plagiat merupakan tindakan tidak terpuji plagiat
advertisement
PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI VALIDASI METODE ANALISIS ALOPURINOL DALAM TABLET SECARA SPEKTROFOTOMETRI DAN JAMU SECARA KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI FASE TERBALIK SERTA APLIKASINYA SKRIPSI Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm) Program Studi Farmasi Oleh : Ria Kusuma Dewi NIM : 108114047 FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2014 PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI VALIDASI METODE ANALISIS ALOPURINOL DALAM TABLET SECARA SPEKTROFOTOMETRI DAN JAMU SECARA KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI FASE TERBALIK SERTA APLIKASINYA SKRIPSI Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm) Program Studi Farmasi Oleh : Ria Kusuma Dewi NIM : 108114047 FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2014 i PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI HALAMAN PERSEMBAHAN Karya ini ku persembahkan untuk Orang tua dan adik tercinta Sahabat-sahabat, teman-teman serta almamaterku semua iv PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI PRAKATA Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Tuhan yang Maha Esa atas berkat dan kasih-Nya sehingga penelitian dan penyusunan skripsi yang berjudul Validasi Metode Analisis Alopurinol Dalam Tablet Secara Spektrofotometri Dan Jamu Secara Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Fase Terbalik Serta Aplikasinya dapat terselesaikan dengan baik. Skripsi ini disusun sebagai salah satu syarat untuk meraih gelar Sarjana Farmasi (S.Farm) di Fakultas Farmasi, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta. Dalam pelaksanaan penelitian hingga selesainya penyusunan skripsi ini, penulis mendapat banyak dukungan dan bantuan dari berbagai pihak. Oleh karena itu, penulis mengucapkan terima kasih kepada: 1. Aris Widayati, M.Si, Ph.D., Apt. Selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. 2. Prof. Dr. Sri Noegrohati, Apt selaku dosen pembimbing yang dengan sabar memberikan pengarahan, masukan, kritik dan saran baik selama penelitian maupun penyusunan skripsi ini. 3. Jeffry Julianus, M.Si selaku dosen penguji atas saran, kritik dan masukan yang telah diberikan. 4. Florentinus Dika Octa Riswanto M.Sc selaku dosen penguji atas saran, kritik dan masukan yang telah diberikan. 5. Sanjayadi, M.Si yang telah membantu penulis dalam penyusunan skripsi ini. vii PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 6. Dewi Setyaningsih, M.Sc. Apt yang telah membantu penulis dalam melakukan penelitian di laboratorium. 7. Seluruh staf laboratorium kimia fakultas farmasi Universitas Sanata Dharma : Mas Bimo, Pak Parlan, Mas Kunto, Mas Agung, Pak Ketul, Pak Darto yang telah banyak membantu selama penelitian di laboratorium. 8. Meta Kartika Sari dan Sugiarto Adji Soenarso atas perjuangan bersama selama penelitian ini. Semuanya sangat bermakna dan menambah banyak pengalaman. 9. Farmasi kelas A dan FST A 2010 kebersamaan selama ini menjadikan hidup menjadi berwarna. 10. Mama, papa, dan adik tercinta yang selalu mendukung baik dari segi moril materiil sehingga dapat terselesaikannya penelitian ini. Penulis menyadari bahwa masih banyak kekurangan dalam penyusunan skripsi ini, sehingga segala kritik dan saran yang membangun sangat penulis harapkan. Semoga skripsi ini dapat membantu dan bermanfaat bagi pembaca pada khususnya ilmu pengetahuan. Penulis viii PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI DAFTAR ISI Halaman HALAMAN JUDUL .............................................................................. i HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING........................................ ii HALAMAN PENGESAHAN SKRIPSI .................................................. iii HALAMAN PERSEMBAHAN ............................................................... iv PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ................................................... v LEMBAR PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA ................................. vi PRAKATA .............................................................................................. vii DAFTAR ISI ........................................................................................... ix DAFTAR TABEL ................................................................................... xiii DAFTAR GAMBAR ............................................................................... xv DAFTAR LAMPIRAN ............................................................................ xvi INTISARI ................................................................................................ xviii ABSTRACT ............................................................................................ xix BAB I PENGANTAR............................................................................. 1 A. Latar Belakang ............................................................................. 1 1. Permasalahan.......................................................................... 3 2. Keaslian Penelitian ................................................................. 3 3. Manfaat Penelitian .................................................................. 4 B. Tujuan Penelitian.......................................................................... 5 BAB II TINJAUAN PUSTAKA ............................................................ 6 A. Alopurinol .................................................................................... 6 ix PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 1. Mekanisme Kerja Alopurinol.................................................. 7 2. Dampak Alopurinol ................................................................ 8 3. Penetapan Kadar Alopurinol ................................................... 9 B. Tablet ........................................................................................... 9 C. Obat Tradisional ........................................................................... 9 D. Spektrofotometri Ultraviolet ......................................................... 11 1. Instrumentasi Spektrofotometri Ultraviolet ............................. 11 2. Interaksi Elektron Dengan Radiasi Elektromangnet ................ 12 3. Hukum Lambert Beer ............................................................. 13 E. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi................................................. 13 1. Instrumentasi KCKT ............................................................... 14 2. Parameter Pemisahan .............................................................. 16 3. Fase Diam............................................................................... 20 4. Fase Gerak .............................................................................. 21 F. Validasi Metode ........................................................................... 24 1. Akurasi ................................................................................... 25 2. Presisi ..................................................................................... 26 3. Linearitas................................................................................ 28 4. Batas Kuantitasi (LOQ) .......................................................... 28 G. Landasan Teori ............................................................................. 28 H. Hipotesis ...................................................................................... 29 BAB III METODOLOGI PENELITIAN ............................................. 30 A. Jenis Penelitian ............................................................................. 30 B. Variabel Penelitian ....................................................................... 30 C. Definisi Operasional ..................................................................... 30 D. Bahan-bahan Penelitian ................................................................ 31 E. Alat-alat Penelitian ....................................................................... 31 F. Tata Cara Penelitian ..................................................................... 31 I. Metode Spektrofotometri............................................................ 31 1. Pembuatan larutan NaOH 0,1 N.............................................. 31 x PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 2. Pembakuan NaOH 0,1 N ........................................................ 32 3. Pengamatan panjang gelombang pengamatan ......................... 32 4. Pembuatan larutan baku alopurinol ......................................... 32 5. Uji keseragaman bobot tablet alopurinol ................................. 33 6. Validasi analisis dalam tablet alopurinol ................................. 33 7. Penetapan kadar alopurinol dalam tablet ................................. 34 II. Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Fase Terbalik ........ 35 1. Penentuan panjang gelombang pengamatan alopurinol ........... 35 2. Pembuatan fase gerak ............................................................. 35 3. Kurva baku alopurinol ........................................................... 35 4. Kurva baku alopurinol dalam matriks jamu ............................. 36 5. Pengaruh matriks jamu pada penetapan kadar alopurinol ........ 37 6. Validasi metode analisis dalam jamu ...................................... 37 7. Penetapan kadar alopurinol dalam jamu .................................. 38 G. Analisis Hasil ............................................................................... 40 BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN................................................. 44 A. Validasi metode analisis alopurinol secara spektrofotometri ......... 45 1. Pembuatan dan pembakuan larutan NaOH 0,1 N..................... 45 2. Penentuan panjang gelombang pengamatan ............................ 47 3. Pembuatan kurva baku alopurinol ........................................... 48 4. Validasi metode analisis pada tablet ........................................ 50 i. Akurasi pada tablet alopurinol ............................................. 50 ii. Presisi pada tablet alopurinol ............................................... 51 iii. LOQ pada tablet alopurinol ............................................... 51 5. Penetapan kadar alopurinol pada tablet ................................... 52 B. Validasi metode analisis alopurinol secara KCKT ........................ 55 1. Penentuan panjang gelombang pengamatan ............................ 55 2. Pembuatan fase gerak ............................................................. 57 3. Kurva baku alopurinol ............................................................ 58 4. Kurva adisi alopurinol dalam matriks jamu ............................. 61 xi PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 5. Pengaruh matriks jamu dalam penetapan kadar alopurinol ...... 62 6. Validasi metode analisis dalam jamu ...................................... 64 i. Linearitas .......................................................................... 64 ii. Akurasi ............................................................................. 65 iii. Presisi ............................................................................... 65 iv. LOQ .................................................................................. 66 7. Penetapan kadar alopurinol dalam jamu .................................. 66 BAB V KESIMPULAN DAN SARAN .................................................. 67 A. Kesimpulan .................................................................................. 67 B. Saran ............................................................................................ 67 DAFTAR PUSTAKA .............................................................................. 68 LAMPIRAN ............................................................................................ 72 BIOGRAFI PENULIS ............................................................................. 121 xii PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI DAFTAR TABEL Halaman Tabel I Modifikasi silika pada kolom dan aplikasinya ............... 21 Tabel II Nilai indeks polaritas pelarut ........................................ 23 Tabel III Kriteria rentang recovery .............................................. 25 Tabel IV Kriteria presisi yang dapat diterima............................... 27 Tabel V Panjang gelombang maksimum alopurinol dengan pelarut NaOH 0,1 N ...................................................... 47 Tabel VI Kurva baku alopurinol .................................................. 49 Tabel VII Rata-rata penetapan % recovery pada tablet alopurinol . 50 Tabel VIII Persen koefisien variasi dari metode penambahan baku 51 Tabel IX Penyimpangan bobot rata-rata pada tablet ..................... 53 Tabel X Keseragaman bobot tablet alopurinol ............................ 53 Tabel XI Kadar alopurinol dalam tablet ....................................... 54 Tabel XII Panjang gelombang maksimum alopurinol dengan pelarut amonium hidroksida 5% dalam metanol ........... 56 Tabel XIII Kurva baku alopurinol periode I ................................... 59 Tabel XIV Hubungan r dengan n .................................................... 60 Tabel XV Kurva baku alopurinol periode II .................................. 60 Tabel XVI Kurva adisi alopurinol dalam matriks jamu ................... 62 Tabel XVII Hasil uji t slope kurva baku alopurinol dalam pelarut periode I xiii PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI dan kurva adisi alopurinol dalam matriks jamu ........... Tabel XVIII 63 Hasil uji t slope kurva baku alopurinol dalam pelarut periode II dan kurva adisi alopurinol dalam matriks jamu ............ 63 Tabel XIX Persen koefisien variasi dari metode penambahan baku 65 Tabel XX Kadar alopurinol dalam sampel jamu ............................ 66 xiv PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI DAFTAR GAMBAR Halaman Gambar 1. Struktur alopurinol........................................................ 6 Gambar 2. Mekanisme kerja alopurinol.......................................... 7 Gambar 3. Diagram tingkat energi elektronik ................................. 13 Gambar 4. Pelebaran puncak selama pemisahan dalam KCKT ....... 19 Gambar 5. Reaksi kalium biftalat dengan NaOH ............................ 44 Gambar 6. Reaksi fenolftalein dengan NaOH ................................. 46 Gambar 7. Bentuk spektra panjang gelombang maksimum alopurinol dengan pelarut NaOH 0,1 N ......................... 48 Gambar 8. Plot kurva baku alopurinol ............................................ 49 Gambar 9. Bentuk spektra panjang gelombang maksimum alopurinol dengan pelarut amonium hidroksida 5% dalam metanol .............................................................. Gambar 10. Gambar 11. 57 Interaksi amonium hidroksida dengan residu silanol dalam Kolom C18 .................................................................... 58 Perbandingan kurva baku dan kurva adisi ..................... 63 xv PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI DAFTAR LAMPIRAN Halaman Lampiran 1. Sertifikat analisis baku alopurinol ................................. 73 Lampiran 2. Sertifikat analisis SPE MCX ......................................... 74 Lampiran 3. Perhitungan indeks polaritas NaOH 0,1 N dan amonium hidroksida 5% dalam metanol ....................... 