kuning Kuning 1) Ungu Flouresens1) + 0,04 Asam 0,12 Ungu Ungu 2) Ungu Ungu 2) + Lemak 0,29 1) Keterangan : (+) = Ada golongan senyawa kimia = Wagner (1983) 2) (-) = Tidak ada golongan senyawa kimia = Harborne (1996) Hasil uji skrining fitokimia menunjukkan bahwa fraksi etil asetat daun mimba mengandung senyawa alkaloid, terpenoid, steroid, tanin(polifenolik), antrakuinon, dan asam lemak. Hal tersebut terjadi karena pemisahan yang kurang baik pada saat KVC, sehingga ada komponen senyawa non polar. Alkaloid di commit to user Ý®»¿¬» ÐÜÚ º·´»- ©·¬¸±«¬ ¬¸·- ³»--¿¹» ¾§ °«®½¸¿-·²¹ ²±ª¿ÐÜÚ °®·²¬»® ø¸¬¬°æññ©©©ò²±ª¿°¼ºò½±³÷ perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id 48 dalam daun mimba mempunyai aktivitas antibakteri dikarenakan alkaloid mempunyai kontribusi membentuk interkhelat dengan DNA bakteri (Cowan, 2000). Selain itu Alkaloid dapat mengganggu terbentuknya jembatan silang komponen penyusun peptidoglikan pada sel bakteri, sehingga lapisan dinding sel tidak terbentuk secara utuh dan menyebabkan kematian sel tersebut (Ajizah, 2004). Terpenoid yang terkandung dalam fraksi etil asetat daun mimba mempunyai aktivitas antibakteri melalui perusakan membran sel bakteri (Cowan, 2000). Steroid merupakan senyawa yang mempunyai aktivitas antibakteri, mekanismenya adalah dengan cara mendesak ke dalam membran lipid sel bakteri sehingga menyebabkan kebocoran liposom sel bakteri (Raquel, 2007). Tanin mempunyai aktivitas antibakteri melalui aksi molekulernya yaitu dengan membentuk kompleks dengan protein melalui ikatan hidrogen dan ikatan hidrofobik (Cowan, 2000). Senyawa kuinon dapat menyebabkan protein bakteri menjadi inaktif dan kehilangan fungsinya (Cowan, 2000). Asam lemak dapat bersifat antibakteri karena asam lemak bersifat hidrofobik, sehingga dapat menyebabkan kerusakan struktur membran sel bakteri dan membran menjadi permeabel, kemudian akan menyebabkan kerusakan membran sitoplasma, sehingga terjadi koagulasi pada nukleoid (Nalina dan Rahim, 2007; Hornitzky, 2003). I. Kromatografi Gas-Spektrofotometer Massa (GC--MS) Hasil pengujian aktivitas antibakteri menunjukkan bahwa fraksi etil asetat mempunyai aktivitas tertinggi diantara fraksi yang lain. Oleh karena itu, untuk mengetahui komponen kimia yang terdapat dalam fraksi etil asetat dilakukan analisis menggunakan GC-MS. Dari hasil analisis diperoleh data Kromatogram yang berasal dari analisis GC dan spektra massa dari analisis MS. Hasil kromatogram GC menunjukkan adanya 12 puncak. Kromatogram GC dari fraksi etil asetat ditunjukkan pada Gambar 11. commit to user Ý®»¿¬» ÐÜÚ º·´»- ©·¬¸±«¬ ¬¸·- ³»--¿¹» ¾§ °«®½¸¿-·²¹ ²±ª¿ÐÜÚ °®·²¬»® ø¸¬¬°æññ©©©ò²±ª¿°¼ºò½±³÷ perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id 49 Gambar 7. Kromatogram GC fraksi etil asetat daun mimba Identifikasi senyawa lebih lanjut dilakukan dengan analisis spektrofotometer massa. Masing-masing puncak dari kromatogram akan diterjemahkan oleh spektrofotometer massa menjadi suatu spektra massa. Analisis dilakukan dengan membandingkan spektra massa dari senyawa target dengan standar yang ada pada library alat yaitu Willey 229.LIB, NIST62.LIB, dan penelusuran pustaka sebelumnya. Berikut ini adalah analisis spektra massa senyawa dalam fraksi etil asetat daun mimba yang teridentifikasi dengan GC-MS beserta dengan spektra massanya. 