Sintas Bakteri Asam Laktat Kandidat Probiotik Kering Beku Asal Air

5
2. TINJAUAN PUSTAKA
2.1
Bakteri Asam Laktat sebagai Probiotik
Bakteri asam laktat (BAL) pertama kali ditemukan oleh Pasteur, seorang
profesor kimia di University of Lille. Pada tahun 1878, Lister melaporkan isolasi
bakteri asam laktat asal susu yang tengik. Beberapa bakteri asam laktat dapat
ditemukan juga pada saluran pencernaan manusia maupun hewan (Surono 2004).
Bakteri asam laktat dan Bifidobacteria termasuk dalam kelompok bakteri baik
bagi manusia dan umumnya memenuhi status Generally Recognized As Safe
(GRAS), yaitu dianggap aman bagi manusia. Kelompok bakteri ini tidak
membusukkan protein, dan dapat memetabolisme berbagai jenis karbohidrat
secara fermentatif menjadi asam laktat sehingga disebut bakteri asam laktat.
Beberapa jenis bakteri asam laktat memiliki potensi sebagai bakteri probiotik.
Perhatian terhadap bakteri probiotik dimulai sejak tahun 1908, ketika Ellie
Metchnikoff seorang ahli mikrobiologi dari Institut Pasteur di Perancis,
menyarankan untuk mengonsumsi susu fermentasi agar berumur panjang. Pada
tahun 1960 definisi probiotik juga digunakan pada pemberian pakan ternak yang
disuplementasi dengan mikroba untuk membantu hewan ternak khususnya dalam
saluran pencernaannya. Seiring berjalannya waktu dan perkembangan ilmu
pengetahuan, pada tahun 1965 konsep probiotik sudah mulai dikenal pertama kali
digunakan oleh Lily dan Stillwell. Istilah probiotik berasal dari bahasa Yunani
yang berarti for life. Kemudian Fuller pada tahun 1989 mencoba memperbaiki
definisi probiotik yang berasal dari kata probios yang berarti kehidupan, probiotik
adalah suplemen mikroba hidup yang memberikan efek positif kepada manusia
dan hewan dengan memperbaiki keseimbangan mikroflora usus. Hingga tahun
1990, masih diperdebatkan apakah konsep probiotik itu fakta, fiksi, mitos atau
suatu relitas. Tahun 1995 diakui, mulai memasuki era probiotik (Surono 2004).
Definisi lain juga menjelaskan bahwa probiotik adalah makanan suplemen berupa
mikroba hidup yang memiliki keuntungan kepada manusia khususnya dalam
keseimbangan mikroflora usus (Shortt 1999; Fuller 1999). Sejalan dengan
perkembangan zaman maka banyak dilakukan penelitian mengenai mekanisme
probiotik yang menggunakan hewan percobaan untuk diekstrapolasikan pada
manusia (Fuller 1999).
6
De Vrese & Schrezenmeir (2008), juga mendefinisikan probiotik sebagai
mikroorganisme potensial yang memiliki jumlah yang cukup untuk mencapai usus
dalam keadaan aktif dan memberikan efek positif untuk kesehatan. Bakteri
probiotik juga didefinisikan sebagai bakteri hidup dalam kultur tunggal atau
campuran yang mempunyai manfaat bagi kesehatan manusia (Salminen 1998).
Probiotik adalah organisme hidup yang apabila dikonsumsi dalam jumlah yang
cukup dapat memberi manfaat bagi kesehatan (WHO 2001).
Probiotik
yang
efektif
harus
memenuhi
beberapa
kriteria
yaitu;
(a) memberikan efek menguntungkan inangnya, (b) tidak patogenik dan tidak
toksik, (c) mengandung sejumlah besar sel hidup, (d) mampu bertahan dan
melakukan kegiatan metabolisme dalam usus, (e) tetap hidup selama
penyimpanan, (f) mempunyai sifat sensori yang baik, (g) diisolasi dari inangnya
(De Vrese & Schrezenmeir 2008; Fuller 1989).
