Identifikasi Bakteri Asam Laktat Isolat 9A dari Kolon Sapi Bali

JURNAL
JSV 33 (2), Desember 2015
SAIN VETERINER
ISSN : 0126 - 0421
Identifikasi Bakteri Asam Laktat Isolat 9A dari Kolon Sapi Bali sebagai
Probiotik melalui Analisis Gen 16S rRNA
(Studies on Lactic Acid Bacteria Isolate 9A from Bali Cattle' Colon as a Probiotic Through 16S
rRNA Gene Analysis)
1
2
Dewa Gede Agung Widyadnyana , I Dewa Made Sukrama , I Wayan Suardana
1
3*
2
Mahasiswa, Fakultas Kedokteran Hewan; Laboratorium Mikrobiologi Klinik Fakultas Kedokteran;
3
Laboratorium Kesmavet, Fakultas Kedokteran Hewan, Universitas Udayana
*)
Corresponding author: [email protected]
ABSTRACT
Lactic acid bacteria (LAB) is a bacterium that ferment lactose to produce lactic acid as the main product.
Moreover, LAB also known potentially producing bacteriosins which has antimicrobial activity. On the order
hands, Bali cattle has many advantages, one of them is their adaptation to survive in less nutritious food. Their
characteristics were believed as a source of potential LAB. The aims of study was to discover the antimicrobial
activity of LAB isolate 9A isolated from colon of bali cattle, so that it can be used as a probiotic, and to analyze
the nucleotides sequences of 16S rRNA gene as well as their's phylogenetic tree. The LAB isolates were
cultivated on MRS broth, followed by catalase test and stained with Gram staining. The antimicrobial activity
was confirmated by testing them against pathogen bacteria (Escherichia coli and Staphylococcus aureus). The
molecular analyses in order to confirm the strain of isolate was done by amplification of the 16S rRNA gene by
using B27F and U1492R primers... The result of study showed antimicrobial activity of LAB isolate 9A against
the growth of S.aureus is 37.56 – 61.47% with an average 50.35% compared antibiotic control. On the other
hands, the isolate showed no antimicrobial activity to Escherichia coli. The isolate was identified as
Streptococcus bovis (99% similarity with bootstrap value 100).
Keywords: Lactic acid bacteria, bali cattle's colon, antimicrobial activity, 16S rRNA gene.
ABSTRAK
Bakteri asam laktat (BAL) merupakan bakteri yang mampu memfermentasi laktosa dan menghasilkan asam
laktat sebagai produk utamanya. BAL berpotensi dalam memproduksi bakteriosin dan bersifat probiotik. Disisi
lain, sapi bali diketahui memiliki banyak keunggulan salah satunya mampu memanfaatkan hijauan yang kurang
bergizi, dan mempunyai daya cerna yang baik terhadap pakan, sehingga diharapkan dapat ditemukan BAL yang
memiliki keunggulan spesifik. Penelitian ini bertujuan untuk dapat mengetahui aktivitas antimikroba BAL isolat
9A asal kolon sapi bali sehingga bisa di manfaatkan sebagai kandidat probiotik, serta untuk menganalisis
susunan nukleotida dan gambaran pohon filogenetiknya. Penelitian diawali dengan kultivasi isolat pada media
MRS broth, dilanjutkan dengan uji katalase dan pewarnaan Gram. Isolat BAL yang sudah terkonfirmasi diuji
aktivitas antimikrobanya dengan bakteri patogen (Escherichia coli dan Staphylococcus aureus). Analisis
molekuler dilakukan dengan amplifikasi gen 16S rRNA menggunakan primer B27F dan U1492R. Hasil
penelitian menunjukkan aktivitas antimikroba bakteri asam laktat isolat 9A mampu menghambat pertumbuhan
S. aureus antara 37,56 - 61,47%, dengan rata-rata 50.35% jika dibandingkan dengan kontrol antibiotika. Dalam
penelitian ini BAL tidak menunjukkan terjadinya penghambatan pada pertumbuhan E. Coli. BAL isolat 9A
teridentifikasi sebagai Streptococcus bovis dengan tingkat similaritas 99% dan berada satu cluster dengan
spesies Streptococcus bovis dengan nilai bootstrap sebesar 100.