1. Senyawa Puncak 1 Spektra massa senyawa puncak 1 dengan waktu retensi 20,770 menit dan kelimpahan 0,41% ditampilkan pada Gambar 8. Dari spektra massa senyawa 1 diperkirakan bahwa senyawa ini memiliki m/z 449 [M+-H], dari literatur sebelumnya diketahui bahwa ekstrak air daun mimba mengandung senyawa azadiradione (Sadeghian, 2007). Senyawa ini merupakan senyawa golongan triterpenoid dan memiliki m/z 450 [M+]. Sehingga diperkirakan senyawa puncak 1 ini adalah senyawa golongan triterpenoid. commit to user Ý®»¿¬» ÐÜÚ º·´»- ©·¬¸±«¬ ¬¸·- ³»--¿¹» ¾§ °«®½¸¿-·²¹ ²±ª¿ÐÜÚ °®·²¬»® ø¸¬¬°æññ©©©ò²±ª¿°¼ºò½±³÷ perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id 50 Gambar 8. Spektra senyawa 1 2. Senyawa puncak 3 Spektra massa senyawa puncak 3 dengan waktu retensi 22,306 menit dan kelimpahan 28,27% ditampilkan pada Gambar 9a, sedangkan spektra massa dari senyawa standar dari library ditampilkan pada Gambar 9b. (a) (b) Gambar 9. (a). Spektra senyawa 3, (b). Spektra massa senyawa asam palmitat Spektra tersebut di atas dibuat tabel fragmentasi sebagai berikut : Tabel 12. Fragmentasi senyawa puncak 3 dibandingkan dengan standar asam palmitat (WILEY229.LIB) No. Senyawa Puncak Fragmentasi 1. Senyawa puncak 3 41 43 60 73 85 98 115 129 143 157 171 185 199 213 227 256 Standar asam 2. 41 43 60 73 85 98 115 129 143 157 171 185 - 213 227 256 palmitat commit to user Ý®»¿¬» ÐÜÚ º·´»- ©·¬¸±«¬ ¬¸·- ³»--¿¹» ¾§ °«®½¸¿-·²¹ ²±ª¿ÐÜÚ °®·²¬»® ø¸¬¬°æññ©©©ò²±ª¿°¼ºò½±³÷ perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id 51 Terlihat pada Gambar 9a dan Tabel 12, spektra massa puncak 3 mirip dengan Gambar 9b yang merupakan spektra massa dari senyawa asam palmitat, dengan Simillarity indeks 95%. Senyawa ini mempunyai berat molekul m/z 256 dengan rumus molekul C16H 32O 2. Pada penelitian sebelumnya senyawa asam palmitat juga pernah diisolasi dari biji mimba (Suirta dkk., 2007). Asam palmitat disebutkan dapat menghambat pertumbuhan bakteri Propionobacterium acnes (Yang dkk., 2009). 3. Senyawa puncak 4 Spektra massa puncak 4 dengan waktu retensi 23,551 menit dan kelimpahan 1,72% memiliki fragmen yang mirip dengan spektra massa senyawa etil linoleolat. Spektra massa senyawa puncak 4 dapat dilihat pada Gambar 10a dan spektra massa etil linoleolat dapat dilihat pada Gambar 10b. (a) (b) Gambar 10. (a). Spektra senyawa 4, (b). Spektra senyawa etil linoleolat commit to user Ý®»¿¬» ÐÜÚ º·´»- ©·¬¸±«¬ ¬¸·- ³»--¿¹» ¾§ °«®½¸¿-·²¹ ²±ª¿ÐÜÚ °®·²¬»® ø¸¬¬°æññ©©©ò²±ª¿°¼ºò½±³÷ perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id 52 Spektra tersebut di atas dapat dibuat tabel fragmentasi sebagai berikut : Tabel 13. Fragmentasi senyawa puncak 4 dibandingkan dengan standar etil linoleolat (WILEY229.LIB) No. 1. 