NASKAH Tugas Akhir
advertisement
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id POTENSI EKSTRAK ETANOL BIJI PINANG (Areca catechu L.) SEBAGAI KANDIDAT ANTIBAKTERI TERHADAP PERTUMBUHAN BAKTERI PADA JERAWAT TUGAS AKHIR Diajukan Untuk Memenuhi Salah Satu Persyaratan Memperoleh Gelar Ahli Madya D3 Farmasi Oleh : RIVA SABRINA AYUNASTITI NIM. M3509055 DIPLOMA 3 FARMASI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS SEBELAS MARET SURAKARTA 2013 commit to user i perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id commit to user ii perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id PERNYATAAN Dengan ini saya menyatakan bahwa tugas akhir yang berjudul “Potensi Ekstrak Etanol Biji Pinang (Areca catechu L.) Sebagai Kandidat Antibakteri Terhadap Pertumbuhan Bakteri Pada Jerawat” adalah penelitian saya sendiri dan tidak terdapat karya yang pernah diajukan untuk memperoleh gelar apapun disuatu perguruan tinggi, serta tidak terdapat karya atau pendapat yang pernah ditulis atau diterbitkan oleh orang lain, kecuali secara tertulis diacu dalam naskah ini dan disebutkan dalam daftar pustaka. Apabila di kemudian hari dapat ditemukan adanya unsur penjiplakan maka gelar yang telah diperoleh dapat ditinjau dan/atau dicabut Surakarta, Januari 2013 Riva Sabrina Ayunastiti NIM. M3509055 commit to user iii perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id Potensi Ekstrak Etanol Biji Pinang(Areca catechu L.) Sebagai KandidatAntibakteri Terhadap PertumbuhanBakteri Pada Jerawat RIVA SABRINA AYUNASTITI Jurusan D3 Farmasi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Sebelas Maret INTISARI Jerawat adalah salah satu gangguan inflamasi pada folikel pilosebaceous yang disebabkan oleh bakteri. Penggunaan antibakteri yang tidak rasional dapat meningkatkan resiko terjadinya resistensi bakteri, sehingga diperlukan zat antibakteri baru yang dapat mengobati penyakit infeksi. Senyawa yang diduga memiliki aktivitas antibakteri adalah alkaloid, flavonoid dan tanin. Salah satu tanaman yang mengandung senyawa-senyawa tersebut adalah biji pinang (Areca catechu L.). Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui potensi ekstrak etanol biji pinang sebagai kandidat antibakteri terhadap bakteri apusan darah jerawat, mengetahui sifat Gram bakteri yang diisolasi dari apusan darah jerawat dan mengetahui konsentrasi optimum ekstrak etanol biji pinang yang mampu menghambat pertumbuhan bakteri uji. Penelitian ini termasuk jenis penelitian eksploratif. Biji pinang diekstraksi denganmetode maserasi dengan pelarut etanol70%. Pengujian aktivitas antibakteri dengan metode difusi padat. Variasi konsentrasi ekstrak yang digunakan adalah 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, dan kontrol berupa DMSOdan klindamisin 0,0075%. Bakteri yang dihasilkan dari apusan darah jerawat yaitu : bakteri bentuk bulatGram positif, batang Gram positif dan negatif.Hasil uji aktivitas antibakteri menunjukkan bahwa ekstrak etanol biji pinangpada konsentrasi 30% efektif menghambat bakteri bentuk bulat Gram positif dengan diameter daya hambat (DDH) 3,03 mm, konsentrasi 80% efektif menghambat pertumbuhan bakteri bentuk batang Gram positif dan negatif dengan diameter daya hambat masingmasing sebesar 2,97 mm dan 4,45 mm. Dari hasil penelitian ini ekstrak etanol biji pinang memiliki daya hambat yang bersifat lemah namun memiliki spektrum kerja antibakteri luas. Kata kunci: antibakteri, pinang, Areca catechu L., jerawat commit to user iv perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id Potential Ethanol Extract of Betel Nut (Areca catechu L.) As Antibacterial Candidate Against The Growth of Acne Bacteria Riva Sabrina Ayunastiti Department of Pharmacy Faculty of Mathematics and Science Sebelas Maret University ABSTRACT Acne is a disorder of inflammation in the pilosebaceous follicles caused by bacteria. Irrational of using antibacterial as anti inflamatorry will make a resistance of these bacteria in future, so that needs to find a new antibacterial for treatment of a new strains bacterial infection. A compound had suspected in capable of antibacterial activities is alcaloid, flavonoid and tannin. Betel nut is a plant that has these compounds. The purpose of this research is to find out the antibacterial activity the ethanol extract of betel nut throughacne blood smear bacteria, determine the Gram of bacteria that isolated from acne blood smear and to find out optimum concentration of ethanol extract betel nut that is able to inhibit the growth of bacteria. This research is kind of explorative research. Betel nut extract obtained using maceration method with ethanol 70%. Antibacterial activity test used agar well diffusion method, with the concentrations variation were 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% and control DMSO and clindamycin 0,0075%. The results of the isolation inacne blood smear bacteria show that there are: bacteria round-shaped Gram positive, bacteria rod-shaped Gram positive and negative. The results of antibacterial activity test showthat ethanol extract of betel nut in concentration 30% is effective to inhibit round-shaped bacteria Gram positive at 3,03 mm and the concentration in80% is effective to inhibit rod-shaped bacteria Gram positive and negative each of 2,97 mm and 4,45 mm. Result of ethanol extract betel nut has weak potency to inhibit bacteria but has broad spectrum to the bacteria test. Keyword : antibacterial, betel nut, Areca catechu L., acne commit to user v perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id MOTTO “Sesungguhnya sesudah kesulitan ada kemudahan, sesungguhnya sesudah kesulitan ada kemudahan” (QS. Al-Insyirah : 5-6) Keberhasilan adalah kemampuan untuk melewati dan mengatasi dari suatu kegagalan ke kegagalan berikutnya tanpa kehilangan semangat (Winston Churcill) “Memories are just memories. If you keep living in the past, there’s no future” (Sora Kang – Dream High) commit to user vi perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id PERSEMBAHAN Tugas Akhir ini kupersembahkan untuk…. Papa dan Mama tercinta yang senantiasa memberikan kasih sayang, motivasi, doa dan pengalaman hidup yang berharga Kakak, Adik, Keponakanku, Keluarga Besar Teguh Wiyono dan Sastromartono yang selalu memberikan semangat dan menghilangkan jenuhku Sahabatku, Rinaldi Maulana yang selalu ada di setiap suka dan dukaku, Sorry for my busiest dayoppa. Teman-teman Farmasi 2009 yang selalu kompak dan penuh semangat, Sukses guys! commit to user vii perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id KATA PENGANTAR Puji syukur penulis panjatkan ke hadirat Tuhan Yang Maha Esa yang telah melimpahkan rahmat dan karunia-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan Tugas Akhir berjudul “Potensi Ekstrak Etanol Biji Pinang (Areca catechu L.) Sebagai Kandidat AntibakteriTerhadap Pertumbuhan Bakteri Pada Jerawat” dengan baik dan lancar. Penyusunan laporan tugas akhir merupakan salah satu syarat untuk dapat memperoleh gelar Ahli Madya Farmasi di Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Sebelas Maret, Surakarta. Dalam penulisan laporan Tugas Akhir ini penulis telah berusaha semaksimal mungkin untuk memberikan hasil yang terbaik. Dan tak mungkin terwujud tanpa adanya dorongan, bimbingan, semangat, motivasi serta bantuan baik moril maupun materiil, dan doa dari berbagai pihak. Karena itu penulis pada kesempatan ini mengucapkan terima kasih kepada: 1. Prof. Ir. Ari Handono Ramelan, M.Sc.(Hons), Ph.D. selaku Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Sebelas Maret Surakarta. 2. Bapak Ahmad Ainurofiq, M.Si., Apt. selaku Ketua Program D3 Farmasi Universitas Sebelas Maret Surakarta dan selaku pembimbing akademikyangtelah memberikan motivasi, arahan,bimbingan, saran, dan ilmunya. 3. Ibu Estu Retnaningtyas N., S.TP.,M.Si.selaku pembimbing Tugas Akhir atas segala waktu,kesabaran, dan ketulusan dalam memberikan motivasi, arahan, bimbingan, dan ilmu yang bermanfaat. commit to user viii perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id 4. Papa dan Mama yang telah memberikan doa, semangat dan kasih sayang tiada tara. 5. Teman-teman farmasi 2009 yang telah berbagi suka dan duka serta pengalaman selama masa-masa kuliah. 6. Semua pihak yang tidak dapat disebutkan satu persatu, yang telah membantu pelaksanaan Tugas Akhir dan penyusunan laporan ini. Penulis menyadari masih banyak kekurangan dalam penulisan laporan Tugas Akhir ini. Untuk itu penulis mengharapkan adanya kritik dan saran yang membangun dari semua pihak untuk perbaikan sehingga akan menjadi bahan pertimbangan dan masukan untuk penyusunan tugas-tugas selanjutnya. Penulis berharap semoga laporan Tugas Akhir ini dapat bermanfaat bagi pembaca pada umumnya dan dapat menjadi bekal bagi penulis dalam pengabdian Ahli Madya Farmasi di masyarakat pada khususnya. Surakarta, Januari 2013 Penulis commit to user ix perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id DAFTAR ISI HALAMAN JUDUL ..................................................................................... i HALAMAN PENGESAHAN....................................................................... ii HALAMAN PERNYATAAN .................................................................... iii INTISARI ...................................................................................................... iv ABSTRACT .................................................................................................. v MOTTO ...................................................................................................... vi PERSEMBAHAN ........................................................................................ vii KATA PENGANTAR ................................................................................. viii DAFTAR ISI ................................................................................................. x DAFTAR TABEL......................................................................................... xii DAFTAR GAMBAR .................................................................................. . xiii DAFTAR LAMPIRAN ............................................................ .................. . xiv DAFTAR SINGKATAN ........................................................................... xv BAB I. PENDAHULUAN ........................................................................ 1 A. Latar Belakang Masalah ................................................................. 1 B. Perumusan Masalah........................................................................ 3 C. Tujuan Penelitian .......................................................................... 3 D. Manfaat Penelitian ......................................................................... 4 BAB II. LANDASAN TEORI ................................................................... 5 A. Tinjauan Pustaka ............................................................................ 5 1. Areca catechu L. ...................................................................... 5 2. Jerawat .................................................................................... 8 3. Bakteri ..................................................................................... 10 4. Pengecatan Bakteri .................................................................. 12 5. Antibakteri............................................................................... 14 6. Uji Aktivitas Antibakteri.......................................................... 15 7. Metode Penyarian .................................................................... commit to user 17 x perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id B. Kerangka Pemikiran ......................................................................... 18 C. Keterangan Empiris ........................................................................ 19 BAB III. METODOLOGI PENELITIAN .................................................. 20 A. Desain Penelitian ............................................................................ 20 B. Waktu dan Tempat Penelitian ........................................................ 20 C. Alat dan Bahan ............................................................................... 20 D. Tahapan Pelaksanaan Penelitian ..................................................... 22 1. Penyiapan Alat ........................................................................ 22 2. Determinasi dan Preparasi Sampel .......................................... 22 3. Ekstraksi ................................................................................ 23 4. Pengambilan Apusan dan Isolasi Bakteri Uji ........................... 24 5. Pengecatan Gram Bakteri Uji .................................................. 26 6. Uji Aktivitas Antibakteri ......................................................... 27 E. Analisis Hasil ................................................................................. 31 BAB VI. HASIL DAN PEMBAHASAN .................................................. 32 A. Identifikasi Sampel ........................................................................ 32 B. Preparasi dan Ekstraksi sampel ...................................................... 32 C. Pengambilan Apusan Darah Jerawat ............................................... 34 D. Isolasi dan Identifikasi Bakteri Uji.................................................. 35 1. Bakteri Bentuk Bulat Gram Positif ........................................... 41 2. Bakteri Bentuk Batang Gram Positif ........................................ 41 3. Bakteri Bentuk Batang Gram Negatif ....................................... 42 E. Pembuatan Seri Konsentrasi Ekstrak .............................................. 43 F. Pengujian Aktivitas Antibakteri Ekstrak Etanol ............................. 43 BAB V. PENUTUP ................................................................................... 49 A. Kesimpulan ................................................................................... 49 B. Saran ............................................................................................. 49 DAFTAR PUSTAKA ................................................................................ 50 LAMPIRAN ............................................................................................. commit to user 55 xi perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id DAFTAR TABEL Tabel I. Kategori daya hambat bakteri (Davis dan Stout, 1971) .............. 16 Tabel II. Komposisi pembuatan seri konsentrasi ekstrak etanol biji pinang ................................................................................. 36 Tabel III. Hasil pengecatan Gram koloni bakteri apusan darah jerawat ...................................................................................... 42 Tabel IV. Hasil uji aktivitas antibakteri ekstrak biji pinang terhadap pertumbuhan bakteri bentuk bulat positif, batang positif dan batang negatif .......................................... .... 45 commit to user xii perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id DAFTAR GAMBAR Gambar 1. Buah pinang (Pandawa, 2011) ........................................... 5 Gambar 2. Mekanisme terjadinya jerawat (Anonim, 2011) ................. 9 Gambar 3. Struktur dinding sel bakteri (Douglas, 1997) ...................... 11 Gambar 4. Alur kerangka pemikiran ................................................. 18 Gambar 5. Pembuatan simplisia biji pinang ........................................ 23 Gambar 6. Pengambilan apusan dan isolasi bakteri uji ........................ 25 Gambar 7. Pembuatan stok bakteri ...................................................... 29 Gambar 8. Pengujian aktivitas antibakteri ........................................... 31 Gambar 9. Koloni apusan darah jerawat .............................................. 34 Gambar 10. Stok koloni apusan darah jerawat dalam tabung reaksi ... 35 Gambar 11. Pemisahan koloni tahap satu dalam media NA ................ 37 Gambar 12. Pertumbuhan koloni tabung 10 ....................................... 38 Gambar 13. Hasil pengecatan Gram dari pemisahan tabung nomer 10 39 Gambar 14. Stok bakteri ..................................................................... 40 Gambar 15. Hasil pengecatan Gram dan pertumbuhan koloni bakteri bentuk bulat Gram positif ............................................... 41 Gambar 16. Hasil pengecatan Gram dan pertumbuhan koloni bakteri bentuk batang Gram positif ............................................. 41 Gambar 17. Hasil pengecatan Gram dan pertumbuhan koloni bakteri bentuk batang Gram negatif ............................................ 42 Gambar 18. Hasil uji antibakteri dan hasil pengukuran zona hambat terbesar ........................................................................... commit to user xiii 44 perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id DAFTAR LAMPIRAN Lampiran 1. Determinasi tanaman pinang (Areca catechu L.) ................ 55 Lampiran 2. Perhitungan rendemen ....................................................... 56 Lampiran 3. Gambar koloni apusan darah jerawat ................................. 57 Lampiran 4. Ekstrak etanol 70% biji pinang (Areca catechu L.) ........... 58 Lampiran 5. Serikonsentrasi ekstrak etanol biji pinang, kontrol DMSO, dan kontrol klindamisin 0,0075%. ..................................... 58 Lampiran 6.Gambar uji aktivitas antibakteri ekstrak etanol biji pinang terhadap bakteri bentuk bulat Gram positif ........................ 59 Lampiran 7.Gambar ujiaktivitas antibakteri ekstrak etanol biji pinang terhadap bakteri bentuk batangGram positif ...................... 60 Lampiran 8.Gambar uji aktivitas antibakteri ekstrak etanol biji pinang terhadap bakteri bentuk batangGram negatif ..................... 61 commit to user xiv perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id DAFTAR SINGKATAN µL : mikroliter cm : centimeter DDH : Diameter Daya Hambat DMSO : Dimethyl Sulfoxide LAF : Laminar Air Flow MIC : Minimum Inhibitory Concentration MHA : Mueller Hinton Agar mm : milimeter NA : Nutrient Agar NB : Nutrient Broth TSA : Tryptone Soya Agar commit to user xv perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id BAB I PENDAHULUAN A. Latar Belakang Masalah Jerawat atau acne vulgaris adalah salah satu gangguan inflamasi pada folikel pilosebaceous yang disebabkan oleh bakteri (Hassanzadeh et al., 2008). Jerawat dapat menyebabkan peradangan, nyeri dan kebanyakan dari jerawat berisi cairan putih seperti nanah (Anonim, 2011). Prevalensi terjadinya jerawat yaitu sekitar 85% yang mencakup usia remaja maupun dewasa (Hassanzadeh et al., 2008). Umumnya penyakit ini terjadi pada sebagian besar remaja usia 15-19 tahun ditandai dengan gambaran klinis adanya komedo, papula, pustula dan kista pada daerah-daerah predileksi seperti muka, punggung bagian atas , bahu, dada , leher dan lengan bagian atas (Djuanda et al., 2007).Faktor-faktor yang mempengaruhi terbentuknya jerawat adalah penyumbatan duktus pilosebaceous, peningkatan produksi sebum, perubahan biokimia susunan lemak-lemak permukaan kulit, kolonisasi bakteri di dalam folikel sebaceous (Halim dan Sambijono, 1986). Bakteri yang memicu pertumbuhan jerawat yaitu Propionibacterium acne dan Staphylococcus epidermidis (Djuanda et al., 2007). Pengobatan jerawat dilakukan dengan cara memperbaiki abnormalitas folikel, menurunkan produksi sebum, menurunkan jumlah koloni bakteri serta menurunkan inflamasi pada kulit. Terapi farmakologi yang digunakan untuk menurunkan koloni bakteri penyebab jerawatmenggunakan regimen antibakteri antara lain eritromisin, klindamisin, dan benzoil peroksida (Wyatt et al., 2001). commit to user 1 perpustakaan.uns.ac.id 2 digilib.uns.ac.id Pengobatan