transplantasi autologus bone marrow

1180: Purwati dkk.
KO-104
TRANSPLANTASI AUTOLOGUS BONE MARROW MESENCHYMAL
STEM CELL DAN ALLOGENIC PANCREATIC STEM CELL UNTUK
PERBAIKAN SEL BETA PANKREAS PADA EKSPERIMENTAL DIABETES
MELITUS
Purwati1,2,∗ , Fedik A.R.2 , Sony Wibisono1 , Anas P.2 , Eric H.2 , Helen S.2 , dan Deya K.2
1
Departemen Penyakit Dalam, Fakultas Kedokteran, Universitas Airlangga - RSUD Dr. Soetomo, Surabaya
2
Laboratorium Sel Punca, Institute of Tropical Disease, Universitas Airlangga, Surabaya
∗
e-Mail: [email protected]
Disajikan 29-30 Nop 2012
ABSTRAK
Background: Alternative therapies in Diabetes Mellitus (DM) management include the use of stem cells. Stem cells derived
from the bone marrow and pancreatic cells from allogenic donors were used in this experimental animal model to restore glucose
control. Methods: DM was induced in Wistar rats with 50 mg/kg alloxan. DM rats were divided into 4 treatment groups,
group 1 was transplanted with autologous bone marrow derived mesenchymal stem cells (MSC) by intraperitoneally injection.
group 2 was given allogenic pancreatic cells intraperitoneally, group 3 was given insulin subcutaneously, and group 4 served as
control (no treated). The dosage was 200,000 cells/rat. Results: Post therapy results in group 1 revealed significant decrease of
blood sugar levels, an increase in insulin levels, and increased C peptide levels. In group 2, there were more pronounced changes,
improvements in glucose control compared to group 1. Those receiving only insulin the levels of blood sugar decreased but less
so compared to those receiving MSC or pancreatic cells (p = 0.002). Conclusion: In a DM Wistar rat model the intraperitoneal
administration of pancreatic cells resulted in better restoration of glucose control than intraperitoneally of bone marrow derived
MSC, which in turn was better than only insulin.
Kata Kunci: DM, stem cell, allogenic, autologous
I.
PENDAHULUAN
DM ditemukan di seluruh dunia, terutama tipe 2 dan
lebih sering terjadi di negara berkembang. Peningkatan
prevalensi paling tinggi di Asia dan Afrika, sebagai akibat dari tren urbanisasi dan perubahan gaya hidup, termasuk adopsi diet ”gaya Barat”. Telah banyak intervensi medis dan perbaikan gaya hidup diupayakan sejauh ini untuk pencegahan dan penanganan diabetes,
tapi prevalensinya tetap meningkat. Oleh karena itu,
kami berupaya menyediakan suatu alternatif dalam
pengobatan diabetes menggunakan stem cell. Stem cell
yang digunakan adalah MSCs yang berasal dari sumsum tulang dan pancreatic stem cell dari donor allogenik.
Autologus MSCs yang berasal dari sumsum tulang
merupakan salah satu jenis stem cell yang digunakan
untuk memperbaiki kerusakan sel pancreas pada DM,
dan tidak didapatkan penolakan pasca dilakukan transplantasi. Sejauh ini, sumsum tulang dianggap sebagai
sumber stem cell yang lebih disukai. MSCs merupakan
derivat sumsum tulang mempunyai sifat multipotent.
MSC akan tumbuh dan berdiferensiasi sesuai dengan
lingkungannya. Secara in vivo, ketika MSCs dimasukkan ke dalam pankreas, maka MSC akan berdiferensiasi menjadi sel pankreas, yang mempunyai fungsi
eksokrin dan endokrin yang sama. Dengan demikian maka transplantasi MSCs ini dapat memperbaiki
kerusakan pankreas paada DM.
Studi in vivo eksperimental komparatif ini, membandingkan transplantasi autologus MSCs, allogenik
PSCs dan terapi pemberian insulin untuk perbaikan
pankreas pada eksperimental DM dengan menggunakan rat.
II.
METODOLOGI
Sampel
Digunakan rat Wistar, dibagi menjadi 4 kelompok.