Bakteri asam laktat untuk dapat berfungsi sebagai probiotik harus
memenuhi berbagai persyaratan sebagai berikut (Shortt 1999):
1) Tahan terhadap asam, terutama asam lambung yang memiliki pH antara
1,5-2,0 sewaktu tidak makan dan pH 4,0-5,0 sehabis makan, sehingga mampu
bertahan dan hidup lama ketika melalui lambung dan usus. Ketahanan
probiotik terhadap asam lambung dapat dilihat dari beberapa hasil penelitian
yang menjelaskan bahwa bakteri ini dapat hidup pada kisaran pH yang sangat
luas. Apabila bakteri ini masuk ke dalam saluran pencernaan manusia maka
harus mampu bertahan pada pH asam lambung yaitu sekitar 3,5. Pada kondisi
yang sangat asam membran sel bakteri akan mengalami kerusakan yang
mengakibatkan hilangnya komponen-komponen intraseluler, seperti Mg, K
dan lemak dari sel, kerusakan ini akan menyebabkan kematian pada sel
(Bender & Marquis 1987). Ketahanan Lactobacillus pada pH rendah terjadi
karena (1) kemampuannya dalam mempertahankan pH internal lebih alkali
daripada pH eksternal (2) mempunyai membran sel yang lebih tahan terhadap
kebocoran sel akibat terpapar pH rendah (Bender & Marquis 1986).
Zavaglia et al. (1998) menguji daya tahan isolat klinis Bifidobacteria pada pH
3 selama 1 jam. Hasilnya menunjukkan bahwa sebanyak 11 dari 25 isolat
7
Bifidobacteria masih hidup dalam kondisi pH rendah, dengan ketahanan lebih
besar dari 1%.
2) Stabil terhadap garam empedu dan mampu bertahan hidup selama berada
pada bagian usus kecil. Empedu disekresikan ke dalam usus untuk membantu
absorbsi lemak dan asam empedu yang terkonjugasi dan diserap dari usus
kecil. Bakteri asam laktat mempunyai ketahanan yang berbeda terhadap
garam empedu yang berhubungan dengan kerusakan terhadap membran luar
sel bakteri. Semakin tinggi konsentrasi garam empedu, maka jumlah sel
Lactobacillus yang mati juga akan meningkat (Ngatirah et al. 2000;
Kusumawati 2002).
3) Memproduksi senyawa antimikroba seperti asam laktat, hidrogen peroksida,
dan bakteriosin.
4) Mampu menempel pada sel usus manusia, faktor penempelan oleh probiotik
merupakan syarat untuk pengkolonisasian, aktivitas antagonis terhadap
patogen, pengaturan sistem daya tahan tubuh dan mempercepat penyembuhan
infeksi.
5) Tumbuh baik dan berkembang dalam saluran pencernaan, sebagai probiotik
tentu saja kemampuan untuk tumbuh harus diperhatikan. Pada beberapa
genus Bifidobacteria dan Lactobacillus dapat tumbuh baik pada saluran
pencemaan tanpa adanya oksigen.
6) Koagregasi membentuk lingkungan mikroflora normal dan seimbang,
koagregasi juga mencerminkan kemampuan interaksi antar kultur untuk
saling menempel.
7) Aman digunakan oleh manusia. Uji secara in vivo merupakan salah satu
indikator bahwa probiotik tersebut dapat dikonsumsi oleh manusia.
8) Tahan terhadap mikrobisida dan spermisidal vaginal. Sifat ini diperlukan
untuk probiotik yang ditujukan untuk mengobati infeksi saluran urinovaginal.
Bakteri asam laktat potensi probiotik memiliki mekanisme kerja mampu
menstimulasi
sistem
imun
karena
adanya
senyawa
peptidoglikan
dan
lipopolisakarida dalam dinding sel. Bakteri asam laktat melakukan kontak dengan
sistem imun saluran usus melalui sel M atau sel folikel epitelium dari Peyer’s
patch atau melalui sel epitelial saluran usus halus atau usus besar. Interaksi antara
8
bakteri asam laktat dengan sel M hanya menstimulasi respon imun spesifik,
sedangkan interaksi antara bakteri asam laktat dengan sel folikel epitel
menstimulasi respon imun non spesifik atau peradangan meskipun juga dapat
meningkatkan respon imun spesifik (Surono 2004).