2. Senyawa Senyawa puncak 4 Standar etil linoleolat Puncak Fragmentasi 41 55 67 79 93 108 121 135 149 163 173 41 55 67 79 95 108 121 135 149 163 173 191 236 - Tampak pada Gambar 10a dan Tabel 13 spektra massa puncak 4 mirip dengan Gambar 10b yang merupakan spektra massa etil linoleolat dengan Simillarity indeks 89%. Etil linoleolat memiliki berat molekul m/z 308 dengan rumus molekul C20H 36O 2. 4. Senyawa puncak 5 Gambar 11. Spektra senyawa 5 Spektra massa puncak 5 dengan waktu retensi 24,091 menit dan kelimpahan 45,06% memiliki [M +] 264. Dari literature sebelumnya diketahui bahwa daun dan ranting mimba mengandung senyawa asam heksadekatrienoatmetil ester, senyawa ini juga memiliki [M+] 264 dan termasuk golongan asam lemak tidak jenuh. Spektra massa puncak 5 dapat dilihat pada Gambar 11. Sehingga diperkirakan senyawa 5 termasuk dalam golongan asam lemak. 5. Senyawa puncak 6 Spektra massa puncak 6 dengan waktu retensi 24,229 menit dan kelimpahan 8,39% memiliki fragmen yang mirip dengan senyawa asam stearat. Spektra massa puncak 6 dapat dilihat pada Gambar 12a dan spektra massa dari asam stearat dapat dilihat pada Gambar 12b. commit to user Ý®»¿¬» ÐÜÚ º·´»- ©·¬¸±«¬ ¬¸·- ³»--¿¹» ¾§ °«®½¸¿-·²¹ ²±ª¿ÐÜÚ °®·²¬»® ø¸¬¬°æññ©©©ò²±ª¿°¼ºò½±³÷ - perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id 53 (a) (b) Gambar 12. (a). Spektra Senyawa 6, (b). Spektra massa senyawa asam stearat Spektra tersebut di atas dapat dibuat tabel fragmentasi sebagai berikut : Tabel 14. Fragmentasi senyawa puncak 6 dibandingkan standar asam stearat (NIST62.LIB) No. Senyawa 1. 2. Senyawa puncak 6 Standar asam stearat Puncak Fragmentasi 41 43 60 73 85 98 115 129 143 157 171 185 199 213 227 241 255 284 41 43 60 73 85 98 115 129 143 - 171 185 199 213 - 241 256 284 Tampak pada Gambar 12a dan Tabel 16, spektra massa puncak 6 mirip dengan gambar 12b yang merupakan spektra massa dari senyawa asam stearat dengan Simillarity indeks 93. Senyawa ini mempunyai berat molekul m/z 284 dengan rumus molekul C18H 36O 2. Asam stearat juga merupakan senyawa yang pernah diisolasi dari biji mimba (Suirta dkk., 2007). Asam stearat dikatakan mempunyai aktivitas antijamur dan antibakteri (Agoramoorthy, 2007). 6. Spektra puncak 7 Spektra massa puncak 7 dengan waktu retensi 24,614 menit dan kelimpahan 1,02% memiliki fragmen yang mirip dengan senyawa trans-fitol. commit to user Ý®»¿¬» ÐÜÚ º·´»- ©·¬¸±«¬ ¬¸·- ³»--¿¹» ¾§ °«®½¸¿-·²¹ ²±ª¿ÐÜÚ °®·²¬»® ø¸¬¬°æññ©©©ò²±ª¿°¼ºò½±³÷ perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id 54 Spektra massa puncak 7 dapat dilihat pada Gambar 13a dan spektra massa dari senyawa standar dari library dapat dilihat pada Gambar 13b. (a) (b) Gambar 13. (a). Spektra senyawa 7, (b) Senyawa standar trans fitol Spektra tersebut dapat dibuat tabel fragmentasi sebagai berikut : Tabel 15. Fragmentasi senyawa puncak 7 dibandingkan dengan standar trans-fitol (WILEY229.LIB) No. 1. 