Kelompok 1 mendapatkan transplantasi MSCs, kelompok 2 mendapatkan transplantasi sel pancreas/PSCs,
kelompok 3 mendapatkan insulin dan kelompok 4 se-
Prosiding InSINas 2012
1180: Purwati dkk.
KO-105
TABEL 1: Kadar glukosa darah, C-peptide dan insulin sebelum dan setelah injeksi alloxan
Kadar glukosa (mg/dl)
Ains ∗
p
Apep ∗∗
GDP
p
GD2JPP
p
Tikus sebelum
85.7±5.33
alloxan
Tikus setelah
135.05±21.25
alloxan
∗
Kadar insulin (pg/L)
∗∗
Kadar C peptide (NG/l)
0.000
98.45±4.67
206.65±58.27
0.000
0.298±0.242
0.057±0.041
0.000
0.262±0.177
p
0.002
0.168±0.132
G AMBAR 1: Karakterisasi MSC dengan DAB immunostaining. Kiri: ekspresi CD44. Kanan: ekspresi CD 105. Pembesaran 40×
bagai kontrol. Rat dibuat menjadi DM dengan injeksi
alloxan dosis 50 mg/kg secara intraperitoneal, kemudian dipuasakan selama 8-10 jam, setelah 72 jam diukur
kadar C peptide dan insulin diukur secara ELISA (Mercodia). Hasilnya dibandingkan antara pra-injeksi dan
pasca-injeksi. Selain itu, diukur juga kadar gula darah
menggunakan stik Accu-chek active (Roche) baik sebelum maupun sesudah injeksi alloxan. Diagnosis diabetes ditegakkan dengan mengukur glukosa darah, Cpeptide dan insulin. Kadar gula darah ditentukan dengan mengukur darah vena yang diambil dari vena
ekor. Kadar glukosa diukur saat puasa dan 2 jam setelah makan. Kadar gula normal pada tikus adalah 60120 mg/dl. Pengukuran kadar C-peptide dan insulin
dilakukan menggunakan metode ELISA. Tabel 1 menunjukkan bahwa pemberian alloxan efektif dalam perusakan sel pankreas pada rat sehingga menyebabkan
penurunan kadar insulin dan C-peptide dan untuk meningkatkan kadar glukosa darah pada binatang ini.
subsection*Isolasi dan kultur MSCs dari sumsum tulang
Mesenchymal stem cells diisolasi dari sumsum
tulang menggunakan aspirasi dan separasi pada
Histopaque-1.077 (Sigma). Sel yang diambil dikultur
pada Dulbecco’s Modified Eagles Medium (DMEM)
yang mengandung glukosa 1.0 g/l. Karakterisasi MSCs
dilakukan dengan menganalisa ekspresi CD44 + dan
CD 105 + dengan menggunakan DAB immunostaining
dan FACS (BD).
Isolasi dan kultur sel pankreas
Sel pankreas diisolasi dari organ pankreas yang diambil dari rat Wistar sehat (Demeterco et al., 2000).
Sel pankreas dilakukan digest dengan menggunakan
trypsin (Sigma) selama 40 menit pada suhu 37 ◦ C yang
bertujuan untuk disosiasi jaringan. Selanjutnya ditambahkan 1,5 FBS (Gibco) untuk menghentikan proses
digest. Kemudian disentrifugasi kecepatan 1600 rpm
selama 10 menit, dan supernatannya dibuang. Pelet
dikultur dalam medium RPMI dan Insulin transferin
selenium medium (ITS). Setelah dikultur selama 21
hari, dikarakterisasi dengan memeriksa kadar insulin
dan C-peptide yang disekresikan dan ekspresi nestin
pada sel pankreas (Shapiro et al., 2000). C-peptide dan
insulin diukur menggunakan metode ELISA, sedangkan imunofluoresensi nestin diperiksa menggunakan
metode indirek (Rantam et al., 2009). MSCs dan sel
pankreas yang sudah konfluen dipanen dan selanjutnya ditransplantasikan pada rat DM. Rat DM dibagi
Prosiding InSINas 2012
KO-106
1180: Purwati dkk.