75 Lampiran 4. Perhitungan pembakuan NaOH 0,1 N ........................... 76 Lampiran 5. Spektogram pada penetapan panjang gelombang maksimum dengan pelarut NaOH 0,1 N........................ Lampiran 6. Pembuatan kurva baku pada metode spektrofotometri ........................................................... Lampiran 7. 77 79 Data kadar alopurinol dalam tablet dan contoh perhitungan .................................................................. 80 Lampiran 8. Akurasi alopurinol pada tablet ...................................... 83 Lampiran 9. Penimbangan bahan untuk akurasi sampel pada tablet... 85 Lampiran 10. Perhitungan LOQ untuk metode spektrofotometri ......... 88 Lampiran 11. Spektogram scanning panjang gelombang maksimum alopurinol dengan pelarut amonium hidroksida 5% dalam metanol .............................................................. 90 Lampiran 12. Kromatogram kurva baku alopurinol periode II ............ 92 Lampiran 13. Penimbangan baku dan contoh perhitungan kadar xvi PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI baku pada metode KCKT ............................................. Lampiran 14. Contoh perhitungan uji t untuk slope kurva baku adisi dalam matriks dan kurva baku dalam pelarut ...... Lampiran 15. 98 100 Kromatogram kurva baku adisi alopurinol dalam Matriks jamu ............................................................... 101 Lampiran 16. Data penimbangan sampel ............................................ 111 Lampiran 17. Kromatogram sampel A ................................................ 114 Lampiran 18. Kromatogram sampel B ................................................ 116 Lampiran 19. Kromatogram sampel C ................................................ 118 Lampiran 20. Perhitungan penetapan kadar alopurinol dalam sampel jamu ................................................................. xvii 120 PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI INTISARI Alopurinol merupakan zat aktif yang digunakan untuk mengatasi asam urat. Identifikasi alopurinol dilakukan pada sampel tablet dan jamu. Alopurinol memiliki gugus kromofor dan auksokrom sehingga dapat dianalisis dengan metode spektrofotometri. Batas kuantitasi alopurinol dengan metode spektrofotometri adalah 15.58 g/mg. Pada sampel jamu batas kuantifikasinya 0,52g/mg sedangkan pada sampel tablet batas kuantifikasinya 300 g/mg oleh karena itu metode spektrofotometri lebih tepat digunakan dalam sampel tablet. Metode spektrofotometri menggunakan pelarut NaOH 0,1 N, digunakan panjang gelombang maksimum 257 nm. Parameter validasi yang diteliti meliputi akurasi, presisi, LOQ. Hasil menunjukkan akurasi dinyatakan recovery sebesar 98,6-100,3%; presisi dinyatakan dengan nilai CV0.4-0.6%; sensitivitas dinyatakan nilai LOQ yang diperoleh 1,46 µg/ mg bobot sampel. Kadar alopurinol dalam tablet adalah 311,6 mg/g tablet. Identifikasi alopurinol dalam jamu menggunakan metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi yang disertai ekstraksi cair cair dan proses clean up dengan SPE MCX. Metode ini menggunakan KCKT fase terbalik dengan kolom shimadzu C18 (250 x 4,6 mm, 5 μm), fase gerak campuran metanol : amonium hidroksida 0,1% dalam akuabides (10:90), kecepatan alir 0,5 mL/menit dan detektor UV 274 nm. Hasil menunjukkan bahwa metode memiliki linearitas dengan r = 0,967; akurasi tidak dapat ditentukan, presisi dinyatakan dengan nilai % CV sebesar 0,1-0,6%; LOQ tidak dapat ditentukan. Kata kunci : alopurinol, spektrofotometri, KCKT fase terbalik, validasi metode xviii PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI ABSTRACT Allopurinol is an active substance that is used to treat gout. Identification of allopurinol was performed on tablets and herbal medicine. Allopurinol has chromophore and auxochrome group which can be analyzed by spectrophotometric method. Limit of quantitation allopurinol with spectrophotometric method is 15,58 µg/mg. Limit quantification in herbal medicine samples is 0,52 µg / mg while in the tablet sample is 300 μg/mg therefore spectrophotometric method is more precise used in tablet samples. Spectrophotometric method using solvent NaOH0.1 N , use maximum wavelength257 nm. Validation parameters examined included accuracy, precision, LOQ. The results obtain a good validity with % recovery 98.6-100.3%; % CV 0.4-0.6%; LOQ of 1.46 mg / mg. Levels of allopurinol in tablets was 311,6 mg /gtablet. Identification of allopurinol in herbal medicine using High Performance Liquid Chromatography with extraction and clean-up. This method uses a reversed-phase HPLC with a Shimadzu C18 column (250 x 4.6 mm, 5 µm), mobile phase methanol: ammonium hydroxide 0,1 % in aquabidest (10:90), flow rate of 0.5 mL/ min and 274 nm UV detector. The results show that the method has linearity r = 0.967; accuracy can not determined, CV 0.1 to 0.6%; LOQ can not determined. Key words: allopurinol, spectrophotometry, HPLC, method validation xix PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI BAB I PENGANTAR A. Latar Belakang Penyakit asam urat merupakan salah satu masalah kesehatan yang sering dialami oleh masyarakat di Indonesia. Kebiasaan dan pola hidup yang kurang baik serta mengkonsumsi makanan yang tinggi purin akan meningkatkan prevalensi penyakit ini (Iskandar, 2006). Salah satu obat yang yang banyak dipasarkan di Indonesia untuk mengobati penyakit asam urat adalah alopurinol. Produk alopurinol yang banyak beredar di pasaran dalam bentuk tablet dimana bentuk tablet lebih praktis dan nyaman untuk penggunaannya (Iskandar, 2006). Aktivitas farmakologis dan efektivitas terapi dapat tercapai ketika dosis obat yang digunakan tepat. Oleh karena itu, dibutuhkan penjaminan mutu dan kualitas zat aktif dalam suatu sediaan obat, yang salah satunya adalah penjaminan kesesuaian dosis sediaan obat terhadap label klaim pada kemasan. Tujuan penjaminan mutu ini adalah untuk melindungi konsumen agar tetap mendapatkan obat dengan kualitas zat aktif yang tepat. Dalam penjaminan mutu suatu sediaan obat dibutuhkan metode yang tervalidasi. Pada penelitian ini dilakukan proses validasi metode spektrofotometri ultraviolet. Untuk mengatasi penyakit asam urat tidak hanya digunakan produk obat sintesis, masyarakat Indonesia juga menggunakan produk obat tradisional jamu untuk mengatasi penyakit tersebut. Kecenderungan gaya hidup back to nature 1 PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 2 menyebabkan masyarakat mulai beralih dari penggunaan obat moderen ke penggunaan obat tradisional. Pertimbangan berdasarkan pada aspek ekonomi dan keamanan bagi kesehatan menjadi dua alasan mendasar dimana masyarakat mulai beralih ke penggunaan obat tradisional. Penggunaan obat tradisional terus berkembang secara luas dan digunakan di seluruh dunia selama beberapa dekade terakhir ini. Menurut WHO, 65-80% populasi dunia menggunakan obat tradisional sebagai pelindungan untuk kesehatan (Yee, 2003). Berdasarkan Keputusan Kepala Badan POM no.HK.00.05.41.1384 tahun 2005,obat tradisional tidak boleh mengandung bahan kimia obat atau hasil sintesis yang berkhasiat sebagai obat. Untuk keamanan konsumen, harus dilakukan penelitian untuk mengidentifikasi dan mengkuantifikasi adanya penambahan obat sintetis ke dalam jamu asam urat. Jaminan kualitas terhadap produk tradisional jenis jamu penting dilakukan. Tujuan dari penjaminan kualitas adalah terciptanya produk yang berkhasiat dan aman pada obat tradisional khususnya jamu. Penjaminan kualitas pada jamu memerlukan metode yang tervalidasi meliputi linearitas, akurasi, presisi dan sensitivitas yang baik (Snyder, 2010). Pemilihan metode penetapan kadar yang akan digunakan untuk analisis kuantitatif sangat penting, karena akan mempengaruhi validitas data yang diperoleh. Validitas metode merupakan proses yang dilakukan melalui penelitian laboratorium untuk membuktikan bahwa karakteristik kinerja metode itu memenuhi persyaratan aplikasi analitik yang dimaksudkan. Tujuan dilakukan PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 3 validasi metode adalah untuk membuktikan dan menjamin bahwa metode analisis yang digunakan memiliki validitas yang baik sehingga hasilnya dapat dipercaya. Pada penelitian ini dilakukan proses validasi terhadap sistem KCKT (Kromatografi Cair Kinerja Tinggi) fase terbalik hasil optimasi dalam rangkaian penelitian penetapan kadar alopurinol dalam jamu. Berdasarkan hasil optimasi yang diperoleh kondisi optimal sistem KCKT fase terbalik menggunakan fase diam C18 dan fase gerak metanol : amonium hidroksida 0,1% dalam akuabides (10:90) dengan flow rate 0,5 mL/menit yang selanjutnya digunakan sebagai sistem acuan pada proses validasi ini. 1. Permasalahan Berdasarkan latar belakang tersebut permasalahan yang mucul adalah a. Apakah metode spektrofotometri UV memenuhi parameter validitas akurasi, presisi dan LOQ (Limit of Quantitation) serta berapakah kadar alopurinol yang terdapat dalam tablet? b. Apakah metode KCKT fase terbalik standar adisi alopurinol dalam matriks jamu memenuhi parameter validitas linearitas, akurasi, presisi dan LOQ ( Limit of Quantitation) serta berapakah kadar alopurinol yang terdapat dalam matriks jamu? 2. Keaslian Penelitian Berbagai penelitian telah dilakukan mengenai evaluasi dan analisis baik kualitatif maupun kuantitatif sediaan obat tradisional. Penelitian sejenis yaitu penetapan kadar bahan kimia obat metampiron dalam jamu yang pernah dilakukan PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 4 oleh (Mayasari, 2009). Optimasi Metode Identifikasi Antalgin dan Klorfeniramin secara KCKT Photodiode Array Setelah Pemisahan dengan Solid Phase Extraction pada Sediaan Serbuk Obat Tradisional (Permata, 2012). Quantification of Oxipurines and Allopurinol Metabolites in Biological Fluids by Cation Exchange Chromatography (Sweetman, 1969). Namun validasi dan penetapan kadar alopurinol dalam jamu asam urat dengan menggunakan metode kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) fase terbalik belum pernah dilakukan sebelumnya. 3. Manfaat Penelitian a. Manfaat teoritis Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi mengenai validasi metode spektrofotometri dalam penetapan kadar alopurinol dalam sediaan tablet dan validasi metode KCKT fase terbalik dalam penetapan kadar alopurinol dalam sediaan jamu. b. Manfaat Metodologis Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi bahwa metode spektrofotometri dapat digunakan dalam menetapkan kadar alopurinol dalam sediaan tablet dan metode KCKT fase terbalik dapat menetapkan kadar alopurinol dalam sediaan obat tradisional dengan validitas yang memenuhi persyaratan. PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 5 c. Manfaat Praktis Penelitian ini diharapkan dapat memberi tambahan informasi bagi ilmu pengetahuan khususnya bidang kefarmasian mengenai parameter-parameter validasi dan penetapan kadar alopurinol dengan metode spektrofotometri dan metode KCKT fase terbalik. B. Tujuan Penelitian Penelitian ini bertujuan untuk : 1. Mengetahui validitas metode spektrofotometri dengan melihat parameter akurasi,presisi, LOQ serta kadar alopurinol yang terdapat dalam sediaan tablet. 2. Mengetahui validitas metode standar adisi alopurinol dalam matriks jamu pada KCKT fase terbalik dengan melihat parameter linearitas, akurasi, presisi dan LOQ serta kadar alopurinol yang terdapat dalam matriks jamu. PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI BAB II PENELAAHAN PUSTAKA A. Alopurinol Alopurinol dengan nama kimia 1H-Pyrazolol[3,4-d]pirimidin-4ol dengan rumus kimia : C5H4N4O. Alopurinol berupa serbuk halus putih hingga hampir putih;berbau lemah yang sedikit larut dalam air dan etanol, larut dalam larutan kalium dan natrium hidroksida, praktis tidak larut dalam eter dan klorofom. (kelarutan dalam air = 0,35 g/L pada suhu 25°C). Alopurinol memiliki bobot molekul 136,11 dan titik didih >300°C (Dirjen POM RI, 1995). Alopurinol memiliki pka 9,4 dan log p 0,33 (Machatha, 2005).Menurut Moffat, alopurinol memiliki serapan maksimum dalam larutan asam pada panjang gelombang 250 nm ( = 563 a) dan pada larutan alkalis memiliki serapan maksimum pada panjang gelombang 257 nm ( = 523 a) Struktur alopurinol sebagai berikut (Dirjen POM RI, 1995). Gambar 1. Struktur alopurinol 6 PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 7 1. Mekanisme Kerja Alopurinol Alopurinol secara struktur kimia merupakan analog struktur dari hipoxantin, maka alopurinol adalah analog subtrat untuk enzim xantin oksidase. Jadi, fungsi alopurinol sebagai analog subtrat akan menempati sisi aktif enzim xantin oksidase yang biasa ditempati oleh hipoxantin. Alopurinol menghambat aktivitas enzim secara irreversible dengan mengurangi bentuk xantin oksidase sehingga menghambat pembentukan asam urat (Khayoon et al, 2008). Gambar 2. Mekanisme kerja Alopurinol (Khayoon et al, 2008). Alopurinol dalam tubuh dimetabolisme oleh xanthin oksidase menjadi oxipurinol yang keduanya bekerja menghambat kerja enzim xanthin oksidase. Enzim ini bertanggung jawab terhadap oksidase hipoxantin dan xantin dalam produksi asam urat yang merupakan produk metabolisme purin pada manusia. PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 8 Adanya pengeblokan produksi asam urat dengan penghambatan xantin oksidase Oleh karena itu alopurinol bekerja dengan menurunkan pembentukan asam urat dan purin (Khayoon et al, 2008). 2. Dampak Alopurinol Alopurinol dapat menimbulkan reaksi kulit, reaksi alergi berupa demam, menggigil, leukopenia atau leukositosis, eosinofilia, artralgia dan pruritus, gangguan saluran pencernaan, pruritus, urtikaria, eksfoliatif dan lesi purpura, dermatitis, nefritis, faskulitis dan sindrome poliartritis, kegagalan hati dan ginjal, mual, muntah, diare, rasa mengantuk, sakit kepala dan rasa logam (Wells, 2009). Alopurinol tidak memberikan efek mutagenik maupun karsinogenetik karena terbukti pada penelitian menunjukkan bahwa alopurinol tidak menginduksi penyimpangan kromosom pada sel darah manusia secara invitro pada kadar hingga 100 μg/mL dan secara invivo mencapai dosis 60 mg/hari pada periode 40 bulan serta tidak mengindikasikan adanya efek teratogen namun alopurinol dan oksipurinol didistribusikan ke air susu ibu sehingga alopurinol rentan menimbulkan efek samping terutama reaksi hipersensitivitas (Medsafe, 2011). LD50 yang ditetapkan untuk tikus secara oral dengan pemakaian akut sebesar > 7500 mg/kg sedangkan untuk pemakaian kronis menggunakan nilai NOAEL sebesar 12 mg/kg/hari (Glaxosmithkline, 2013). PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 9 3. Penetapan kadar alopurinol Alopurinol dapat ditetapkan kadarnya secara spektrofotometri ultraviolet dengan pelarut NaOH P 0,4% b/v dan asam klorida P 1% v/v (Dirjen POM RI, 1995). B. Tablet Tablet adalah sediaan padat yang mengandung bahan obat dengan atau tanpa bahan pengisi. Berdasarkan metode pembuatan, dapat digolongkan sebagai tablet cetak dan tablet kempa. Tablet kempa dibuat dengan memberikan tekanan tinggi pada serbuk atau granul menggunakan cetakan baja. Tablet cetak dibuat dengan cara menekan massa serbuk lembab dengan tekanan rendah ke dalam lubang cetakan (Dirjen POM RI, 1995). C. Obat Tradisional Obat tradisional bahan atau ramuan bahan yang berupa bahan tumbuhan, bahan hewan, sediaan sarian (galenik) atau campuran dari bahan tersebut yang secara turun temurun telah digunakan untuk pengobatan berdasarkan pengalaman (Permenkes RI No.007 Tahun 2012). Sediaan obat tradisional yang beredar dibuat dari simplisia nabati, yaitu bagian tanaman atau seluruh tanaman baik segar ataupun sudah dikeringkan atau hasil penyariannya dengan berbagai bentuk sediaan seperti rajangan, serbuk, pil, tablet, kapsul, cairan (sediaan luar dan sediaan dalam), salep, krim, parem, tapel dan sebagainya (POM, 2004). PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 10 Sediaan obat tradisional ini perlu dilakukan berbagai jenis pengujian untuk mengetahui mutu dari sediaan obat tradisional yang akan diproduksi. Jenis pengujian ini meliputi pengujian mutu dan pengujian keamanan. Pengujian mutu meliputi organoleptik, kemasan, makroskopis, kebenaran simplisia, kadar air dan keseragaman bobot. Pengujian keamanan meliputi uji cemaran logam berat, cemaran pestisida, cemaran mikroba, zat tambahan yang diizinkan seperti bahan pengawet, cemaran afatoksin dan penetapan ada tidaknya bahan kima obat yang ditambahkan dalam sediaan obat tradisional (Kepmenkes RI no 661/MENKES/SK/VII/1994). Menurut Keputusan Badan POM RI No. 00.05.4.2411 tahun 2004, berdasarkan cara pembuatan serta klaim penggunaan dan tingkat pembuktian khasiat, Obat Bahan Alam Indonesia dikelompokkan menjadi 3 jenis yaitu : 1. Jamu (Obat tradisional warisan nenek moyang) 2. Obat Herbal Terstandar(telah dikembangkan berdasarkan bukti-bukti ilmiah, uji praklinis dan standarisasi bahan baku) 3. Fitofarmaka(telah melewati uji klinis dan standariasasi bahan baku). Menurut Keputusan Kepala Badan POM No. HK.00.05.41.1384 tahun 2005 di dalam jamu dilarang digunakan 1. Bahan kimia hasil isolasi atau sintetik yang berkhasiat obat. 2. Narkotika atau psikotropika. 