Penerapan Teknik Kloning pada Transforming Growth

Penerapan Teknik Kloning pada Transforming Growth Factor
(TFG) dan Reseptor Hormon Ikan
Paper ini dibuat sebagai tugas akhir Mata Kuliah Pengantar Bioteknologi
yang dibimbing oleh Ir. Darius, M. Biotech
Oleh:
Rizqi Akbar Ega Putra
125080301111045
TEKNOLOGI HASIL PERIKANAN
FAKULTAS PERIKANAN DAN ILMU KELAUTAN
UNIVERSITAS BRAWIJAYA
MALANG
2013
Penerapan Teknik Kloning pada Transforming Growth Factor
(TFG) dan Reseptor Hormon Ikan
Oleh:
Rizqi Akbar Ega Putra
Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan
Abstrak
Perkembangan teknologi dalam mengkloning hormon pertumbuhan maupun
hormon seksual pada ikan semakin berkembang. Metode transfer nukleus dan PCR
(Polymeration Chain System) adalah yang paling banyak digunakan untuk teknik kloning.
Metode diatas banyak diaplikasikan pada pengembangan esterogen reseptor pada ikan
telesotei dan tiroid reseptor pada Atlantic salmon. Belum lagi penduplikatan faktor
perubahan pertumbuhan (TFG-β) pada ikan hibrid Morone saxalis dan Morone chrysop.
Aplikasi PCR ditemukan dalam pengkloningan dan pengurutan gen IFN dari Atlantic
salmon.
Pendahuluan
Embrio rekonstruksi hasil transfer nukleus donor sel somatik mempunyai manfaat
yang sangat besar untuk riset dan implementasinya di bidang kedokteran, produksi ternak
maupun konservasi hewan langka. Adanya kecenderungan tingkat keberhasilan yang
tinggi dalam produksi hewan kloning yang lahir dan hidup normal pada berbagai spesies,
membuka peluang dan harapan yang sangat besar bahwa teknologi ini berpotensi bagi
konservasi plasma nutfah dari berbagai spesies. Semenjak kelahiran domba kloning
pertama hasil transfer nukleus dengan sel somatik, maka kemudian disusul berbagai
keberhasilan lahirnya hewan kloning berbagai spesies seperti, kambing, sapi, babi, tikus
dll. Berbagai sel somatik yang telah menghasilkan individu kloning, diantaranya adalah
sel kumulus, fetal/adult fibroblast, mammary gland, epitel dll (Ciptadi, 2007).
Secara definisi, klon adalah sekelompok organisme hewan maupun tumbuhtumbuhan yang dihasilkan melalui reproduksi aseksual dan berasal dari satu induk yang
sama. Setiap anggota dari klon tersebut mempunyai susunan dan jumlah gen yang sama
dan kemungkinan besar fenotipnya juga sama. Kloning pada hewan dilakukan mula-mula
pada amfibi (kodok), dengan mengadakan transplantasi nukleus ke dalam telur kodok
yang dienukleasi. Sebagai donor digunakan nukleus sel somatik dari berbagai stadium
perkembangan. Ternyata donor nukleus dari sel somatik yang diambil dari sel epitel usus
kecebong pun masih dapat membentuk embrio normal (Wilmut et al., 1999).
Kloning adalah proses pembentukan satu atau sejumlah individu, tanaman, atau
hewan yang mempunyai susunan genetik yang sama. Sebenarnya terbentuknya kloning
merupakan hal yang biasa terjadi pada tanaman, hewan, dan manusia. Proses kloning
buatan dapat dilakukan melalui metode pemisahan embrio (embryo splitting) atau transfer
nukleus (nuclear transfer) (Byrne, 2002).
Kloning dengan cara transfer nukleus dari sel-sel somatik adalah teknik yang
paling efisien untuk memproduksi salinan dari hewan ternak terbaik dan hewan
transgenik lainnya. Bagaimanapun juga, hanya sedikit tipe sel yang telah direplika dan
dari hal tersebut belum diketahui tipe sel mana yang paling sukses untuk transfer nukleus
kedalam oocytes. Hubungan antara potensi perkembangan dari transplantasi nukleus dan
aktivitas telomerase dari sel-sel pendonor masih tetap belum jelas (Kato et al., 2000).
