METODE Lokasi dan Waktu Penelitian ini

METODE
Lokasi dan Waktu
Penelitian ini dilaksanakan di Bagian Ruminansia Besar, Fakultas
Peternakan, Laboratorium mikrobiologi, SEAFAST CENTER, Pusat Antar
Universitas, Institut Pertanian Bogor. Penelitian ini dilaksanakan selama 3 bulan
mulai bulan Juni sampai Agustus 2008.
Materi
Bahan baku yang digunakan dalam pembuatan salami probiotik adalah
daging sapi dan lemak sapi. Bahan lain yang digunakan adalah garam NPS (Nitrit
Polkent Salt), gula pasir, lada putih, pala, bawang putih, susu skim bubuk dan
selongsong sosis fibrosa berdiameter 60 mm. Kultur starter bakteri asam laktat yang
telah melalui tahap seleksi sebagai kandidat probiotik. Bahan yang digunakan untuk
pengasapan adalah serbuk gergaji dan tempurung kelapa. Media yang digunakan
untuk penyegaran kultur starter yaitu de Man Ragosa Sharp Broth (MRS-B) lalu
untuk pembuatan kultur induk bahan yang digunakan adalah larutan susu bubuk skim
10%. Media yang digunakan untuk pembuatan kultur kerja dan analisa mikrobiologi
adalah de Man Ragosa Sharp Agar (MRS-A), Buffer Pepton Water (BPW), Eosyn
Methylen Blue Agar (EMBA), Plate Count Agar (PCA), Vogel Johnson Agar (VJA)
dan Kalium tellurit.
Peralatan yang digunakan untuk membuat kultur kerja adalah tabung reaksi,
cawan Petri, jarum ose, inkubator. Alat yang digunakan untuk membuat salami
adalah hand stuffer, cutter, alat pengasap, kompor, baskom, timbangan, panci, dan
pisau. Alat untuk analisa mikrobiologi adalah mikroskop, alumunium foil, waterbath,
autoclave, blender, hockey stick, termometer, rak tabung reaksi, pipet dan alat gelas
lain.
Rancangan Percobaan
Rancangan yang digunakan pada penelitian ini adalah rancangan acak
lengkap (RAL) dengan perlakuan salami probiotik dengan kombinasi kultur
Lactobacillus sp 1A5 dan Lactobacillus fermentum 2B2 dan lama penyimpanan hari
ke-0, ke-10, ke-20 dan ke-30 menggunakan 3 kali ulangan.
Model matematis yang digunakan berdasarkan Steel and Torrie (1997) :
Yij = µ + Pi + εij
Keterangan :
Yij : Variabel respon akibat pengaruh lama penyimpanan ke-i pada
ulangan ke-j
µ
: Nilai tengah umum
Pi : Pengaruh lama penyimpanan ke-i terhadap kualitas mikrobiologis
salami probiotik ( i = 0, 10, 20 dan 30 hari)
εij : Pengaruh galat percobaan pada unit percobaan ke-i dalam
kombinasi perlakuan ke-j
Prosedur
Persiapan penelitian ini dimulai dengan pembiakan kultur asam laktat yang
mempunyai potensi probiotik Lactobacillus sp 1A5 dan Lactobacillus fermentum
2B2 dan pembuatan salami probiotik dan menganalisis kualitas mikrobiologis selama
penyimpanan pada hari ke-0 sebelum disimpan, kemudian dianalisis pada hari ke-10,
ke-20, dan ke-30.
Persiapan Penelitian
Pembiakan Kultur. Kultur starter murni diisolasi dari daging sapi. Kultur murni
dilakukan penyegaran pada media de Man Ragosa Sharp Broth (MRS-B). Sebanyak
2% kultur diinokulasikan ke dalam larutan skim steril 10%. Kultur kemudian
diinkubasi pada suhu 37oC selama 48 jam yang hasilnya disebut kultur induk. Kultur
induk sebanyak 2% diinokulasikan dan diinkubasikan kembali yang hasilnya disebut
kultur antara. Kultur antara sebanyak 2% diinokulasikan dan diinkubasikan kembali
yang hasilnya disebut kultur kerja. Kultur kerja ditumbuhkan pada media de Man
Ragosa Sharp Agar (MRSA) dan dihitung populasinya.