3. Hewan atau tumbuhan yang dilindungi sesuai dengan ketentuan peraturan perundang-undangan yang berlaku. PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 11 D. Spektrofotometri Ultraviolet Spektrofotometri serapan merupakan pengukuran suatu interaksi antara radiasi elektromagnet dan molekul atau atom dari suatu senyawa. Teknik yang sering digunakan dalam analisis farmasi meliputi spektrofotometri ultraviolet, cahaya tampak, infra merah dan serapan atom. Jangkauan panjang gelombang untuk daerah ultraviolet adalah 190-380 nm dan daerah cahaya tampak 380-780 nm (Dirjen POM RI, 1995). Radiasi ultraviolet diabsorpsi oleh molekul organik, molekul yang mengandung elektron terkonjugasi dan atom yang mengandung elektron-n menyebabkan transisi elektron di orbital terluarnya dari tingkat energi elektron dasar ke tingkat energi elektron tereksitasi lebih tinggi. Besarnya serapan radiasi tersebut sebanding dengan banyaknya molekul analit yang mengabsorpsi sehingga dapat digunakan untuk analisis kuantitatif (Satiadarma, 2004). 1. Instrumentasi Spektrofotometer Ultraviolet Spektrofotometer yang sesuai untuk pengukuran di daerah spektrum ultraviolet terdiri atas suatu sistem optik dengan kemampuan menghasilkan sinar monokromatis dalam jangkauan panjang gelombang 190-380 nm. Komponen – komponen meliputi sumber sinar, monokromator dan sistem optik. a. Sumber lampu Lampu deuterium digunakan untuk daerah UV pada panjang gelombang 190-380 nm, sementara lampu halogen kuarsa atau lampu tungsten digunakan untuk daerah visibel (pada panjang gelombang 380-780 nm) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI b. 12 Monokromator Monokromator digunakan mendispersikan sinar ke dalam komponen- komponen panjang gelombangnya yang selanjutnya dipilih oleh celah (slit). Monokromator berputar seingga kisaran panjang gelombang dilewatkan pada sampel sebagai scan instrumen melewati spektrum. c. Optik Optik dapat dirancang untuk memecah sumber sinar sebagai sumber sinar yang melewati 2 kompartemen pada spektrofotometer berkas ganda (double beam), suatu larutan blangko dapat digunakan dalam satu kompartemen untuk mengkoreksi pembacaan atau spektrum sampel. Larutan yang paling sering digunakan sebagai blangko dalam spektrofotometri adalah semua pelarut yang digunakan untuk melarutkan sampel atau pereaksi (Gandjar dan Rohman, 2010). 2. Interaksi elektron dengan Radiasi Elektromagnet Secara umum ada 3 macam distribusi elektron di dalam suatu senyawa organik yang dikenal sebagai elektron pi ( ), sigma ( ) dan elektron tidak berpasangan (n). Apabila molekul tersebut dikenakan radiasi elektromagnetik maka akan terjadi eksitasi elektron yang lebih tinggi (Mulja dan Suharman, 1995). Ada empat jenis transisi elektronik yang terjadi diantara tingkat energi dalam suatu molekul yaitu : i. Transisi sigma-sigma star ( - ii. Transisi n-sigma star (n- iii. Transisi n-phi star (n- ∗ ) iv. Transisi n-phi star (n- ∗ ) ∗ ∗ ) ) (Gandjar dan Rohman, 2010). PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 13 Gambar 3. Diagram tingkat energi elektronik 3. Hukum Lambert Beer Menurut Hukum Lambert, serapan berbanding lurus terhadap ketebalan sel yang disinari. Menurut hukum Beer, yang hanya berlaku untuk cahaya monokromatik dan larutan yang sangat encer, serapan berbanding lurus dengan konsentrasi (banyak molekul zat). Kedua pernyataan ini dapat dijadikan satu dalam hukum Lambert-Beer, sehingga diperoleh bahwa serapan berbanding lurus terhadap konsentrasi dan ketebalan sel sesuai pada persamaan : log Io/It = A = . b. c Io : intensitas radiasi yang masuk It : intensitas radiasi yang ditransmisikan A : absorbansi : konstanta koefisien molar ekstingsi b : ketebalan kuvet yang dinyatakan dalam cm c : konsentrasi analit (mol. L-1) (Watson, 2003). E. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) adalah teknik pemisahan campuran senyawa berdasarkan interaksi dengan fase diam dibawah aliran fase PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 14 gerak, dimana fase gerak dialirkan dengan bantuan tekanan menuju kolom secara cepat dan dideteksi dengan detektor yang sesuai (Hendayana, 2006). 1. Instrumentasi KCKT Komponen pokok instrumentasi KCKT pada dasarnya terdiri atas kolom, wadah fase gerak, tempat penyuntikan sampel, pompa, detektor dan sisem pengolah data untuk menampilkan hasil pemisahan. a. Kolom Suatu bagian dimana terdapat fase diam untuk berlangsungnya proses pemisahan analit. Oktadesil silika (C18) merupakan fase diam yang paling banyak digunakan karena mampu memisahkan senyawa-senyawa dengan kepolaran rendah, sedang maupun tinggi. Oktil atau rantai alkil yang lebih pendek sesuai untuk solut yang polar (Gandjar dan Rohman, 2010). b. Wadah fase gerak Wadah fase gerak harus bersih dan lembam (inert). Fase gerak sebelum digunakan harus dilakukan degassing (penghilangan gas) yang ada pada fase gerak, sebab adanya gas akan berkumpul dengan komponen lain terutama di pompa dan detektor sehingga akan mengacaukan analisis. (Gandjar dan Rohman, 2010). c. Tempat penyuntikan sampel (injektor) Sampel-sampel cair dan larutan disuntikkan secara langsung ke dalam fase gerak yang mengalir di bawah tekanan menuju kolom menggunakan syringe yang terbuat dari tembaga tahan karat. (Gandjar dan Rohman, 2010). PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 15 d. Pompa Pompa harus bersifat inert terhadap fase gerak. Pompa yang digunakan sebaiknya mampu memberikan tekanan sampai 5000 psi dan mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan alir 3mL/menit. Tujuan penggunaan pompa adalah untuk menjamin proses penghantaran fase gerak berlangsung secar tepat, reprodusibel, konstan dan bebas dari gangguan (Gandjar dan Rohman, 2010). e. Detektor Fungsi detektor dalam KCKT adalah untuk mendeteksi komponenkomponen cuplikan hasil pemisahan kolom secara kualitatif dan kuantitatif bergantung pada kebutuhan analisis. Detektor KCKT yang baik harus mempunyai sensitivitas yang cukup tinggi atau mempunyai limit deteksi yang sangat kecil, sehingga memberikan perubahan sinyal yang besar pada perubahan konsentrasi komponen cuplikan yang kecil. Detektor yang sensitif akan membantu analisis kualitatif maupun kuantitatif terutama untuk trace analysis (Gandjar dan Rohman, 2010). f. Sistem Pengolah Data (Rekorder/Integrator/Komputer) Sistem KCKT memerlukan sistem pengolah data sebagai sistem pencatat yang berkualitas baik dan mampu menampilkan hasil kromatogram dengan jelas, tepat dan peka. Alat pengumpul data seperti komputer, integrator atau rekorder dihubungkan dengan detektor. Alat ini akan mengukur sinyal elektronik yang dihasilkan oleh detektor lalu mem-plotkannya sebagai suatu kromatogram yang selanjutnya dapat dievaluasi oleh seorang analis (pengguna). PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 16 2. Parameter Pemisahan Dalam metode kromatografi, suatu pemisahan dikatakan baik bila memenuhi beberapa parameter utama yang dikenal dengan istilah faktor retensi (k), faktor pemisahan (ɑ), jumlah total pelat (N) dan resolusi (R). Ketiga faktor ini harus diperhitungkan untuk menggambarkan tingkat resolusinya. Faktor retensi (k) adalah retensi relatif dari masing-masing puncak kromatogram pada kolom. Faktor retensi tidak tergantung pada panjang kolom dan aliran fase gerak, namun mewakili rasio molar dari senyawa di dalam fase diam dan fase gerak. Faktor retensi biasanya bernilai antara 1 hingga 10. Jika nilai k terlalu rendah, maka derajat pemisahan mungkin tidak cukup dikarenakan tidak adanya interaksi antara analit dengan fase diam karena analit lewat fase diam terlalu cepat. Sebaliknya, jika nilai k terlalu besar, maka waktu analisis juga akan menjadi terlalu lama (Jeffrey, 1996). Persamaan untuk menghitung nilai k sebagai berikut : k= keterangan : k=faktor retensi tR=waktu retensi analit t0=waktu retensi dari puncak pertama yang keluar dari kolom Faktor pemisahan (selektivitas) merupakan besaran yang menunjukkan pemisahan relatif antara dua puncak dalam satu kromatogram. Dua komponen PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 17 dalam suatu campuran tidak dapat dipisahkan , kecuali memiliki perbedaan nilai k dengan nilai k2>k1. Jika nilai ɑ=1 maka artinya tidak terjadi pemisahan atau menunjukkan kedua komponen memiliki waktu retensi yang sama. Faktor pemisahan atau selektivitas ( ) adalah suatu ukuran dari potensi sistem kromatografi untuk mampu atau tidak memisahkan dua senyawa (Jeffrey, 1996). Persaman selektivitas : = Keterangan : = faktor pemisahan k1= faktor retensi analit 1 k2= faktor retensi analit 2 Resolusi (R) dari dua puncak tergantung pada faktor pemisahan ( ), faktor efisiensi (N) dan faktor retensi (k). Jika diasumsikan N1=N2 dibawah kondisi pemisahan isokratik. Isokratik adalah cara pemrograman aliran fase gerak yang hanya memerlukan satu macam komposisi pelarut tunggal maupun campuran (Jeffrey, 1996). Persamaan resolusi : R= ( − 1)√ Keterangan : R= resolusi = faktor pemisahan = ( − 1)√ PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 18 k1= faktor retensi analit 1 k2= faktor retensi analit 2 N= jumlah pelat teoritis (faktor efisiensi) Jumlah pelat teoritis (N) atau faktor efisiensi adalah karaterisasi efisien kolom. Faktor efisien (N) mengukur derajat ketajaman puncak kromatogram yang didapatkan. Nilai faktor efisiensi yang meningkat menandakan proses pengemasan (packing) yang lebih baik, panjang kolom yang lebih panjang, kondisi aliran fase gerak yang optimum. Kolom dengan nilai efisiensi yang tinggi, berarti dapat memisahkan campuran yang terdiri atas komponen yang memiliki faktor pemisahan yang mirip (Jeffrey, 1996). Persamaan jumlah pelat teoritis : N=16 Keterangan : N= jumlah pelat teoritis tR= waktu retensi analit w= luas area analit Pada saat pemisahan kromatografi, analit individual akan membentuk profil konsentrasi yang simetri / profil Gaussian dalam arah aliran fase gerak. Peak kromatogram secara perlahan akan melebar dan sering membentuk profil asimetrik karena analit melanjutkan migrasinya ke fase diam (Gandjar dan Rohman, 2010). Alasan timbulnya bentuk puncak dan pelebaran puncak PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 19 didasarkan pada difusi Eddy, difusi longitudinal, dan transfer massa (Snyder et al., 2010). Difusi longitudinal adalah saat analit melewati kolom. Proses difusi ini menyebabkan pelebaran peak untuk meningkatkan retention time ( Snyder et al., 2010). Spesies analit menyebar ke segala arah dengan difusi ketika berada di dalam fase gerak. Difusi terjadi dengan arah yang sama dan berlawanan dengan fase gerak sehingga berkontribusi terhadap pelebaran pita secara simetris (Gandjar dan Rohman, 2010). Gambar 4. Pelebaran puncak selama pemisahan dalam KCKT (Snyder et al., 2010) Difusi Eddy menggambarkan faktor lain yang menyebabkan pelebaran pita. Molekul analit masuk ke dalam kolom melewati partikel fase diam dengan arah yang berbeda-beda menuju keluar kolom. Molekul yang bergerak lebih lambat akan keluar lebih lambat. Molekul yang bergerak lebih cepat akan keluar PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 20 lebih dahulu. Pelebaran pita tidak tergantung dari kecepatan alir yang digunakan dan hanya bergantung dari penyusunan dan ukuran partikel dalam kolom. Pelebaran pita yang diakibatkan karena difusi Eddy akan semakin besar seiring dengan peningkatan ukuran partikel kolom (Snyder et al., 2010). Transfer massa dapat menyebabkan pelebaran pita, terjadinya transfer massa disebabkan oleh transfer massa fase gerak yang merupakan kecepatan alir analit yang mempengaruhi pelebaran pita, diantara partikel fase diam terdapat rongga bilamana analit melewatinya akan lebih cepat keluar terbaca detektor dan bila analit cenderung lebih menyamping maka akan terjadi interaksi dahulu terhadap partikel fase diam. Transfer massa fase diam menggambarkan analit yang terpenetrasi ke dalam partikel fase diam dan tinggal lebih lama sebelum meninggalkan partikel fase diam. Perbedaan lama waktu tinggal dan adanya analit yang terlebih dahulu terelusi keluar akan menyebabkan pelebaran pita (Snyder et al., 2010). 