Tabel 1. Perkembangan transplantasi nukleus sel somatik secara in vitro
Sumber: Kato et al., 2000
Kepunahan mengancam 11% dari burung, 25% dari mamalia, dan 34% spesies
ikan. Mengingat tren saat ini, banyak spesies vertebrata yang langka atau terancam punah
akan segera hilang meskipun upaya untuk mempertahankan keanekaragaman hayati
melalui habitat dan konservasi satwa liar. Bahkan ketika suatu spesies tidak terancam atau
terancam, hilangnya keanekaragaman hayati dapat menyebabkan kepunahan subspesies
dan populasi genetik berharga lainnya (Corley-Smith and Brandhorst, 1999).
Tabel 2. Perkembangan transplantasi nukleus sel somatik secara in vivo
Sumber: Kato et al., 2000
Kira-kira terdapat hampir 100 spesies mengalami kepunahan setiap harinya.
Meskipun meningkatnya minat dalam menggunakan kloning untuk menyelamatkan
spesies, keberhasilan transfer nukleus antarspesies tidak digambarkan sebelumnya, dan
hanya ada beberapa laporan pembentukan embrio secara in vitro. Metode kloning sel
somatik dapat digunakan untuk mengembalikan spesies dan populasi yang terancam, atau
bahkan punah (Lanza et al., 2000).
Saat ini metode melestarikan keragaman genetik dari spesies langka di tahanan
adalah melalui serangkaian program pengangkaran propagasi. Namun, program ini bukan
tanpa keterbatasan, yang meliputi ruang fisik yang terbatas bagi hewan masalah dengan
peternakan, dan umum kegagalan reproduksi hewan. Kemajuan teknik kloning baru-baru
ini di dibantu oleh teknik reproduksi seperti cryogenics gamet/embrio, inseminasi buatan,
dan embrio transfer sudah diperbolehkan sebagai metode baru untuk keberlanjutan
propagasi dari spesies langka (Lasley et al., 1994).
Aplikasi yang nyata adalah pengembangan esterogen reseptor pada ikan telesotei.
Estrogen adalah sebuah hormon penting untuk banyak fungsi reproduksi dan nonreproduksi. Fungsi estrogen dalam siklus reproduksi dari Seabream ( Sparus aurata ),
sebuah hermaprodit protandrous teleost ikan, adalah sangat kompleks. Namun hal ini
dipahami atas keterlibatannya dalam inversi seks, sebuah proses yang terjadi di beberapa
individu selama reproduksi musim kedua. Estrogen bekerja dimediasi oleh dua reseptor
Estrogen ( ER ) subtypes α dan β yang ditunjuk (Socorro et al., 2000).
Tabel 3. Perbandingan dua kloning reseptor hormon esterogen pada ikan
Sumber: Socorro et al., 2000
ER (Esterogen reseptor) termasuk dalam superfamili reseptor nukleus dan juga
termasuk dalam subfamili reseptor steroid. Steroid reseptor protein dibagi menjadi enam
domain fungsional yang independent, disebut A sampai F dari amino hingga carboxyl.
Daerah N-terminal (domain A / B) telah ditunjukkan memiliki sel-jenis dan promotor
fungsi transactivation yang spesifik (AF-1). Wilayah pusat (domain C atau mengikat
DNA domain, DBD) sangat terlindungi antara spesies dan bertanggung jawab untuk
mengikat DNA (Laudet, 1997).
ER telah dikloning dalam beberapa ikan teleostei, termasuk ikan Rainbow trout,
Oncorhynchus mykiss, Killifish, Oryzias spp. (aksesi nomor D28954), Tilapia,
Oreochromis aureus, Channel catfish, Lctalurus punctatus, Sidat Jepang, Anguilla
japonica, Red seabream, Chrysophrys mayor, Gilthead seabream, Sparus aurata dan Ikan
mas, Carassius auratus. Semua ERs ikan, tidak termasuk belut Jepang dan ikan mas,
adalah lebih berkaitan dengan ER & ERα. Fungsi estrogen dalam siklus reproduksi
seabream, ikan teleost hermafrodit protandrous, adalah kompleks. Selama siklus
reproduksi pertama ikan ini mengembangkan fungsional dari testis meskipun administrasi
estrogen menyebabkan testis berregresi dan akhirnya mencapai pengembangan fungsional
ovarium (Condeça & Canario 1999).
