Prihatiningtyas TR (C14052554)

IV. HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Hasil
4.1.1 Analisis Ekspresi Gen GFP pada Beberapa Jaringan Menggunakan
Metode PCR
Hasil PCR dengan cetakan cDNA saat 24 jam dan 1 minggu pasca injeksi
(p.i.) menunjukkan bahwa gen GFP terekspresi pada jaringan ginjal, insang,
limpa, dan otot yang diperlihatkan dengan keberadaan pita DNA yang sejajar
dengan pita DNA kontrol positif (Gambar 1 dan 2). Tingkat ekspresi gen GFP
berbeda antara 24 jam dan 1 minggu p.i. Pada 24 jam p.i, gen GFP diekspresikan
pada semua jaringan dengan menggunakan heat shock-GFP, keratin-GFP, dan βaktin-GFP, yang ditandai dengan adanya pita DNA produk PCR (Gambar 1A).
Ekspresi gen GFP yang lebih tinggi terdapat pada jaringan otot dibandingkan
jaringan lainnya untuk perlakuan keratin-GFP dan β-aktin-GFP. Pada 1 minggu
p.i, ekspresi gen GFP menurun yang ditandai dengan intensitas/ketebalan pita
DNA produk PCR menurun pada beberapa jaringan (Gambar 2A). Ekspresi gen
GFP pada perlakuan heat shock-GFP hanya muncul pada jaringan ginjal dan otot.
Pada perlakuan keratin-GFP, ekspresi gen GFP hanya terdeteksi pada jaringan
insang, ginjal, dan otot. Pada perlakuan β-aktin-GFP, ekspresi gen GFP muncul
pada jaringan ginjal, insang, dan otot. Ekspresi GFP yang tinggi terdapat pada
jaringan otot perlakuan heat shock-GFP. Berdasarkan kontrol internal, DNA
cetakan dalam kondisi baik. Hal ini ditunjukkan dengan keberadaan hasil
amplifikasi dengan primer β-aktin (Gambar 1B dan 2B)
A
B
Gambar 1. Ekspresi gen GFP yang dianalisis menggunakan metode PCR pada
beberapa jaringan setelah 24 jam injeksi (A) dengan PCR β-aktin
sebagai kontrol internal (B).
A
B
Gambar 2. Ekspresi gen GFP yang dianalisis menggunakan metode PCR pada
beberapa jaringan setelah 1 minggu injeksi (A) dengan PCR
β-aktin sebagai kontrol internal (B).
Keterangan:
M
No. 1,2,3,4
No. 5,6,7,8
No. 9,10,11,12
No. 13
No. 14
= marker
= heat shock-GFP (ginjal, insang, limpa, otot)
= keratin-GFP (ginjal, insang, limpa, otot)
= β-aktin-GFP (ginjal, insang, limpa, otot)
= kontrol positif (produk PCR dengan cetakan plasmid DNA)
= kontrol negatif (produk PCR tanpa cetakan plasmid DNA)
4.1.2 Analisis Ekspresi Gen
Gen GFP pada Beberapa Jaringan Menggunakan
Mikroskop Fluoresensi
Dengan menggunakan mikroskop fluoresensi, ekspresi gen GFP mulai
muncul 8 jam p.i (Gambar 3). Ekspresi GFP terdapat pada jaringan ginjal, insang,
limpa, dan otot hasil injeksi dengan ketiga konstruksi yang diuji. Ekspresi gen
GFP yang dikendalikan dengan promoter heat shock pada jaringan ginjal lebih
tinggi dibandingkan pada jaringan insang, limpa, dan otot. Ekspresi GFP yang
dikendalikan oleh promoter keratin lebih tinggi pada jaringan insang, ginjal, dan
otot dibandingkan pada jaringan limpa. Sementara itu, ekspresi gen GFP yang
dikendalikan oleh promoter β-aktin lebih tinggi pada jaringan ginjal dan otot
dibandingkan jaringan insang dan limpa.
Gambar 3. Ekspresi gen GFP yang dikontrol oleh promoter heat shock-GFP,
keratin-GFP, dan β-aktin-GFP pada beberapa jaringan setelah 8
jam injeksi.