3. Fase Diam Kolom pada KCKT tidak memerlukan temperatur tinggi karena sifat ikatan kimia terhadap fase diam sangat sensitif terhadap temperatur tinggi. pemilihan kolom berdasarkan jenis fase gerak dan sifat fisika kimia zat analit (Snyder et al, 2010). Sifat bahan pengisi atau fase diam dalam kolom bervariasi meskipun dari satu produk yang sama. Variasi fase diam yang banyak digunakan dapat berdasarkan partikel yang porous atau non porous dengan ukuran diameter yang PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 21 kecil dan permukaan partikel kecil yang porous. Salah satu fase diam yang digunakan dalam instrumen KCKT adalah silika. Silika adalah suatu adsorben dengan sifat yang terkenal dan banyak digunakan sebagai bahan isian kolom. Silika terdiri dari atom silikon yang dijembatani secara tiga dimensi oleh atom oksigen. Silika mengandung gugus OH (silanol) sehingga permukaannya memungkinkan untuk dimodifikasi untuk memberikan sifat yang spesifik. Modifikasi dari kolom silika sebagai bahan isian kolom telah sangat berkembang (Munson, 1991). Tabel I. Modifikasi silika pada kolom dan aplikasinya (Munson, 1991) Kolom Fase Aplikasi C18 Octadecyl Non-polar umum C8 Octyl Non-polar umum Phenyl Styryl Asam lemak, ikatan rangkap Cyano Cyanopropil Keton, aldehide Diol Aminopropil Sugar,anion Amino Dihydroxylhexyl Protein SAX (Strong anion exchanger) Aromatic quaternaryamine Anion 4. Fase Gerak Pada pemilihan fase gerak yang perlu diperhatikan adalah fase gerak harus berinteraksi dengan fase diam yang sesuai untuk memisahkan suatu campuran secepat dan seefisien mungkin. Secara umum pemilihan fase gerak PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 22 harus memenuhi kriteria viskositas, transparansi UV, titik didih, kemurnian, sifat inert, toksisitas dan harga (Chan et al, 2004). Viskositas yang rendah menghasilkan tekanan yang rendah dibanding suatu pelarut dengan viskositas yang lebih tinggi pada suatu aliran tertentu. Untuk transparansi UV, jika serapan UV yang digunakan maka fase gerak yang digunakan haruslah transparan pada panjang gelombang yang digunakan (Jeffrey, 1996). Pelarut yang digunakan dalam KCKT harus standar KCKT dan disaring dengan ukuran pori 0,2 μm. Pelarut yang digunakan harus murni dan tidak mengandung gas untuk menghindari pembentukan gelembung gas ketika melewati katub atau memasuki bejana piston. Suatu sistem degassing dibutuhkan untuk menghilangkan udara dalam larutan (Christian, 1994). Adanya gas dalam fase gerak akan berkumpul dengan komponen lain terutama di pompa dan detektor sehingga akan mengacaukan analisis (Gandjar dan Rohman, 2012). Syarat-syarat fase gerak untuk KCKT adalah : murni, tanpa cemaran, tidak bereaksi dengan kemasan, sesuai dengan detektor, dapat melarutkan cuplikan, mempunyai viskositas yang rendah, memungkinkan memperoleh kembali cuplikan dengan mudah, harganya wajar (Gandjar dan Rohman, 2012). Pemilihan fase gerak yang digunakan terutama berdasarkan indeks polaritas (P’) campuran fase geark tersebut. Semakin besar nilai indeks polaritas menyatakan semakin polar fase gerak yang digunakan. Fase gerak yang sering digunakan merupakan kombinasi dari dua atau lebih campuran pelarut yang saling PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 23 bercampur secara keseluruhan. Campuran fase gerak tersebut akan menghasilkan nilai polaritas tersendiri yang disebut indeks polaritas fase gerak (Harvey, 2000). P’AB = Dengan A dan B A. P’A + B. P’B merupakan fraksi volume pelarut yang digunakan pada pelarut A dan B, sedangkan P’A dan P’B merupakan indeks polaritas pelarut yang digunakan pada pelarut A dan B (Harvey, 2000). Untuk mengetahui nilai indeks polaritas dari fase gerak yang digunakan maka dapat dilihat dari tabel berikut. Tabel II. Nilai indeks polaritas pelarut (Snyder et al., 1997). Pelarut Indeks polaritas Eluotropic values Alumina C18 Silika UV Cut off (nm) Heksan 0,1 0,01 - 0,00 195 Sikloheksan 0,2 0,04 - - 200 Toluen 2,4 0,29 - 0,22 284 Tetrahidrofuran 4,0 0,45 3,7 0,53 212 Etil asetat 4,4 0,58 - 0,48 256 Aseton 5,1 0,56 8.8 0,53 330 Metanol 5,1 0,95 1,0 0,70 205 Asetonitril 5,8 0,65 3,1 0,52 190 Air 10,2 - - - 190 PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 24 Deret elutropik yang disusun berdasarkan polaritas pelarut merupakan suatu panduan yang berguna dalam memilih fase gerak yang akan digunakan dalam sistem KCKT. Nilai UV cut off (pemenggalan UV) merupakan panjang gelombang dimana kuvet 1 cm yang digunakan pelarut akan memberikan absorbsi lebih dari satu satuan absorbansi. Pentingnya mengetahui panjang gelombang pemenggalan UV sangat berguna saat menggunakan detektor UV, penggunaan panjang gelombang deteksi dianjurkan tidak bertepatan atau di sekitar panjang gelombang pemenggalan UV dari pelarut yang digunakan sebagai fase gerak (Gandjar dan Rohman, 2010). F. Validasi Metode Validasi metode analisis adalah proses dimana suatu metode ditetapkan melalui serangkaian uji laboratorium bahawa karakter penampilan metode tersebut memenuhi persyaratan untuk penerapan metode yang dimaksud. Tujuan akhir validasi metode adalah untuk menjamin bahwa tiap pengukuran di masa yang akan datang dalam suatu analisis rutin harus cukup dekat dengan nilai kandungan analit sebenarnya yang terkandung dalam suatu sampel (Gandjar dan Rohman, 2012). Validasi metode menurut Association of Official Analytical Chemistry (AOAC) adalah suatu proses yang menetapkan karakteristik suatu metode yang ditemukan dapat memenuhi kebutuhan untuk aplikasi analisis yang diharapkan dengan cara studi laboratorium. Validasi dibagi menjadi empat kelas yaitu kelas A, B, C dan D. Kelas A digunakan untuk identifikasi senyawa. Kelas B digunakan untuk mendeteksi dan menentukan pengotor. Kelas C dapat menentukan senyawa PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 25 secara kuantitatif. Kelas D untuk mencari ciri suatu senyawa (Levin, 2002). Parameter metode validasi dalam penelitian ini meliputi lineritas, spesifisitas, keseksamaan (presisi), ketepatan (akurasi), batas deteksi (limit of detection) dan batas kuantifikasi (limit of quantification). Karakter penampilan metode dinyatakan sebagai parameter analisis. Beberapa parameter yang harus dipertimbangkan dalam validasi metode analisis adalah : 1. Akurasi (Ketepatan) Ketepatan suatu prosedur analisis adalah kedekatan hasil yang diterima (baik sebagai nilai teoritis maupun dengan nilai rujukan yang diterima) dengan nilai yang diperoleh dari hasil pengukuran (Chan et al., 2004). Ketepatan menurut (Horwitz, 2005), adalah kedekatan nilai hasil percobaan yang diperoleh dari suatu metode terhadap nilai sebenarnya. Ketepatan diukur dengan menghitung recovery menggunakan metode penambahan standar. Nilai recovery tergantung pada matriks sampel, prosedur proses sampel dan konsentrasi analit. Batas penerimaan recovery menurut AOAC adalah 80-120%. % recovery = x 100% Keterangan : a = konsentrasi sampel + konsentrasi standar yang terukur b = konsentrasi sampel c = konsentrasi standar teoritis yang ditambahkan PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 26 Acceptance criteria untuk nilai recovery diharapkan sesuai dengan matriks sampel, prosedur pembuatan sampel dan konsentrasi analit. Rentang % recovery yang diperbolehkan dapat dilihat pada tabel III berikut : Tabel III. Kriteria rentang recovery (Gonzales and Herrador, 2007) Analyte (%) 2. Analyte fraction Unit Recovery range (%) 100 1 100% 98-102 10 10-1 10% 98-102 1 10-2 1% 97-103 0,1 10-3 0,1% 95-105 0,01 10-4 100 ppm 90-107 0,001 10-5 10 ppm 80-110 0,0001 10-6 1 ppm 80-110 0,00001 10-7 100 ppb 80-110 0,000001 10-8 10 ppb 60-115 0,0000001 10-9 1 ppb 40-120 Presisi (Keseksamaan) Presisi adalah ukuran keterulangan metode analisis dan biasanya diekspresikan sebagai simpangan baku atau Relative Standard Deviation (RSD) dari sejumlah sampel. Sesuai ICH presisi harus dilakukan pada 3 tingkatan yang berbeda yaitu keterulangan (repeatibility), presisi antara (intermediete precision) dan. reprodusibilitas. penetapan pada keterulangan ada 2 cara yaitu (1) suatu pengukuran sebanyak 9 kali yang mencakup kisaran yang digunakan dalam prosedur analisis ( misalnya 3 konsentrasi berbeda dengan masing-masing PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 27 dilakukan replikasi sebanyak 3 kali) atau (2) dilakukan 6 kali penetapan terhadap larutan dengan konsentrasi yang sama (Chan et al., 2004). Ada 2 ukuran presisi yaitu : a. Presisi sistem (replikabilitas) : merupakan penilaian terhadap keberulangan sistem untuk mengetahui kesalahan karena sistem , yang tidak bergantung pada penyiapan sampel. b. Presisi metode (repeatibilitas) : merupakan ukuran dari variabilitas intrinsik, termasuk kesalahan yang disebabkan oleh penyiapan sampel. Besarnya % RSD yang dapat diterima dapat dilihat pada tabel IV berikut : Tabel IV. Kriteria presisi yang dapat diterima (Gonzales and Herrador, 2007) Analyte (%) Analyte fraction Unit Horwitz %RSD AOAC %RSD 100 1 100% 2 1,3 10 10-1 10% 2,8 1,8 1 10-2 1% 4 2,7 0,1 10-3 0,1% 5,7 3,7 0,01 10-4 100 ppm 8 5,3 0,001 10-5 10 ppm 11,3 7,3 0,0001 10-6 1 ppm 16 11 0,00001 10-7 100 ppb 22,6 15 0,000001 10-8 10 ppb 32 21 0,0000001 10-9 1 ppb 45,3 30 PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 28 3. Linearitas Linearitas merupakan kemampuan suatu metode untuk memperoleh hasil-hasil uji yang secara proporsional dengan konsentrasi analit pada kisaran yang diberikan. Linearitas suatu metode merupakan ukuran seberapa baik kurva kalibrasi yang menghubungkan antara respon (y) dengan konsentrasi (x). (Snyder et al., 1997). 4. Batas kuantitasi (LOQ) merupakan kuantitas terkecil analit dalam sampel yang masih dapat memberikan resopon yang memenuhi kriteria cermat dan seksama. Batas deteksi dan kuantitasi dapat dihitung secara statistik melalui garis regresi linier dari kurva kalibrasi (Snyder et al., 1997). G. Landasan Teori Asam urat merupakan penyakit yang berkaitan dengan hiperurisemia karena peningkatan sintesis asam urat yang ditandai dengan arthritis akut pada persendian dan kartilago (Johnstone, 2005). Penyakit asam urat dapat diatasi dengan obat sintesis maupun jamu sebagai obat tradisional. Untuk menjaga keamanan konsumen perlu dilakukan jaminan kualitas untuk obat sintesis maupun jamu. Alopurinol merupakan salah satu zat aktif obat yang digunakan untuk menurunkan kadar asam urat dalam darah. Alopurinol memiliki gugus kromofor dan auksokrom yang dapat menyerap radiasi pada panjang gelombang di daerah ultraviolet, maka alopurinol dapat dianalisis dengan metode spektrofotometri. PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 29 Pada tablet alopurinol mengandung tidak kurang dari 93% dan tidak lebih dari 107% C5H4N4O dari label klaim sediaan (Dirjen POM RI, 1995). Penggunaan metode spektrofotometri dalam penetapan kadar alopurinol dalam tablet perlu dilakukan untuk memberikan hasil dengan reprodusibilitas dan reabilitas yang baik. Validasi suatu metode analisis ditentukan oleh parameter : linearitas, akurasi, presisi, LOQ. Selain menggunakan obat sintesis untuk mengatasi asam urat, masyarakat juga menggunakan jamu sebagai alternatif dalam mengatasi penyakit ini. Menurut Keputusan Kepala Badan POM No. HK.00.05.41.1384 tahun 2005 di dalam jamu dilarang digunakan bahan sintetik yang berkhasiat obat. Menurut Sari(2014), analisis alopurinol dalam jamu tidak dapat menggunakan metode spektrofotometri karena jamu memiliki matriks yang kompleks dan metode spektrofotometri tidak mencapai batas kuantifikasi yang ditentukan. Oleh karena itu dikembangkan metode analisis menggunakan KCKT. Untuk metode KCKT ini juga dilakukan validasi metode analisis untuk menjamin metode memiliki spesifikasi yang diterima meliputi : linearitas, akurasi, presisi dan LLOQ. H. Hipotesis Dapat dilakukan validasi dan penetapan kadar alopurinol dalam tablet secara spektrofotometri serta dalam jamu secara KCKT. PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI BAB III METODE PENELITIAN A. Jenis dan Rancangan Penelitian Penelitian ini merupakan jenis penelitian non eksperimental dengan rancangan deskriptif karena tidak dilakukan manipulasi terhadap subjek uji. B. Variabel Penelitian 1. Variabel bebas dalam penelitian ini adalah kondisi optimal dari hasil optimasi Sari (2014) dan Soenarso (2014). 2. Variable tergantung pada penelitian ini adalah parameter validitas yaitu akurasi, presisi, linearitas, dan LOQ. 3. Variabel pengacau terkendali dalam penelitian ini, yaitu : Kualitas bahan baku, kemurnian pelarut, digunakan pelarut yang memiliki grade pro analysis. C. Definisi Operasional 1. Alopurinol merupakan senyawa yang sering digunakan untuk mengatasi penyakit asam urat. 2. Validasi metode yang dilakukan pada penelitian ini meliputi pengukuran terhadap parameter-parameter validitas yaitu akurasi, presisi, linearitas, dan LOQ. 30 PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 31 3. Sampel yang digunakan yaitu dan tablet alopurinol dan jamu asam urat. D. Bahan Penelitian Bahan yang digunakan adalah baku alopurinol (PT. Ifars), metanol (E.Merck), asam klorida (E.Merck), natrium hidroksida (E.Merck), kloroform (E.Merck), ammonium hidroksida solution 25% (E.Merck), akuades dan akuabides, matriks sampel jamu asam urat, sampel tablet alopurinol E. Alat Penelitian Alat yang digunakan dalam penelitian ini, yaitu : seperangkat spektrofotometer UV-VIS merek Optima SP 300 Plus, seperangkat KCKT fase terbalik merek Shimadzu dengan sistem gradient, kolom oktadesilsilan C18 150 x 4,6 mm dengan ukuran pori 5 m, ultrasonikator, neraca analitik Ohaus Carat Series PAJ 1003, milipore filter ukuran 0,45 µm, mikropipet Socorex ukuran 1001000 μL, indikator pH (E.Merck), organic and anorganic solvent membrane filter (Whatman) ukuran pori (0,45 μm dengan diameter 47 mm), vakum dan seperangkat alat gelas (Pyrex). F. Tata Cara Penelitian I. Metode Spektrofotometri 1. Pembuatan larutan NaOH 0,1 N Sejumlah 1 gram pelet NaOH dilarutkan dengan akuades hingga semua larut sempurna lalu dimasukkan ke dalam labu ukur 250 mL dan diencerkan dengan akuades hingga batas tanda(Mursyidi,2008). PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 32 2. Pembakuan NaOH 0,1 N Ditimbang lebih kurang 400 mg kalium biftalat secara seksama yang sebelumnya telah dihaluskan dan dikeringkan pada suhu 120ºC selama 2 jam dan larutkan dalam 75 mL air bebas karbondioksda lalu tambahkan 2 tetes indikator fenolftalein dan titrasi dengan larutan natrium hidroksida hingga terjadi warna merah muda mantap. Normalitas NaOH dihitung dengan menggunakan rumus : N NaOH = (Mursyidi,2008). 3. Penentuan panjang gelombang pengamatan alopurinol Dibuat seri larutan kurva baku dengan konsentrasi 4, 8, dan 12 μg/mL dengan cara mengambil 2,4, dan 6 mL dari larutan intermediet 2 lalu dimasukkan ke dalam labu ukur 10 mL dan diencerkan dengan menggunakan NaOH 0,1 N hingga tanda. Kemudian ukur serapan pada panjang gelombang 200-400 nm 4. Pembuatan larutan baku alopurinol a. Pembuatan larutan induk baku alopurinol Sejumlah lebih kurang 50 mg baku alopurinol ditimbang seksama, dimasukkan ke dalam labu ukur 50 mL dilarutkan dengan NaOH 0,1 N hingga tanda sehingga diperoleh larutan dengan konsentrasi 1000 μg/mL. b. Pembuatan larutan intermediet 1 alopurinol Dari larutan induk diambil 1,0mL lalu dimasukkan ke dalam labu ukur 10 mL, encerkan dengan NaOH 0,1 N hingga tanda sehingga diperoleh larutan dengan konsentrasi 100 μg/mL PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 33 c. Pembuatan larutan intermediet 2 alopurinol Dari larutan induk intermediet 1 diambil 10 mL lalu dimasukkan ke dalam labu ukur 50 mL, encerkan dengan NaOH 0,1 N hingga tanda sehingga diperoleh larutan dengan konsentrasi 20 μg/mL. d. Pembuatan kurva baku alopurinol Larutan intermediet 2 diambil sebanyak 2,3,4,5,6, dan 7 mL dari kemudian dimasukkan ke dalam labu ukur 10 mL. Ditambahkan NaOH 0,1 N hingga batas tanda sehingga diperoleh seri larutan kurva baku alopurinol dengan konsentrasi 4, 6, 8, 10, 12, dan 14 μg/mL. Larutan seri baku tersebut diukur absorbansinya pada panjang gelombang pengamatan menggunakan spektrofotometer UV. Dibuat kurva regresi linear antara kadar alopurinol dan absorbansi yang diperoleh, kemudian ditentukan persamaan regresi linear dan nilai koefisien korelasinya. 5. Uji keseragaman bobot tablet alopurinol Disiapkan 20 tablet alopurinol kemudian ditimbang satu per satu untuk mengetahui keseragaman bobot tablet. Bobot tablet yang diperoleh dihitung bobot rata-ratanya. Setelah dilakukan uji keseragaman bobot, tablet alopurinol digerus menggunakan mortir dan stamper dan disimpan dalam wadah yang kering. 6. Validasi metode analisis dalam tablet alopurinol Dua puluh tablet alopurinol digerus kemudian ditimbang sampel sebanyak 77 mg. Ke dalam masing-masing sampel ditambahkan baku alopurinol 4, 6, dan 8 mg. Replikasi dilakukan 5 kali. Masing-masing sampel yang telah PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 34 diadisi dengan baku alopurinol kemudian larutkan dengan NaOH 0,1 N dan saring dengan menggunakan kertas saring, masukkan ke dalam labu ukur 25 mL. Diambil 1,0mL lalu dimasukkan ke dalam labu ukur 10 mL dan add hingga tanda. Diambil lagi 1,0mL dan diencerkan hingga 10 mL, ukur serapan konsentrasi larutan sampel pada panjang gelombang pengamatan dengan replikasi 5 kali. Dilakukan penetapan blanko dengan replikasi 5 kali. Dilakukan pengukuran absorbansi larutan adisi sampel dan blanko menggunakan spektrofotometer UV pada panjang gelombang maksimum. Nilai absorbansi yang didapat digunakan untuk menghitung kadar alopurinol dengan memasukkan nilai absorbansi pada persamaan kurva baku yang telah dibuat. Dihitung persen perolehan kembali (% recovery), nilai koefisien variasi (% CV) dan LOQ (Limit of Quantitation) alopurinol yang telah diadisi ke dalam matriks tablet alopurinol. 