kasus infeksi paling menggunakan antibiotik atau antibakteri. Antibakteri adalah obat atau senyawa kimia yang digunakan untuk membunuh ataupun menghambat pertumbuhan bakteri, khususnya bakteri yang sifatnya merugikan manusia. Munculnya bakteri strain baru menyebabkan timbulnya sifat resistensi terhadap senyawa antibakteri, sehingga suatu senyawa aktif yang dahulu efektif sebagai antibakteri penyakit infeksi akan kehilangan nilai kemoterapinya (Pelczar dan Chan, 1988). Berdasarkan penelitian Tan et al., (2011) dari National Skin Care of Singapore menunjukkan bahwa kasus resistensi P. acne terhadap antibiotik yang sering terjadi pada penggunaan eritromisin dan adanya resistensi silang terhadap klindamisin. Dewasa ini telah banyak dilakukan studi dan penelitian mengenai bahan alam yang mempunyai khasiat sebagai antibakteri. Salah satu tanaman yang memiliki daya antibakteri adalah buah Areca catechu L. atau sering disebut buah pinang. Berdasarkan penelitian pada biji pinang (Areca catechu L.) senyawa yang diduga memiliki khasiat antibakteri adalah alkaloid, flavanoid dan tanin (Jaiswall et al., 2011). Mekanisme kerja alkaloid diduga dengan cara mengganggu komponen penyusun peptidoglikan pada sel bakteri, sehingga lapisan dinding sel tidak terbentuk secara utuh dan menyebabkan kematian sel tersebut (Robinson, 1995).Menurut Cowan (1999) flavonoid memiliki mekanisme antibakteri dengan cara mengganggu aktivitas transpeptidase peptidoglikan sehingga pembentukan dinding sel terganggu dan sel akan mengalami lisis. Sedangkan tanin bertindak sebagai antibakteri karena dapat mendenaturasi protein yang terdapat pada dinding sel (Robinson, 1995). Hal ini diperkuat adanya penelitian bahwa ekstrak commit to user 3 digilib.uns.ac.id perpustakaan.uns.ac.id etanol biji pinang memiliki diameter clear zone pada Streptococcus mutans, Bacillus megaterium, Pseudomonas aeruginosa masing-masing sebesar 12 mm, 16 mm dan 11mm ( Shafi et al., 2011). Ekstrak etanol 95% biji pinang matang yang digunakan untuk mengetahui MIC pada bakteri Bacillus cereus, Staphylococcus aureus, Escherichia colli dan Salmonella typhimurium yaitu masing masing sebesar 0,78 mg/ml, 0,78 mg/ml, 0,78 mg/ml dan 1,56 mg/ml. Dari hasil MIC ini diketahui bahwa ekstrak etanolik biji pinang dapat digunakan sebagai antibakteri bakteri Gram positif dan Gram negatif (Kaphrom et al., 2009). Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan di atas, maka dalam penelitian ini akan dilakukan uji aktivitas antibakteri ekstrak etanol biji pinang (Areca catechu L.) terhadap bakteri penyebab jerawat. Sehingga diharapkan ekstrak etanol biji pinang dapat digunakan sebagai alternatif pengobatan jerwat. B. Perumusan Masalah 1. Apakah ekstrak etanol biji pinang (Areca catechu L.)mempunyai potensi sebagai kandidat antibakteri dengan parameter diameter daya hambat terhadap pertumbuhan bakteri yang diisolasi dari apusan darah jerawat? 2. Bagaimana sifat Gram bakteri uji yang diisolasi dari apusan darah jerawat? 3. Berapakah konsentrasi optimum ekstrak etanol biji pinang (Areca catechu L.) yang mampu menghambat pertumbuhan bakteri uji? C. Tujuan Penelitian 1. Mengetahui potensi ekstrak etanol biji pinang (Areca catechu L)sebagai kandidat antibakteri dengan parameter diameter daya hambat terhadap pertumbuhan bakteri yang diisolasi dari apusan darah jerawat. commit to user 4 digilib.uns.ac.id perpustakaan.uns.ac.id 2. Mengetahui sifat Gram bakteri uji yang diisolasi dari apusan darah jerawat. 3. Mengetahui konsentrasi optimum ekstrak etanol biji pinang (Areca catechu L.) yang mampu menghambat pertumbuhan bakteri uji. D. Manfaat Penelitian Penelitian ini diharapkan dapat bermanfaat untuk mengetahui aktivitas antibakteri ekstrak etanol biji pinang (Areca catechu L.) terhadap bakteri uji yang diisolasi dari apusan darah jerawat. Hasil penelitian diharapkan menjadi dasar penelitian mengenai potensi biji pinang (Areca catechu L.) sebagai senyawa antibakteri alternatif untuk mengobati jerawat. commit to user perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id BAB II LANDASAN TEORI A. Tinjauan Pustaka 1. Areca catechu L. a. Klasifikasi Divisi : Spermatophyta Sub‐Divisi : Angiospermae Kelas : Monocotyledone Bangsa : Arecles Suku : Arecaceae Marga : Areca catechu Jenis : Areca catechu L. (Backer dan Van den Brink, 1968). Gambar 1. Buah pinang (Pandawa, 2011) b. Nama Lain Buah pinang memiliki nama yang berbeda di setiap negara antara lain Areca Nut, Betel Nut, Buá ( Staples dan Bevacqua, 2006) di Indonesia buah pinang juga dikenal sebagai Jambe, Pinang dan Pineng (Anonim, 1989). commit to user 5 6 digilib.uns.ac.id perpustakaan.uns.ac.id c. Morfologi Tanaman Pinang atau Areca catechu L. merupakan tanaman famili Arecaceae tinggi pinang dapat mencapai 15-20 m dengan batang tegak lurus bergaris tengah 15 cm (Anonim, 1989) dan dapat tumbuh di iklim tropis meliputi Afrika Selatan, Asia bagian selatan dan kepulauan pasifik (Staples dan Bevacqua, 2006). Buah pinang berbentuk bulat telur berukuran 3,5 mm – 10 mm berwarna kuning jingga atau merah saat masak (Staples dan Bevacqua, 2006). Biji buah berwarna kecoklatan sampai coklat kemerahan, agak berlekuk-lekuk dengan warna yang lebih muda. Pada bidang irisan biji tampak perisperm berwarna coklat tua dengan lipatan tidak beraturan menembus endosperm yang berwarna agak keputihan (Anonim, 1989). d. Manfaat Tanaman Di Indonesia air rebusan biji pinang digunakan untuk mengobati koreng, bisul, eksim, kudis, difteri, mimisan, haid dengan darah berlebihan, cacingan ( kremi, gelang, pita, tambang), mencret dan disentri (Pandawa, 2011). e. Kandungan Kimia Biji buah pinang mengandung alkaloid, seperti arekolin, arekolidine, arekain, guvakolin, guvasine dan isoguvasine, tanin terkondensasi, tanin terhidrolisis, flavan, senyawa fenolik, asam galat, getah, lignin, minyak menguap dan tidak menguap, serta garam (Wang dan Lee, 1996). Senyawa commit to user 7 digilib.uns.ac.id perpustakaan.uns.ac.id metabolit yang diduga sebagai antibakteri adalah alkaloid, flavonoid dan tanin. Alkaloid memiliki kemampuan sebagai antibakteri. Mekanisme yang diduga adalah dengan cara mengganggu komponen penyusun peptidoglikan pada sel bakteri, sehingga lapisan dinding sel tidak terbentuk secara utuh dan menyebabkan kematian sel tersebut (Robinson, 1995). Flavonoid merupakan senyawa polifenol mekanisme antibakteri dengan cara mengganggu aktivitas transpeptidase peptidoglikan sehingga pembentukan dinding sel terganggu dan sel akan mengalami lisis (Cowan, 1999). Tanin merupakan salah satu senyawa metabolit sekunder yang terdapat pada tanaman dan disintesis oleh tanaman, tanin termasuk dalam golongan polifenol. Tanin dibagi menjad dua kelompok yaitu tanin yang mudah terhidrolisis dan tanin yang terkondensasi. Tanin yang mudah terhidrolisis merupakan polimer gallic atau ellagic acid yang berikatan ester dengan sebuah molekul gula, sedangkan tanin terkondensasi merupakan polimer senyawa flavonoid dengan ikatan karbon-karbon (Jayanegara dan Sofyan, 2008). Nonaka (1989) menyebutkan bahwa biji buah pinang mengandung proantosianidin, yaitu suatu tanin terkondensasi yang termasuk dalam golongan flavonoid. Proantosianidin mempunyai efek antibakteri, antivirus, antikarsinogenik, anti-inflamasi, anti-alergi, dan vasodilatasi (Fine, 2000). Tanin memiliki aktivitas antibakteri dengan mekanisme commit to user perpustakaan.uns.ac.id 8 digilib.uns.ac.id denaturasi protein yang terdapat pada dinding sel bakteri (Robinson, 1995). 2. Jerawat Jerawat adalah penyakit peradangan menahundari unit pilosebaceous yang disebabkan oleh bakteri (Hassanzadeh et al., 2008) disertai penyumbatan dan penimbunan bahan kreatin (Djuanda et al., 2007). Jerawat dapat menyebabkan peradangan dan nyeri dan kebanyakan dari jerawat berisi cairan putih seperti nanah (Anonim, 2011). Jerawat didapatkan terutama di daerah muka, leher, dada dan punggung yang ditandai dengan adanya komedo, papul, pustule, nodulus dan kista. Penyakit ini dijumpai pada hampir semuaorang akil baliq yang menginjak pada masa pubertas pada usia 15-19 tahun, orang dewasa bahkan juga pada orang dengan usia lanjut (Djuanda et al., 2007). Jerawat dibedakan menjadi jerawat tipe ringan, sedang dan parah berdasarkan pada keparahan lesi jerawat.Jerawat tipe ringan adalah jerawat yang terdiri dari lesi yang tidak meradang, sedangkan jerawat tipe sedang apabila terdapat papul dan pustule yang tidak meradang. Jerawat akan dikategorikan sebagai jerawat parah apabila terdapat lesi yang meradang dan menimbulkan scar.Penyebab munculnya jerawat belum diketahui secara pasti, tetapi dapat disebabkan faktor psikis, kelembaban udara, hormonal, obat-obatan dan infeksi bakteri (Anonima, 2000). Jerawat terjadi ketika lubang pada permukaan kulit yang disebut pori-pori tersumbat. Pori-pori merupakan lubang bagi saluran yang disebut folikel, yang mengandung rambut dan kelenjar minyak. Biasanya, kelenjar minyak membantu commit to user 9 digilib.uns.ac.id perpustakaan.uns.ac.id menjaga kelembaban kulit dan mengangkat sel kulit mati. Ketika kelenjar minyak memproduksi terlalu banyak minyak, pori – pori akan banyak menimbun kotoran dan juga mengandung bakteri ( Anonim, 2007). Bakteri yang sering menyebabkan jerawat adalah Propionibacterium acne dan Staphylococcus epidermidis. Terkadang jerawat menyebabkan rasa gatal atau sakit kecuali bila terjadi pustule atau nodus yang besar (Djuanda et al., 2007). Mekanisme terjadinya jerawat adalah bakteri P. acne merusak stratum korneum dan stratum germinativum dengan cara mengekskresikan bahan kimia yang menghancurkan dinding pori. Kondisi ini dapat menyebabkan inflamasi.Asam lemak dan minyak kulit tersumbat dan mengeras. Jika jerawat disentuh maka inflamasi akan meluas sehingga padatan asam lemak dan minyak kulit yang mengeras akan membesar (Anonim, 2007). Gambar mekanisme terjadinya jerawat dapat dilihat pada Gambar 2. Gambar 2. Mekanisme terjadinya jerawat (Anonim, 2012) Menurut Jawetz et al., (2005)faktor-faktor yang berperan untuk menghilangkan flora normal pada kulit adalah pH rendah, asam lemak pada commit user mempunyai pH berkisar 4 – 6,5 sekresi sebase dan adanya lisozim. Kulit to normal 10 digilib.uns.ac.id perpustakaan.uns.ac.id yang bersifat asam, selain berfungsi sebagai regenerasi sel-sel kulit juga berfungsi untuk membunuh bakteri (Stone, 2010). Lisozim memiliki aktivitas bakteriolitik dan merupakan perlindungan alami kekebalan tubuh (Anonim, 2002). Lisozim dapat ditemukan pada pori-pori kulit dan atau folikel rambutnya. Lisozim bekerja dengan merusak dinding sel bakteri sehingga menyebabkan bakteri lisis. Dengan membersihkan kulit menggunakan sabun heksaflofen atau desinfektan lain diharapkan jumlah mikroorganisme pada permukaan kulit bisa berkurang, namun flora normal secara cepat muncul kembali dari kelenjar sebase dan keringat (Jawetz et al ., 2005). 