Identitas urutan dan filogeni analisis menunjukkan bahwa kedua hasil klon terkait
erat dengan diidentifikasi ERs ikan, dan klone z22 ini terkait dengan ER α dari tetrapod
dan clone Q45 ini terkait dengan Erβ dari tetrapod. Namun, merujuk pada rendahnya
urutan identitas antara ikan dan reseptor estrogen tetrapod serta percabangan lebar pola
pohon filogenetik, sebuah analisis yang lebih rinci dari konservasi asam amino antara
berbagai urutan reseptor telah ditemukan. Dari hasil analisis ini dan studi filogenetik
klone z22 dan hubungannya dengan ERs dari ikan, telah ditetapkan kedalam grup
Estrogen Reseptor α sedangkan klone Q45 dan hubungannya dengan ERs dari ikan, telah
ditetapkan kedalam grup Estrogen Reseptor β yang kemudian dikenal sebagai grup sub
ERα dan sub ERβ (Socorro et al., 2000).
Tabel 4. Jumlah dari asam amino yang diawetkan dalam ER (Esterogen receptor)
Sumber: Socorro et al., 2000
Disimpulkan bahwa urutan asam amino dibedakan oleh hanya lima asam amino
dari sebuah urutan subER (Estrogen receptor), di bawah yang ditunjuk subERα2.
Identitas urutan adalah yang tertinggi jika dibandingkan dengan ERs ikan teleostei
lainnya dan ERα dari spesies tetrapod. Identitas terendah lain ditemukan bersama Erβ
tetrapod dan eER, ntERβ, gfERβ dan klone Q45 dari ikan teleostei (Munoz-Cueto et al.,
1999).
Data baru-baru ini pada αβERKO tikus jelas menunjukkan bahwa hanya ERα yang
diperlukan bagi fungsi testikular normal. Namun, kehadiran kedua subtypes ER itu
diperlukan bagi pemeliharaan dan nutfah sel somatik dalam ovarium pascakelahiran dan
ketidakhadiran sel-sel somatik menyebabkan pengaruh penampilan jenis kelamin
termasuk menyerupai struktur tubulus seminiferous, degenerasi sel-sel granulosa dan
penampilan dari Sertoli sel. Entah model ini dapat diterapkan pada fisiologi reproduksi
Seabream dan pembalikan seks alami yang memerlukan penyuluhan (Couse et al. 1999).
Penerapan lainnya ada pada penduplikatan faktor perubahan pertumbuhan (TFG-β)
pada ikan hibrid Morone saxalis dan Morone chrysop. Faktor transformasi pertumbuhan
(TGF-β) diisolasi dan diklon dari hybrid Striped bass (Morone saxatilis x M. Chrisops)
pada bagian sel mononukleus anterior ginjal. Isolat ini (Genbank aksesi nomor
AF140363) berisi kerangka baca terbuka dari 1146 basis coding untuk protein asam
amino 382 yang paling mirip dengan TGF-β Rainbow trout (57,3 dan 78,6% identitas
dengan prekursor dan protein aktif masing-masing) dan TGF-β1 tikus (41,1 dan 68,8%
identitas dengan prekursor dan protein aktif masing-masing). Konsensus primer yang
ditunjukkan untuk memperkuat secara khusus oleh polymerase chain reaction (PCR),
segmen TGF-β dari 14 spesies ikan teleost terdiri dari 10 keluarga taksonomi dalam 7
ordo (Harms et al., 2000).
Sifat utama dari regulasi imun TFG-β adalah sebagai penekan. Penurunan fungsi
kekebalan oleh TFG-β meliputi: MHC dan ekspresi FCR, beberapa produksi sitokin,
proliferasi thymocyte, dll. TGF-β juga memiliki beberapa efek pro-inflamasi: promosi
makrofag dan neutrofil chemotaxis, produksi IgA, dan granulopoiesis produksi beberapa
sitokin. Apakah TGF-β adalah pro-atau anti-inflamasi tergantung pada konsentrasi,
keadaan diferensiasi sel target dan konsentrasi senyawa pro-inflamasi lainnya
(McCartney-Francis and Wahl, 1994).