G AMBAR 2: Kultur sel pankreas. Kiri: pertumbuhan sel pankreas pada hari ke-5. Kanan: pertumbuhan sel pankreas pada hari ke-12
menunjukkan lapisan sel yang konfluen. Mikroskop inverted, pembesaran 40×
menjadi empat kelompok, tiap kelompok terdiri dari
6 binatang. Kelompok 1 diberikan 200.000 sel MSC,
kelompok 2 diberikan 200.000 sel pankreas, kelompok
3 diberikan insulin subkutan 1 unit/kgBB, 3 kali sehari
15 menit sebelum makan, dan kelompok 4 yang tidak
diobati bertindak sebagai kontrol. Sel diberikan secara
intraperitonel. Evaluasi setelah tansplantasi dilakukan
pengukuran kadar glukosa darah, C-peptide, dan insulin serta imunohistokimia untuk memeriksa ekspresi
HE dan PDX1.
III.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Tiga bulan setelah injeksi alloxan, diukur kadar
glukosa darah, C-peptide dan insulin serta pemeriksaan imunohistokimia. Hasil kadar glukosa darah, Cpeptide dan insulin tampak pada TABEL 1.
Kadar glukosa darah (puasa dan 2 jam post-prandial)
meningkat secara signifikan setelah injeksi alloxan.
Kadar C-peptide dan insulin menurun secara signifikan
setelah injeksi alloxan.
G AMBAR 3: Kadar C peptide dan insulin diukur dengan elisa dari
supernatan kultur sel pankreas, meningkatkan sesuai pasase dan
mencapai puncak pada pasase 4
Karakterisasi MSCs dan sel pankreas
Stem cell dikarakterisasi sebelum ditrasnplantasikan
dengan tujuan untuk memastikan apakah sel yang ditransplantasikan sudah sesuai dengan sel yang dimaksud. Dalam studi ini karakterisasi fenotip MSC menggunakan immunostaining DAB untuk mengamati ekspresi CD 44+ dan CD105+. Hasil positif ditunjukkan
dalam warna coklat seperti tampak pada G AMBAR 1.
Setelah melalui tahapan isolasi dan kultur sel
pankreas, didapatkan hasil yang diperoleh seperti ditunjukkan dalam G AMBAR 2:
Karakterisasi sel pancreas dilakukan dengan mengukur kadar insulin dan C peptide dengan menggunakan
elisa. Selain itu juga diperiksa ekspresi nestin dengan
menggunakan imunofluoresens indirek. Pengukuran
kadar insulin dan C peptide menunjukkan insulin disekresi oleh sel pankreas sejak pasase awal, meningkat
pada setiap pasase dan mencapai kadar puncak pada
pasase 4. C peptide juga disekresikan pada pasase 1,
meningkat setiap pasase dan mencapai kadar puncak
pada pasae 4.
Transplantasi MSCs dan sel pankreas
Hasil glukosa darah puasa dan 2 jam post prandial (PP) pasca-transplantasi menggunakan autologus
MSCs dengan dosis 2×106/kgBB, sel pankreas (PSC) allogenik 2×106/kgB dibandingkan dengan insulin subkutan dan kontrol seperti tampak pada G AMBAR 5 dan
G AMBAR 6.
Kadar glukosa puasa dan 2 jam post-prandial secara signifikan menurun setelah transplantasi MSCs
dan PSCs, juga setelah pemberian insulin tapi tidak
pada kelompok kontrol.
Pengukuran kadar insulin dan C-peptide setelah
transplantasi autologus MSCs dan allogenik PSCs dibandingkan dengan pemberian insulin dan kontrol.
Hasilnya ditunjukkan pada G AMBAR 7 dan G AMBAR 8.
Kadar C peptide dan insulin secara signifikan
Prosiding InSINas 2012
1180: Purwati dkk.