Tingkat ekspresi GFP setelah 24 jam injeksi mengalami peningkatan bila
dibandingkan setelah 8 jam injeksi (Gambar 4). Ekspresi GFP yang dikendalikan
oleh promoter heat shock terlihat pada jaringan insang, ginjal, limpa, dan otot,
dimana pendaran lebih terang
terang terdapat pada jaringan otot dan insang dibandingkan
pada jaringan ginjal dan limpa. Hal ini sejalan dengan pola ekspresi gen GFP
menggunakan metode PCR setelah 24 jam injeksi. Pola ekspresi gen GFP yang
dikendalikan oleh promoter keratin yang diamati menggunakan
menggunakan mikroskop
fluoresensi sejalan dengan hasil analisis PCR. Ekspresi GFP terlihat pada jaringan
insang, ginjal, limpa, dan otot, dimana pendaran lebih terang terdapat pada
jaringan otot. Demikian juga dengan hasil analisis ekspresi gen GFP yang
dikendalikan oleh promoter β-aktin sejalan antara hasil analisis menggunakan
mikroskop fluoresensi dengan analisis PCR.
Gambar 4. Ekspresi gen GFP yang dikontrol oleh promoter heat shock-GFP,
keratin-GFP, dan β-aktin-GFP pada beberapa jaringan setelah 24
jam injeksi.
Ekspresi GFP mulai melemah ketika 1 minggu p.i (Gambar 5). Ekspresi
GFP yang dikendalikan oleh promoter heat shock GFP hanya terdapat pada
jaringan otot dan ginjal, dan level ekspresi GFP pada otot lebih tinggi
dibandingkan pada ginjal. Hasil ini sejalan dengan apa yang ditunjukkan dengan
analisis PCR. Hasil analisis ekspresi gen GFP yang dikendalikan oleh promoter
keratin menggunakan mikroskop fluoresensi dan PCR juga sejalan, yaitu ekspresi
GFP yang lebih tinggi terdapat pada jaringan limpa dibandingkan pada jaringan
otot dan insang. Sementara itu, dengan promoter β-aktin, ekspresi GFP hanya
terdapat pada jaringan ginjal, insang, dan otot dengan pendaran lebih rendah
dibandingkan dengan kedua promoter yang lain. Pengamatan GFP menggunakan
mikroskop fluoresensi dilakukan hingga 2 bulan dan diperoleh hasil bahwa
ekspresi pada beberapa jaringan semakin melemah, tetapi masih ditemukan
pendaran kurang terang pada jaringan otot pada semua promoter yang diuji
(Gambar 6)
Gambar 5. Ekspresi gen GFP yang dikontrol oleh promoter heat shock-GFP,
keratin-GFP, dan β-aktin-GFP pada beberapa jaringan setelah 1
minggu injeksi.
Gambar 6. Ekspresi gen GFP pada yang dikontrol oleh promoter heat shockGFP, keratin-GFP, dan β-aktin-GFP pada beberapa jaringan setelah
2 minggu injeksi.
4.2 Pembahasan
Promoter dapat aktif dan mengendalikan ekspresi pada waktu dan tempat
yang tepat dengan adanya kerjasama antara elemen-elemen penyusun promoter
tersebut. Ekspresi GFP yang terlihat pada jaringan ginjal, insang, limpa, dan otot
perlakuan heat shock-GFP, keratin-GFP, dan β-aktin-GFP membuktikan bahwa
promoter heat shock yang diisolasi dari ikan rainbow trout maupun promoter
keratin yang diisolasi dari ikan flounder Jepang, dan promoter β-aktin yang
diisolasi dari ikan medaka dapat aktif di berbagai jaringan pada ikan mas,
sehingga ketiga jenis promoter tersebut tidak bersifat spesifik pada suatu jenis
ikan tertentu. Dari ketiga promoter diduga bahwa promoter keratin mampu
mengendalikan ekspresi gen GFP lebih baik dibandingkan promoter heat shock
dan β-aktin. Hal ini dapat dilihat dari tingkat dan lama waktu ekspresi gen GFP
pada jaringan ginjal, insang, limpa, dan otot. Perbedaan tingkat ekspresi gen GFP
yang terjadi diduga karena elemen cis-regulator keratin dapat berikatan lebih baik
atau lebih sesuai dengan elemen trans-regulator ikan mas.