Tabel 5. Persentase rangkaian nukleotida dan asam amino dari Hybrid Striped Bass TGFβ dengan TGFs-β lainnya.
Sumber: Harms et al., 2000
Potensi sinyal polyadenylation terdeteksi di Striped bass urutan TGF-β hybrid jauh
lebih dekat dengan kodon stop (94 nukleotida ujung) dari pada Rainbow trout (503
nukleotida), dan mungkin tidak memainkan peran utama. 3 'UTR ditentukan dengan 277
nukleotida luar kodon stop untuk tipe TGF-β hybrid Striped bass. Urutan peraturan
seperti ATTTA motif stabilitas di 3 'UTR tidak diidentifikasi dalam rentang waktu
tertentu (Harms et al., 2000).
Beberapa isolasi gen baik itu esterogen maupun progesteron mempunyai beberapa
kriteria yang harus dipenuhi. Dari hasil penelitian Zhu et al., (2003) didapatkan hasil
bahwa gen asing yang diisolasi dari Spotted Seatrout menyandikan sebuah reseptor
membran steroids. Tujuh kriteria berikut untuk penunjukan sebagai reseptor membran
steroid: struktural yang jelas, spesifisitas jaringan, lokasi plasma membran, karakteristik
pengikat steroid, aktivasi jalur transduksi sinyal, regulasi hormon, dan relefansi biologis.
Secara khusus, kehadiran afinitas tinggi, saturable, dapat diganti, tempat pengikatan
tunggal khusus untuk satu kelas steroid pada protein rekombinan mendefinisikan
karakteristik reseptor steroid.
Sebuah perpustakaan cDNA dari ovarium Seatrout dibangun setelah ligasi cDNA
yang disintesis menjadi situs EcoRI vektor λZAP II dan pengemasan terikat dari vektor
λZAP (Stratagene). Protein fusi mengungkapkan dari 300.000 fag disaring dengan
antibodi monoklonal tikus (diperoleh sebelumnya) dan kambing anti-tikus picoBlue
immunoscreening kit (Stratagen). Klon positif diinterogasi dengan tiga putaran tambahan
screening sebelum eksisi pBluescript II SK (-) vektor plasmid dari λZAP II fag dan
pemurnian plasmid dipilih untuk analisa lebih lanjut. Sequencing dilakukan untuk kedua
helai klon cDNA yang dipilih dengan menggunakan sequencer DNA otomatis (Zhu et al.,
2003).
Pada tahun 2001 Marchand et al., melakukan percobaan mengenai kloning reseptor
hormon tiroid pada ikan teleostei. Pentingnya hormon tiroid bagi ikan teleostei
dikarenakan fungsi hormon tersebut sebagai faktor pertumbuhan (Growth factor).
Fungsinya sendiri dijalankan oleh dua reseptor khusus yaitu TRα dan TRβ.
TRS adalah anggota dari superfamili besar reseptor nukleus yang bertindak sebagai
faktor ligan-bergantung pada faktor transkripsi. Keluarga ini juga termasuk vitamin D3,
reseptor steroid dan reseptor retinoid. Reseptor nukleus berbagi domain lestari yang
sangat penting untuk fungsi mereka: domain pendek DNA-binding (DBD) meliputi dua
jari seng, dan hidrofobik ligand binding domain C-terminal (LBD) (Gronemeyer &
Laudet 1995).
Konservasi asam amino ditemukan antara TRS ikan dan TRs mamalia lebih
mencolok dibandingkan dengan TRs lainnya. Tidak diragukan lagi reseptor ini harus
memiliki, di setiap spesies tersebut, mode kerja yang sama seperti di tetrapoda, yaitu
pengikatan DNA pada TREs serta pengikatan T3. Hal ini telah dikonfirmasi oleh
karakterisasi salmon TRβ itu sendiri (Marchand et al., 2001).