7. Penetapan kadar alopurinol dalam tablet Dua puluh tablet alopurinol digerus kemudian ditimbang sebanyak 77 mg. Dilarutkan dengan NaOH 0,1 N dan saring dengan menggunakan kertas saring, masukkan ke dalam labu ukur 25 mL. Diambil 1,0 mL lalu dimasukkan ke dalam labu ukur 10 mL dan add hingga tanda. Diambil lagi 1,0 mL dan diencerkan hingga 10 mL, ukur serapan konsentrasi larutan sampel pada panjang gelombang maksimum. Masukkan hasil absorbansi ke persamaan kurva baku alopurinol sehingga diperoleh kadar alopurinol dalam sampel. Replikasi dilakukan 5 kali. PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 35 II. Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Fase Terbalik 1. Penentuan panjang gelombang pengamatan alopurinol Penentuan panjang gelombang pengamatan dilakukan dengan cara mengukur spektra larutan baku alopurinol dengan menggunakan konsentrasi 5,0; 7,5; 10,0; 12,5 dan 15,0 μg/mL. Pengukuran dilakukan pada rentang panjang gelombang 200-400 nm terhadap blanko amonium hidroksida 5% dalam metanol. Berdasarkan spektra yang diperoleh kemudian ditentukan panjang gelombang maksimum. Panjang gelombang ini akan digunakan pada deteksi sistem KCKT 2. Pembuatan fase gerak Fase gerak yang digunakan yaitu campuran metanol : amonium hidroksida 0,1% dalam akuabides (10:90). Masing-masing larutan disaring menggunakan kertas saring Whatman yang dibantu dengan pompa vakum dan diawaudarakan selama 15 menit. Pencampuran fase gerak dilakukan di dalam sistem KCKT. 3. Kurva baku alopurinol a. Pembuatan larutan stok baku alopurinol. Ditimbang secara seksama lebih kurang 25 mg baku alopurinol, kemudian dimasukkan ke dalam labu ukur 25 mL dan dilarutkan dengan dengan amonium hidroksida 5% dalam metanol. b. Pembuatan larutan intermediet alopurinol.Dibuat larutan intermediet dengan konsentrasi 10 g/mL dengan cara mengambil sebanyak 100 L dari larutan stok baku alopurinol, dimasukkan labu takar 10 mL dan diencerkan dengan amonium hidroksida 5% dalam metanol hingga tanda. PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI c. 36 Pembuatan seri larutan baku alopurinol. Diambil sejumlah100, 200, 300, dan 400 μL larutan intermediet alopurinol kemudian masing-masing dimasukkan ke dalam labu takar 10 mL. Masing-masing labu takar diencerkan dengan amonium hidroksida 5% dalam metanol hingga tanda. Masing-masing seri baku alopurinol disaring menggunakan milipore kemudian di-degassing menggunakan ultrasonikator selama 15 menit. Sejumlah 10 μL masing-masing seri larutan baku disuntikkan ke sistem KCKT. Replikasi dilakukan 3 kali. 4. Kurva baku adisi alopurinol dalam matriks jamu a. Pembuatan larutan stok baku alopurinol. Ditimbang secara seksama lebih kurang 25 mg baku alopurinol, kemudian dimasukkan ke dalam labu ukur 25 mL dan dilarutkan dengan dengan amonium hidroksida 5% dalam metanol. b. Pembuatan larutan intermediet alopurinol.Dibuat larutan intermediet dengan konsentrasi 500 g/mL dengan cara mengambil sebanyak 5 mL dari larutan stok baku alopurinol, dimasukkan labu takar 10 mL dan diencerkan dengan amonium hidroksida 5% dalam metanol hingga tanda. c. Pembuatan seri larutan baku alopurinol. Diambil sejumlah 100, 300, dan 600 μL larutan intermediet alopurinol kemudian masing-masing dimasukkan ke dalam labu takar 10 mL. Masing-masing labu takar diencerkan dengan amonium hidroksida 5% dalam metanol hingga tanda, sehingga diperoleh konsentrasi 5, 15, dan 30 μg/mL. d. Pembuatan kurva adisi alopurinol dalam matriks jamu Diambil 20 bungkus jamu merek asam urat yang telah dibeli, ditimbang secara seksama 0,5 g jamu merek asam urat yang sebelumnya telah PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 37 dihomogenkan dengan menimbang 20 bungkus jamu dan dihitung bobot rataratanya, kemudian dilarutkan dengan 10 mL NaOH 0,1 N. Ditambahkan sebanyak 200 μL seri larutan baku 5, 15, 30 μg/mL dan 100, 200, 300 µL dari larutan intermediet sehingga diperoleh massa alopurinol yang ditambahkan sebanyak 51, 103, 156 µg kemudian diekstraksi dengan kloroform 3 mL sebanyak tiga kali. Didapatkan 2 fase pemisahan, diambil fase air (bagian atas), tampung dalam flakon. Fase air ditambahkan HCl 0,1 N hingga pH 2 dan diperoleh volume akhir 4 mL. Sebanyak 1 mL sampel dimasukkan ke dalam catridge MCX yang telah dikondisikan dengan metanol dan air. Kolom SPE MCX dicuci dengan dialiri 2 mL asam asetat 2% dan 2 mL metanol. Selanjutnya elusi dengan 10 mL amonium hidroksida 5% dalam metanol. Fraksi amonium hidroksida 5% dalam metanol ditampung dalam flakon, lalu diuapkan seluruhnya. Kemudian dilarutkan dengan amonium hidroksida 5% dalam metanol sebanyak 10 mLlalu disaring dengan menggunakan milipore kemudian diultrasonifikasi selama 15 menit. Masing-masing diinjeksikan ke dalam sistem KCKT dengan replikasi lima kali. 5. Pengaruh Matriks Jamu pada Penetapan Kadar Alopurinol Untuk mengetahui pengaruh matriks pada penetapan kadar alopurinol dalam jamu, maka dilakukan perbandingan antara slope kurva baku alopurinol dan slope kurva baku adisi alopurinol dalam matriks jamu. 6. Validasi metode analisis dalam jamu Validasi metode analisis dilakukan padadata yang diperoleh di langkah 4 meliputi linearitas, akurasi dan sensitivitas. a. Linearitas. Linearitas ditentukan dengan nilai koefisien korelasi. Luas area diplotkan terhadap massa alopurinol yang ditambahkan ke dalam matriks jamu PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 38 untuk memperoleh regresi linier dengan persamaan y = bx + a. Nilai koefisien korelasi (r) yang akan digunakan untuk parameter validasi linearitas. b. Akurasi. Akurasi ditentukan dengan % perolehan kembali. % perolehan kembali = x 100% c. Presisi. Presisi ditentukan nilai % CV yang dapat dihitung dengan rumus berikut. % CV = x 100% d. Sensitivitas. Sensitivitas ditentukan dengan nilai LOQ yang dapat dihitung dengan rumus berikut. LOQ = 3,3 Keterangan: Sa: standar deviasi dari intersep kurva baku b: slope 7. Penetapan Kadar Alopurinol dalam Jamu Ditimbang secara seksama 0,5 gram jamu merek A,B dan C, kemudian dilarutkan dengan 10 mL NaOH 0,1 N. Diekstraksi dengan kloroform 3 mLsebanyak tiga kali. Didapatkan 2 fase pemisahan, diambil fase air (bagian atas), tampung dalam flakon. Fase air ditambahkan HCl 0,1 N hingga pH 2 dan diperoleh volume akhir 4 mL. Sebanyak 1 mL sampel dimasukkan ke dalam catridge MCX yang telah dikondisikan dengan metanol dan air. Kolom SPE MCX dicuci dengan dialiri 2 mL asam asetat 2% dan 2 mL metanol. Selanjutnya elusi dengan 10 mL amonium hidroksida 5% dalam metanol. Fraksi amonium PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 39 hidroksida 5% dalam metanol ditampung dalam flakon,lalu diuapkan seluruhnya. Kemudian dilarutkan dengan amonium hidroksida 5% dalam metanol sebanyak 10 mL lalu disaring dengan menggunakan milipore kemudian diultrasonifikasi selama 15 menit. Sejumlah 20 μL masing-masing sampel diinjeksikan ke sistem KCKT dengan replikasi tiga kali. PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 40 G. Analisis Hasil 1. Analisis Hasil Metode Spektrofotometri UV a. Akurasi Akurasi dinyatakan sebagai persen perolehan kembali (recovery). %recovery = x 100% Menurut Gonzales dan Herrador (2007) % recovery yang baik yaitu 98102%. b. Presisi Presisi dinyatan sebagai % CV % CV= Keterangan : CV = koefisien variasi SD = simpangan deviasi X = rata-rata c. LOQ (batas kuantitasi) Batas kuantitasi diperoleh dengan menghitung simpangan baku dari intersep kurva baku adisi alopurinol dalam matriks jamu dan diolah menggunakan persamaan matematis secara statistik menggunakan program powerfit, untuk menghitung nilai LOQ digunakan rumus : LOQ = 3,3 Keterangan : LOQ = batas kuantitasi PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI k = 3,3 Sa = standar deviasi dari intersep kurva baku b = slope 41 d. Perhitungan kadar alopurinol dalam sediaan tablet Untuk kadar alopurinol dalam sampel, analisis dilakukan dengan cara memplotkan absorbansi alopurinol dalam sampel tablet ke dalam kurva baku yang didapatkan. Kadar alopurinol dihitung menggunakan persamaan : Y = Bx + A Keterangan : Y = AUC alopurinol dalam sampel X = kadar alopurinol Sehingga kadar alopurinol dalam sampel adalah x = 2. Analisis Hasil Metode KCKT fase terbalik a. Linearitas Linearitas dinyatakan dalam koefisien relasi (r) pada regresi linear. Linearitas yang baik bila r hitung ≥ nilai r pada tabel. b. Akurasi Akurasi dinyatakan sebagai persen perolehan kembali (recovery). %recovery = x 100% Menurut Gonzales dan Herrador (2007) % recovery yang baik yaitu 80-110%. PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 42 c. Presisi Presisi dinyatan sebagai % CV % CV= Keterangan : CV = koefisien variasi SD = simpangan deviasi X = rata-rata d. LOQ (batas kuantitasi) Batas kuantitasi diperoleh dengan menghitung simpangan baku dari intersep kurva baku adisi alopurinol dalam matriks jamu dan diolah menggunakan persamaan matematis secara statistik menggunakan program powerfit, untuk menghitung nilai LOQ digunakan rumus : LOQ = 3,3 Keterangan : LOQ = batas kuantitasi k = 3,3 Sa = standar deviasi dari intersep kurva baku b = slope e. Perhitungan kadar alopurinol dalam jamu Untuk kadar alopurinol dalam sampel, analisis dilakukan dengan cara memplotkan absorbansi alopurinol dalam sampel jamu ke dalam kurva baku yang didapatkan. Kadar alopurinol dihitung menggunakan persamaan : PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI Y = Bx + A Keterangan : Y = AUC alopurinol dalam sampel X = kadar alopurinol Sehingga kadar alopurinol dalam sampel adalah x = 43 PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN Alopurinol memiliki gugus kromofor dan auksokrom sehingga dapat dianalisis menggunakan metode spektrofotometri. Menurut Sari (2014), batas kuantitasi alopurinol dengan metode spektrofotometri adalah 15.58 g/mg. Pada sampel jamu asam urat batas kuantifikasinya 0,52 g/mg sedangkan pada sampel tablet batas kuantifikasinya 300 g/mg. Metode spektrofotometri UV lebih tepat digunakan untuk penetapan kadar alopurinol dalam sampel tablet obat karena nilai LOQ yang diperoleh jauh lebih kecil dari batas yang ditentukan. Di dalam matriks sediaan tablet mengandung eksipien berupa zat pengisi, zat pengikat, zat penghancur (disintegran) yang beberapa tidak larut dalam pelarut yang digunakan. Oleh karena itu dibutuhkan optimasi isolasi proses penyaringan agar larutan yang dibuat bebas dari partikel ekspien. Berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh Soenarso (2014), diperoleh bahwa penyaringan dengan menggunakan pelarut 20 mL sebanyak satu kali merupakan ekstraksi yang optimal. Metode spektrofotometri untuk penetapan kadar alopurinol dalam tablet perlu dilakukan validasi untuk menjamin bahwa metode analisis memenuhi spesifikasi yang dapat diterima. 44 PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 45 A. Validasi Metode Analisis Alopurinol Dalam Tablet Prinsip metode analisis alopurinol dalam tablet (Dirjen POM RI, 1974), dilakukan pengembangan metode analisis dengan cara melarutkan sampel tablet ke dalam larutan NaOH 0,1 N kemudian diukur serapan pada maks dengan spektrofotometri UV. Validasi dilakukan menurut tata cara berikut: 1. Pembuatan dan Pembakuan Larutan NaOH 0,1 N Pelarut yang digunakan pada metode spektrofotometri ini adalah NaOH 0,1 N karena alopurinol larut baik dalam pelarut ini (Moffat, 2011). Namun NaOH yang akan digunakan sebagai pelarut harus dilakukan standarisasi. Tujuan dilakukan standarisasi ini adalah karena larutan NaOH bersifat hidroskopis yang dapat menyerap air dari lingkungannya sehingga terjadi pengenceran atau dengan kata lain dapat mengalami perubahan konsentrasi sehingga harus distandarisasi. Selain itu NaOH juga dapat bereaksi dengan gas CO2 dari udara. NaOH + CO2 → Na2CO3 + H2O NaOH distandarisasi dengan menggunakan kalium hidrogen biftalat sebagai standar primer. Pada pembakuan NaOH dengan kalium biftalat reaksi yang terjadi adalah Gambar 5. Reaksi kalium biftalat dengan NaOH PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 46 Standarisasi NaOH ini merupakan asidimetri dimana menentukan konsentrasi NaOH dari asam yang telah diketahui konsentrasinya terlebih dahulu. Asidimetri ini menggunakan prinsip titrasi yang mereaksikan kalium hidrogen biftalat sebagai asam dan NaOH sebagai basa hingga pada saat sejumlah mol ion OH- yang ditambahkan ke larutan sama dengan jumlah mol ion H+ yang semula ada. Dalam menentukan titik ekuivalen dalam suatu titrasi, kita harus mengetahui dengan tepat berapa volume basa yang ditambahkan dari buret ke asam dalam labu dengan cara menambahkan indikator asam basa. Indikator yang dipakai harus dipilih agar titik akhir titrasi dan teoritis berhimpit atau sangat berdekatan. Untuk itu harus dipilih indikator yang memiliki trayek perubahan warnanya di sekitar titik akhir teoritis (Gandjar dan Rohman, 2010). Pada penelitian ini digunakan indikator fenolftalein yang memiliki trayek pH 8,2-10 ( Jenkins, 1967). Digunakan indikator fenolftalein karena fenolftalein memiliki trayek perubahan warna disekitar titik akhir teoritis. Fenolftalein pada suasana basa akan memberikan warna merah muda. Gambar 6. Reaksi fenolftalein dengan NaOH PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 47 Pada penelitian ini dibutuhkan NaOH sejumlah 21,35 ml, maka normalitas NaOH yang digunakan adalah 0,092 N (Lampiran 4). 2. Penentuan Panjang Gelombang Pengamatan Penentuan panjang gelombang pengamatan bertujuan untuk mengetahui panjang gelombang alopurinol yang memiliki serapan maksimum. Pada panjang gelombang maksimum ini diharapkan semua kadar alopurinol dalam sampel dapat terdeteksi dengan baik oleh detektor UV. Pada penetapan alopurinol dalam sediaan tablet diperlukan pembacaan serapan dilakukan pada rentang panjang gelombang 200-400 nm menggunakan pelarut NaOH 0,1 N karena panjang gelombang maksimum alopurinol secara teoritis berada pada rentang tersebut. Pada penelitian ini digunakan tiga level konsentrasi yaitu 4,8 dan 12 μg/mL. Tabel V. Panjang gelombang maksimum alopurinol dengan pelarut NaOH 0,1 N Konsentrasi (µg/mL) 4 8 12 Panjang gelombang pengamatan (nm) 257 257 257 Panjang gelombang maksimum pada konsentrasi 4,8 dan 12 µg/mL menunjukkan dengan panjang gelombang yang sama dengan panjang gelombang teoritis menurut Moffat (2011) yaitu pada 257 nm. Berikut spektrogram alopurinol: PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 48 Gambar 7. Bentuk spektra panjang gelombang maksimum alopurinol dengan pelarut NaOH 0,1 N pada (A) konsentrasi 4µg/mL, (B) konsentrasi 8 µg/mL, (C) konsentrasi 12 µg/mL Berdasarkan Gambar 7. diatas dapat dilihat bahwa ketiga seri konsentrasi yang berbeda dihasilkan bentuk spektra yang sama, sehingga dapat disimpulkan bahwa spektra tersebut merupakan spektra alopurinol. 