KO-107
G AMBAR 4: Ekspresi nestin padea sel pankreas. Kiri, sel pankreas yang sudah matur. Kanan, ekspresi nestin ditunjukkan dengan
fluoresensi hijau spesifik. Pembesaran 40×
G AMBAR 5: Kadar glukosa puasa sebelum dan sesudah transplantasi autologus MSC , allogenik PSCs dibandingkan dengan insulin
dan control
G AMBAR 6: Kadar glukosa dua jam post-prandial sebelum dan
sesudah transplantasi autologus MSCs, allogenik PSCs dibandingkan dengan insulin dan control
meningkat setelah transplantasi MSCs dan PSC, juga
setelah pemberian insulin tapi tidak pada kelompok
kontrol.
Pemeriksaan imunohistokimia pasca transplantasi
autologus MSCs dan allogenik PSCs dibandingkan
dengan pemberian insulin and kontrol didapatkan
hasil seperti pada gambar di bawah ini. Marker
yang digunakan untuk pemeriksaan imunohistokimia
adalah PDX1 sebagai promoter insulin dan HE sebagai
marker untuk melihat recovery atau repair dari sel beta
pankreas.
Ekspresi PDX1 pada pankreas rat yang normal
adalah lebih dari 75%, setelah induksi dengan alloxan
50 mg/kg dan menjadi rat DM maka ekspresi PDX1
menurun di bawah 25%. Pasca dilakukan transplantasi
dengan menggunakan autologus MSCs dan allogenik
PSCs didapatkan peningkatan ekspresi PDX1 menjadi
25∼50%, demikian juga transplantasi allogenik PSCs,
ekspresi PDX1 meningkat menjadi lebih dari 75%. Ekspresi PDX1 tidak meningkat pasca pemberian terapi
insulin.
Hasil pemeriksaan imunohistokimia ekspresi HE
(Hematosilin Eosin) didapatkan hasil serupa dengan
ekspresi PDX1, yaitu ekspresi HE pada pankreas tikus
normal adalah lebih dari 75% dan menurun setelah
injeksi alloxan. Peningkatan ekspresi HE didapatkan
pasca transplantasi autologus MSCs (50∼75%) dan tranplantasi allogenik PSCs (lebih dari 75%), tapi HE tidak
diekspresikan terlalu banyak pada tikus diabetik dengan pemberian insulin, hanya di bawah 25%.
Diabetes melitus disebabkan oleh penurunan absolut produksi insulin, sehingga memerlukan suplementasi insulin eksogen, dalam hal ini secara fisiologis lebih
dipilih untuk meregenerasi kapasitas fungsi pankreas
untuk memproduksi insulin itu sendiri daripada pemberian insulin dari luar. Pada penelitian ini didapatkan hasil bahwa injeksi autologus MSCs derivat sumsum tulang dan allogenik PSCs dapat merekonstitusi
produksi insulin pada model binatang DM. Sebelum digunakan, MSCs divalidasi terlebih dahulu untuk kadar
Prosiding InSINas 2012
1180: Purwati dkk.
KO-108
G AMBAR 7: Kadar C peptide sebelum dan sesudah transplantasi
autologus MSCs, allogenik PSCs dibandingkan dengan insulin dan
kontrol.
kemurniannya dengan menggunakan ekspresi CD105
dan CD44. Hal ini mengindikasikan bahwa sel ini memang MSCs matur.
Mesenchymal stem cell adalah prekursor jaringan
non-hematopoietik (misal, otot, tulang, tendon, ligamen, jaringan adiposa, dan fibroblas) yang relatif mudah didapatkan dari sumsum tulang autologus. Sel
ini bersifat multipotent serta menunjukkan imunogenisitas yang relatif rendah, dan mudah disimpan
dalam suhu di bawah nol derajat. MSCs bersifat
hipoimunogenik dan dapat menghindar dari eliminasi
imun pejamu. MSCs akan tumbuh dan berdiferensiasi berdasarkan lingkungannya. In vivo, ketika diinjeksikan ke dalam pankreas, dapat diperkirakan bahwa
MSCs akan berdiferensiasi menjadi sel pankreas yang
mempunyai fungsi eksokrin dan endokrin. Dengan
demikian maka transplantasi autologus MSCs derivate
dari sumsum tulang dapat memperbaiki kerusakan
sel pankreas melalui efek selnya sendiri maupun efek
parakrin dari MSCs, sehingga bisa mengembalikan
fungsi dari sel pancreas tersebut. Studi lain menyebutkan bahwa stem cell derivat sumsum tulang dapat
berdiferensiasi menjadi sel yang dapat mensekresikan
insulin in vitro (Baksh dan Tuan, 2007; Sotiropoulou et
al., 2006).