Sesuai penelitian Robertsen et al., (2003), mengenai kloning dan pengurutan gen
IFN dari Atlantic salmon diketahui bahwa amplifikasi PCR pada gen IFN seperti fragmen
cDNA dari TO sel dicapai dengan menggunakan dikurangi cDNA sebagai template dan
primer maju merosot dirancang dari jenis vertebrata yang dilestarikan I IFN urutan motif
YSACAW di C-terminal. Kemunduran utama adalah salah satu yang disebabkan oleh
SSH. Urutan ini memungkinkan desain primer gen spesifik yang dapat digunakan untuk
memperkuat 5'-akhir gen IFN Atlantic salmon oleh RACE kloning. Dua produk IFN 5'end telah diperoleh dengan menggunakan cDNA dari kepala ginjal poli ikan (I)-poli (C)yang diransang. PCR DNA genom dengan primer yang dirancang dari urutan cDNA
salmon IFN mengungkapkan bahwa gen IFN salmon mengandung intron.
Salmon IFNs diduga memiliki massa molekul sepakat dengan 18 kDa ditentukan
untuk aktivitas IFN massa molekul rendah yang dihasilkan oleh Rainbow trout sel gonad.
IFNs ikan salmon yang terutama lebih pendek dari ikan zebra IFN, yang memiliki
panjang diduga dari 163 asam amino. IFNs ikan salmon dan ikan zebra berisi nomor dan
posisi sistein yang sama dan menunjukkan identitas urutan sebesar 45% (Lin et al., 2001).
Tabel 6. Primer yang digunakan untuk kloning dan analisis ekspresi gen IFN pada
Atlantic salmon
Sumber: Robertsen et al., 2003
Kehadiran 5 struktur-helix khas tipe 1 IFNs menunjukkan bahwa SasaIFN-a1
memiliki konformasi yang mirip dengan tipe 1 IFNs lain meskipun identitas urutan
persen relatif rendah. Para IFNs adalah anggota a-heliks keluarga sitokin, yang
mengadopsi secara umum bentuk 4-helix-bundel topologi. IFN Atlantic salmon dewasa
merupakan salah satu IFNs terpendek yang hingga saat ini telah terdeteksi
(Radhakrishnan et al., 1996).
Kesimpulan
Meningkatnya populasi penduduk di dunia akan meningkatkan pula kebutuhan
pangan dan energi. Sedangkan sumber daya biru belum terlalu di lirik oleh masyarakat.
Pemanfaatan teknik bioteknologi yakni penggandaan hormon pertumbuhan (tiroid),
hormon seksual (estrogen) maupun Transforming Growth Factor (TFG) lainnya akan
membantu perkembangan sumber hewani khusunya di lingkungan akuatik menjadi lebih
baik. Metode transfer nukleus dan PCR (Polymeration Chain System) adalah yang paling
banyak digunakan untuk teknik kloning. Hasilnya dapat dilihat pada keberhasilan kloning
gen IFN dari Atlantic salmon dengan metode PCR.
DAFTAR PUSTAKA
Byrne, J.A. & Gurdon, J.B. 2002. Commentary on human cloning. Differentiation
69:154-157.
Ciptadi, G. 2007. Pemanfaatan Teknologi Kloning Hewan Untuk Konservasi Sumber
Genetika Ternak Lokal Melalui Realisasi Bank Sel Somatis. Jurnal Ternak tropika
Vol. 6, No. 2; 60-65.
Condeça, J. A. B., and Canario, A. V. M. 1999. The Effect of Estrogen on The Gonads
and on In Vitro Conversion of Androstenedione to Testosterone, 11ketotestosterone and Estradiol-17 in Sparus aurata (Teleostei, Sparidae). General
and Comparative Endocrinology 116 59–72.
Corley-Smith, G. E., and Brandhorst, B. P. 1999. Preservation of Endangered Species and
Populations: A Role for Genome Banking. Somatic Cell Cloning, and
Androgenesis. Mol. Reprod. Dev. 53, 363–367.
Couse, J. F., Hewitt, S. C., Bunch, D. O., Sar, M., Walker, V. R., Davis, B. J., and
Korach, K. S. 1999. Postnatal Sex Reversal of The Ovaries in Mice Lacking
Estrogen Receptors α and β. Science 286: 2328–2331.