3. Bakteri Bakteri adalah organisme uniseluler yang tidak memiliki klorofil, sel bakteri mirip dengan sel tumbuhan atau hewan terdiri atas sitoplasma dan dinding sel. Bakteri berkembang biak dengan cara pembelahan diri, dan karena ukuran yang renik ini bakteri hanya akan tampak dengan mikroskop (Dwijoseputro, 1994). Bentuk dan ukuran bakteri bervariasi ukuran berkisar 0,4 – 2 µm (Pelczar dan Chan, 1988). Bakteri dapat diklasifikasikan berdasarkan morfologi, biokimia dan perwarnaan (bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif). Bakteri dapat didefinisikan secara morfologi yaitu dengan mempelajari bentuk, ukuran dan susunan sel. Perubahan lingkungan mungkin dapat sedikit mempengaruhi bentuk dan ukuran sel, misalnya bakteri berbentuk batang dapat menjadi lebih panjang atau lebih pendek. Bentuk dasar bakteri, yaitu bulat (tunggal: coccus, jamak: cocci), batang atau silinder tunggal: bacillus, jamak: commit to user 11 digilib.uns.ac.id perpustakaan.uns.ac.id bacilli), dan spiral yaitu berbentuk melingkar-lingkar atau batang melengkung) (Pratiwi , 2008). Berdasarkan pewarnaan Gram, bakteri dibedakan menjadi bakteri Gram negatif dan Gram positif. a. Bakteri Gram Negatif Bakteri Gram negatif terdiri dari dinding sel yang mengandung satu atau beberapa lapis peptidoglikan tipis dan membran luar, membran dalam dan membran sitoplasma. Sel bakteri Gram negatif mungkin berbentuk bulat, lonjong, batang lurus atau lengkung, helix, dan filamen (seperti tali). Anggota dari kategori ini adalah bakteri fototrof atau non fototrof dan termasuk spesies aerobik,anaerobik, anaerobik fakultatif dan mikroaerofilik ( Jawetz et al ., 2005). b. Bakteri Gram Positif Bakteri Gram positif terdiri dinding sel yang mengandung banyak lapisan peptidoglikan dengan membentuk struktur tebal dan kaku, membran dalam, membran sitoplasma (Pratiwi, 2008). Struktur dinding sel bakteri Gram negatif dan positif dapat dilihat pada Gambar 3. (A) (B) Gambar 3. Struktur dinding sel bakteri (A) Gram negatif, (B) Gram positif (Douglas, 1997) commit to user 12 digilib.uns.ac.id perpustakaan.uns.ac.id 4. Pengecatan Bakteri Sebagian besar mikroorganisme tidak berwarna, maka untuk dapat melakukan pengamatan di bawah mikroskop diperlukan pewarnaan mikroorganisme dengan menggunakan pewarna. Pewarnaan mikroorganisme pada dasarnya adalah prosedur mewarnai mikroorganisme dengan menggunakan zat warna yang dapat menonjolkan struktur tertentu dari mikroorganisme yang akan diamati. Sebelum mikroorganisme dapat diwarnai, mikroorganisme tersebut harus terlebih dahulu difiksasi agar terikat atau menempel pada kaca objek. Tanpa adanya fiksasi, maka pemberian zat warna pada mikroorganisasi yang dilanjutkan dengan prosedur pencucian zat warna dengan air mengalir dapat menyebabkan mikroorganisme ikut tercuci (Pratiwi, 2008). Menurut Pratiwi (2008) ada tiga macam prosedur pewarnaan: a. Pewarnaan Sederhana Pada pewarnaan sederhana hanya digunakan satu macam pewarna dan bertujuan mewarnai seluruh sel mikroorganisme sehingga bentuk seluler dan struktur dasarnya dapat terlihat. Contoh pewarna sederhana adalah carbol fuchsin dan safranin. b. Pewarnaan Diferensial Pewarnaan diferensial menggunakan lebih dari satu pewarna dan memiliki reaksi berbeda untuk setiap bakteri, sehingga digunakan untuk membedakan bakteri. Pewarnaan diferensial yang sering digunakan adalah pewarnaan Gram. Pewarnaan Gram ini mampu membedakan dua kelompok besar bakteri yaitu user bakteri Gram positif dan baktericommit Gram to negatif. 13 digilib.uns.ac.id perpustakaan.uns.ac.id c. Pewarnaan Primer Bakteri yang telah difiksasi dengan panas sehingga membentuk noda pada kaca objek diwarnai dengan pewarna basa yaitu kristal violet. Karena warna ungu mewarnai seluruh sel, maka dinamakan pewarnaan primer. Selanjutnya pewarna dicuci, baik bakteri Gram positif maupun negatif tampak berwarna ungu. Selanjutnya noda spesimen dicuci dengan etanol yang merupakan senyawa peluntur pewarna yang pada spesies bakteri tertentu dapat menghilangkan warna ungu dari sel. Setelah etanol dicuci, noda spesimen diwarnai kembali dengan safranin yang merupakan warna basa berwarna merah. Bakteri yang tetap berwarna ungu digolongkan ke dalam Gram positif, sedangkan bakteri yang berwarna merah digolongkan ke dalam Gram negatif. Perbedaan warna antara bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif disebabkan oleh adanya perbedaan struktur pada dinding selnya. Dinding bakteri Gram positif banyak mengandung peptidoglikan, sedangkan dinding bakteri Gram negatif banyak mengandung lipopolisakarida. Kompleks kristal violet-iodin yang masuk ke dalam sel bakteri Gram positif tidak dapat tercuci oleh alkohol karena adanya lapisan peptidoglikan yang kokoh pada dinding sel, sedangkan pada bakteri Gram negatif, alkohol akan merusak lapisan lipopolisakarida. Kompleks kristal violet-iodin pada bakteri Gram negatif dapat tercuci dan menyebabkan sel bakteri tampak transparan yang akan berwarna merah setelah diberi safranin. commit to user 14 digilib.uns.ac.id perpustakaan.uns.ac.id 5. Antibakteri Antibakteri adalah obat atau senyawa kimia yang digunakan untuk membasmi bakteri, khususnya bakteri yang sifatnya merugikan manusia (Pelczar dan Chan, 1988), sedangkan Setiabudy (2007) menambahkan antibakteri merupakan senyawa kimia yang dalam konsentrasi kecil mampu menghambat bahkan membunuh bakteri. Istilah yang digunakan untuk menjelaskan proses pembasmian bakteri yaitu : 1. Germisid adalah bahan yang dipakai untuk membasmi mikroorganisme dengan mematikan sel-sel vegetatif tapi tidak selalu mematikan sporanya, 2. Bakterisid adalah bahan yang dipakai untuk mematikan bentuk – bentuk vegetatif bakteri, 3. Bakteriostatik adalah suatu bahan yang mempunyai kemampuan untuk menghambat pertumbuhan bakteri tanpa mematikannya, 4. Antiseptik adalah suatu bahan yang menghambat atau membunuh mikroorganisme dengan mencegah pertumbuhan atau menghambat aktivitas metabolisme, antiseptik digunakan pada jaringan hidup, 5. Desinfektan adalah bahan yang dipakai untuk membasmi bakteri dan mikroorganisme patogen tapi belum tentu beserta sporanya, digunakan pada benda mati (Pelczar dan Chan, 1988). Kadar minimal yang diperlukan untuk menghambat pertumbuhan mikroba disebut Kadar Hambat Minimal (KHM). Sedangkan Kadar Bunuh Minimal (KBM) adalah kadar minimal yang dibutuhkan untuk membunuh mikroba (Batubara, 2008). Antibakteri tertentu aktivitasnya dapat meningkat commit to user perpustakaan.uns.ac.id 15 digilib.uns.ac.id dari bakteriostatik menjadi bakterisidal bila kadarnya ditingkatkan melebihi KHM (Setiabudy, 2007). Antibakteri yang ideal harus memenuhi syarat – syarat sebagai berikut : 1. Mempunyai kemampuan menghambat atau mematikan pertumbuhan mikroorganisme yang luas, 2. Tidak menimbulkan resisten dari mikroorganisme patogen, 3. Tidak menimbulkan efek samping yang buruk pada tubuh, seperti reaksi alergi, kerusakan syaraf, dan iritasi lambung, 4. Tidak mengganggu keseimbangan flora normal tubuh (Jawetz et al., 2005) Berdasarkan mekanisme kerjanya antibakteri dibagi dalam lima kelompok: 1. Mengganggu metabolisme sel mikroba, 2. Menghambat sintesis dinding sel mikroba, 3. Mengganggu permeabilitas membran sel mikroba, 4. Menghambat sintesis protein sel mikroba, 5. Menghambat sintesis atau merusak asam nukleat sel mikroba (Setiabudy, 2007). 6. Uji Aktivitas Antibakteri Pengujian terhadap antibakteri dapat dilakukan dengan metode difusi agar. Prinsip metode difusi agar yaitu uji potensi yang berdasarkan pengamatan luas daerah hambatan pertumbuhan bakteri karena berdifusinya antibakteri dari titik awal pemberian ke daerah difusi. Ada beberapa cara pada metode difusi yaitu cara Kirby Bauer, Sumuran dan Pour Plate. Pada cara sumuran media agar tersebut dibuat sumuran / lubang dengan garis tengah tertentu menurut kebutuhan, ke commit to user 16 digilib.uns.ac.id perpustakaan.uns.ac.id dalam sumuran tersebut dimasukkan atau diteteskan larutan antibiotik yang digunakan. Kemudian agar diinkubasi pada suhu 35-37oC selama 18-24 jam kemudian hasilnya dibaca (Anonim, 1993). Zona radikal adalah suatu daerah di sekitar disk sama sekali tidak ditemukan adanya pertumbuhan bakteri. Potensi antibakteri diukur dengan mengukur diameter dari zona radikal. Sedangkan zona irradikal adalah suatu daerah disekitar disk yang menunjukan adanya pertumbuhan bakteri yang dihambat tetapi tidak dimatikan oleh antibiotik tersebut. Pada zona irradikal akan terlihat adanya pertumbuhan yang kurang subur atau jarang dibandingkan dengan daerah di luar pengaruh antibiotik tersebut (Anonim, 1993). Pengujian aktivitas antibakteri dilakukan dengan mengukur zona hambat yang berwarna bening.Makin besar zona hambatan, makin peka isolat tersebut.Zona hambatan tersebut dibandingkan dengan acuan zona hambatan organisme, kepekaan tes isolat digambarkan dengan susceptible(S), intermediate(I), atau resistant(R) (Jawetz et al., 2005). Kategori daya hambat bakteri dapat dilihat pada tabel I. Tabel I. Kategori daya hambat bakteri (Davis dan