Kata kunci: Bakteri asam laktat, kolon sapi bali, aktivitas antimikroba, gen 16S rRNA
228
Dewa Gede Agung Widyadnyana et al.
menyebabkan kesalahan identifikasi
PENDAHULUAN
Bakteri asam laktat (BAL) merupakan bakteri Gram
positif, tidak berspora, berbentuk basil atau kokus,
fakultatif anaerob dan mampu memfermentasi
laktosa dengan asam laktat sebagai hasil utamanya.
Peranan penting BAL adalah memecah protein
menjadi monopeptida asam amino tersedia bagi
tubuh serta menghasilkan bakteriosin (Widodo,
2003). Bakteriosin memiliki peranan dalam
menanggulangi kejadian infeksi, aman dan tidak
menimbulkan resistensi (Marshall dan Arenas,
2003)
Sapi bali yang merupakan sapi asli Indonesia,
merupakan hasil domestikasi banteng (Bos (Bibos)
banteng) (Batan, 2006) dengan keunggulannya
mudah beradaptasi dengan lingkungannya, serta
dapat hidup di lahan kritis karena dapat
memanfaatkan hijuan yang kurang bergizi, dan
mempunyai daya cerna yang baik terhadap pakan
(Hardjosubroto, 1994). Diketahui bahwa pakan
memberikan pengaruh terhadap ekologi dari bakteri
(misidentification) (Chenooll et al., 2003). Metode
genotipik yang banyak diaplikasikan dalam studi
identifikasi mikrobia adalah menggunakan analisis
skuen gen 16S dan 23S rRNA (Anindita, 2013).
Isolat bakteri asam laktat (BAL) 9A merupakan
bakteri asam laktat hasil isolasi 20 sampel feses yang
berasal dari kolon sapi bali yang sudah terkonfirmasi
sebagai BAL didasarkan atas uji penumbuhan pada
MRS, uji katalase, pewarnaan Gram dan diketahui
memiliki potensi antimikroba terhadap
pertumbuhan bakteri patogen (Lindawati dan
Suardana, 2014), namun sejauh ini konfirmasi
akurat tentang potensi serta analisis secara genetik
dengan analisis gen 16S rRNA belum pernah
dilakukan. Berdasarkan uraian tersebut, maka kajian
ini menarik untuk disajikan sehingga nantinya dapat
memperkuat
kriteria penilaian sebagai kandidat
probiotik unggul.
Materi dan Metode
asam laktat dalam saluran pencernaan (Suardana dan
Kultivasi Bakteri Asam Laktat Isolat 9A
Suarsana, 2007). Disisi lain, saluran pencernaan
Isolat bakteri asam laktat (BAL) 9A merupakan BAL
hewan (sapi) diketahui memiliki sejumlah besar
hasil penelitian sebelumnya (Lindawati dan
mikroorganisme, pada usus besar atau kolon dengan
Suardana, 2014), tersimpan dalam bentuk stok
400-500 jenis bakteri, dan
jumlahnya dapat
freezer -20°C. Penumbuhan isolat BAL 9A di mulai
mencapai (10 -10 ) sel. Pada kolon, bakteri asam
dengan melakukan thawing pada suhu 4°C selama
12
14
4
9
15 menit. Selanjutnya di biakan dalam de Mann
bakteri per gram isi kolon (Lambert and Hull, 1996),
Rogosa Sharp (MRS) broth dan dinkubasikan
sehingga menjadikan upaya identifikasi BAL pada
selama 24 jam 37 C pada kondisi anaerob (0,5%
saluran cerna sapi bali menarik untuk dilakukan.