Pankreas adalah suatu organ yang mempunyai kemampuan terbatas untuk berproliferasi (Soria et al.,
2001) walaupun demikian sel ini masih dapat berproliferasi dan berdiferensiasi secara in vitro menjadi sel
islet (Demeterco et al., 2000; Kahn et al., 2005). Untuk
mendapatkan hasil yang diinginkan sel pankreas dikultur dalam free serum medium yang mengandung ITS
(insulin-transferrin selenium), terdiri dari nikotinamida
dan faktor pertumbuhan keratinosit. Dalam beberapa
hari sel tumbuh secara konfluen dengan formasi tridimensional yang memproduksi insulin dan glukagon.
Sebelum diberikan, sel pankreas terlebih dahulu divalidasi untuk kadar kemurniannya menggunakan insulin,
C peptide, dan nestin. Pemeriksaan insulin dan C peptide menggunakan ELISA ditemukan kadar insulin dan
C peptida pada supernatan sel kultur, menunjukkan
bahwa sel tersebut mensekresi insulin dan C peptide.
Karakterisasi sel pankreas juga menggunakan ekspresi
nestin melalui pemeriksaan imunofluoresens, menunjukkan ekspresi nestin positif. Ekspresi nestin positif
menunjukkan suatu ciri spesifik sel punca pankreas,
baik dalam fungsi eksokrin maupun endokrin. Pasca
Transplantasi menggunakan autologus MSCs derivate
sumsum tulang, allogenik PSCs dan terapi insulin
sub cutan ditemukan adanya restorasi pengendalian
glukosa, sekresi insulin, C peptide dan perbaikan sel
beta pancreas paling bagus adalah pasca allogenik PSCs
dibandingkan dengan autologus MSCs. Hal ini dikarenakan populasi sel pankreas yang digunakan mengandung sel progenitor yang berfungsi secara langsung secara endokrin dan eksokrin, sedangkan MSC adalah
sel punca multipoten, yang membutuhkan waktu untuk berdiferensiasi menjadi sel pankreas. Sedamgkan
pasca terapi insulin hanya didapatkan peningkatan
kadar insulin tetapi tidak didapatkan perbaikan dari sel
pankreas itu sendiri, dengan demikian maka stem cell
dapat mengatasi permasalahan DM langsung dari akar
penyebabnya yaitu dengan merepair sel pankreas itu
sendiri.
IV.
KESIMPULAN
Injeksi allogenik sel pankreas intraperitoneal memberikan respons lebih baik dibandingkan dengan autologus MSC intraperitoneal dalam merepair sel pankreas
pada rat DM.
G AMBAR 8: Kadar insulin sebelum dan sesudah transplantasi autologus MSCs, allogenik PSCs dibandingkan dengan insulin dan
control
UCAPAN TERIMA KASIH
Peneliti berterima kasih kepada semua yang membantu penyelesaian studi ini, dr. Budiono M.S., drh.
Budi S., Handoko dan ITD, Airlangga University.
Prosiding InSINas 2012
1180: Purwati dkk.
KO-109
G AMBAR 9: Ekspresi PDX1 dengan pemeriksaan imunohistokimia.A. Pankreas tikus normal. B. Pankreas tikus diabetik. C. Pankreas
tikus diabetik setelah 1 bulan pemberian insulin. D. Pankreas tikus diabetik 1 bulan setelah transplantasi allogenik PSCs. E. Pankreas tikus
diabetik 1 bulan setelah transplantasi autologus MSCs
Penelitian ini didukung oleh Kementerian Riset dan
Teknologi, Republik Indonesia, melalui insentif peneliti
Program Research Grant (InSINas No. RT-2012-1180).