Stout, 1971) Daya Hambat Bakteri Kategori ≥ 20 mm Sangat kuat 10-20 mm Kuat 5-10 mm Sedang ≤ 5 mm Lemah commit to user perpustakaan.uns.ac.id 17 digilib.uns.ac.id 7. Metode Penyarian a. Ekstraksi Ekstraksi adalah penarikan zat aktif yang diinginkan dari bahan mentah obat menggunakan pelarut yang dipilih sehingga zat yang diinginkan akan larut. Pemilihan sistem pelarut yang digunakan dalam ekstraksi harus berdasarkan kemampuan dalam melarutkan jumlah yang maksimal dari zat aktif dan seminimal mungkin bagi unsur yang tidak diinginkan (Ansel, 1989). Ekstrak adalah sediaan pekat yang diperoleh dengan mengekstraksi zat aktif dari simplisia nabati atau hewani menggunakan pelarut yang sesuai. Kemudian semua atau hampir semua pelarut diuapkan dan massa atau serbuk yang tersisa diperlakukan sedemikian rupa hingga memenuhi baku yang telah ditetapkan ( Ansel, 1989 ). b. Maserasi Maserasi merupakan metode ekstraksi yang paling sederhana dan banyak digunakan dalam mencari bahan obat yang berupa serbuk simplisia yang halus ( Ansel, 1989). Maserasi merupakan proses pengekstrakan simplisia dengan menggunakan pelarut dengan beberapa kali pengocokan atau pengadukan pada temperatur ruangan (kamar). Secara teknologi termasuk ekstraksi dengan prinsip metode pencapaian konsentrasi pada keseimbangan. Maserasi kinetik berarti dilakukan pengadukan secara kontinyu (terus – menerus). Remaserasi berarti dilakukan pengulangan commit to user 18 digilib.uns.ac.id perpustakaan.uns.ac.id penambahan pelarut setelah dilakukan penyarian maserat pertama dan seterusnya (Anonimb, 2000). Proses ini dilakukan dalam bejana bermulut lebar, serbuk ditempatkan lalu ditambah pelarut dan ditutup rapat, isinya dikocok berulang-ulang kemudian disaring (Ansel, 1989). Pada umumnya maserasi dilakukan dengan cara 10 bagian simplisia dengan derajat kehalusan tertentu dimasukkan kedalam bejana, kemudian dituang dengan 75 bagian cairan penyari (Anonim, 1986). Proses ini dilakukan pada suhu kamar selama tiga hari. Waktu dalam pelaksanaan maserasi tergantung pada sifat dan ciri campuran serbuk dan pelarut. Lamanya harus cukup supaya dapat memasuki semua rongga struktur serbuk dan melarutkan semua zat yang mudah larut (Ansel, 1989). Untuk memperoleh ekstrak, selanjutnya sari yang diperoleh dilakukan pemekatan dengan tekanan rendah pada suhu 50oC (Anonim,1986). Keuntungan maserasi adalah cara pengerjaan dan peralatan yang digunakan sederhana dan mudah sehingga mudah diusahakan ( Anonim, 1986). B. Kerangka Pemikiran Biji pinang ( Areca catechu L.) mengandung senyawa antibakteri (spektrum luas) meliputi : alkaloid, flavonoid dan tanin Jerawat disebabkan oleh bakteri yang bersifat Gram positif dan negatif Uji aktivitas antibakteri ekstrak etanol biji pinang terhadap bakteri uji yang diisolasi dari apusan darah jerawat Gambar 4. Alur kerangka pemikiran commit to user 19 digilib.uns.ac.id perpustakaan.uns.ac.id C. Keterangan Empiris Berdasarkan penelitian biji pinang mengandung alkaloid, tanin dan flavonoid yang merupakan senyawa antibakteri, hal ini terbukti dengan penelitian ekstrak etanol 95% biji pinang dapat menghambat pertumbuhan bakteri Bacillus cereus, Staphylococcus aureus, Escherichia coli dan Salmonella typhimurium yaitu masing masing sebesar 0,78 mg/ml, 0,78 mg/ml, 0,78 mg/ml dan 1,56 mg/ml (Kaphrom et al., 2009). commit to user perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id BAB III METODOLOGI PENELITIAN A. Desain Penelitian Penelitian ini merupakan penelitian eksploratif yaitu dengan melakukan isolasi bakteri pada apusan darah jerawat, mengamati sifat Gram dan morfologinya serta menguji aktivitas antibakteri ekstrak etanol biji pinang (Areca catechu L.) terhadap bakteri uji. B. Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian ini dilakukan pada bulan Mei - September tahun 2012 di Laboratorium Biologi Pusat Sub Lab Mikrobiologi UNS dan Laboratorium Teknologi Farmasi FMIPA UNS. C. Alat dan Bahan 1. Alat yang digunakan Alat yang digunakan untuk preparasi sampel dan ekstraksi simplisia antara lain grinder (Philips®), toples kaca, timbangan analit (Mettler Toledo®), ayakan nomor 40 dan 60, batang pengaduk, rotary evaporator (Bibby RE 200®), beaker glass (Pyrex®), corong kaca (Pyrex®), gelas ukur ( Pyrex®). Alat yang digunakan untuk pengambilan apusan dan isolasi bakteri uji antara lain cotton budd steril, cawan petri, handscoon , bunsen burner, jarum commit to user 20 21 digilib.uns.ac.id perpustakaan.uns.ac.id ose, inkubator suhu 37°C (J.P. Selecta Hotcold M), masker, Laminer Air Flow (LAF) cabinet (Labconco®). Alat yang digunakan untuk pengecatan Gram bakteri antara lain kertas label, handscoon, masker, ose, object glass, degglass, tabung reaksi (Pyrex®), pipet tetes, busen burner, mikroskop (Olympus cx21®), spidol. Alat yang digunakan untuk uji aktivitas antibakteri antara lain tabung reaksi (Pyrex®), rak tabung reaksi, yellow tips, handscoon, masker, cawan petri, ose, mikropipet 10µL-100µL (Master ptt®) , bunsen burner, gelas ukur (Pyrex®), pipet tetes, pelubang gabus, autoklaf (Sturdy®), Laminar Air Flow (LAF) cabinet (Labconco®),jangka sorong (bdq®), flakon, timbangan analit (Mettler Toledo®), hot-plate (IKA Labortechnick), shaker (IKA Labortechnick), inkubator suhu 4°C (J.P. Selecta Hotcold M®), inkubator suhu 37°C (J.P. Selecta Hotcold M). 2. Bahan yang digunakan Bahan yang digunakan dalam ekstraksi adalah biji pinang (Areca catechu L.) sebanyak 1,5 kg, etanol 70% sebanyak 5,5 L dan kain flanel. Bakteri yang digunakan untuk uji aktivitas antibakteri diambil dari apusan darah jerawat. Bahan yang digunakan dalam pengambilan apusan dan isolasi bakteri uji adalah alkohol 70%, akuades steril, media NA (Nutrient Agar) Merck®, Media TSA (Tryptone Soya Agar) Merck®, Agar Darah, dan Media MacConkey. commit to user 22 digilib.uns.ac.id perpustakaan.uns.ac.id Bahan yang digunakan dalam pengecatan Gram bakteri adalah bakteri yang telah diisolasi dari apusan darah jerawat, cat Gram A (Kristal violet), cat Gram B (Lugol/Iodine), cat Gram C (Etanol 96%), cat Gram D (Safranin), tisu, kapas. Bahan yang digunakan dalam uji aktivitas antibakteri adalah ekstrak etanol biji pinang, DMSO, media MHA (Muller Hinton Agar) Merck®, media NB (Nutrient Broth) Merck®, akuades steril, Klindamisin 0,0075% dan kapas. D. Tahapan Penelitian Tahapan pelaksanaan penelitian ini meliputi penyiapan alat, determinasi dan preparasi sampel, pembuatan ekstrak, pengambilan apusan darah jerawat, isolasi bakteri uji, pengecatan Gram bakteri dan uji aktivitas antibakteri secara in vitro dengan metode difusi padat. 1. Penyiapan alat Alat yang dipakai adalah alat yang dipinjam dari Laboratorium Biologi Pusat Sub Lab Mikrobiologi UNS. Untuk alat yang digunakan dalam uji aktivitas antibakteri disterilisasi menggunakan autoklaf pada suhu 121o C tekanan 1 atm selama 15 menit. 2. Determinasi dan preparasi sampel Biji pinang (Areca catechu L.) diperoleh dari Pasar Gedhe dan Pasar Legi, Kota Surakarta. Biji pinangsebelumnya diidentifikasi Lembaga Penelitian dan Pengabdian pada Masyarakat Universitas Setia Budi Surakarta dengan buku acuan “Flora”. commit to user 23 digilib.uns.ac.id perpustakaan.uns.ac.id Biji pinang yang telah dipisahkan dari bagian sabut dan daging buah (sortasi basah) kemudian dicuci dengan air mengalir, ditiriskan, diiris dan dikeringkan di bawah sinar matahari dilapisi dengan kain hitam. Simplisia biji pinang kemudian dipisahkan dari pengotor yang tersisa kemudian digerus dengan grinder dan serbuk kemudian diayak dengan pengayak nomor 40 dan 60. Diagram alir pembuatan simplisia biji pinang dapat dijelaskan pada Gambar 5. Biji pinang Sortasi basah Dicuci denganair mengalir Diiris Dikeringkan di bawah sinar matahari ditutup kainhitam Sortasi kering Diserbuk Diayak mesh nomor 40/60 Serbuk simplisia biji pinang Gambar 5. Pembuatan simplisia biji pinang 3. Ekstraksi Pembuatan ekstrak dilakukan dengan cara maserasi yakni serbuk simplisia buah pinang sebanyak 700 gram dimasukkan ke dalam bejana, kemudian dimaserasi dengan menggunakan etanol 70 % sebanyak 5,5 liter commit to user 24 digilib.uns.ac.id perpustakaan.uns.ac.id selama 3 hari sambil diaduk. Dalam 3 hari tersebut dilakukan penggantian pelarut setiap 24 jam dengan volume pelarut hari pertama sampai hari ke tiga adalah sebagai berikut 2,5 L : 1,5 L : 1,5 L. Hasil maserasi (maserat) kemudian disaring dengan menggunakan kain flanel kemudian filtrat yang didapat dihilangkan pelarutnya dengan menggunakan rotary evaporatordengan suhu 55oC dengan kecepatan 5 rpmhingga pelarut hilang, ekstrak selanjutnya diuapkan menggunakan waterbath dengan suhu 55oC hingga didapat ekstrak kental. Ekstrak yang diperoleh kemudian ditimbang dan disimpan di dalam eksikator. 