CaCO3) dengan menambahkan gas generating kit
Upaya identifikasi spesies bakteri asam laktat dapat
sebanyak 2 sachet pada anaerobic jar. Bakteri diuji
dilakukan melalui pemeriksaan karakteristik
katalase dengan diambil satu tetes kultur isolat
morfologi, metabolit, fenotipik dan genotipik.
selanjutnya di tetesi dengan H2O2 dengan konsentrasi
Metode fenotipik dianggap kurang efisien dan
10% dan diamati adanya gelembung gas yang
kurang akurat karena mengandalkan ekspresi
terbentuk. Bakteri pada uji katalase negatif
fenotip di bawah kondisi laboratorium dan dapat
selanjutnya dibuat sediaan apus pada objek gelas
laktat (BAL) umumnya ditemukan sekitar 10 -10
229
º
Identifikasi Bakteri Asam Laktat Hasil Isolasi dari Kolon Sapi Bali
dengan pewarnaan Gram dan diamati di bawah
perbandingan 1 : 4 yaitu 1 µl DNA genom
mikroskop.
diencerkan dengan 4 µl aquabides. Satu mikroliter
(1 µl) DNA genom dimasukan ke dalam tabung PCR
Uji Aktivitas Antimikroba Bakteri Asam Laktat
kemudian ditambahkan 25 µl dream taq green, 1 µl
Isolat 9A
forward primer B27F (10 pmol), 1 µl reverse primer
Uji aktivitas antimikroba dilakukan dengan
U1492R (10 pmol) dan 10 µl aquabides sehingga
menginokulasi biakan dari stock culture ke dalam 5
volume total 38 µl. Reaksi PCR menggunakan suhu
mL MRS broth dan diinkubasi selama 48 jam dalam
denaturasi tunggal 94oC selama 7 menit yang diikuti
suasana anaerob. Selanjutnya diinokulasikan satu
35 siklus yang terdiri dari denaturasi dengan suhu
ose biakan murni bakteri patogen E. coli dan S.
94oC selama 1 menit, annealing dengan suhu 56oC
aureus ke dalam 5 mL medium nutrient broth dan
selama 1 menit, dan extension dengan suhu 72oC
diinkubasi pada suhu 37°C selama 24 jam. Suspensi
selama 1,5 menit. Satu tahap perpanjangan tahapan
biakan ditanam dengam metode sebar sebanyak 100
pada akhir siklus dilakukan pada suhu 72oC selama 5
μL di atas medium Mueller Hinton (MH). Setelah
menit. Produk PCR kemudian dielektroforesis
kering, pada medium dibuat sumur-sumur dengan
dengan agarose gel 1,5%.
diameter 5-6 mm, kemudian bakteri asam laktat
yang telah ditumbuhkan sebelumnya masing-
Analisis Data
masing didepositkan sebanyak 20 μL pada sumur-
Prodak PCR yang positif kemudian di sekuensing.
sumur tersebut diinkubasi selama 24 jam pada suhu
Data susunan nukleotida gen 16S rRNA di alignment
o
37 C. Zona hambat yang terbentuk diukur sebanyak
dan di baca homologinya di NCBI
tiga kali kemudian hasilnya dirata-ratakan dan
( h t t p : / / w w w. n c b i . n l m . n i h . g o v / ) d e n g a n
dikurangi dengan diameter sumur (well) dari
menggunakan “clustal W program package” untuk
antibiotika kontrol (Sujaya et al., 2008). Persentase
menentukan pohon filogenetik untuk melihat
penghambatan BAL dalam menghambat patogen
hubungan kekrabatan isolat, di buat berdasarkan
dihitung dengan pembanding antibiotik
pendekatan neighbor-joining method dalam
chloramphenicol menggunakan rumus Tangapo
program MEGA 4.0 (Tamura et al., 2007)
(2006).