Probiotik selain mempunyai efek modulasi flora normal saluran pencernaan,
bakteri ini juga mampu berperan sebagai modulator sistem imun. Salah satu
contohnya adalah Lactobacillus yang mampu meningkatkan fungsi imunitas
seluler dan humoral (Vanderhoof 1999). Bakteri ini mampu menstimulasi sistem
imun antara lain meningkatkan fungsi fagositosis makrofag, sel natural killer
(NK), monosit dan netrofil. Lactobacillus GG mampu merangsang sekresi IgM
setelah vaksinasi rotavirus dan meningkatkan produksi IgA dengan hasil akhir
meningkatkan produksi imunoglobulin.
Pada penerapanya agar dapat berfungsi sebagai probiotik pada berbagai
produk fermentasi seperti susu fermentasi, yoghurt, kultur yoghurt, susu
acidophilus, kefir, kuyms jumlah bakteri BAL minimal sebesar 107 CFU/g
(Codex
2003).
The
International
Dairy
Federation
dalam
laporannya
menyebutkan bahwa jumlah minimal sel probiotik pada produk susu untuk dapat
berperan dalam menigkatkan kesehatan pencernaan adalah 106 CFU/g sel per
gram produk (Sultana et al. 2000), sehingga berdasarkan acuan ini, maka pada
studi ini dilakukan penambahan BAL lebih banyak dengan perbandingan
(108:103) antara BAL dengan C. sakazakii.
Isolat
bakteri
yang
umum
digunakan
dalam
probiotik
adalah
L. acidophillus dan berbagai Bifidobacteria spp., yang merupakan organisme yang
dominan dalam usus kecil dan usus besar. Mikroba ini mempunyai peranan dalam
menghambat pertumbuhan mikroba patogen melalui produksi asam organik dan
bakteriosin dan dengan dekonjugasi garam empedu. Saat ini sediaan probiotik
yang ada mengandung L. delbrueckii subsp bulgaricus, L. acidophilulus, L. casei,
L. fermentum, L. plantarum, L. brevis, L. cellobiosus, L. lactis dan L. reuteri
(Fuller 1992). Bifidobacteria yang saat ini digunakan sebagai probiotik adalah
Bifidobacterium adolescentis, B. animalis, B. bifidum, B. infantis, B. longum dan
B. thermophilus (Fuller 1992). Vinderola dan Reinheimer (2003) menyatakan
bahwa L. delbrueckii subsp bulgaricus merupakan spesies starter asam laktat
9
dengan karakteristik probiotik terbaik diantara spesies starter yang dianalisis.
Bakteri ini tahan terhadap asam lambung dan empedu dan menunjukkan nilai
tinggi untuk aktivitas β-galactosidase.
Aplikasi probiotik pada produk pangan diantaranya dimanfaatkan untuk
fermentasi beberapa produk pangan dan dilaporkan dapat mencegah kerusakan
makanan baik oleh bakteri patogen serta bakteri perusak pangan (Budiana 1997).
Kelompok bakteri probiotik juga lazim digunakan sebagai kultur starter baik pada
pengolahan yoghurt, keju, atau proses fermentasi lainnya. Penggunaan BAL juga
banyak digunakan karena memiliki sifat antimikroba baik sebagai anti bakteri
maupun sebagai antimikotik (ldawati 1996; Ismail 2002). Sifat antimikroba
tersebut dihasilkan oleh kemampuan BAL untuk menghasilkan asam organik,
hidrogen peroksida dan bakteriosin (Axelsson 1998). Selain itu bakteri probiotik
dewasa ini sering dimanfaatkan oleh industri penghasil susu formula bubuk
sebagai mikroba potensial untuk menghambat pertumbuhan patogen sehingga
dapat ditambahkan dalam bentuk bubuk kering beku. Jenis bakteri probiotik yang
telah dimanfaatkan untuk dikeringbekukan adalah B. lactis dan L. acidophillus
(Gerber 2011).
2.2
Pengeringan Bakteri Asam Laktat
Untuk mengawetkan kultur BAL yang mengandung sel hidup dalam jumlah
tinggi dan tahan lama maka BAL dapat diawetkan dengan cara pengeringan
semprot (spray drying), pengeringan beku (freeze drying), dibekukan (freezing),
atau pengeringan dengan oven vakum (Fu dan Etzel 1995; Nuraida et al. 1995;
Harmayani et al. 2001).