3. Pembuatan Kurva Baku Alopurinol Pembuatan kurva baku digunakan untuk mengetahui apakah hubungan antara respon instrumen dengan konsentrasi analit linier pada seri larutan kurva baku. Larutan seri kurva baku alopurinol yang digunakan terdiri dari 6 seri konsentrasi yaitu 4, 6, 8, 10, 12, dan 14 μg/mL. Pelarut yang digunakan untuk seri larutan baku adalah NaOH 0,1 N. Digunakan NaOH 0,1 N karena alopurinol larut dengan baik pada larutan alkalis NaOH 0,1 N (Moffat, 2011). Persamaan regresi linier yang didapatkan PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 49 merupakan hubungan antara konsentrasi alopurinol vs absorbansi yang dihasilkan dari pengukuran spektrofotometri. Hasil kurva baku alopurinol disajikan pada Tabel VI dan Gambar 8. Tabel VI. Kurva baku alopurinol Replikasi 1 konsentrasi baku Abs (µg/mL) 4 0,256 6 0,356 8 0,453 10 0,563 12 0,659 14 0,755 Replikasi 2 konsentrasi baku Abs (µg/mL) 4 0,253 6 0,355 8 0,460 10 0,570 12 0,686 14 0,776 Replikasi 3 konsentrasi baku Abs (µg/mL) 4 0,253 6 0,367 8 0,475 10 0,587 12 0,683 14 0,798 Dari ketiga replikasi yang diperoleh kemudian data dimasukkan ke dalam progam powerfit untuk dapat diperoleh kurva kalibrasi gabungan. Kurva kalibrasi gabungan yang diperoleh persamaan yaitu Y = 0,052 x + 0,045 dengan nilai r yaitu 0,998. Dengan demikian dapat dikatakan bahwa respon instrumen linier terhadap konsentrasi analit. Gambar 8. Plot kurva baku alopurinol PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 50 4. Validasi Metode Analisis Pada Tablet i. Akurasi pada tablet alopurinol Penetapan persen recovery dilakukan menggunakan 3 seri baku dengan masing-masing 5 kali replikasi. Nilai AUC yang diperoleh pada pengukuran kemudian dihitung menggunakan persamaan regresi liner Y = 0,052 x + 0,045. Akurasi yang dimaksud adalah penentuan akurasi baku alopurinol yang dispike ke dalam matriks sampel. Digunakan 3 level massa alopurinol yaitu 4 ,6 dan 8 mg masing-masing replikasi sebanyak 5 kali. Sebagai blanko digunakan sampel tablet alopurinol yang tidak diadisi dengan baku alopurinol. Berdasarkan hasil perhitungan (Lampiran 8) nilai akurasi baku alopurinol (hasil adisi) dapat dilihat pada Tabel VII berikut. Tabel VII. Rata-rata penetapan % recovery pada tablet alopurinol Rata-rata alopurinol yang diperoleh kembali (mg) Penambahan alopurinol (mg) Rata-rata konsentrasi alopurinol (mg) rata-rata % recovery (n=5) (%) 0 23,8 - - 4 27,6 3,9 98,6 6 29,7 5,9 98,9 8 31,8 8,1 100,3 Berdasarkan data pada Tabel VII diatas menunjukkan bahwa rata-rata % recovery pada ketiga level adisi memenuhi kriteria % perolehan kembali yang dipersyaratkan yaitu padar rentang 98-102% (Gonzales dan Herrador, 2007). PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 51 ii. Presisi pada tablet alopurinol Presisi adalah ukuran yang menyatakan derajat kesesuaian antara hasil uji individual yang diperoleh dari pengambilan sampel berulang pada suatu metode analisis (Snyder et al., 1997). Suatu metode dapat dikatakan memiliki presisi yang baik apabila memiliki CV < 2 % (AOAC dalam Gonzales and Herrador, 2007). Hasil penelitian ditunjukkan pada Tabel VIII. Tabel VIII. Persen koefisien variasi dari metode penambahan baku Penambahan (mg) konsentrasi alopurinol (n = 5) (mg) % CV 0 4 6 8 23,8±0,08 27,6±0,15 29,7±0,15 31,8±0,18 0,4 0,5 0,5 0,6 Berdasarkan data pada Tabel VIII, dapat diketahui bahwa setiap level massa alopurinol telah memenuhi syarat presisi yang baik dilihat dari nilai % CV yang kurang dari 2%. iii. LOQ pada tablet alopurinol Limit of quantitation (LOQ) adalah konsentrasi analit terendah dalam sampel yang dapat ditentukan dengan presisi dan akurasi yang dapat diterima pada kondisi operasional metode yang digunakan (Gandjar dan Rohman, 2012). Berdasarkan penelitian Sari (2014) dan Soenarso (2014) dalam penelitian ini, digunakan kurva adisi yang berasal dari matriks sampel tablet 77 mg + adisi PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 52 alopurinol (4.6 dan 8 mg) untuk menghitung nilai LOQ. Rumus untuk menghitung LOQ: LOQ = 3,3 x Nilai Sa (standar deviasi intersep) dari kurva diperoleh menggunakan program powerfit. Perhitungan LOQ ada di lampiran 10. Pada penelitian ini diperoleh nilai LOQ = 1,46 µg/mg bobot sampel. Aplikasi metode spektrofotometri akan digunakan untuk penetapan alopurinol dalam jamu. Namun menurut Sari (2014), batas kuantifikasi alopurinol yang harus dicapai dalam jamu adalah 0,52 µg/mg. Oleh karena itu, untuk penentapan kadar alopurinol dalam jamu tidak dapat menggunakan metode spektrofotometri karena batas kuantifikasi pada metode spektrofotometri tidak mencapai batas yang ditentukan. 5. Penetapan Kadar Alopurinol Pada Tablet Penetapan kadar alopurinol dalam tablet diawali dengan preparasi sampel tablet dengan cara penentuan keseragaman bobot tablet. Keseragaman bobot ini ditetapkan untuk menjamin keseragaman bobot tiap tablet yang dibuat. Tablettablet yang bobotnya seragam diharapkan akan memiliki kandungan bahan obat yang sama, sehingga akan mempunyai efek terapi yang sama. Keseragaman bobot dapat dilakukan dengan cara menimbang 20 tablet satu persatu lalu dihitung bobot rata-rata tablet alopurinol adalah 306 mg. Tidak boleh ada 2 tablet yang bobotnya menyimpang dari bobot rata-rata yang ditetapakan pada kolom A dan tidak boleh satu bobot tablet pun yang bobotnya menyimpanng dari bobot ratarata yang ditetapkan pada kolom B (Dirjen POM RI, 1995). PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 53 Tabel IX. Penyimpangan bobot rata-rata pada tablet bobot rata-rata ( mg) 25 atau kurang 26 sampai dengan 150 151 sampai dengan 300 Lebih dari 300 penyimpangan bobot rata-rata A B 15% 30% 10% 20% 7,5% 15% 5% 10% Pada penelitian ini bobot rata-rata yang diperoleh adalah 306 mg, maka dikategorikan bobot tablet lebih dari 300 mg. Persayaratan untuk penyimpangan bobot rata-rata yang harus dipenuhi adalah tidak lebih dari 2 tablet yang bobotnya menyimpang sebesar 5% bobot rata-rata dan tidak boleh satu bobot tablet pun yang bobotnya menyimpang sebesar 10% dari bobot rata-rata. Tabel X. Keseragaman bobot tablet alopurinol No Bobot tablet (mg) 1 307,9 2 310,1 3 311,4 4 306,4 5 307,5 6 305,6 7 306,0 8 309,2 9 305,6 10 304,4 Σ = 6119.8 range 5% : 290,7-321,3 no Bobot tablet (mg) 11 307,1 12 303,9 13 305,9 14 310,0 15 302,0 16 302,0 17 302,7 18 304,1 19 303.2 20 304,8 ̅ = 306 range 10% : 275,4-336,6 Pada Tabel X. diatas menunjukkan bahwa tablet alopurinol merek X memenuhi uji keseragaman bobot karena tidak ada satu tablet pun yang bobot nya menyimpang sebesar 5% atau 10 % dari bobot rata-rata. Tablet yang telah diuji keseragaman bobotnya kemudian digerus dengan menggunakan stamper dan mortir. Tujuan tablet digerus adalah untuk menghomogenkan dan mengecilkan ukuran partikel serbuk kasar, diharapkan PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 54 kehomogenan dan kecilnya ukuran partikel dapat meningkatkan luas permukaan serbuk yang dapat terbasahi dan terekstraksi oleh perlarut. Pelarut yang digunakan adalah NaOH 0,1 N. Analisis kuantitatif untuk mengetahui kadar alopurinol pada sediaan tablet dilakukan dengan dengan cara perhitungan berdasarkan persamaan kurva baku yang diperoleh dari proses validasi yakni Y = 0,052 x + 0,045. Berikut disajikan kadar alopurinol dalam sediaan tablet serta nilai % CV. Tabel XI. Kadar alopurinol pada tablet Sampel Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3 Replikasi 4 Replikasi 5 rata-rata CV Abs konsentrasi alopurinol (µg/mL) 0,537 0,538 0,542 0,539 0,540 0,539 0,4 9,5 9,5 9,5 9,6 9,5 9,5 0,5 Berat alopurinol dalam tablet (mg) 95,1 95,2 96,0 95,2 95,3 95,4 0,4 Kadar alopurinol dalam tablet (mg/g) 310,8 311,1 313,7 311,1 311,4 311,6 0,4 Berdasarkan Tabel XI di atas data penetapan kadar yang diperoleh ratarata kadar alopurinol per tablet adalah 311,6 mg/g dengan CV 0,4 %. Pada penelitian ini menggunakan tablet alopurinol dengan dosis 100 mg/tablet. Berdasarkan persyaratan dari Dirjen POM RI (1995), kadar alopurinol yang harus terkandung dalam tablet dalam rentang 93-107%. Oleh karena itu tablet alopurinol yang dianalisis telah memenuhi persyaratan yang ditentukan. Menurut Gonzales and Herrador (2007) CV yang baik < 2 %, maka CV yang diperoleh pada penelitian ini telah memenuhi syarat yang ditentukan. PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 55 B. Validasi metode Analisis Alopurinol Secara Kromatografi Cair Kinerja Tinggi fase Terbalik Pada penelitian ini juga dilakukan penetapan kadar alopurinol dalam jamu. Menurut Sari (2014), batas kuantifikasi alopurinol dalam jamu yang harus dicapai yang diturunkan dari NOAEL (No Observed Adverse Effect Level) adalah 0,52 µg/mg sehingga metode spektrofotometri tidak dapat digunakan untuk penetapan kadar alopurinol dalam jamu. Oleh karena itu untuk penetapan kadar alopurinol dalam jamu digunakan metode KCKT. Metode KCKT untuk penetapan kadar alopurinol dalam jamu perlu dilakukan validasi untuk menjamin bahwa metode analisis memenuhi spefikasi yang dapat diterima. Proses validasi metode analisis dilakukan menurut tata cara berikut : 1. Penentuan Panjang Gelombang Pengamatan Penentuan panjang gelombang pengamatan bertujuan untuk mengetahui panjang gelombang alopurinol yang memiliki serapan maksimum. Analisis suatu senyawa menggunakan KCKT memerlukan panjang gelombang maksimum dimana suatu senyawa memberikan serapan maksimum untuk dapat terbaca pada detektor UV pada alat KCKT. Pada panjang gelombang maksimum ini diharapkan semua kadar alopurinol dalam sampel dapat terdeteksi dengan baik oleh detektor UV. Pada penetapan alopurinol dalam jamu asam urat diperlukan pembacaan serapan dilakukan pada rentang panjang gelombang 200-400 nm dengan PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI menggunakan pelarut amonium hidroksida 5% 56 dalam metanol. Penggunaan pelarut amonium hidroksida 5% dalam metanol ini karena pelarut ini dapat melarutkan dengan baik alopurinol dan pelarut ini digunakan dalam proses elusi pada clean up menggunakan solid phase extraction (Waters, 2008). Pada penelitian ini digunakan lima level konsentrasi. Konsentrasi yang digunakan adalah 5; 7,5; 10; 12,5 dan 15 μg/mL. Tabel XII. Panjang gelombang maksimum alopurinol dengan pelarut amonium hidroksida 5% dalam metanol Konsentrasi (g/mL) 5,0 7,5 10,0 12,5 15,0 maks terukur Rata-rata maks terukur 272,9 273,9 273,7 274,0 273,8 273,7 ≈ 274 nm Pada Tabel XII di atas menunjukkan bahwa maks terukur rata-rata yang diperoleh adalah 274 nm, digunakan sebagai panjang gelombang maksimum. Berikut spektrogram alopurinol : PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 57 Gambar 9. Bentuk spektra panjang gelombang maksimum alopurinol dengan pelarut amonium hidroksida 5% dalam metanol pada (A) konsentrasi 5 µg/mL, (B) konsentrasi 10 µg/mL, (C) konsentrasi 15 µg/mL Berdasarkan Gambar 9. diatas dapat dilihat bahwa ketiga seri konsentrasi yang berbeda dihasilkan bentuk spektra yang sama, sehingga dapat disimpulkan bahwa spektra tersebut merupakan spektra alopurinol. 2. Pembuatan Fase Gerak Pemilihan fase gerak yang akan digunakan sangat penting karena akan mempengaruhi waktu retensi dan pemisahan komponen-komponen dalam sampel yang akan dianalisis. Berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh Sari (2014) komposisi fase gerak dan flow rate yang optimum adalah metanol:akuabides/amonium hidroksida 0.1% adalah 10:90 dengan flow rate 0,5 mL/ menit. Fase gerak yang digunakan adalah campuran metanol p.a. dan akuabides yang ditambahkan dengan amonium hidroksida 0,1%. Metanol digunakan karena memiliki viskositas yang rendah yaitu 0,55 cp sehingga dapat menurunkan tekanan pada kolom (Gandjar dan Rohman, 2010). PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 58 Penambahan amonium hidroksida 0.1 % dalam fase gerak berfungsi untuk menutup residu silanol dalam kolom C18. Senyawa yang dianalisis yaitu alopurinol bersifat basa sehingga dapat berikatan dengan residu silanol yang bersifat asam sehingga peak yang dihasilkan dapat mengalami tailing. Dengan demikian, amonium hidroksida dapat menurunkan tailing factor yang dialami oleh senyawa-senyawa yang bersifat basa (Snyder, 2010). Berikut gambar Interaksi amonium hidroksida dengan residu silanol dalam kolom C18. Gambar 10. Interaksi amonium hidroksida dengan residu silanol dalam kolom C18 Sebelum digunakan, masing-masing komponen fase gerak harus disaring menggunakan kertas whatman untuk menghilangkan adanya partikel. Selanjutnya fase gerak di degassing dengan menggunakan ultrasonikator selama 15 menit yang bertujuan untuk menghilangan gelembung udara pada fase gerak. Adanya gelembung udara dapat mengakibatkan tekanan pompa tidak stabil sehingga mempengaruhi pembacaan sinyal dalam instrumen KCKT. 3. Kurva Baku Alopurinol Pembuatan kurva baku digunakan untuk mengetahui apakah hubungan antara respon instrumen. Pada penelitian ini dilakukan 2 kali pembuatan kurva baku yaitu pada periode I (Desember 2013) dan periode II (Februari 2014). Pada PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 59 periode I dibuat untuk perhitungan kadar alopurinol di dalam sampel sedangkan kurva baku periode II untuk perhitungan LOD. Kurva baku periode I dan II disajikan pada tabel XIII dan XV. Tabel XIII. Kurva baku alopurinol periode I Replikasi 1 2 3 Massa alopurinol (ng) 101 201 302 402 503 603 101 201 302 402 503 603 101 201 302 402 503 603 AUC 247249 818744 1654925 2309629 2986392 3639311 245974 813919 1651463 2307736 2986772 3653295 245746 815105 1650687 2306361 2981560 3655325 Persamaan Persamaan kumulatif F(x) = -471920.3 + 6859.7 x r= 0.999 F(x) = -480792.2 + 6886.3 x r = 0.999 F(x) = -477792.8 + 6876.6 x r = 0.999 F(x) = -480665.7 + 6883.9 x r = 0.999 Pada Tabel XIII diperoleh persamaan kumulatif dengan koefisien korelasi (r) sebesar 0,999. Batasan yang digunakan untuk nilai koefisien korelasi ini menggunakan Pearson’s correlation coefficient test, dimana dapat dijelaskan bahwa koefisien korelasi memiliki hubungan terhadap banyaknya jumlah determinasi (n) yang dilakukan. Hubungan tersebut dapat dilihat pada tabel berikut. PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 60 Tabel XIV. Hubungan r dengan n (Cook et al., 2000) Apabila nilai r dari suatu regresi linear lebih besar daripada nilai r pada tabel tersebut menunjukkan hubungan linearitas pada kurva baku secara statistik terpenuhi. Pada Tabel XIII diperoleh nilai koefisien korelasi (r) sebesar 0,999 dengan n = 6 ( tiga replikasi) , maka dapat dikatakan linear secara statistik karena r > 0,811. Dengan demikian dapat dikatakan bahwa respon istrumen linier terhadap konsentrasi analit. Tabel XV. Kurva baku alopurinol periode II Replikasi 1 2 3 Massa Alopurinol (ng) 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 AUC 18307 22397 27433 34450 16573 21598 26991 34521 16871 21857 27438 34305 Persamaan Persamaan kumulatif y= 12280.5 + 5346.5 x r = 0.992 y = 10111.5 + 5923.7 x r = 0.995 y = 10647 + 5788.3 x r = 0.997 y = 11013 + 5686.2 x r = 0,993 PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 61 Pada Tabel XV diperoleh nilai koefisien korelasi (r) sebesar 0,993 dengan n = 4 ( tiga replikasi) , maka dapat dikatakan linear secara statistik karena r > 0,95. Dengan demikian dapat dikatakan bahwa respon istrumen linier terhadap konsentrasi analit. 