DAFTAR PUSTAKA
[1] Aggarwal S, Pittenger MF. 2005.Human mesenchymal stem cells modulate allogeneic immune cell responses. Blood, 105:1815-1822
[2] American Diabetes Association: Standards of medical care in diabetes.2008 (Position statement). Diabetes Care 2008;31 (Suppl.1):S12-54.
[3] Baksh D. and Tuan R.S. 2007. Canonical and noncanonical Wnts differentially affect the development potential of primary isolate of human bone
marrow mesenchymal stem cells. J. Cell physiol.
212: 817-826
[4] Bartholomew A., Sturgeon C., Siatskas M., Ferrer
K., McIntosh K., Patil S., Hardy W., Devine S.,
Ucker D., Deans R., Moseley A., Hoffman R.. 2002.
Mesenchymal stem cells suppress lymphocyte proliferation in vitro and prolong skin graft survival in
vivo. Exp Hematol .30:42-48.
[5] Brunner & Suddarth. (1997), Keperawatan Medikal
Bedah, alih bahasa Hartono, A.
[6] DeFronzo R.A., Ferrannini E., Keen H., Zimmet P.
2004. International Textbook of Diabetes Mellitus,
3rd ed. Chichester, UK: John Wiley and Sons.
[7] Demeterco C., Beatttie G.M., Dib S.A., et al. 2000. A
[8]
[9]
[10]
[11]
[12]
Role for Activin A and Beta Cellulin in human fetal
pancreatic cell differentiation and growth . J. Clin.
Endocrinol Metab 85: 3892-3897
Diabetes Control and Complications Trial Research
Group: The effect of intensive diabetes treatment
on the development progression of long-term complications in insulin-dependent diabetes mellitus:
the Diabetes Controland Complication Trial. N.
Engl. J. Med. 1993;329:978-986.
Dominici M, Le Blanc K, Mueller I, SlaperCortenbach I, Marini F, Krause D, Deans R, Keating A, Prockop D, Horwitz E. 2006. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal
cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy, 8:315-317.
Leahy JL. Beta-cell Dysfunction in Type 2 Diabetes
In: Kahn C.R., King G.L.,Moses A.C., Weir G.C.,
Jacobson A.M., Smith R.J. (Eds) Joslinfs Diabetes
Mellitus. Lippincott Williams & Wilkin. Philadelphia. p. 449-462, 2005
Purnamasari D. Diagnosis dan klasifikasi diabetes
melitus. Dalam: Sudoyo A., Setiyohadi B., Alwi I.,
Simadibrata M., Setiati S.. Buku Ajar Ilmu Penyakit
Dalam Jilid 3. 5th ed. Jakarta: Interna Publishing. p.
1880-3.
Rantam F.A., Ferdiansyah, Nasronudin, Purwati.
2009. Stem Cells and Exploration, Airlangga University Press
Prosiding InSINas 2012
KO-110
1180: Purwati dkk.
G AMBAR 10: Ekspresi HE dengan pemeriksaan imunohistokimia. A. Pankreas tikus normal. B. Pankreas tikus diabetik. C. Pankreas
tikus diabetik setelah 1 bulan pemberian insulin. D. Pankreas tikus diabetik 1 bulan setelah transplantasi allogenik PSCs. E. Pankreas tikus
diabetik 1 bulan setelah transplantasi autologus MSCs.
[13] Shapiro A.M.J., Lakey J.R.T., Ryan E.A., et al. 2000.
Islet Transplantation in seven patients with type 1
diabetes mellitus using a corticoid free immunosupressive regimen. N Eng J Med 343: 230-238
[14] Soria B., Skoudy A., Martin F. 2001. From Stem Cell
TO Beta Cell: New Strategies in cell therapy of Diabetes Mellitus. Diabetologia 44:407-415
[15] Sotiropoulou P.A., Perez S.A., Salagianni M., Baxevanis C.N., Papamichail M. 2006. Characterization of the optimal culture conditions for clinical scale production of human mesenchymal stem
cells. Stem Cells.24:462-471.
[16] Wild S., Roglic G., Green A., Sicree R., King H.
Global prevalence of diabetes: estimates for the
year 2000 and projections for 2030. Diabetes Care
2004 May;27(5):1047-53.
Prosiding InSINas 2012