Pengeringan beku atau liofilisasi adalah teknik pengeringan dimana produk
dibekukan terlebih dahulu kemudian dengan menggunakan energi dalam bentuk
panas dan pada tekanan yang rendah, kandungan air bahan yang berupa es akan
diuapkan dengan cara sublimasi. Pengeringan beku merupakan pengeringan yang
terbaik untuk mencegah terjadinya perubahan kimia dan meminimumkan
kehilangan nutrien selama proses pengeringan berlangsung. Kultur kering beku
mempunyai penampakan jernih, padat dan memiliki viabilitas sel yang baik.
Pengeringan beku dapat mempertahankan bentuk kaku dari bahan yang
10
dikeringkan sehingga dapat menghasilkan produk kering yang berpori dan tidak
berkerut.
Selama proses pengeringan beku, kandungan air bahan akan hilang
sebanyak 90%, dan kandungan air bahan tidak berada pada fase cair sehingga
dapat mencegah transpor zat-zat yang dapat larut dalam air dan memperkecil
terjadinya
reaksi
degradasi
(King
1971
dalam
Endry
2000).
Terdapat beberapa keunggulan dan kelemahan pada produk pangan yang
dikeringkan dengan pengeringan beku. Keunggulan produk yang dikeringkan
melalui pengeringan beku adalah produk lebih kering, stabil, menempati volume
yang kecil sehingga dapat menekan biaya penyimpanan dan pengiriman. Adapun
kelemahanya adalah proses pengeringan beku membutuhkan biaya operasional
mahal, biasanya diproduksi dalam skala besar. Produksi lambat atau rendah
karena proses pengeringan beku biasanya dengan sistem batch dan pengeringan
melalui sublimasi berjalan lambat (Jhonson & Etzel 1995).
Pengeringan beku dapat menyebabkan beberapa perubahan, diantaranya
perubahan fisik, kimiawi maupun biokimia pada sel bakteri. Selama proses
pembekuan kemungkinan terjadi kerusakan sel karena perbedaan sensitivitas
untuk setiap jenis mikroba terhadap pembekuan, terbentuknya kristal es baik
ekstraseluler maupun intraseluler. Kerusakan yang terjadi akibat proses
pembekuan ini akan mengakibatkan perubahan morfologi sel, struktur sel,
perubahan fungsi sel dan perubahan stabilitas genetik (Ray & Speck 1973).
Kemampuan sel untuk bertahan selama pembekuan dipengaruhi oleh ukuran dan
tipe sel, umur sel, permeabilitas membran sel, metode penyimpanan dan metode
thawing. Secara umum respon BAL terhadap pembekuan yaitu, BAL akan
mensintesis senyawa-senyawa protein dan terjadinya perubahan komposisi asam
lemak pada membran bakteri (Wang et al. 2005). Beberapa penelitian
menjelaskan bahwa proses pembekuan dapat mempengaruhi BAL yang
dibekukan, seperti terjadinya perubahan rasio antara asam lemak jenuh dan tidak
jenuh yang dapat menentukan resistensi dari BAL terhadap pembekuan
(Goldberg & Eschar 1977; Beal et al. 2001; Wang et al. 2005). Hal yang serupa
telah dilaporkan oleh Murga et al. (2000), yang telah mengamati kenaikan C16:0
dan C18:2 pada L. acidopilus. Siuta dan Goulet (2001), menjelaskan bahwa
11
enkapsulasi L. acidophilus R0052 menyebabkan viabilitas sel dapat bertahan dari
9,l x 109 CFU menjadi 5,3 x 109 CFU pada hari ke 50 pada penyimpanan 40 °C
dengan kelembaban (RH) 75%. De Vrese dan Schrezenmeir (2008),
dalam
laporannya juga menyebutkan bahwa pengeringan probiotik melalui spray drying
dapat melindungi sel bakteri yang dikeringkan hingga suhu 70 °C.