4. Kurva Adisi Alopurinol Dalam Matriks Jamu Komposisi matriks jamu asam urat sangat kompleks, oleh karena itu perlu diketahui pengaruh matriks sampel pada determinasi alopurinol dengan menggunakan KCKT. Apabila matriks sampel jamu asam urat memberikan pengaruh yang signifikan maka perlu dipertimbangkan penggunaan kurva adisi alopurinol dalam matriks jamu. Seri larutan kurva baku alopurinol dalam matriks jamu asam urat dibuat dengan menambahkan baku alopurinol ke dalam sampel blanko matriks jamu asam urat yang telah melalui tahap ekstraksi dan clean up hingga diperoleh sejumlah massa alopurinol (10,2; 54,1 dan 81,9 ng) yang diinjeksikan kedalam sistem KCKT. Hasil disajikan dalam tabel berikut : PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 62 Tabel XVI. Kurva adisi alopurinol dalam matriks jamu Rep 1 2 3 4 5 Massa Massa alopurinol alopurinol yang yang ditambahkan diinjeksikan (ng) (ng) 51 10,2 103 54,1 156 81,9 51 10,2 103 54,1 156 81,9 51 10,2 103 54,1 156 81,9 51 10,2 103 54,1 156 81,9 51 10,2 103 54,1 156 81,9 AUC 161281 1413539 3389374 160994 1417681 3401810 160904 1418200 3431567 160153 1415550 3391014 158998 1416969 3384573 Persamaan Persamaan kumulatif Y=-466882,3+ 43535,2 x r = 0,967 Y=-469763,3+ 43705,7x r = 0,967 Y=-478220,1+ 44085,7x r = 0,966 Y=-468067,2+ 43576,7x r = 0.967 Y=-467114,8+ 43514,9 r = 0,968 y=-470009,5 + 43683,7 x r = 0,967 Berdasarkan Tabel XVI diperoleh nilai koefisien korelasi (r) sebesar 0,967 dengan n = 3 ( lima replikasi) dapat dikatakan tidak linear secara statistik karena nilai r < r tabel XIV (0,997). Dengan demikian dapat dikatakan bahwa respon instrumen belum linier terhadap konsentrasi analit dalam matriks jamu. 5. Pengaruh Matriks Jamu Dalam Penetapan Kadar Alopurinol Tujuan melihat pengaruh matriks adalah untuk melihat matriks jamu memberikan pengaruh dalam penetapan kadar alopurinol dalam jamu. Pengaruh matriks dapat diketahui dari slope kurva baku alopurinol dan kurva baku adisi alopurinol dalam matriks jamu dilakukan uji signifikansi slope. Uji signifikansi perbedaan slope kurva baku alopurinol periode I dan II terhadap kurva adisi alopurinol dalam matriks jamu ditampilkan pada Tabel XVII dan XVIII. PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 63 Tabel XVII. Hasil uji t slope kurva baku alopurinol dalam pelarut periode I dan kurva adisi alopurinol dalam matriks jamu Slope Kurva baku periode I Kurva adisi 6876,6 t hitung P t tabel Kesimpulan 3,22 0,05 2,048 berbeda signifikan 43683,7 Tabel XVIII. Hasil uji t slope kurva baku alopurinol dalam pelarut periode II dan kurva adisi alopurinol dalam matriks jamu Kurva baku Kurva baku adisi Slope 5686.2 43683,7 t hitung P t tabel Kesimpulan 2,89 0,05 2,059 berbeda signifikan Berdasarkan Tabel XVII dan Tabel XVIII. diatas menunjukkan bahwa slope kurva baku alopurinol dalam pelarut baik periode II dan II terhadap kurva adisi alopurinol dalam matriks jamu berbeda signifikan secara statistik, hal ini ditunjukkan dengan t hitung >t tabel. Berikut gambar perbandingan kurva baku dan kurva adisi. AUC Perbandingan kurva baku dan kurva adisi 4000000 3500000 3000000 2500000 2000000 1500000 1000000 500000 0 kurva adisi kurva baku periode I kurva baku periode II 0 200 400 600 800 massa alopurinol (ng) Gambar 11. Perbandingan kurva baku dan kurva adisi PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 64 Perbedaan slope yang signifikan pada kedua kurva baku disebabkan adanya pengaruh matriks jamu pada penetapan kadar alopurinol dalam jamu. Oleh karena itu digunakan kurva baku adisi alopurinol dalam matriks jamu untuk penetapan kadar alopurinol dalam sampel. 6. Validasi Metode Analisis Dalam Jamu Validasi metode analisis dilakukan untuk membuktikan bahwa metode KCKT yang digunakan pada penelitian ini memiliki validitas yang baik atau tidak dalam penetapan kadar alopurinol dengan kondisi percobaaan sesuai hasil optimasi. i. Linearitas Linearitas merupakan kemampuan suatu metode untuk memperoleh hasil uji yang proporsional dengan konsentrasi analit pada kisaran yang diberikan (Gandjar dan Rohman, 2012). Pada penelitian ini diperoleh persamaan kurva adisi alopurinol dalam matriks jamu adalah y= -470009,5 + 43683,7 x dengan linearitas r = 0,967. Linieritas dinyatakan sebagai koefisien korelasi. Batasan yang digunakan untuk nilai koefisien korelasi ini menggunakan Pearson’s correlation coefficient test, dimana dapat dijelaskan bahwa koefisien korelasi memiliki hubungan terhadap banyaknya jumlah determinasi (n) yang dilakukan. Hubungan tersebut dapat dilihat pada tabel XIV di atas. Apabila nilai r dari suatu regresi linear lebih besar daripada nilai r pada tabel menunjukkan hubungan linieritas pada kurva baku secara statistik terpenuhi. Persamaan kurva baku adisi alopurinol dalam matriks jamu memiliki (r) sebesar PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 65 0,967 dengan n = 3 (lima replikasi) maka dapat dikatakan belum linier secara statistik karena r > 0,997 ii. Akurasi Konsentrasi sampel setelah adisi diluar rentang linearitas kurva baku periode I dan II serta pengaruh matriks yang sangat besar (Gambar 11), oleh sebab itu tidak dapat ditentukan akurasi . iii. Presisi Presisi adalah ukuran yang menyatakan derajat kesesuaian antara hasil uji individual yang diperoleh dari pengambilan sampel berulang pada suatu metode analisis (Snyder et al., 1997). Presisi ditunjukkan dengan nilai koefisien variasi (CV). Suatu metode dapat dikatakan memiliki presisi yang baik apabila memiliki CV < 2 % (AOAC dalam Gonzales and Herrador, 2007). Hasil penelitian ditunjukkan pada Tabel XIX. Tabel XIX. Persen koefisien variasi dari metode penambahan baku Massa alopurinol yang ditambahkan (n = 5) (ng) 10,2 54,1 81,9 Rata-rata ditemukan (n=5) (ng) 3,4 32,2 77,6 SD % CV 0,02 0,4 0,43 0,6 0,1 0,6 Berdasarkan data pada Tabel XIX, dapat diketahui bahwa setiap level massa alopurinol telah memenuhi syarat presisi yang baik dilihat dari nilai % CV yang kurang dari 2%. PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 66 iv. LOQ Limit of quantitation (LOQ) adalah konsentrasi analit terendah dalam sampel yang dapat ditentukan dengan presisi dan akurasi yang dapat diterima pada kondisi operasional metode yang digunakan (Gandjar dan Rohman, 2012). Parameter akurasi tidak dapat ditentukan oleh karena itu nilai LOQ juga tidak dapat diperoleh. 7. Penetapan Kadar Alopurinol dalam Jamu Meskipun metode analisis tidak valid penulis mencoba melakukan penetapan kadar terhadap 3 sampel jamu yang beredar di pasaran dengan menggunakan kurva adisi y= -470009,5 + 43683,7 x. Tabel XX. Kadar alopurinol dalam sampel jamu Sampel A B C rep 1 rep 2 rep 3 rep 1 rep 2 rep 3 rep 1 rep 2 rep 3 rata-rata kadar alopurinol (ng /g) Tidak terdeteksi 46,39 83,72 Hasil penetapan kadar di atas tidak dapat digunakan karena validitas metode analisis yang tidak dapat dipertanggung jawabkan. PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI BAB V KESIMPULAN DAN SARAN A. Kesimpulan 1. Hasil metode spektrofotometri pada penetapan kadar alopurinol dalam sediaan tablet dengan melihat parameter akurasi yang dinyatakan dengan nilai recovery sebesar 98,6 -100,3 %; presisi dinyatakan dengan nilai % CV sebesar 0.4-0.6%; LOQ dengan nilai 1,46 µg/mg sampel. Kadar rata-rata alopurinol yang terdapat dalam sediaan tablet adalah 311,6 mg/g. 2. Hasil validasi metode standar adisi alopurinol dalam matriks jamu pada KCKT fase terbalik tidak valid. B. Saran 1. Pada metode spektrofotometri perlu dilakukan untuk penetapan kadar sampel alopurinol pada merek tablet yang berbeda. 2. Pada metode KCKT fase terbalik perlu dilakukan perbaikan terhadap pembuatan kurva baku adisi 67 PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 68 Daftar pustaka Chan, C.C.,Lee,Y.C., Lam, H., and Zhang, X.M., 2004, Analytical method validation and instrument performance verification, John Wiley & Sons, Inc., New Jersey, pp. 17,18. Cook, et al., 2000, Pearson’s Product Moment Correlation Coefficient, http://media3.bmth.ac.uk/spss/focus_pages/focus_10a.htm, diakses tanggal 16 Agustus 2014 Direktorat Pengawas Obat dan Makanan RI,1974, Farmakope Indonesia, edisi 3, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta, pp. 26-30. Direktorat Pengawas Obat dan Makanan RI,1995, Farmakope Indonesia, edisi 4, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta, pp. 73-75. Gandjar, I.G. dan Rohman,A., 2010, Kimia Farmasi Analisis, Pustaka Pelajar, Yogyakarta, pp.378-400. Gandjar, I.G., dan Rohman,A., 2012, Analisis Obat Secara Spektrofotometri dan Kromatografi, Pustaka Pelajar, Yogyakarta, pp.417-428. Gennaro, A.R., (Ed.), Remington The Science and Practice of Pharmacy, 20th ed., Lipincott William and Wilkins, Philadelphia, pp. 1462-1464. Glaxosmithkline, 2013, Safety Data Sheet of Allopurinol, www.msdsgsk.com/GetSdsFile.ashx?fileId=2421, diakses tanggal 1 April 2014 Gonzales, A.G. and Herrador, M.A., 2007, A practical guide to analytical method validation, Including Measurement Uncertainty and Accuracy Profiles, Trends in Anal. Chem., 26, pp. 232-234. Harmita, 2006, Analisis Kuantitatif Bahan Baku dan Sediaan Farmasi, Departemen Farmasi FMIPA Universitas Indonesia, Depok, pp. 157-165. Harvey, D., 2000, Modern Analytical Chemistry, McGraw Hill, New York, pp. 578-586. Hendayana, S., 2006, Kimia Pemisahan, PT Remaja Rosdakarya, Bandung, pp. 67-112. Horwitz, W., Latimer, G.W., (Eds), 2005, Official Method of Analysis, AOAC International, USA, pp. 254-250. Iskandar, J.,2006. Rematik dan Asam Urat. Bhuana Ilmu Komputer. Jakarta, pp. 34-38. PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 69 Jeffrey, R., 1996, Analytical Detection Limit Guidance & Laboratory Guide for Determining Method Detection Limit, Laboratory Certification Program, Department of Natural Resources, Wisconsin. Jenkins,G.L., 1967, Quantitative Chemical Analysis, Second Edition, W.H. Freeman and Company, New York Johnstone, A., 2005, Gout The disease and Non Drug Treatment, Hospital Pharmacist, 12, pp. 391-394 Kantasubrata,J., 2004, Kiat Memahami HPLC, Puslitkimia, LIPI, pp. 12-24. Kepmenkes RI no 661/MENKES/SK/VII/1994, Tentang Persyaratan Obat Tradisional, Departemen Kesehatan RI,Jakarta Khayoon,W.S, Abaichy,M.Q., Jasim, M., and Hamadany, M.A., 2008, Spectrophotometric Determination of Allopurinol in Tablet Formulation, Journal of Phisical Science, 19(2), 23-30. Levin, S., 2002, Quantitative Work in HPLC, http://forumsci.co.il/HPLC, diakses tanggal 31 Desember 2013. Long, William dan Henderson, 2007, Chromatography of Nitrogen Containing Compounds Without Triethylamine, Agilent Technology. Machata, S.G., 2005, Comparison of the Octanol/Water Partition Coefficients Calculated by ClogP®, ACDlogP and KowWin® to Experimentally Determined Values, International Journal of Pharmaceutics, 294, pp. 185-192. Mayasari, 2009, Analisis Kandungan Metampiron Pada Jamu Tradisional Yang Beredar Di Kota Medan Tahun 2009, Skripsi, Fakultas Kesehatan Masyarakat, Universitas Sumatra Utara, Sumatra Utara Mandell and Brian, F., 2008, Clinical manifestation of hyperuricemia and gout, Clinic Journal of Medicine, 15(3), 256-260. Medsafe, 2011, Allopurinol, http://www.medsafe.govt.nz/profs/datasheet/a/apoallopurinoltab.pdf, diakses tanggal 1 April 2014 Moffat, C., Osselton, M.D., Widdop, B., 2011, Clarke’s Analysis of Drugs and Poisons, 4th edition, Pharmaceutical Press, London, UK, pp. 125-150. Mulja, M., Suharman, 1995, Analisis Instrumental, Airlangga University Press, Surabaya, pp. 26-27, 33-34. Munson, J.W., 1991, Pharmaceutical Analysis Modern Methods, diterjemahkan oleh Harjana, Parwa B., Volume II, Airlangga University Press, Surabaya, pp. 12-18. PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 70 Mursyidi, A., Volumetri dan Gravimetri, Gadjah Mada University Press, Yogyakarta, pp. 88,89,108. Permata, D., 2012, Optimasi Metode Identifikasi Antalgin Dan Klorfeniramin Maleat Secara KCKT Photodiode Array Setelah Pemisahan Dengan Solid Phase Extraction Pada Sediaan Obat Tradisional, Skripsi, Fakultas Matematika Dan Ilmu Pengetahuan Alam Program Ekstensi Departemen Farmasi, Universitas Indonesia, Depok Pengawas Obat dan Makanan (POM), 2004, Tentang Ketentuan Pokok Pengelompokan dan Penandaan Obat Bahan Alam Indonesia, Departemen Kesehatan RI, Jakarta. Pengawas Obat dan Makanan (POM), 2005, Kriteria dan Tata Laksana Pendaftaran Obat Tradisional, Obat Herbal Terstandar dan Fitofarmaka, Departemen Kesehatan RI, Jakarta. Permenkes RI. No. 246/Menkes/Per/V/1990, Tentang Izin Usaha Industri Obat Tradisional dan Pendaftaran Obat Tradisional, Departemen Kesehatan RI, Jakarta. Permenkes RI. No. 007 tahun 2012, Tentang Registrasi Obat Tradisional, Departemen Kesehatan RI, Jakarta Reinders et al, 2007, A simple method for quantification of allopurinol and oxypurinol in human by high performance liquid chromatography with uv detection, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 45(2), pp. 312-317. Sari, M.K., 2014, Optimasi dan Validasi Penetapan Kadar Alopurinol Dalam Matriks Tablet Obat Secara Spektrofotometri UVdan Matriks Sampel Jamu Asam Urat Secara Kromatografi Cair Kinerja Tinggi, Skripsi, Fakultas Farmasi, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta Satiadarma, K., 2004, Azas Pengembangan Prosedur Analisis, Edisi pertama, Airlangga University Press, Surabaya, pp. 378-388 Sastrohamidjojo, H., 1991, Kromatografi, Liberty, Yogyakarta, pp. 99-105. Skoog, D.A., West, D.M., Holler, F.J., 1998, Analytical Chemistry, Sixth edition, Saunders College Publishing, USA, pp. 383-385. Snyder, L.R., Kirkland, J.J., Glajch, J.L., 1997, Practical HPLC Method Development, 2nd edition, John Wiley & Sons, Inc., New York, pp. 2528. Snyder, L.R., Kirkland, J.J., Dolan, J.W., 2010, Introduction of Modern Liquid Chromatography, 3 rd edition, John Wiley & Sons, Inc., New York, pp. 25, 28, 33, 40-42, 51-52, 71, 109, 152, 316, 327. PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 71 Soenarso, S.A., Optimasi Isolasi Alopurinol Dalam Sediaan Tablet Dan Jamu, Skripsi, Fakultas Farmasi, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta Sweetman,L., 1969, Quantitation of Oxypurines and Allopurinol Metabolites in Biological Fluid by Cation Exchange Chromatography, Analytical Biochemistry,31, pp. 358-365. United States Pharmacopeial Convention, 2009, The United States Phamacopeia 32-National Formulary, United States Pharmacopeial Convention Inc., Rockville, pp. 733 Waters, 2008, Oasis Sample Preparation, Water Corporation, USA, pp.7 Watson, D.G., 2003, Pharmaceutical Analysis: A Textbook for Pharmacy Students and Pharmaceutical Chemist, Churchill Livingstone, USA, p. 79 Wells, B.G., 2009, Pharmacotherapy Handbook, 7th edition, McGraw Hill Inc., New York, pp. 345-347, 457-460. Yee, S.K., 2003, Regulatory Control Of Chinese Propretary Medicines in Singapore, J.Healthy Policy,15(2) 71, 133-149. PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 72 LAMPIRAN PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI Lampiran 1. Sertifikat analisis baku alopurinol 73 PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI Lampiran 2. Sertifikat analisis SPE MCX 74 PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 75 LAMPIRAN 3. Perhitungan indeks polaritas NaOH 0,1 N dan amonium hidroksida 5% dalam metanol Diketahui data berikut : Pelarut / Solvent Polarity Index Metanol 5,1 Air 10,2 Perhitungan indeks polaritas NaOH 0,1N = 1 x 10,2 = 10,2 Perhitungan indeks polaritas amonium hidroksida 5% dalam metanol = 10,2 + = 0,5 + 4,8 = 5,3 5,1 PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI Lampiran 4. Perhitungan Pembakuan NaOH Penimbangan kalium biftalat dan NaOH Penimbangan Kalium biftalat (g) NaOH Berat wadah 0,4374 63,4134 Berat wadah + zat 0,8375 67,3383 Berat wadah + sisa 0,4377 63,4134 Berat zat 0,3998 3,9248 Diketahui : bobot kalium biftalat (g) : 0,3998 g = 399,8 mg BM kalium biftalat : 204,2 Valensi kalium biftalat :1 Volume NaOH : 21,35 mL Rumus : N NaOH = = , , , = 0,0917 N Warna larutan setelah terjadi titik akhir titrasi 76 PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI Lampiran 5. Spektrogram pada penetapan panjang gelombang maksimum dengan pelarut NaOH 0,1 N a. Kosentrasi 4 μg/mL b. Konsentrasi 8 μg/mL 77 PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI c. Konsentrasi 12 μg/mL 78 PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 79 Lampiran 6. Pembuatan kurva baku pada metode spektrofotometri Penimbangan baku alopurinol penimbangan replikasi I (g) replikasi II (g) replikasi III (g) berat kertas 0,2560 0,2455 0,2545 berat kertas + zat 0,3064 0,2961 0,3050 berat kertas + sisa 0,2564 0,2461 0,2550 berat zat 0,0500 0,0500 0,0500 konsentrasi larutan induk 50 100,51 % 50 100,51 % 50 100,51 % 50 50 50 = 1005,1 μg/mL = 1005,1 μg/mL = 1005,1 μg/mL Tingkat kemurnian alopurinol = 100,51 (berdasarkan CoA pada lampiran 1) Jumlah allopurinol = 50 mg x 100,51% = 5025,5 mg C stok = 5025,5 mg/ 50 mL = 1,0051 mg/mL = 1005,1 μg/mL C1V1 = C2V2 