21
Kultur yang memenuhi syarat untuk siap dijadikan kandidat starter kultur untuk sosis
fermentasi adalah dengan populasi ≥ 109 CFU/ml. Tahap pembiakan kultur dapat
dilihat pada Gambar 1.
Kultur starter murni yang diisolasi dari daging sapi
Penyegaran pada media de Man Ragosa Broth (MRS-B)
2% diinokulasikan ke dalam larutan skim steril 10%
Diinkubasi pada suhu 37oC selama 48 jam
(hasilnya disebut kultur induk)
2 % dari kultur
Kultur antara
2 % dari kultur
Kultur kerja
Ditumbuhkan pada media MRS-agar
Dihitung populasinya
9
Populasi ≥ 10 CFU/ml
Populasi < 10 9 CFU/ml
Starter kultur untuk salami
Gambar 1. Pembiakan Starter Kultur (Arief, 2000)
Penelitian Utama
Pembuatan Salami Probiotik. Bakteri asam laktat yang digunakan sebagai starter
kultur pada pembuatan salami probiotik ditentukan berdasarkan seleksi bakteri asam
laktat yang mempunyai potensi sebagai probiotik. Starter kultur yang dipakai adalah
kombinasi bakteri asam laktat 1A5 dan 2B2 sebanyak 2% dengan perbandingan
jumlah kultur yang diinokulasikan sebesar 1:1. Setelah diinokulasikan kemudian
proses conditioning selama 1 hari dilanjutkan dengan pematangan pada suhu ruang
dan pengasapan dingin selama 3 hari. Kemudian salami tersebut diteliti kualitas
mikrobiologisnya selama penyimpanan.
22
Proses pembuatan salami dilakukan dengan 3 ulangan dan diamati pada 4
titik penyimpanan data diambil secara duplo, sehingga terdapat 24 data untuk
masing-masing peubah yang diukur. Sebelum dilakukan pembuatan salami, daging
dianalisis kualitas mikrobiologisnya.
Proses pembuatan salami yang dilakukan adalah sebagai berikut ,daging
digiling lalu dibekukan dengan metode pembekuan lambat di dalam freezer berikut
lemak. Daging dan lemak yang dibekukan kemudian dicampurkan dan digiling ke
dalam bowl cutter dengan penambahan berturut-turut bumbu, gula pasir 2%, starter
kultur dan garam NPS (Nitrit Polken Salt) sebanyak 2% dari total adonan. Starter
kultur yang ditambahkan harus mempunyai jumlah populasi minimal 108 CFU/g
(Arief, 2000), dan penambahannya sebanyak 2% (b/v). Temperatur proses ini harus
dijaga dan tidak melebihi 20C. Adonan dengan kehalusan sebesar menir (butiran
beras) kemudian dimasukan kedalam selongsong (casing) yang mempunyai diameter
5 cm. Formulasi pembuatan Salami Probiotik dapat dilihat di Tabel 4.
Tabel 4. Formulasi Adonan Salami yang Digunakan
Bahan
Jumlah yang Digunakan (g)
Bahan Utama
Daging Sapi
720
Lemak Sapi
180
Bahan Tambahan ................………………………...
Gula pasir
Starter Kultur
NPS
Bawang Putih
Ketumbar
Lada Halus
Jahe Halus
Pala Halus
11,25
18
18
11,25
4,5
4,5
4,5
2,25
Persen
80
20
( % dari jumlah total
daging + lemak sapi )
1,25
2
2
1,25
0,5
0,5
0,5
0,25
Sumber : Arief, (2000)
Proses conditioning dilakukan pada suhu kamar selama 24 jam, yang
dilanjutkan dengan pengasapan dingin selama 3 hari, pada suhu 25-28oC selama 3
jam per harinya, kemudian setelah pengasapan dilakukan proses fermentasi dan
pematangan sosis dalam ruang fermentasi pada suhu kamar. Setelah 3 hari proses
fermentasi berlangsung maka diperoleh sosis fermentasi. Setelah sosis fermentasi
terbentuk, kemudian disimpan pada suhu 10o ± 2o C dan dilanjutkan dengan analisa
23
kualitas mikrobiologis selama penyimpanan 0, 10, 20, dan 30 hari. Alur proses
perlakuan dari bahan baku hingga pembuatan dan penyimpanan salami dapat dilihat
pada Gambar 2. Proses pembuatan salami probiotik dapat dilihat pada Gambar 3.