Hasil dan Pembahasan
Analisis Molekuler
Isolasi DNA genom dilakukan sesuai dengan
Kultivasi Bakteri Asam Laktat Isolat 9A
prosedur Kit Qiagen, 2007. Metode PCR dilakukan
Bakteri asam laktat (BAL) 9A tumbuh pada media
dengan menggunakan primer universal
MRS broth, bersifat katalase negatif, dan Gram
o l i g o n u k l e o t i d a
5 ' -
positif (+) dengan morfologi coccus. Widodo (2003)
AGAGTTTGATCCTGGCTACG-'3 dan U1492R
menyebutkan hampir semua strain BAL tidak
5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-'3 seperti yang
menghasilkan enzim katalase, sehingga pada
digunakan oleh Lim et al. (2009). Setiap sampel
pengujian hasilnya negatif sebagai akibat tidak
DNA diencerkan dengan aquabides dengan
terjadinya degradasi H2O2 oleh ensim katalase.
B 2 7 F
230
Dewa Gede Agung Widyadnyana et al.
Peptidoglikan pada dinding sel bakteri ini membuat
isolat 9A hanya menunjukkan diameter zona
bakteri Gram positif resisten terhadap lisis osmotik.
hambatannya terhadap bakteri indikator S. Aureus.
Pada pewarnaan Gram, bakteri ini memiliki
dengan zona hambat yang berkisar 0,77-1,26 cm
tampilan berwarna ungu (Jawetz et al., 2001).
atau memiliki kemampuan menghambat sebesar
6,15 - 7,56 % dibandingkan kontrol antibiotika
control dengan zona hambat 2,12 cm, namun tidak
Uji Aktivitas Antimikroba
Pengujian aktivitas antimikroba spesies BAL
memperlihatkan daya hambat terhadap E. coli
Tabel 1. Uji daya hambat BAL isolat 9A terhadap bakteri patogen
Diameter Zona Hambat (cm)
Ulangan
S. aureus
Efektifitas
penghambatan %
E. coli
Efektifitas
penghambatan %
1
1.26
61.47
0
0
2
0.97
47.3
0
0
3
1.13
55.1
0
0
4
0.77
37.56
0
Rata-rata
1.03±0,21
50.35
0
*) Nilai-nilai pada Tabel 1. standar deviasi rata-rata dari empat kali ulangan
Dalam menghambat pertumbuhan bakteri uji,
bakteri asam laktat tidak hanya menghasilkan asam
laktat dan asam asetat (asam organik), tetapi juga
senyawa-senyawa lain
seperti bakteriosin yang
memiliki aktivitas antibakteri (Daeschel, 1989).
Bakteriosin merupakan zat antimikroba berupa
polipeptida, protein, atau senyawa yang mirip
0
0
Analisis Molekuler
Hasil amplifikasi gen 16S rRNA dapat
dilihat dengan munculnya fragmen produk PCR
dengan ukuran 1.502 base pairs (bp) yang
merupakan ukuran yang diharapkan dengan
menggunakan kombinasi primer B27F dan
U1492R (Gambar 1).
protein. Bakteriosin mencegah sintesis
peptidoglikan yang utuh, sehingga dinding sel
melemah dan akibatnya sel bakteri mengalami lisis.
Selain itu, target utama dari bakteriosin yaitu
membran sitoplasma dengan cara mengubah
permeabilitasnya, sehingga transport membran
terganggu dan akibatnya produksi energi dan
biosintesis protein terhambat (Nissen-Meyer et al.,
1992).
231
Gambar 2. Amplifikasi gen 16S rRNA BAL isolat
9A hasil isolasi kolon sapi bali dengan
primer B27F dan U1492R pada agarose
1%. M: Marker 1kb. DNA ladder, 1:
Isolat 9A.
Identifikasi Bakteri Asam Laktat Hasil Isolasi dari Kolon Sapi Bali
Hasil sekuensing amplifikasi gen 16S rRNA
dengan primer
dibuktikan dengan terletaknya isolat BAL 9A dalam
1 cluster dengan strain
B27F dan U1492R didapat data
tersebut dengan nilai
nukleotida yang layak untuk dianalisis yaitu
bootstrap sebesar 100%. Nilai bootstrap
sepanjang 630 nukleotida. Hasil Basic Local
menunjukan kekerabatan yang dekat apabila
Alignment Search Tool (BLAST) menunjukkan
memiliki nilai yang tinggi, yaitu lebih dari 70% atau
isolat 9A memiliki homologi (kemiripan) dengan St.