Iyengar et al. (1996) menyebutkan bahwa efektivitas suatu promoter
dalam mengendalikan gen untuk terekspresi sangat terkait erat dengan kesesuaian
antara elemen cis-regulator pada promoter dengan elemen trans-regulator pada
inang target. Hal senada juga disebutkan oleh Hackett (1993) bahwa jika elemen
cis-regulator suatu promoter cocok dengan elemen trans-regulator, maka
umumnya ekspresi gen yang dikendalikan tinggi, sebaliknya apabila tidak atau
kurang sesuai maka ekspresi gen yang dikendalikan akan rendah. Dunham (2004)
juga menyebutkan bahwa perbedaan tingkat ekspresi dikarenakan promoter yang
diintroduksikan bukan berasal dari ikan yang homolog. Promoter yang bukan
berasal dari ikan yang homolog memiliki interaksi antara elemen cis-regulator
pada promoter dan elemen trans-regulator inang yang berbeda. Selanjutnya
dijelaskan pula bahwa promoter keratin merupakan promoter yang digunakan
pada teknologi transgenesis yang terkait dengan sistem imun, karena
efektivitasnya yang tinggi pada jaringan kulit (Gong et al., 2002).
Pada penelitian ini berdasarkan hasil PCR DNA 1 minggu p.i didapat
bahwa secara kuantitatif promoter keratin terekspresi pada 3 jaringan, yaitu
insang, limpa, dan otot dengan aktivitas lebih tinggi pada jaringan limpa.
Promoter β-aktin juga terekspresi pada 3 jaringan, yaitu ginjal, insang, dan otot.
Akan tetapi aktivitasnya lebih rendah. Sedangkan promoter heat shock hanya
terekspresi pada 2 jaringan saja, yaitu ginjal dan otot. Sehingga diduga bahwa
promoter keratin dimana pada jaringan limpanya mempunyai aktivitas lebih tinggi
dibanding yang lain akan bekerja lebih baik dalam mengendalikan gen
imunogenik dalam pencegahan infeksi virus KHV pada ikan mas.
Adanya ekspresi gen GFP pada jaringan ginjal, insang, dan limpa
menunjukkan bahwa plasmid DNA diduga didistribusikan ke berbagai jaringan
melalui darah (Gome-Chiarri et al., 1999 dalam Zheng et al., 2006). Ginjal depan
dan limpa merupakan organ yang berperan dalam pembentukan sel darah. Organ
ini merupakan jaringan limfomyeloid utama (Rijkers, 1981). Menurut Ferguson
(1989), ginjal ikan terletak retroperitoneal di bawah tulang vertebrae. Bagian
anteriornya berfungsi sebagai organ limfomyeloid, sedangkan bagian posteriornya
berfungsi sebagai organ ekskretori. Sedangkan limpa terletak dekat lengkung
lambung pada belokan usus, berwarna merah gelap atau hitam, dibalut oleh
lapisan tipis jaringan ikat. Pulpa putihnya banyak mengandung limfosit. Pulpa
merah limpa banyak mengandung eritrosit dan mengandung melanomakrofag
center (MMC) yang juga memainkan peranan yang penting dalam sistem imun
ikan (Lamers & De Haas, 1985).
Insang adalah salah satu organ target KHV selain ginjal. Dari kajian
histopatologi insang ikan yang sakit menunjukkan bahwa terdapat sel-sel
inflamasi di insang dan epitel insang mengalami hiperplasia. Sedangkan pada
ginjal, tampak jelas bahwa virus ini mengakibatkan inflamasi pada renal tubul
ginjal dan mengakibatkan sel-sel yang terinfeksi mengalami pembentukan badan
inklusi pada inti selnya. Kemudian berdasarkan kajian dengan menggunakan
indirect immunofluorescen microscopy terhadap insang, ginjal, otak dan hati
diketahui bahwa virus KHV terakumulasi pada insang dan ginjal (Pikarsky et al.