Daging dari pasar
Lemak dari pasar
Cooler box
Cooler box
Dipotong dadu
Dipotong dadu
Digiling dengan mincer
Digiling dengan mincer
Analisis kualitas
mikrobiologis daging
Dibekukan
Analisis kualitas
mikrobiologis adonan
Dibuat salami
Conditioning 1 hari,
proses fermentasi dan
pengasapan 3 hari
Disimpan pada suhu 10oC ± 2oC
Analisis kualitas mikrobiologis
salami selama penyimpanan
Hari ke-0 sebelum disimpan
Hari ke-10
Hari ke-20
Hari ke-30
Gambar 2. Alur Proses Perlakuan dari Bahan Baku hingga Pembuatan dan
Penyimpanan Salami
24
Daging (80%)
Lemak (20%)
Digiling
Dibekukan
Digiling ke dalam cutter
Dimasukkan
bumbu, gula,
starter kultur
dan NPS
Dimasukkan ke dalam selongsong
Conditioning (suhu kamar, 24 jam)
Proses fermentasi (suhu kamar, 3 hari) yang diselingi
dengan proses pengasapan selama 3 jam per harinya pada suhu kamar
Salami
Gambar 3. Pembuatan Salami (Arief, 2000)
Pengukuran Peubah
Uji Kualitas Mikrobiologis Daging. Sebelum dilakukan analisis mikrobiologi,
sampel daging segar dipersiapkan terlebih dahulu dengan cara sebagai berikut:
sebanyak 5 gram sampel daging dimasukan ke dalam plastik steril lalu ditambahkan
45 ml larutan pengencer steril, kemudian dikocok diremas-remas hingga diperoleh
campuran yang homogen dengan konsentrasi 0,1g/ml. Sampel ini kemudian
diencerkan dengan larutan pengencer sesuai dengan kebutuhan dan siap untuk
plating.
Total Bakteri Asam Laktat. Prosedur analisis bakteri asam laktat dilakukan
dengan media tuang sesuai petunjuk APHA (1992). Sebanyak 5 gram sampel daging
yang telah disiapkan diencerkan menggunakan 45 ml BPW lalu dipipet secara
25
aseptik sebanyak 1ml lalu dimasukan ke tabung yang berisi media pengencer BPW 9
ml yang selanjutnya disebut pengenceran 10-1, sebanyak 1ml diambil dari tabung
pengenceran 10-1 dimasukan ke tabung kedua yang berisi BPW
9 ml yang
-2
selanjutnya disebut pengenceran 10 , kemudian dilakukan prosedur yang sama
sampai pengenceran 10-7. Media tumbuh yang digunakan adalah de Man Ragosa
Sharp Agar (MRS-A) lalu pengenceran 10-5 sampai 10-7 dipupukkan ke dalam cawan
petri steril secara duplo, selanjutnya diinkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam dan
dihitung populasinya. Koloni yang berwarna putih atau kekuning-kuningan
merupakan koloni bakteri asam laktat.
Analisis Total Plate Count (APHA, 1992). Sebanyak 5 gram sampel yang
telah disiapkan diencerkan menggunakan 45 ml BPW lalu dipipet secara aseptik pada
pengenceran 10-6 sampai 10-8 dan dipupukkan sebanyak 1 ml ke dalam cawan petri
steril, selanjutnya ditambahkan medium Plate Count Agar (PCA), dihomogenkan
dengan cawan diputar membentuk angka delapan. Jika agar telah beku inkubasi pada
suhu 37o selama sekitar 24 jam. Cara perhitungan jumlah koloni adalah sebagai
berikut :
Jumlah bakteri = rata-rata jumlah koloni x faktor pengencer.
Selang jumlah bakteri yang digunakan adalah 25-250 koloni.
Analisis Kuantitatif Escherichia coli. Sebanyak 5 gram sampel yang telah
disiapkan diencerkan menggunakan 45 ml BPW lalu dipipet secara aseptik pada
pengenceran 10-2 sampai 10-4 dan dipupukkan sebanyak 0,1 ml ke dalam cawan petri
steril. Sampel dipupukkan ke dalam cawan yang telah berisi media Eosyn Methylen
Blue Agar (EMBA) beku. Sampel disebarkan dengan alat hockey stick yang steril
hingga merata. Inkubasi dilakukan selama 24 jam pada suhu 37oC, koloni E coli yang
tumbuh berwarna biru keunguan.