di atas 70 (Mount, 2001). Petti (2007) menyatakan
bovis (DQ148957), St. bovis (AY500370) dan St.
bahwa hasil identifikasi bakteri berdasarkan sekuen
sunkii (AB366385.1) sebesar 99%. Serta memiliki
gen 16S rRNA dapat diterima sebagai satu genus bila
kemiripan cukup jauh jika dibandingkan dengan
memiliki homologi lebih dari 97% dan sebagai satu
Bifidobacterium animalis sp.lactis (AB050136), B.
spesies jika homologinya lebih dari 99%. Hasil ini
saguini (AB559504) dan B. reuteri (AB613259)
selanjutnya dikonstruksi untuk menyusun pohon
(Data tidak ditunjukkan). Kemiripan yang tinggi
filogenetik dengan hasil seperti Gambar 2.
dengan strain Streptococcus bovis (DQ148957)
63 S. bovis AY500370
57 S. infantarius KF408386
100
S. bovis DQ148957
Isolat 9A
99
L. lactis subsp. cremoris AB008214
100 L. lactis bv. diacetylactis AB100805
89
91 L. lactis subsp. lactis AB008215
99
E. cecorum AB681217
E. durans AB596943
L. rhamnosus D16552.1
98
L. sunkii AB366385.1
94
L. mesenteroides subsp. mesenteroides...
100 L. mesenteroides subsp. mesenteroides(2)
B. animalis subsp. lactis AB050136
B. reuteri AB613259
100
99
0.15
0.10
0.05
B. saguini AB559504
0.00
Gambar 3. Pohon filogenetik isolat 9A berdasarkan sekuen gen 16S rRNA
Bakteri St. bovis adalah adalah bakteri Gram
menghambat pembentukan metana pada ruminansia
positif, fakultatif anaerobik, katalase dan oksidase
sebanyak 50% dan bahkan konsentrasi rendah
negatif berbentuk coccus merupakan genus dari
Bovicin HC5 menyebabkan penurunan produksi
Streptococcus (Lozano at al., 2014). Menurut
metan yang signifikan (Lee at al., 2002). Bovicin
Mantovani dan Russell (2002) Streptococcus bovis
HC5 St. bovis stabil pada kondisi asam dan hanya
menghasilkan bakteriosin HC5 (Bovicin HC5)
mengikat bakteri yang sensitif pada pH kurang dari 6
mampu menghambat bakteri Clostridium
(Haulihan and Russell, 2006).
aminophilum. Bakteriosin St. bovis HC5 dapat
232
Dewa Gede Agung Widyadnyana et al.
Kesimpulan
Berdasarkan data yang diperoleh dalam
penelitian ini, dapat disimpulkan bahwa bakteri
asam laktat isolat 9A berpotensi digunakan sebagai
sumber probiotik didukung dengan kemampuannya
untuk menghambat pertumbuhan S. aureus sebasar
50,35% (36,56 - 61,47% ) dibandingkan antibiotika
kontrol kloramphenikol. Bakteri asam laktat isolat
9A teridentifikasi sebagai St. bovis dengan nilai
similaritas 99% dan berada satu kelompok dengan
St. bovis nilai bootstrap sebesar 100.
Daftar Pustaka
Anindita, N. S. (2013) Identifikasi dan Karakterisasi
Isolat Bakteri Asam Laktat Potensi Probiotik
Pensintesis Conjugated Linoleic Acid (CLA).
Tesis. Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta.
Batan, I. W. (2006) Sapi Bali dan Penyakitnya.
Fakultas Kedokteran Hewan Universitas
Udayana. Denpasar.
Chenooll, E., Macian, M. C. and Aznar, R. (2003)
Identification of Canobacterium,
Lactobacillus, Leuconostoc and Pediococcus
by rDNA-based techniques. Syst. Appl.
Microbiol. 26 (4): 546-56.
Daeschel, M. A. (1989) Antimicrobial substance
from lactic acid bacteria for use as food
preservation. J Food Technol. 43: 148-155.