4. Pengambilan apusan dan isolasi bakteri uji Pengambilan apusan dilakukan dengan cara mengusap darah pada jerawat dengan menggunakan cotton budd steril kemudian diratakan dengan metode streak pada media NA (Nutrient Agar) selanjutnya diinkubasi selama 24 jam pada suhu 35-37oC. Masing-masing koloni yang tumbuh diisolasi pada media NA (Nutrient Agar) dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 35-37oC. Diagram alir kerja pengambilan apusan dan isolasi bakteri uji dapat dijelaskan dalam Gambar 6. commit to user 25 digilib.uns.ac.id perpustakaan.uns.ac.id Apusan darah jerawat Dikulturkan dalam media NA (Nutrient Agar) dengan metode streak Tumbuh koloni bakteri lebat dari 4 apusan darah jerawat yang berbeda Diinkubasi selama 24 Jam pada suhu 37oC Dikulturkan dalam media NA dan diinkubasi 24 jam pada suhu 37°C Diambil 10 koloni berbeda dengan melihat bentuk dan warna koloni diperoleh biakan 10 koloni bakteri Dilakukan pengecatan Gram dan pengamatan morfologi bakteri 10 stok bakteri dalam agar miring Bakteri bentukbulatGrampositif pada stok tabung 1 sampai 9 Campuran bakteri bentukbatang Grampositif dan negatif padastok tabung 10 Dilakukan pemisahan Dibuat stok dalam TSA Media Agar Darah Media MacConkey Koloni bakteri bentuk batang Gram negatif Koloni bakteri bentuk batang Grampositif Koloni bakteri bentuk batang Gramnegatif Uji aktivitas antibakteri Dilakukan pengecatan Gram dan pengamatan morfologibakteri pada tiap koloni yang berbeda BakteribatangGram negatif Bakteri batangGrampositif Masing-masing dibuat stokdalam NA Gambar 6.Pengambilan apusan dan isolasi bakteri uji commit to user 26 digilib.uns.ac.id perpustakaan.uns.ac.id 5. Pengecatan Gram bakteri uji Langkah pengecatan Gram bakteri uji dimulai dengan membersihkan object glass dan degglass dengan alkohol kemudian masing-masing ujung object glass diberi label untuk membedakan bakteri yang akan dicat. Pada bagian bawah object glass digambar bulatan berdiameter 1 cm dengan spidol (daerah ini digunakan untuk pengecatan bakteri). Pada sisi sebaliknya diteteskan 1 tetes akuades dalam daerah bulatan kemudian ditetesi akuades dan ditambahkan sedikit biakan bakteri dengan jarum ose secara aseptis, dicampur hingga terbentuk suspensi, selanjutnya suspensi ini diratakan pada seluruh area bulatan dan dikering anginkan hingga membentuk noda. Tahap selanjutnya dilakukan fiksasi panas dengan melewatkan object glass pada nyala api beberapa kali (jangan terkena api secara langsung). Preparat digenangi dengan cat Gram A selama 1-3 menit kemudian cat dibuang (tanpa menggunakan air), selanjutnya preparat digenangi cat Gram B selama 1 menit kemudian sisa cat B dicuci dengan air mengalir dan dikering anginkan. Object glass dimiringkan dan dicuci dengan cat Gram C dengan cara meneteskannya pada permukaan noda sampai warna cat dapat dilunturkan (tidak berwarna) selama 30 detik kemudian dicuci dengan air mengalir dan dikering anginkan. Preparat ditetesi dengan cat Gram D dan didiamkan selama 2 menit selanjutnya dicuci dengan air mengalir dan dikering anginkan. Permukaan object glass ditutup dengan deglass dan ditetesi minyak imersi lalu diamati dibawah mikroskop dengan perbesaran kuat (1000 x) Sel berwarna commit to user perpustakaan.uns.ac.id 27 digilib.uns.ac.id merah muda merupakan Gram negatif dan sel berwarna biru-ungu merupakan Gram positif. Hasil pengamatan berupa sifat Gram dan morfologi bakteri uji. 6. Uji aktivitas antibakteri Ekstrak etanol biji pinang diuji aktivitas antibakterinya untuk mengetahui potensinya sebagai antibakteri. Ekstrak dibuat konsentrasi tertentu dengan pelarut DMSO. Pengujian aktivitas antibakteri dilakukan dengan metode difusi terhadap bakteri dengan tahapan kerja sebagai berikut: a. Penyiapan alat dan bahan Alat-alat dan bahan yang digunakan untuk uji aktivitas antibakteri disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 121ºC, tekanan 1atm selama 15 menit. b. Pembuatan media 1) Media NA (Nutrient Agar) Sebanyak 0,7 gram NA dilarutkan dalam 35 ml akuades, kemudian dipanaskan hingga larut. Selanjutnya media tersebut disterilkan menggunakan autoklaf selama 15 menit pada suhu 121°C. Pembuatan media agar miring terlebih dahulu 5 ml media dituang ke dalam tabung reaksi kemudian dilakukan sterilisasi selanjutnya dimiringkan. 2) Media agar miring TSA (Tryptone Soya Agar) Tryptone Soya Broth sebanyak 3 gram dilarutkan dalam 100 ml akuades dan ditambahkan 1 gram agar, kemudian dipanaskan hingga larut . TSA yang sudah larut dan homogen dimasukkan ke dalam tabung reaksi steril sebanyak 5 ml kemudian disterilisasi menggunakan autoklaf commit to user 28 digilib.uns.ac.id perpustakaan.uns.ac.id selama 15 menit pada suhu 121oC. Tabung reaksi selanjutnya dimiringkan. 3) Media NB (Nutrient Broth) Media NB sebanyak 0,4 gram dilarutkan dalam 50 ml akuades Larutan media dipanaskan, selanjutnya dimasukkan dalam erlenmeyer dan dilakukan sterilisasi. 4) Media MHA (Muller Hinton Agar) Sebanyak 21 gram bubuk media MHA dilarutkan dalam 550 ml akuades, larutan dipanaskan hingga larut, selanjutnya dimasukkan kedalam erlenmeyer dan dilakukan sterilisasi. Media MHA yang sudah steril, didiamkan sampai kisaran suhu 40-50ºC, kemudian secara aseptis dicampurkan kultur bakteri uji dengan perbandingan 1:100 (bakteri : media) 5) Pembuatan larutan antibiotik klindamisin 0,0075% Sebanyak 25 mg serbuk antibiotik klindamisin dilarutkan dalam 100 ml akuades steril. c. Pembuatan stok bakteri Memindahkan dan membiakan koloni yang berasal dari hasil pemisahan bakteri apusan jerawat kemudian digoreskan 1-2 mata ose pada media agar miring yaitu media agar miring NA dan TSA dalam tabung reaksi yang kemudian diinkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam. Diagram alir kerja pembuatan stok bakteri dapat dijelaskan dalam Gambar 7 commit to user 29 digilib.uns.ac.id perpustakaan.uns.ac.id Kultur bakteri bentuk bulat Gram positif Kultur bakteri bentuk batang Gram positif distreakpada mediaagar miring TSA Kultur bakteri bentuk batang Gram negatif Masing-masing kulturdistreak pada media agar miring NA Diinkubasi pada suhu 37°C selama 24 jam Digunakan sebagai stok Gambar 7. Pembuatan stok bakteri d. Pembuatan suspensi bakteri Bakteri uji diambil 1-2 mata ose dari stok bakteri dimasukkan dalam 20 ml ke media NB steril, kemudian dishaker dengan kecepatan 200 rpm selama 24 jam. e. Pembuatan seri konsentrasi ekstrak etanol biji pinang Ekstrak etanol biji pinang (Areca catechu L) dibuat seri konsentrasi untuk diujikan pada bakteri uji sebesar 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%,90% dan 100%. Pembuatan seri konsentrasi ekstrak dengan cara melarutkan sejumlah ekstrak etanol biji pinang (Areca catechu L.) ke dalam DMSO sampai 2 ml. Komposisi pembuatan seri konsentrasi ekstrak etanol biji pinang dapat dilihat dalam Tabel II. commit to user 30 digilib.uns.ac.id perpustakaan.uns.ac.id Tabel II. Komposisi pembuatan seri konsentrasi ekstrak etanol biji pinang Konsentrasi (%) Ekstrak (gram) 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 2,0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 DMSO (mL) ad 2 ad 2 ad 2 ad 2 ad 2 ad 2 ad 2 ad 2 ad 2 ad 2 ad 2 f. Pembuatan larutan kontrol Kontrol yang digunakan pada uji aktivitas antibakteri ini terdiri dari kontrol DMSO dan kontrol klindamisin 0,0075 %. g. Pengujian aktivitas antibakteri Pengujian aktivitas antibakteri menggunakan metode difusi padat dengan teknik sumuran. Tahap pengujiannya dapat dilihat pada Gambar 8. commit to user 31 digilib.uns.ac.id perpustakaan.uns.ac.id Bakteri uji dipindahkan Media MHA disterilkan Media MHA dengan suhu 40-55º C Bakteri dan media MHA dihomogenkan Dituang ke cawan petri sebanyak 15 mL Dibiarkan memadat Dibuat lubang sumuran pada media uji Dimasukkan larutan seri konsentrasi ekstrak, kontrol DMSO, dan kontrol klindamisin 0,0075% dalam lubang masing-masing 20 µL. Diinkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam Diukur diameter zona hambat Replikasi 2 kali Dibandingkan hasil pada sampel uji dengan kontrol DMSO dan klindamisin 0,0075% Dibandingkan nilai diameter zona hambat antar bakteri uji Gambar 8. Pengujian aktivitas antibakteri E. Analisis Data Analisis data dilakukan secara deskriptifmelalui pengamatan morfologi koloni (bentuk dan warna), sifat Gram bakteri pada jerawat dan diameter daya hambat ekstrak terhadap pertumbuhan bakteri uji. commit to user perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN A. Identifikasi Sampel Identifikasi biji pinang yang diperoleh dari Pasar Gedhe dan Pasar Legi Surakarta dilakukan di Lembaga Penelitian dan Pengabdian pada Masyarakat (LPPM) Universitas Setia Budi Surakarta dengan menggunakan buku acuan “Flora”. Hasil identifikasi menunjukkan bahwa jenis tanaman yang diteliti merupakan Areca catechu L. dengan nama umum pinang. Hasil determinasi dapat dilihat pada Lampiran 1. B. Preparasi dan Ekstraksi Sampel Biji pinang sebanyak 1,5 kg yang telah dipisahkan dari sabut dan daging buah dicuci kemudian diiris melintang. Proses pengeringan dilakukan dibawah sinar matahari dengan cara menutup sampel dengan kain hitam untuk mencegah paparan sinar UV yang dapat merusak kandungan senyawa aktif (Anonim, 1986), sesekali sampel dibalik supaya kering disetiap sisi. Tujuan dilakukan proses pengeringan untuk mengurangi kadar air yang terkandung dalam simplisiasehingga dapat meminimalkan pertumbuhan jamur selama penyimpanan dan menghentikan reaksi enzimatik untuk mencegah kerusakan simplisia. Simplisia biji pinang kemudian diserbuk dan diayak, dengan memperkecil ukuran akan memperluas bidang permukaan yang berinteraksi dengan pelarut sehingga senyawa aktif akan mudah untuk tersari (Anonim, 1986). Serbuk yang diperoleh dari 1,5 kg biji pinang basah sebanyak 700 gram. Sampel yang berbentuk serbuk kemudian diekstraksi dengan metode maserasi dengan pelarut commit to user 32 perpustakaan.uns.ac.id 33 digilib.uns.ac.id etanol 70%.Pemilihan etanol 70% sebagai larutan penyari mengacupadapenelitian Puspawati (2010) yang menyatakanbahwaekstrak etanol 70% biji pinang dapat menghambat pertumbuhan bakteri uji yaitu Staphylococcus aureus dan Pseudomonas aeruginosa, selain itu etanol juga merupakan pelarut inert, tidak toksik, mudah diperoleh, dan harga terjangkau. Etanol 70% bersifat polar sehingga dapat digunakanuntuk menyari senyawa polar yang terkandung dalam biji pinang. Selama proses maserasi dilakukan pengadukan 3-5 kali sehari, fungsi pengadukan adalahuntuk membantu kontak pelarut pada rongga sel tumbuhan, sehingga senyawa tumbuhan yang terkandung di dalamnya dapat tertarik keluar, selain itu pengadukan juga dapat menimbulkan sirkulasi pelarut sehingga ekstraksi dapat berlangsung optimal. Adanya perbedaan konsentrasi antara cairan di dalam dan di luar sel akan menyebabkan senyawa aktif terdesak ke luar sel yang memiliki konsentrasi yang lebih rendah. Proses ekstraksi akan terus berlanjut hingga terjadi keseimbangan konsentrasi antara cairan di dalam dan di luar sel sehingga cairan menjadi jenuh dan proses ektraksi terhenti (Ristiningsih, 2009). Maserat yang diperoleh kemudian disaring menggunakan kain flanel. Filtrat kemudian dipisahkan dengan pelarutnya