Gronemeyer, H., and Laudet, V. 1995. Transcription Factor 3: Nuclear Receptors. Protein
Profile 2; 1173–1308.
Harms, C. A., S. Kennedy-Stoskoff., W. A. Horne., F. J. Fuller., and W. A. F. Tompkins.
2000. Cloning and Sequencing Hybrid Striped Bass (Morone saxatilis x M.
chrysops) Transforming Growth Factor-β (TGF-β), and Development of A Reverse
Transcription Quantitative Competitive Polymerase Chain Reaction (RT-qcPCR)
Assay to Measure TGF-β mRNA of Teleost Fish. Fish & Shellfish Immunology
(2000) 10, 61–85.
Kato, Y., T. Tani, and Y. Tsunoda. 2000. Cloning of Calves from Various Somatic Cell
Types of Male and Female Adult, Newborn and Fetal Cows. Journal of
Reproduction and Fertility (2000) 120, 231–237.
Lanza, R. P., Jose, B. C., Francisca, D., Carlos, T. M., Peter, W. F., Charlotte, E. F.,
Carolyn, J., H., Michael, D. W., and Phlilip D. 2000. Cloning of an Endangered
Species (Bos gaurus) Using Interspecies Nuclear Transfer. Cloning, Vol. 2, No. 2,
2000: 79-90.
Lasley, B. L., Loskutoff, N. M., and Anderson, G. B. 1994. The Limitations of
Conventional Breeding Programs and The Need and Promise of Assisted
Reproduction in Nondomestic Species. Theriogenology 41, 119–132.
Lin, S., Lin, C., and Hsu, Y. 2001. Establishment of An Antiviral Assay and the
Identification and Partial Purification of Interferon-like Protein from Rainbow
Trout Gonad Cells (RTG-2). Zoology Study. 40, 240–246.
Laudet, V. 1997. Evolution of The Nuclear Receptor Superfamily: Early Diversification
from An Ancestral Orphan Receptor. Journal of Molecular Endocrinology 19 207–
226.
Marchand, O., R. Safi., H. Escriva., E. Van Rompaey., P. Prunet and V. Laudet. 2001.
Molecular Cloning and Characterization of Thyroid Hormone Receptors in Teleost
Fish. Journal of Molecular Endocrinology (2001) 26; 51–65
McCartney-Francis, N. L., and Wahl, S. M. 1994. Transforming Growth Factor-Beta: A
Matter of Life and Death. Journal of Leukocyte Biology 55, 401–409.
Munoz-Cueto J. A., Burzawa-Gerard, E., Kah, O., Valotaire, Y., and Pakdel, F. 1999.
Cloning and Sequencing of the Gilthead Sea Bream Estrogen Receptor cDNA.
DNA Sequence 10 75–84.
Radhakrishnan, R., Walter, L. J., Hruza, A., Reichert, P., Trotta, P. P., Nagabhushan, T.
L., and Walter, M. R. 1996. Zinc-mediated Dimer of Human Interferon-alpha 2b
Revealed by X-ray Crystallography. Structure 4,, 1453–1463.
Robertsen, B., Veronica, B., Torunn, R., Rannveig, L. And Artur, A. 2003. Atlantic
Salmon Interferon Genes: Cloning, Sequence Analysis, Expression, and Biological
Activity. Journal of Interferon & Cytokine Research Vol. 23:601–612.
Socorro, S., D. M. Power, P-E. Olsson, and A. V. M. Canario. 2000. Two Estrogen
Receptors Expressed in The Teleost Fish, Sparus aurata: cDNA Cloning,
Characterization and Tissue Distribution. Journal of Endocrinology (2000) 166,
293–306.
Wilmut, I., Schnieke, A. E., Mc Whir, J., Kind A. J., Campbell K. H. S. 1999. Viable
Offspring Derived from Fetal and Adult Mammalian Cells. Journal of Nature,
1999; 385: 810-3.
Zhu, Y., Charles, D. R., Yefel, P., Margaret, P., and Peter, T. 2003. Cloning, Expression,
and Characterization of A Membrane Progestin Receptor and Evidence It Is An
Intermediary in Meiotic Maturation of Fish Oocytes. PNAS Vol. 100, No. 5: 22312236.