C baku intermediet 1 →1005,1 x 1 mL = C2 x 10 mL C2 = 100,51 μg/mL C baku intermediet 2 →100,51 x 10 mL = C2 x 50 mL C2 = 20,102 μg/mL Seri 1→ 20,102 μg/mL x 2 mL = C2 x 10 mL PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 80 C2 = 4,0204 μg/mL NB : perhitungan seri baku lainnya dilakukan dengan cara yang sama dengan menyesuaikan volume larutan baku intermediet 2 yang diambil. PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 81 Lampiran 7. Data kadar alopurinol dalam tablet dan contoh perhitungan sampel Abs konsentrasi berat sampel alopurinol (µg/mL) (mg) Berat alopurinol dalam sampel(mg) Berat alopurinol dalam tablet (mg) Replikasi 1 0,537 9,5 76.1 23,7 95,1 Replikasi 2 0,538 9,5 76,2 23,7 95,2 Replikasi 3 0,542 9,6 76,2 23,9 96,0 Replikasi 4 0,539 9,5 76,3 23,8 95,2 Replikasi 5 0,540 9,5 76,4 23,8 95,3 rata-rata CV 0,539 0,4 9,5 0,4 76,3 0,1 23,8 0,3 95,4 0,4 Contoh perhitungan kadar alopurinol dalam sediaan tablet Absorbansi alopurinol dalam sediaan tablet replikasi 1 = 0,537, kemudian dimasukkan ke dalam persamaan kurva baku Y = 0,052 x + 0,045 0,537 = 0,052 x + 0,045 0,052 x = 0,492 x = 9,5 μg/mL PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI bobot alopurinol dalam sampel : konsentrasi x faktor pengenceran : 9,5 μg/mL x 10 mL x : 23653,9 μg = 23,7 mg Bobot alopurinol dalam sediaan tablet: = bobot alopurinol dalam sampel x = 23,7 mg x = 95,1 mg , , x 82 PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 83 Lampiran 8. Akurasi alopurinol pada tablet adisi 0 4 6 8 alopurinol bobot konsentrasi yang sampel absorbansi alopurinol ditambahkan (g) (µg/mL) (µg) 0,0761 0,537 9,5 0,0762 0,538 9,5 0,0762 0,542 9,6 0,0763 0,539 9,5 0,0764 0,54 9,5 Rata-rata bobot alopurinol dalam sampel 0,0765 3900 0,618 11,0 0,0764 3800 0,617 11,0 0,0765 4100 0,624 11,1 0,0764 3900 0,62 11,1 0,0764 4100 0,623 11,1 0,0763 5800 0,658 11,8 0,0764 6000 0,662 11,9 0,0765 6100 0,666 11,9 0,0765 5900 0,661 11,8 0,0764 5900 0,66 11,8 0,0765 7900 0,704 12,7 0,0764 0,0765 0,0764 0,0765 8000 8100 8100 7900 0,706 0,71 0,711 0,703 12,7 12,8 12,8 12,7 bobot alopurinol (µg) 23653,8 23701,9 23894,2 23750,0 23798,1 23759,6 27548,1 27500,0 27836,5 27644,2 27788,5 29471,2 29663,5 29855,8 29615,4 29567,3 31682,7 31778,8 31971,2 32019,2 31634,6 % recovery ratarata - - 97,1 97,4 98,5 98,6 97,3 97,8 97,8 99,3 98,6 97,8 99,8 99,8 100,9 101,5 99,2 97,8 98,3 99,8 PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI Contoh perhitungan recovery baku alopurinol 4 mg replikasi I Persamaan kurva baku alopurinol : Y = 0,052 x + 0,045 X = kadar terukur, Y = absorbansi Absorbansi adisi baku alopurinol replikasi I : 0,618 Y = 0,052 x + 0,045 0,618 = 0,052 x + 0,045 0,052 x = 0,573 x = 11, 0 μg/mL bobot adisi alopurinol 4 mg : konsentrasi x faktor pengenceran : 11,0 μg/mL x 10 mL x : 27548,1μg % recovery : : x 100 % , : 97, 1 % , x 100 % x 84 PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 85 Lampiran 9. Penimbangan bahan untuk akurasi pada tablet a. Penimbangan sampel tanpa adisi Penimbangan berat kertas berat kertas +zat berat kertas + sisa berat zat Replikasi I (g) 0,2457 0,3222 0,2461 0,0761 Replikasi II (g) 0,2560 0,3326 0,2564 0,0762 Replikasi III (g) 0,2446 0,3212 0,2450 0,0762 Replikasi IV (g) 0,2580 0,3346 0,2583 0,0763 Replikasi V (g) 0,2449 0,3214 0,2450 0,0764 Replikasi IV (g) 0,2438 0,3204 0.2440 0,0764 Replikasi V (g) 0,2514 0,3280 0,2516 0,0764 b. Penimbangan sampel dengan adisi 4 mg alopurinol Penimbangan berat kertas berat kertas +zat berat kertas + sisa berat zat Replikasi I (g) 0,2487 0,3253 0,2488 0,0765 Replikasi II (g) 0,2512 0,3278 0,2514 0,0764 Replikasi III (g) 0,2412 0,3178 0,2413 0,0765 PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 86 c. Penimbangan sampel dengan adisi 6 mg alopurinol Penimbangan berat kertas berat kertas +zat berat kertas + sisa berat zat Replikasi I (g) 0,2501 0,3267 0,2504 0,0763 Replikasi II (g) 0,2506 0,3272 0,2508 0,0764 Replikasi III (g) 0,2458 0,3224 0,2459 0,0765 Replikasi IV (g) 0,2456 0,3222 0,2457 0,0765 Replikasi V (g) 0,2411 0.3177 0,2413 0,0764 Replikasi IV (g) 0,2456 0,3222 0,2458 0,0764 Replikasi V (g) 0,2516 0,3282 0,2517 0,0765 d. Penimbangan sampel dengan adisi 8 mg alopurinol Penimbangan berat kertas berat kertas +zat berat kertas + sisa berat zat Replikasi I (g) 0,2450 0,3216 0,2451 0,0765 Replikasi II (g) 0,2489 0,3255 0,2491 0,0764 Replikasi III (g) 0,2415 0,3181 0,2416 0,0765 PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 87 Penimbangan baku alopurinol yang ditambahkan ke dalam sampel a. Penambahan alopurinol 4 mg Penimbangan berat kertas berat kertas +zat berat kertas + sisa berat zat Replikasi I (g) 0,2425 0,2466 0,2427 0,0039 Replikasi II (g) 0,2455 0,2496 0,2458 0,0038 Replikasi III (g) 0,2540 0,2582 0,2541 0,0041 Replikasi IV (g) 0,2512 0,2554 0,2515 0,0039 Replikasi V (g) 0,2449 0,2492 0,2451 0,0041 Replikasi II (g) 0,2478 0,2539 0,2479 0,0060 Replikasi III (g) 0,2488 0,2550 0,2489 0,0061 Replikasi IV (g) 0,2510 0,2572 0,2513 0,0059 Replikasi V (g) 0,2505 0,2566 0,2507 0,0059 b. Penambahan alopurinol 6 mg Penimbangan berat kertas berat kertas +zat berat kertas + sisa berat zat Replikasi I (g) 0,2522 0,2583 0,2525 0,0058 PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 88 c. Penambahan alopurinol 8 mg Penimbangan berat kertas berat kertas +zat berat kertas + sisa berat zat Replikasi I (g) 0,2412 0,2493 0,2414 0,0079 Replikasi II (g) 0,2435 0,2516 0,2436 0,0080 Replikasi III (g) 0,2508 0,2590 0,2509 0,0081 Replikasi IV (g) 0,2516 0,2598 0,2517 0,0081 Replikasi V (g) 0,2514 0,2595 0,2516 0,0079 PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 89 Lampiran 10. Perhitungan LOQ untuk metode spektrofotometri Abs Replikasi Replikasi Replikasi Replikasi Replikasi I II III IV V 4 0,618 0,617 0,624 0,62 0,623 6 0,658 0,658 0,658 0,658 0,658 8 0,704 0,706 0,71 0,711 0,703 addisi (mg) LOQ = 3,3 = 3,3 . , . =0,45 µg/mL LOQ = , /( =1,46 µg/mg ) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI LAMPIRAN 11. Spektogram scaning panjang gelombang maksimum alopurinol dengan pelarut amonium hidroksida 5% dalam metanol a. Alopurinol 5,0 μg/mL b. Alopurinol 7,5 μg/mL 90 PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI c. Alopurinol 10 μg/mL d. Alopurinol 12,5 μg/mL e. Alopurinol 15 μg/mL 91 PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI Lampiran 12. Kromatogram kurva baku alopurinol periode II 1. Replikasi I a. Seri 1 (alopurinol 0,1μg/mL) b. Seri 2 (alopurinol 0,2μg/mL) 92 PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI c. Seri 3 (alopurinol 0,3μg/mL) d. Seri 4 (alopurinol 0,4μg/mL) 93 PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 2. Replikasi II a. Seri 1 (alopurinol 0,1 μg/mL) b. Seri 2 (alopurinol 0,2μg/mL) 94 PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI c. Seri 3 (alopurinol 0,3μg/mL) d. Seri 4 (alopurinol 0,4μg/mL) 95 PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 3. Replikasi III a. Seri 1 (alopurinol 0,1 μg/mL) b. Seri 2 (alopurinol 0,2μg/mL) 96 PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI c. Seri 3 (alopurinol 0,3μg/mL) d. Seri 4 (alopurinol 0,4μg/mL) 97 PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 98 Lampiran 13. Penimbangan baku dan contoh perhitungan kadar baku pada metode KCKT a. Penimbangan baku Penimbangan b. Replikasi I (g) Replikasi II (g) Replikasi III (g) Berat kertas 0,3056 0,3025 0,3047 Berat kertas + zat 0,3308 0,3277 0,3299 Berat kertas + sisa 0,3058 0,3027 0,3049 Berat zat 0,0250 0,0250 0,0250 DATA AUC Replikasi 1 massa AUC baku (ng) 1,0051 18307 2,0102 22397 3,0153 27433 4,0204 34450 c. Replikasi 2 massa AUC baku (ng) 1,0051 16573 2,0102 21598 3,0153 26991 4,0204 34521 Replikasi 3 massa AUC baku (ng) 1,0051 16871 2,0102 21857 3,0153 27438 4,0204 34305 Contoh perhitungan kadar Replikasi I Tingkat kemurnian allopurinol = 100,51 (berdasarkan CoA pada lampiran 1) Jumlah allopurinol = 25 mg x 100,51% = 25,1275 mg C stok = 25,1275 mg/25 mL = 1005,1 mg/1000 mL = 1005,1 μg/mL C1V1 = C2V2 C baku intermediet →1005,1 x 0,1 mL = C2 x 10 mL PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 99 C2 = 10,051 μg/mL Seri 1→10,051 μg/mL x 0,1 mL = C2 x 10 mL C2 = 0,10051 μg/mL = 0,10051 ng/μL Setiap penginjekan ke sistem KCKT menggunakan volume 10 μl Maka massa alopurinol yang masuk ke dalam sistem KCKT : 0,10051 ng/μL x 10 μl = 1,0051 ng = 1 ng NB : perhitungan seri baku lainnya dilakukan dengan cara yang sama dengan menyesuaikan volume larutan baku intermediet yang diambil. PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 100 Lampiran 14. Contoh perhitungan Uji T untuk slope kurva baku adisi dalam matriks dan kurva baku dalam pelarut periode I t hitung = untuk mencari nilai s digunakan rumus : = ( ( ) = ( ) ( )43683,7 ) ( ( )6876,6 ) s = 31269.4 t hitung = 43683,7 . . = 3.22 t tabel= 2,048 karena nilai t hitung (2,89) lebih besar daripada t tabel (2,048) pada tingkat kepercayaan 95% dengan harga degree of freedom 28, maka nilai slope antara kurva baku adisi dalam matriks dan kurva baku dalam pelarut berbeda signifikan. PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 101 Lampiran 15. Kromatogramkurva baku adisi alopurinol dalam matriks jamu 1.Replikasi I a. Blanko sampel (tanpa adisi baku alopurinol) b. Kadar rendah (sampel dispike dengan alopurinol 51μg) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI c. Kadar sedang (sampel dispike dengan alopurinol 103μg) d. Kadar tinggi (sampel dispike dengan alopurinol 156μg) 102 PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 2. Replikasi II a. Blanko sampel (tanpa adisi baku alopurinol) b. Kadar rendah (sampel dispike dengan alopurinol 51μg) 103 PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI c. kadar sedang (sampel dispike dengan alopurinol 103 μg) d. Kadar tinggi (sampel dispike dengan alopurinol 156 μg) 104 PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 3.Replikasi III a. Blanko sampel (tanpa adisi baku alopurinol) b. Kadar rendah (sampel dispike dengan alopurinol 51 μg) 105 PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI c. Kadar sedang (sampel dispike dengan allopurinol 103μg) d. Kadar tinggi (sampel dispike dengan allopurinol156 μg) 106 PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 4. Replikasi IV a. Blanko sampel (tanpa adisi baku alopurinol) b. Kadar rendah (sampel dispike dengan allopurinol 51 μg) 107 PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI c. Kadar sedang (sampel dispike dengan alopurinol 103 μg) d. Kadar tinggi (sampel dispike dengan alopurinol 156 μg) 108 PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 5. Replikasi V a. Blanko sampel (tanpa adisi baku alopurinol) b. Kadar rendah (sampel dispike dengan alopurinol 51 μg) 109 PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI c. Kadar sedang (sampel dispike dengan alopurinol 103 μg) d. Kadar tinggi (sampel dispike dengan alopurinol 156 μg) 110 PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 111 Lampiran 16. Data penimbangan sampel a. Penimbangan baku Penimbangan Replikasi I (g) Replikasi II (g) Replikasi III (g) Replikasi IV (g) Replikasi V (g) Berat kertas 0,2125 0,2147 0,2136 0,2786 0,2546 Berat kertas + zat 0,2375 0,2397 0,2386 0,3036 0,2796 Berat kertas + sisa 0,2125 0,2147 0,2136 0,2786 0,2546 Berat zat 0,0250 0,0250 0,0250 0,0250 0,0250 b. Penimbangan sampel A untuk blanko Penimbangan Replikasi I (g) Replikasi II (g) Replikasi III (g) Replikasi IV (g) Replikasi V (g) Berat kertas 0,3125 0,3028 0,2996 0,3455 0,3578 Berat kertas + zat 0,8165 0,8025 0,7997 0,8476 0,8590 Berat kertas + sisa 0,3127 0,3030 0,2997 0,3457 0,3580 Berat zat 0,5038 0,4995 0,5000 0,5019 0,5010 PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 112 c. Penimbangan sampel A untuk adisi 51 μg Penimbangan Replikasi I (g) Replikasi II (g) Replikasi III (g) Replikasi IV (g) Replikasi V (g) Berat kertas 0,3065 0,3055 0,2978 0,3123 0,3089 Berat kertas + zat 0,8090 0,8124 0,7973 0,8135 0,8115 Berat kertas + sisa 0,3075 0,3061 0,2980 0,3125 0,3091 Berat zat 0,5015 0,5063 0,4997 0,5010 0,5024 Replikasi I (g) Replikasi II (g) Replikasi III (g) Replikasi IV (g) Replikasi V (g) Berat kertas 0,3067 0,3045 0,3065 0,3012 0,3053 Berat kertas + zat 0,8093 0,8067 0,8079 0,8037 0,8063 Berat kertas + sisa 0,3069 0,3047 0,3067 0,3014 0,3055 Berat zat 0,5024 0,5020 0,5012 0,5023 0,5008 d. Penimbangan sampel A untuk adisi 103 μg Penimbangan PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 113 e. Penimbangan sampel A untuk adisi 156 μg Penimbangan Replikasi I (g) Replikasi II (g) Replikasi III (g) Replikasi IV (g) Replikasi V (g) Berat kertas 0,3044 0,3078 0,3034 0,3066 0,3087 Berat kertas + zat 0,8061 0,8097 0,8059 0,8102 0,8118 Berat kertas + sisa 0,3046 0,3080 0,3036 0,3068 0,3089 Berat zat 0,5015 0,5017 0,5023 0,5034 0,5026 PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI Lampiran 17. Kromatogram sampel A a. Replikasi I b. Replikasi II 114 PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI c. Replikasi III 115 PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI Lampiran 18. Kromatogram sampel B a. Replikasi I b. Replikasi II 116 PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI c. Replikasi III 117 PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI Lampiran 19. Kromatogram sampel C a. Replikasi I b. Replikasi II 118 PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI c. Replikasi III 119 PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 120 Lampiran 20. Perhitungan penetapan kadar alopurinol dalam sampel jamu Data penimbangan sampel : penimbangan (g) Sampel rata-rata Replikasi I Replikasi II Replikasi III A 0,5012 0,5044 0,5047 0,5034 B 0,5082 0,5012 0,5025 0,5039 C 0,5043 0,5034 0,5047 0,5041 AUC yang diperoleh : AUC Sampel Replikasi I Replikasi II Replikasi III A 17983 18710 18677 B 554547 550842 548114 C 1372118 1372292 1374533 Data AUC kemudian dikonversi menjadi bobot seperti tabel di bawah ini : bobot (ng) Sampel Replikasi I A Replikasi II Replikasi III Tidak terdeteksi B 23,45 23,37 23,31 C 42,17 42,17 42,22 PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 121 BIOGRAFI PENULIS Penulis skripsi dengan judul “Validasi Metode Analisis Alopurinol Dalam Tablet Secara Spektrofotometri Dan Jamu Secara Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Fase Terbalik Serta Aplikasinya” ini memiliki nama lengkap Ria Kusuma Dewi. Penulis dilahirkan di Surakarta pada 8 Maret 1992 sebagai anak pertama dari dua bersaudara, dari pasangan Tomo dan Mikke Iskandar. Pendidikan formal yang pernah ditempuh penulis yaitu TK Marsudirini (1996-1998), SD Widya Wacana (1998-2004), SMP Bintang Laut (2004-2007), SMA Regina Pacis (2007-2010) dan pada tahun 2010 melanjutkan pendidikan di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. Selama kuliah, penulis aktif dalam berbagai kegiatan dan kepanitiaan antara lain menjadi anggota tim dalam kegiatan penyuluhan dengan tema waspadai demam chikungunya (2011), peserta dalam kegiatan seminar Kanker Serviks dan Kanker Paru-Paru (2011), peserta dalam acara seminar nasional Pemberdayaan Pasien dalam Self Management Diabetes Melitus untuk Meningkatkan Kualitas Hidup, peserta dalam acara Hari Aids Sedunia (2011), sie konsumsi dalam acara Pharmacy Performance and Event Cup (2012), co kesekretariatan dalam kegiatan Pelepasan Wisuda (2012), peserta dalam acara seminar Who are you, Give or Be Given (2012), asisten praktikum biokimia dan farmakognosi fitokimia(2012), sie perlengkapan dalam Komisi Pemilihan Umum Gubernur Badan Eksekutif Mahasiswa dan Ketua Dewan Perwakilan Mahasiswa Fakultas Farmasi (2013), asisten praktikum analisis farmasi dan validasi metode (2014).