menggunakan rotary evaporator dengan suhu 55o C dengan kecepatan putar 5rpm, selanjutnya dipekatkan dengan menggunakan waterbath dengan suhu 55oC hingga dihasilkan ekstrak kental berwarna coklat kemerahan.Ekstrak kental yang diperoleh sebanyak 68,871 gram dengan rendeman 9,839%, perhitungan rendemen terlampir padaLampiran2. commit to user 34 digilib.uns.ac.id perpustakaan.uns.ac.id C. Pengambilan Apusan Darah Jerawat Pada penelitian ini, digunakan seorang probandus yang memiliki jerawat untuk diambil apusan darah jerawat.Apusan darah jerawat diambil dari 4 jerawat probandus yang dilakukan secara aseptiskemudianditanampadamedia Nutrient Agar(NA) dengan metode streak.Akuades steril digunakan untuk membentuk suspensi darah sehingga mempermudah darah untuk diapuskan pada media. Metode streakatau cawan gores digunakanuntukmendapatkan koloni yang terpisah sehingga mempermudah proses isolasi.Biakan kemudian diinkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam.Pada permulaan goresan akan terjadi pertumbuhan koloni yang lebat, sehingga harus dilakukan pemisahan koloni yang terbentuk. Gambar koloni apusan darah jerawat dapat dilihat pada Gambar 9. A B D C Gambar 9. Koloni apusan darah jerawat (A). Jerawat 1, (B).Jerawat 2 , (C). Jerawat 3, dan (D). Jerawat 4 commit to user 35 digilib.uns.ac.id perpustakaan.uns.ac.id D. Isolasi dan Identifikasi Bakteri Uji Pemisahan koloni dilakukan untuk mendapatkan isolat bakteridengandasar pemilihan padabentukdanwarnakoloninya.Proses pemisahan / isolasi tahap I ini dilakukan terhadap biakan bakteri apusan darah jerawat.Biakan bakteri apusan darah jerawat inidiambil 10 koloni yang terpisah. masingkoloniinidibiakkanpadamedia Selanjutnyamasing- NA dengan metodestreakdandiinkubasiselama 24 jam pada suhu 37oC .Sebelum dilakukan pengecatan Gram, masing-masing koloni bakteri yang akan diuji dipindahkan menggunakan metode streak pada media miring NA dalam 10 tabung reaksi sehingga mempermudah pengambilan, penyimpanan dan mengurangi resiko kontaminasi. Gambar stok koloni apusan darah jerawatpada agar miring NA dalam tabung reaksi terdapat pada Gambar 10. Gambar 10. Stok koloni apusan darah jerawat dalam tabung reaksi Langkah selanjutnya adalah pengecatan Gram untuk mengidentifikasi sifat Gram bakteri yang diuji. Perbedaan 2 kelompok bakteri ini didasarkan pada kemampuan sel menahan (mengikat) warna ungu dari kristal violet selama proses dekolorisasi oleh alkohol. Bakteri Gram positif tidak mengalami dekolorisasi karena tetap mengikat warna ungu kristal violet dan pada tahap akhir pengecatan commit to user 36 digilib.uns.ac.id perpustakaan.uns.ac.id tidak terwarnai safranin. Bakteri Gram negatif mengalami dekolorisasi oleh alkohol dan pada tahap akhir pengecatan terwarnai menjadi merah oleh safranin. Menurut Gozali (2009) hasil pengecatan Gram yang tidak sama ini disebabkan oleh perbedaan susunan dinding sel dari bakteri seperti terlihat pada Gambar 3. Bakteri Gram negatif memiliki 3 lapisan dinding sel. Lapisan terluar yaitu lipopolisakarida (lipid) kemungkinan tercuci oleh alkohol, sehingga pada saat diwarnai dengan safranin akan berwarna merah. Bakteri Gram positif memiliki selapis dinding sel berupa peptidoglikan yang tebal. Setelah pewarnaan dengan kristal violet, pori-pori dinding sel menyempit akibat dekolorisasi oleh alkohol sehingga dinding sel tetap menahan warna biru. Dari hasil pengecatan Gram yang dilakukan terhadap10 kolonibakteri uji diperolehhasil 9 kolonimerupakanbakteribentukbulat kolonimerupakancampurandaribakteribentukbatang Gram Gram positifdan negatif 1 danpositif (Tabel III). Sedangkan hasilpemisahan koloni dan pengecatanGram kolonitabung 1 sampai 10dapatdilihatpadaGambar 11. Tabel III. Hasil pengecatan Gram koloni bakteri apusan darah jerawat No. Tabung 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. Bentuk Bakteri Bulat Bulat Bulat Bulat Bulat Bulat Bulat Bulat Bulat Batang Batang commit to user Sifat Gram Positif Positif Positif Positif Positif Positif Positif Positif Positif Positif Negatif 37 digilib.uns.ac.id perpustakaan.uns.ac.id A. B. Gambar 11.Pemisahan koloni tahap satu dalam media NA : (A) Hasil pengecatan Gram dan kultur koloni bakteri bentuk bulat Gram positif tabung 1-9, (B) Hasil pengecatan Gram dan kultur koloni bakteri bentuk batang Gram positif dan negatif (campuran) tabung 10. Dari hasil pemisahan koloni tahap 1 ini ditemukan koloni bakteri bentuk bulat Gram positif dan koloni campuran antara bakteri bentuk batang Gram positif dan negatif. Dengan demikian perlu dilakukan pemisahantahap 2 untuk mendapatkan koloni bakteri bentuk batang Gram positif dan Gram negatif.Pemisahan bakteri bentukbatangGram positif dan negatif dilakukan dengan menggunakandua media yaitumedia Agar Darah dan MacConkey.Media Agar Darah merupakan media diperkaya yang dapat menyediakan nutrisi ekstra untuk pertumbuhan bakteri.Media Agar Darah termasuk dalam media differensial yaitu media yang dapat membedakan bakteri yang memiliki kemampuan untuk hemolisis dan tidak. Menurut Kamel et al.,(2011)daribakteribentukbatangGram negatif ada yang commit to user mempunyaikemampuanuntukmenghemolisisseperti yang 38 digilib.uns.ac.id perpustakaan.uns.ac.id terdapatpadakasusinfeksikulit pada luka bakar. SedangkanMedia MacConkey merupakan media selektif untuk bakteri batang Gram negatif. Media inimengandunggaram empedu dan kristal ungu yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri batangGram positif sehingga koloni bakteri yang tumbuh pada media ini adalah batang Gram negatif.Pertumbuhan koloni tabung 10 pada media Agar Darah dan MacConkey terdapat pada Gambar 12. A. B. Gambar 12. Pertumbuhan koloni tabung 10 pada (A) Agar Darah (B) MacConkey Agar Dari hasildapatdilihatbentukkolonibakteri bentuk batangpadaMacConkeyadalahtidak bersifat hemolisis, sedangkan pada Agar Darah dapat dilihat perbedaan pertumbuhan bakteri batang Gram positif dan negatif yang memiliki sifat tidak menghemolisis Agar Darah, darihasilpertumbuhanpada media dapatdilihatada 2 koloni yang berbedauntukkolonibakteri gram negatifdanpositif. Denganmetodediatasmakadapatdipisahkan 2 jenisbakteribatangGram positifdannegatif.Untukmemperkuathasil dan memastikan sifat Gramnya maka dilakukanpengecatanGram daribakteri yang didapat.Dari hasil pengecatan Gram diperoleh hasil bakteri bentuk batang Gram positifdannegatif.Sepertitampakpada Gambar 13. commit to user 39 digilib.uns.ac.id perpustakaan.uns.ac.id A. B Gambar 13.Hasil pengecatan Gram dari pemisahan tabung nomor 10: (A) Bakteri bentuk batang Gram positif, (B) Bakteri bentuk batang Gram negatif Dari proses pemisahandanpengecatan bakteridariapusandarahjerawatyaitubakteri Gram inidapatdihasilkantiga bentukbulatGram positif, isolat bentuk batangGram positifdanGram negatif. Ketigaisolat bakteri uji yang diperoleh kemudian diregenerasi 3-5 kali untuk mendapatkan biakan bakteri dengan fase pertumbuhan yang optimalselanjutnya dibuat stok.Stok bakteri bentuk batang Gram positif dan negatif dibuat pada media NA karena media NA mengandung nutrisi yang lengkap untuk pertumbuhan bakteri. Stok bakteri bentuk bulatGram positif dibuat dalam media agar miring TSA yaitu Tryptone Soya Agar karena pada media TSA bakteri tumbuh lebih subur daripada menggunakan media NA (Gentry et al., 2000). Cara pembuatan stok bakteri yaitu dengan mengambil koloni bakteri dengan ose kemudian digoreskan pada media NA miring atau TSA miring kemudian diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37oCdandisimpandalamlemari pendingin. Stok bakteri uji dapat dilihat pada Gambar 14.Stok bakteri dibuat pada media miring dengan tujuan untuk memperoleh luas permukaan yang lebih besar sehingga diharapkan koloni yang tumbuh lebih banyak selain itu dapat memudahkan dalam pengambilan bakteri untuk pengujian.Penyimpanan stok commit to user bakteri pada suhu rendah dapat mengurangi laju metabolisme dengan tetap 40 digilib.uns.ac.id perpustakaan.uns.ac.id mempertahankan viabilitas (daya hidupnya) ciri-ciri genetiknya tetap stabil (tidak terjadi perubahan fisik) (Soni, 2010). Stok bakteri juga perlu dilakukan regenerasi untuk mencegah bakteri mati selama penyimpanan karena kurangnya nutrisi. A B C Gambar 14.Stok bakteri bentuk: (A) Bulat Gram positif, (B) BatangGram positif, dan (C) Batang Gram negatif pada media agar miring Identifikasi bakteri uji dapatdilakukandengan carayaitumelaluipengamatanbentuk 2 danwarnakoloninya sertapengamatanmorfologinya. Pengamatanbentukdanwarnakolonidapatdilakukansecaralangsung pertumbuhan.Pengamatan morfologi di bakteri media dilakukan dibawahmikroskopdilengkapidenganpengecatanGram.Denganmetodeiniakandiper oleh data tentangbentuk, susunan seldansifatGramnya. Pengamatandibawah mikroskop dilakukandengan perbesaran 1000x dengan minyak imersi. Hasil pengamatan morfologi bakteri bentuk bulat Gram positif dan bakteri bentuk batang Gram positif dan negatif dapat dilihat pada Gambar 15, 16 dan 17. commit to user 41 digilib.uns.ac.id perpustakaan.uns.ac.id 1. Bakteri Bentuk Bulat Gram Positif A B Gambar 15. (A) Hasil pengecatan bakteri bentuk bulat Gram positif (perbesaran 1000x), (B) Pertumbuhan koloni bakteri bentuk bulat Gram positif Dari gambar 15 dapat dilihat ciri-ciri morfologi bakteri bentuk bulat Gram positif adalah sebagai berikut : Bentuk koloni : bulat Warna koloni : krem Bentuk tepian : rata Morfologi sel : bulat Susunan sel : bergerombol Warna pengecatan Gram : ungu SifatGram : positif 2. Bakteri Bentuk BatangGram Positif A commit to user B 42 digilib.uns.ac.id perpustakaan.uns.ac.id Gambar 16. (A) Hasil pengecatan bakteri bentuk batang Gram positif (perbesaran 1000x), (B) Pertumbuhan koloni bakteri bentuk batang Grampositif Dari gambar 16 dapat dilihat ciri-ciri morfologi bakteri bentuk batang Gram positif adalah sebagai berikut Bentuk koloni : bulat Warna koloni : krem Morfologi sel : batang Susunan sel : berderet Bentuk tepian : berombak Warna pengecatan Gram : ungu SifatGram : positif 