2004).
Otot mengandung lendir/mukus yang merupakan barier pertahanan tubuh
yang bersifat fisik dan kimiawi. Patogen harus menembus barikade lendir/mukus.
Lendir ini memiliki kemampuan untuk menggumpalkan antigen secara kimiawi.
Setelah itu patogen harus mampu menerobos kulit maupun melewati sisik terlebih
dahulu untuk ikan yang bersisik. Setelah bagian ini lolos maka patogen harus
berhadapan dengan sistem pertahanan non-spesifik lainnya dalam tubuh
(Anderson, 1974).
Pada penelitian ini, ekspresi gen GFP mulai muncul 8 jam p.i. Hal ini
berbeda dengan hasil penelitian Zheng et al. (2006) dimana ekspresi gen GFP
muncul 36 jam p.i. Namun demikian, pola ekspresi gen yang dikendalikan oleh
ketiga promoter adalah sama, yaitu pada awalnya rendah, meningkat, kemudian
menurun hingga tidak terdeteksi lagi. Ekspresi gen GFP yang dikendalikan oleh
ketiga promoter muncul hingga 2 bulan (60 hari) p.i. Kim et al. (2000)
menyebutkan bahwa aplikasi vaksin DNA yang mengandung sisipan gen
glikoprotein dapat menginduksi terbentuknya alpha/beta interferon pada ikan
rainbow trout yang diuji tantang setelah 21 atau 70 hari pasca penginjeksian
plasmid yang mengandung vaksin DNA. Alpha/beta interferon tersebut yang akan
bertindak sebagai mediator untuk menginduksi perlindungan antiviral yang
bersifat non-spesifik dan selanjutnya terbentuk pula respons imun yang bersifat
spesifik sehingga proteksi yang diberikan akan berlangsung cukup lama karena
respons imun yang terbentuk tidak hanya bersifat non spesifik tetapi juga bersifat
spesifik, yaitu terhadap gen G (glikoprotein). Proteksi tersebut terjadi secara
signifikan empat hari setelah vaksinasi selama 28 hari. Berdasarkan lama waktu
munculnya ekspresi gen GFP dapat diduga jika aplikasi vaksin DNA
menggunakan salah satu dari ketiga promoter tersebut akan mampu menginduksi
respons imun pada ikan.
Penggunaan vaksin pada ikan dapat dilakukan dengan berbagai metode,
yaitu suntikan (injection), perendaman (immersion), dan melalui pakan (oral).
Namun cara yang paling umum dan mudah adalah dengan cara injeksi melalui
intraperitonial atau intramuskular. Injeksi intramuskular (IM) sederhana plasmid
DNA yang telah dimurnikan dalam buffer netral lebih efisien diterapkan pada ikan
daripada hewan tipe lain (Lorenzen et al., 2005). Menurut Ellis (1988)
penggunaan vaksin melalui injeksi memiliki kelebihan, yaitu vaksin dapat masuk
ke dalam tubuh ikan dengan jumlah yang tepat sehingga efektivitasnya terjamin.
Sedangkan kekurangannya adalah tidak efisien digunakan pada ikan yang
berukuran kecil dan jumlah yang banyak. Meskipun aplikasi melalui injeksi IM
merupakan metode yang dapat dipertimbangkan dalam vaksinasi, akan tetapi
pengembangan aplikasi dengan metode yang lain perlu terus dilakukan misalnya
melalui perendaman atau melalui pencampuran dengan pakan (edible vaccine)
dengan mempertimbangkan keamanan bagi lingkungan.
Dari ekspresi gen GFP yang terjadi pada ikan mas, menunjukkan bahwa
promoter keratin dapat direkomendasikan sebagai vektor dalam pembuatan vaksin
DNA untuk menanggulangi infeksi KHV. Aplikasi vaksin DNA dilakukan dengan
cara mengganti gen GFP dengan gen target tertentu misalnya gen imunogenik
(glikoprotein). Oleh karena itu perlu diuji lebih lanjut untuk membuktikan
hubungan waktu aktivitas promoter dengan waktu infeksi virus.