Analisis Kuantitatif total Staphylococcus aureus ( Fardiaz, 1982). Analisis
terhadap Staphylococcus spp. menggunakan metode hitungan cawan seperti halnya
angka lempeng total bakteri. Masing-masing sebanyak 1 ml dari pengencer
pengenceran
10-2 sampai 10-5 dipipet kemudian dipupukkan pada media Vogel
Johnson Agar (VJA) dengan Kalium Tellurit 6%. Inkubasi pada suhu 370 C selama
24 jam, kemudian dihitung populasinya dengan melihat karakter koloni berwarna
hitam.
26
Uji Kualitas Mikrobiologis Adonan dan Salami. Sebelum dilakukan analisis
mikrobiologi, sampel dipersiapkan terlebih dahulu dengan cara sebagai berikut :
sebanyak 5 gram sampel dimasukan ke dalam plastik steril lalu ditambahkan 45 ml
larutan pengencer steril, kemudian dihancurkan hingga diperoleh campuran yang
homogen dengan konsentrasi 0,1g/ml. Sampel ini kemudian diencerkan dengan
larutan pengencer sesuai dengan kebutuhan dan siap untuk plating.
Total Bakteri Asam Laktat. Prosedur analisis bakteri asam laktat dilakukan
dengan media tuang sesuai petunjuk APHA (1992). Sebanyak 5 gram sampel salami
yang telah disiapkan diencerkan menggunakan 45 ml BPW lalu dipipet secara
aseptik sebanyak 1ml lalu dimasukan ke tabung yang berisi media pengencer BPW 9
ml yang selanjutnya disebut pengenceran 10-1, sebanyak 1ml diambil dari tabung
pengenceran 10-1 dimasukan ke tabung kedua yang berisi BPW
9 ml yang
-2
selanjutnya disebut pengenceran 10 , kemudian lakukan prosedur yang sama sampai
pengenceran 10-9. Media tumbuh yang digunakan adalah de Man Ragosa Sharp Agar
(MRS-A) lalu pengenceran 10-7 sampai 10-9 dipupukkan ke dalam cawan petri steril
secara duplo, selanjutnya diinkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam dan dihitung
populasinya. Koloni yang berwarna putih atau kekuning-kuningan merupakan koloni
bakteri asam laktat.
Analisis Total Plate Count (APHA, 1992). Sebanyak 5 gram sampel yang
telah disiapkan diencerkan menggunakan 45 ml BPW lalu dipipet secara aseptik pada
pengenceran 10-13 sampai 10-15 dan dipupukkan sebanyak 1 ml ke dalam cawan petri
steril, selanjutnya ditambahkan medium Plate Count Agar (PCA), dihomogenkan
dengan cawan diputar membentuk angka delapan. Jika agar telah beku inkubasi pada
suhu 37o selama sekitar 24 jam. Cara perhitungan jumlah koloni adalah sebagai
berikut :
Jumlah bakteri = rata-rata jumlah koloni x faktor pengencer
Selang jumlah bakteri yang digunakan adalah 25-250 koloni.
Analisis Kuantitatif Escherichia coli. Sebanyak 5 gram sampel yang telah
disiapkan diencerkan menggunakan 45 ml BPW lalu dipipet secara aseptik pada
pengenceran 10-2 sampai 10-4 dan dipupukkan sebanyak 0,1 ml ke dalam cawan petri
steril. Sampel dipupukkan ke dalam cawan yang telah berisi media Eosyn Methylen
Blue Agar (EMBA) beku. Sampel disebarkan dengan alat hockey stick yang steril
27
hingga merata. Inkubasi dilakukan selama 24 jam pada suhu 37oC, koloni E coli yang
tumbuh berwarna biru keunguan.
Analisis Kuantitatif total Staphylococcus aureus ( Fardiaz, 1982). Analisis
terhadap Staphylococcus spp. menggunakan metode hitungan cawan seperti halnya
angka lempeng total bakteri. Masing-masing sebanyak 1 ml dari pengencer
pengenceran
10-3 sampai 10-5 dipipet kemudian dipupukkan pada media Vogel
Johnson Agar (VJA) dengan Kalium Tellurit 6%. Inkubasi pada suhu 370 C selama
24 jam, kemudian dihitung populasinya dengan melihat karakter koloni berwarna
hitam.
28