Hardjosubroto, W. (1994) Aplikasi Pemuliabiakan
Ternak di Lapangan. Gramedia Widiasarana
Indonesia. Jakarta.
Haulihan, A. J. and Russell, J. B. (2006) Factors
affecting the activity of bovicin HC5, a
bacteriocin from Streptococcus bovis HC5:
release, stability and binding to target bacteria.
Journal of Applied Microbiology. 100 (1): 16874.
Jawetz, E., Melnick, J. L. and Adelberg, E. A. (2001)
Mikrobiologi kedokteran 2rd ed. Bagian
Mikrobiologi. FKU Unair. Jakarta.
Lambert, J. and Hull, R. (1996) Upper
gastrointestinal tract disease and probiotics.
Asia Pasific J Clin. Nutr. 5(1): 31-35
Lee, S. S., Hsu, J. T., Mantovani, H. C. and Russell, J.
B. (2002) he e¡ect of bovicin HC5, a
bacteriocin from Streptococcus bovis HC5, on
ruminal methane production in vitro. FEMS
Microbiology Letters. 217:51-55
233
Lindawati, S. A. and Suardana, I. W. (2014). Isolasi
dan Uji Potensi Bakteri Asam Laktat Hasil
Isolasi dari Kolon Sapi Bali sebagai Kandidat
Unggul Biopreservatif. Fakultas Peternakan
Universitas Udayana.
Lozano, T. G., Ballestero, P. P., Oroval, E. A. and
Jonatan, A. G. (2014) Analysis of
Streptococcus bovis infections at a
monographic oncological centre. J Cancer Res
Ther. 2 (2): 34-35
Mantovani, H.C. and Russell, J. B. (2002) The
ability of a bacteriocin of streptococcus bovis
Hc5 (bovicin Hc5) to inhibit Clostridium
aminophilum, anobligate amino acid
fermenting bacterium from the rumen.
Anaerobe. 8: 247-252
Marshall, S. H. and Arenas, G. (2003) Antimicrobial
peptides : A natural atlernative to chemical
antibiotics and a potential for applied
biotechnology. Electron. J. Biotechnology. 6
(2): 271-284
Mount, D. W. (2001) Phylogenetic prediction. In:
Bioinformatic, Sequence and Genome
Analysis. Cold Spring Harbor laboratory. New
York Press
Nissen-Meyer, J., Holo, H., Håvarstein, L. S.,
Sletten, K. and Nes, I. F.(1992) A novel
lactococcal bacteriocin whose activity depends
on the complementary action of two peptides. J
Bacteriol. 174, 5686–5692
Petti, P. A. (2007) Detection and identification of
microorganisms by gene Amplification and
Sequencing. Clin Infect Disc. 44 (8):1108-1114
Suardana, I. W. and Suarsana, I. N. (2007) Isolasi dan
Identifikasi Bakteri Asam Laktat dari Cairan
Rumen Sapi Bali sebagai Kandidat
Biopreservatif. Jurnal Veteriner, 8 (4): 155 –
159.
Sujaya I. N., Ramona Y., Utami D. N. M., Suariani N.
L. P., Widarini N. P., Nocianitri K. A., Nursini
N. W. (2008) Isolation and characterization of
Lactic acid bacteria from Sumbawa mare milk.
Jurnal Veteriner. 9: 52-59.
Tamura K., Dudley, J., Nei, M. and Kumar, S. (2007)
MEGA4: Molecular Evolutioary Genetic
Analysis (MEGA) Softwer Version 4.0. Mol.
Biol. Evol. 24 (8): 1596-1599
Tangapo, A. M. (2006) Efektivitas Antibakteri
Ekstrak Tumbuhan Daun Sendok (Plantago
major) Terhadap Staphylococcus aureus dan
Pseudomonas aeruginosa. Skripsi. FMIPA
UNSRAT, Manado.
Widodo. (2003) Bioteknologi Industri Susu. Penerbit
Duawarna. Yogyakarta.