3. Bakteri Bentuk BatangGram Negatif A B Gambar 17. (A) Hasil pengecatan bakteri bentuk batang Gram negatif (perbesaran 1000x), (B) Pertumbuhan koloni bakteri bentuk batang Gram negatif Dari gambar 17 dilihat ciri-ciri morfologi bakteri bentuk batang Gram negatif adalah sebagai berikut Bentuk koloni : bulat Warna koloni : krem Morfologi sel : batang commit to user 43 digilib.uns.ac.id perpustakaan.uns.ac.id Susunan sel : monobasil Bentuk tepian : berombak Warna pengecatan Gram : merah SifatGram : negatif E. Pembuatan Seri Konsentrasi Ekstrak Ekstrak etanol biji pinang dilarutkan dalam dimetil sulfoksida (DMSO) dibuat seri konsentrasi 0%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% dan 100%.Sampel dilarutkan dalam DMSO karena DMSO dapat melarutkan ekstraksecara sempurna.Selain itu DMSO tidak mempengaruhi hasil uji antibakteri (Kustyaningsih, 2004). F. Pengujian Aktivitas Antibakteri Ekstrak Etanol Metode yang digunakan untuk pengujian aktivitas antibakteri adalah metode sumuran dengan diameter lubang 6 mm. Prinsip pengujian dari metode ini adalah terbentuk atau tidaknya zona bening disekitar sumuran setelah media agar yang ditanami bakteri diinkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam, sehingga besarnya daya hambat terhadap bakteri uji dapat teramati dengan jelas. Metode sumuran memiliki kelebihan dapat memberikan akurasi yang tinggi (Richardsonet al., 1986) dan lebih mudah mengukur luas daerah hambat yang terbentuk karena efek penetrasi senyawa aktif tidak hanya di permukaan atas media agar tetapi juga sampai ke bawah (Listari, 2009). Media Muller Hinton Agar (MHA) digunakan sebagai uji daya hambat, karena bersifat netral dan mengandung nutrisi lengkap.Pengujian dilakukan dengan menambahkan 1/100 suspensi bakteri kedalam MHA, kemudian MHA commit to user perpustakaan.uns.ac.id 44 digilib.uns.ac.id dituang pada cawan petri steril.Ketebalan media dalam cawan petri dibuat seragam dengan menyeragamkan volume yang digunakan. Menurut Richardson et al., (1986) ketebalan yang digunakan adalah 3 mm karena ketebalan dibawah 2 mm akan mempengaruhi zona daya hambat yang dihasilkan. Seri konsentrasi ekstrak, larutan kontrol yang terdiri dari DMSO dan antibiotik klindamisin 0,0075%, kemudian dilakukan pengujian aktivitas antibakteri menggunakan 3 bakteri uji yaitu bakteri bentuk bulat Gram positif, bentuk batang Grampositif dan negatif. Hasil uji antibakteri dan hasil pengukuran zona hambat ekstrak etanol biji pinang terhadap bakteri uji dapat dilihat pada Gambar 20. A B C Gambar 20. Hasil uji antibakteri dan hasil pengukuran zonahambat terbesar pada bakteri bentuk: (A) BulatGram positif, (B) BatangGram positif dan (C) Batang Gram negatif oleh penambahan ekstrak etanol biji pinang Hasil pengujian terhadap bakteri bulat Gram positif dan batang Gram positif terbentuk dua zona hambat yaitu zona radikal dan zona irradikal.Zona radikal yaitu suatu daerah di sekitar sumuran tidak ditemukan adanya pertumbuhan bakteri.Potensi antibakteri diukur dengan mengukur diameter dari zona radikal.Zona irradikal yaitu suatu daerah di sekitar sumuran terdapat pertumbuhan bakteri dihambat oleh antibakteri, tetapi tidak dimatikan (Anonim, commit to user 1993).Sedangkan pada batang Gram negatif hanya terbentuk zona radikal. Hasil 45 digilib.uns.ac.id perpustakaan.uns.ac.id pengukuran uji aktivitas antibakteri ekstrak biji pinang terhadap pertumbuhan bakteri uji dapat dilihat pada Tabel IV. Tabel IV. Hasil uji aktivitas antibakteri ekstrak biji pinang terhadap pertumbuhan bakteri bentuk bulat Gram positif, bentuk batang Gram positif, danbentuk batang Gram negatif. Konsentrasi % (b/v) 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Kontrol DMSO Klindamisin 0,0075% Diameter Daya Hambat (mm) Bulat Positif Batang Positif Batang Negatif (Radikal) Radikal Irradikal Radikal Irradikkal 2,88 2,55 3,03 2,39 2,38 1,55 1,81 1,97 1,79 2,24 2,12 2,13 4,55 4,14 4,66 5,06 4,11 4,93 5,14 4,29 1,86 0,44 1,42 1,40 1,93 2,14 2,82 2,97 2,23 1,44 4,29 5,40 6,73 6,11 6,33 6,37 6,56 8,65 7,15 7,79 3,18 3,08 1,49 2,35 2,85 3,31 3,65 4,45 3,55 2,42 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 25,09 9,76 19,45 0,00 15,98 Keterangan : : Diameter daya hambat terbesar Dari hasil uji diperoleh, penentuan aktivitas antibakteri yang diutamakan adalah zona radikal karena pada zona ini secara nyata bakteri tidak tumbuh. Zona daya hambat terbesar yaitu pada bakteri bentuk batang Gram negatif pada konsentrasi ekstrak 80% disusul konsentrasi ekstrak 30% bakteri bentuk bulat Gram positif dan terkecil bakteri bentuk batang Gram positif pada konsentrasi 80%.Aktivitas ekstrak terbesar ditunjukkan pada konsentrasi 30% karena pada konsentrasi yang rendah sudah mampu menghambat pertumbuhan bakteri bentuk bulat Gram positif. Sedangkan kontrol DMSO tidak menunjukkan adanya daya commit to user hambat, maka dapat disimpulkan bahwa DMSO tidak berpengaruh pada uji 46 digilib.uns.ac.id perpustakaan.uns.ac.id aktivitas antibakteri. Kontrol klindamisin 0,0075% memiliki daya hambat dengan kategori sangat kuat terhadap bakteri bentuk bulat Gram positif, sedangkan pada bakteri bentuk batang Gram positif dan negatif memiliki daya hambat dengan kategori kuat. Klindamisin merupakanantibakteri yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri dengan mekanisme menghambat sintesa protein (Katzung, 1998).Pada bakteri bentuk batang gram positif kontrol klindamisin tidak membentuk zona irradikal karena klindamisin lebih aktif untuk menghambat pertumbuhan bakteri Gram positif termasuk staphylococcus yang resisten terhadap penisilin (Jawetz et al., 2005), oleh karena itu daya hambat klindamisin pada bakteri bentuk batang lebih rendah dibandingkan dengan bakteri bentuk bulat. Hasil pengamatan zona daya hambat menunjukkan bahwa ekstrak etanol biji pinang memiliki daya hambat lemah terhadap bakteri uji yaitu zona hambat tertinggi hanya 4,45 mm. Penentuan kekuatan daya antibakteri ini berdasarkan Davis dan Stout (1971) bahwa zona hambat 20 mm atau lebih termasuk sangat kuat, daerah hambatan 10-20 mm tergolong kuat, daerah hambatan 5-10 mm tergolong sedang, dan daerah hambatan 5 mm atau kurang tergolong lemah. Pada umumnya, diameter daya hambat memiliki kecenderungan meningkat dengan meningkatnya konsentrasi ekstrak, akan tetapi pada suatu konsentrasi besar akan mengalami penurunan diameter daya hambat. Hal dapat terjadi karena adanya perbedaan kecepatan difusi senyawa antibakteri pada media agar (Ambarwati, 2007) dan (Noor et al., 2006).Richardsonet al., (1986) commit to user 47 digilib.uns.ac.id perpustakaan.uns.ac.id jugamenyatakan bahwa jenis dan konsentrasi yang berbeda memberikan diameter zona hambat yang berbeda pada lama waktu tertentu. Adanya perbedaan besar daya hambat antara bakteri Gram positif dan Gram negatif dapat disebabkan perbedaan struktur dinding sel, ikatan dan aktivitas senyawa bakteri (Jawetz et al., 2005).Pada bakteri Gram positif memiliki struktur dinding sel yang lebih sederhana yaitu mengandung lebih banyak peptidoglikan, sedikit lipid dan dinding sel mengandung polisakarida (asam teikoat).Asam teikoat adalah polimer yang larut air hal ini menunjukan dinding sel bakteri Gram positif bersifat polar.Sedangkan bakteri Gram negatif dengan struktur dinding lebih kompleks yang mengandung banyak lipid, sedikit peptidoglikan serta membran luar yang terdiri dari fosfolipid dan lipopolisakarida.Fungsi membran luar sebagai pertahanan selektif senyawasenyawa yang keluar atau masuk.Adanya kandungan lipid sehingga membran sel bakteri bersifat non polar. Selain hal tersebut, perbedaan aktivitas antibakteri suatu zat antibakteri tergantung pada tipe ekstrak, spesies tanaman, dan spesies bakteri itu sendiri (Durmas et al., 2006). Hal ini dapat dilihat padabakteri bentuk batangGram negatif memiliki zona daya hambat yang paling besar dibandingkan kedua bakteri lainnya kemungkinan yang terjadi ekstrak mampu menembus membran terluar bakteri dan masuk ke membran dalam untuk merusak sel bakteri tersebut. Konsentrasi ekstrak yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri berbeda pada bakteri bentuk bulat dan batang. Pada bakteri bentuk bulat Gram positif, konsentrasi ekstrak 30% dapat menghasilkan daya hambat radikal yang tinggi hal commit to user 48 digilib.uns.ac.id perpustakaan.uns.ac.id ini disebabkan karena zat aktif lebih mudah berdifusi kedalam sel bakteribentuk bulatGram positif. Sedangkan bakteri bentuk batangGram positif dan negatif daya hambat terbesar diberikan pada konsentrasi 80%. Pada uji aktivitas antibakteri ekstrak etanol biji pinang ini dapat dilihat daya hambat bersifat lemah namunmemilikispektrumkerjaluasterhadap bakteri uji karena mampu menghambat pertumbuhan bakteri Gram positif maupun negatif. Aktivitas ekstrak etanol biji pinang terbesar pada konsentrasi 30% terhadap bakteri bentuk bulat Gram positif. commit to user perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id BAB V KESIMPULAN DAN SARAN A. Kesimpulan 1. Berdasarkan parameter diameter daya hambat aktivitas antibakteri ekstrak etanol biji pinang memiliki potensi daya hambat yang tergolong lemah terhadap pertumbuhan bakteri yang diisolasi dari apusan darah jerawat. 2. Bakteri hasil isolasi dari apusan darah jerawat yaitu bakteri bentuk bulat Gram positif, bakteri bentuk batang Gram positif dan Gram negatif. 3. Konsentrasi optimum ekstrak etanol biji pinang yang mampu menghambat bakteri uji adalah konsentrasi 30% untuk bakteri bentuk bulat Gram positif sedangkan Bakteri bentuk batangGram positif dan Gram negatif pada konsentrasi 80%. B. Saran 1. Perlu dilakukan purifikasi / partisi terhadap golongan senyawa ekstrak etanol biji pinang yang memiliki aktifitas antibakteri. 2. Perlu dilakukan identifikasi lanjut berupa uji biokimia dan fisiologi terhadap isolat bakteri uji hingga diperolehkarakter yang lebih spesifik. commit to user 49 55 digilib.uns.ac.id perpustakaan.uns.ac.id commit to user 55