2. Senyawa Senyawa puncak 7 Standar trans- fitol Puncak Fragmentasi 41 43 68 81 95 109 123 137 152 165 179 41 43 68 82 95 109 123 137 151 - - 278 179 208 278 Tampak bahwa pada Gambar 13a dan Tabel 15, senyawa puncak 7 mirip dengan Gambar 13b yang merupakan spektra massa dari senyawa trans-fitol dengan Simillarity indeks 86%. Senyawa ini memiliki berat molekul m/z 296 dengan rumus molekul C20H 40. Senyawa fitol dilaporkan pernah ditemukan dalam minyak atsiri bunga mimba (Aromdee dan Sriubolmas, 2005), senyawa ini merupakan kelompok senyawa diterpen yang mempunyai fungsi sebagai antibakteri, antideuretik, antiinflamatori, dan antikanker (Uma dkk., 2011). commit to user Ý®»¿¬» ÐÜÚ º·´»- ©·¬¸±«¬ ¬¸·- ³»--¿¹» ¾§ °«®½¸¿-·²¹ ²±ª¿ÐÜÚ °®·²¬»® ø¸¬¬°æññ©©©ò²±ª¿°¼ºò½±³÷ perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id 55 7. Senyawa puncak 8 Gambar 14. Spektra Senyawa 8 Spektra massa puncak 8 mempunyai waktu retensi 26,739 menit dan kelimpahan relatif 0,74%. Dari spektra massa puncak 8 diperkirakan senyawa ini memiliki m/z 385 [M +-H], sedangkan dari literature sebelumnya diketahui bahwa senyawa nimolactone memiliki m/z 386 [M +]. Senyawa nimolactone yaitu senyawa triterpenoid yang pernah diisolasi dari kulit buah segar mimba dan dapat dilihat bahwa senyawa puncak 8 memiliki M+ yang sama dengan nimolacton. Sehingga senyawa 8 diperkirakan termasuk dalam golongan triterpenoid. Spektra massa puncak 8 ditampilkan pada Gambar 14. 8. Senyawa puncak 9 Spektra massa puncak 9 dengan waktu retensi 27,532 menit dan kelimpahan relatif 0,96% memiliki fragmen yang mirip dengan senyawa DOP (Di Oktil Ptalat). Spektra massa puncak 9 dapat dilihat pada Gambar 15a, sedangkan senyawa standarnya dapat dilihat pada Gambar 15b. (a) (b) Gambar 15. (a). Spektra senyawa 9, (b). Senyawa standar DOP commit to user Ý®»¿¬» ÐÜÚ º·´»- ©·¬¸±«¬ ¬¸·- ³»--¿¹» ¾§ °«®½¸¿-·²¹ ²±ª¿ÐÜÚ °®·²¬»® ø¸¬¬°æññ©©©ò²±ª¿°¼ºò½±³÷ perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id 56 Spektra tersebut di atas dapat dibuat tabel fragmentasi sebagai berikut : Tabel 16. Fragmentasi senyawa puncak 9 dibandingkan dengan standar DOP (WILEY229.LIB) No. 1. 2. Senyawa Senyawa puncak 9 Standar DOP Puncak Fragmentasi 41 57 71 84 104 132 149 167 168 279 41 57 71 84 104 132 149 167 - 279 Terlihat bahwa pada Gambar 15a dan Tabel 16, senyawa puncak 9 mirip dengan Gambar 15b yang merupakan spektra massa dari senyawa DOF (Di Oktil Ftalat) dengan Simillarity indeks 97%. Senyawa ini memiliki berat molekul m/z 279 dengan rumus molekul C 24H 38O 4. 9. Senyawa puncak 10 Gambar 16. Spektra senyawa 10 Senyawa puncak 10 dengan waktu retensi 29,800 menit dan kelimpahan relatif 4,81% dapat dilihat pada Gambar 16. Dari spektra massa senyawa 10 terlihat bahwa senyawa 10 memiliki M+ 424, dan dari literatur yang diperoleh senyawa ini memiliki kesamaan M+ dengan senyawa limocinone yaitu senyawa yang pernah diisolasi dari kulit buah segar mimba. Sehingga senyawa ini dapat diperkirakan termasuk golongan triterpenoid. 10. Senyawa puncak 11 Gambar 17. Spektra senyawa 11 commit to user Ý®»¿¬» ÐÜÚ º·´»- ©·¬¸±«¬ ¬¸·- ³»--¿¹» ¾§ °«®½¸¿-·²¹ ²±ª¿ÐÜÚ °®·²¬»® ø¸¬¬°æññ©©©ò²±ª¿°¼ºò½±³÷ perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id 57 Spektra massa senyawa puncak 11 dengan waktu retensi 35,309 menit dan kelimpahan 2,17% ditampilkan pada Gambar 17. Dari spektra massa senyawa 11 dapat dilihat bahwa senyawa ini memiliki [M+] 452, dari literatur yang diperoleh senyawa ini memiliki kesamaan [M+] dengan senyawa nimonol yang merupakan senyawa golongan triterpenoid yang tedapat dalam biji mimba (Moslem dan ElKholie, 2009). Sehingga dimungkinkan senyawa puncak 1 ini adalah senyawa golongan triterpenoid. 11. Senyawa puncak 12 Gambar 18. Spektra senyawa 12 Spektra massa senyawa puncak 12 dengan waktu retensi 38,883 menit dan kelimpahan 5,79% ditampilkan pada Gambar 18. Dari spektra massa senyawa 1 dapat dilihat bahwa senyawa ini memiliki [M+] 466, dan berdasarkan literatur yang diperoleh senyawa ini memiliki kesamaan [M+] dengan senyawa nimbolid yaitu merupakan senyawa golongan triterpenoid. nimbolid merupakan senyawa yang diisolasi dari ekstrak air daun mimba (Sadeghian, 2007). Sehingga dimungkinkan senyawa puncak 1 ini adalah senyawa golongan triterpenoid. Hasil analisis dengan GC-MS menunjukkan bahwa fraksi etil asetat mengandung 11 senyawa yaitu asam palmitat, etil linoleolat, asam stearat, transfitol, DOF (Di Oktil Ftalat), dan diperkirakan mengandung 1 senyawa golongan asam lemak dan 5 senyawa golongan triterpenoid. Senyawa-senyawa tersebut diperkirakan menyebabkan fraksi etil asetat daun mimba mempunyai aktivitas antibakteri terhadap ketiga bakteri uji. commit to user Ý®»¿¬» ÐÜÚ º·´»- ©·¬¸±«¬ ¬¸·- ³»--¿¹» ¾§ °«®½¸¿-·²¹ ²±ª¿ÐÜÚ °®·²¬»® ø¸¬¬°æññ©©©ò²±ª¿°¼ºò½±³÷ perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id BAB V PENUTUP A. KESIMPULAN Berdasarkan hasil dan pembahasan dapat diambil kesimpulan sebagai berikut : 1. Fraksi daun mimba hasil pemisahan KVC mempunyai aktivitas antibakteri Staphylococcus epidermidis, Bacillus cereus, dan Shigella flexneri dan fraksi teraktif antibakteri terhadap ketiga bakteri uji adalah fraksi etil asetat. 2. Potensi antibakteri fraksi etil asetat apabila dibandingkan terhadap amoksisilin adalah 0,01% untuk S. epidermidis, 0,02% untuk B. cereus, dan 0,02% untuk S. flexneri, sedangkan potensi antibakteri fraksi etil asetat apabila dibandingkan terhadap kloramfenikol adalah 0,04% untuk S. epidermidis, 0,02% untuk B. cereus, dan 0,06% untuk S. flexneri. Potensi antibakteri fraksi etil asetat masih lebih kecil apabila dibandingkan dengan amoksisilin dan kloramfenikol, namun bisa digunakan sebagai alternatif antibakteri baru. 3. Fraksi etil asetat daun mimba mengandung senyawa alkaloid, terpenoid, steroid, tanin(polifenolik), antrakuinon, dan asam lemak. Identifikasi komponen kimia fraksi etil asetat menggunakan GC-MS menunjukkan adanya 11 senyawa yaitu asam palmitat, etil linoleolat, asam stearat, trans fitol, DOF (Di Oktil Ftalat), dan diperkirakan mengandung 1 senyawa golongan asam lemak serta 5 senyawa golongan triterpenoid. B. SARAN Perlu dilakukan pemisahan lebih lanjut terhadap senyawa-senyawa yang terkandung dalam fraksi etil asetat daun mimba (Azadirachta indica A. Juss) beserta uji aktivitas antibakteri komponen utamanya. commit to user 58 Ý®»¿¬» ÐÜÚ º·´»- ©·¬¸±«¬ ¬¸·- ³»--¿¹» ¾§ °«®½¸¿-·²¹ ²±ª¿ÐÜÚ °®·²¬»® ø¸¬¬°æññ©©©ò²±ª¿°¼ºò½±³÷