Untuk dapat melindungi sel agar tetap hidup selama proses pengeringan
beku, maka beberapa cara dapat dilakukan, yaitu melalui penambahan bahan
pelindung (kriogenik) pada sel bakteri yang akan dikeringkan. Bahan pelindung
adalah bahan yang berfungsi untuk mengurangi kerusakan dinding sel dan
membran sel, tetapi ada juga bahan yang hanya dapat menahan kerusakan
membran sel. Bahan kriogenik sangat berperan penting dalam mencegah
kerusakan akibat proses pengeringan ataupun pengeringan beku. Beberapa hasil
penelitian yang telah dilakukan, menjelaskan bahwa bahan pelindung dapat
mencegah terjadinya penurunan jumlah sel selama proses pengeringan,
pengeringan
beku
atau
pembekuan.
Nasombat
dan
Sriwong
(2000),
mengemukakan dalam hasil penelitiannya bahwa penggunaan Lyoprotective
agents (9,1% b/b) jenis laktosa dapat mempertahankan kemampuan hidup bakteri
Lactococcus lactis sebesar 64,17±3,00% dan L. sakei sebesar 56,42 ± 2,35%.
Hasil yang sama juga dikemukakan oleh Puspawati et al. (2010) yang menyatakan
bahwa pengeringan beku P. pentosaceus A16, Lactobacillus brevis, L. rhamnosus
R21 setelah disalut dengan kriogenik mengalami sedikit penurunan yaitu masingmasing 1,24; 1,42; dan 2,13 log CFU/g.
Laktosa merupakan salah satu jenis bahan pelindung atau kriogenik yang
umum digunakan pada proses pengeringan beku. Laktosa merupakan golongan
karbohidrat yang utama terdapat pada susu. Laktosa merupakan disakarida yang
terdiri dari glukosa dan galaktosa.
Penggunaan laktosa sebagai bahan pelindung sudah banyak diaplikasikan.
Hasil penelitian yang dilakukan Zamora et al. (2006) menunjukkan bahwa
penggunaan laktosa 12% sebagai bahan pelindung pada proses pengeringan beku
dapat mempertahankan ketahanan L. murinus-PS85 yang selama penyimpanan
pada suhu 20 °C selama 60 hari, mencapai 20% sedangkan pada suhu 5 °C
sebesar 4%. Pada kultur Enterococcus raffinosus-PS7, penggunaan laktosa 12%
12
sebagai bahan pelindung mampu mempertahankan viabilitasnya
selama
penyimpanan pada suhu 5 °C sebesar 60%, sedangkan pada suhu 20 °C selama
60 hari dapat menyebakan penurunan sebesar 100%. Puspawati et al. (2010), juga
mengemukakan dalam hasil penelitiannya bahwa penggunaan laktosa sebagai
pelindung pada proses freeze dried Pediococcus pentosaceus
A16 dapat
mengurangi penurunan jumlah bakteri ini, besarnya penurunan jumlah total
bakteri akibat freeze dried sebesar 0,91 log CFU/g.
2.3
Bakteri Asam Laktat Asal Air Susu Ibu
Bakteri asam laktat bersifat anaerob, aerotoleran, tahan asam, fermentatif,
berbentuk batang dan bulat, habitatnya harus kaya nutrisi(fastidious), komposisi
basa nitrogen DNA kurang dari 50 % mol G+C (Axelsson 2004; Adam & Moss
1995). Bakteri asam laktat secara alami dapat berasal dari saluran pencernaan
manusia, produk-produk susu dan permukaan tanaman tertentu. Klasifikasi BAL
menjadi beberapa genus didasarkan pada perbedaan morfologi, jenis fermentasi
glukosa, perbedaan suhu pertumbuhan, produksi asam laktat, kemampuan untuk
tumbuh pada konsentrasi garam tinggi dan toleransi terhadap asam, alkali, serta
garam yang berbeda-beda. Pada pengklasifikasian beberapa genus baru,
penambahan karakteristik seperti komposisi asam lemak dan sifat motil juga
digunakan sebagai dasar. BAL terdiri dari dua bentuk yaitu kokus (Lactococcus,
Vagococcus,
Leuconostoc,
Pediococcus,
Aerococcus,
Tetragenococcus,
Streptococcus, Enterococcus) dan batang (Lactobacillus, Carnobacterium,
Bifidobacterium). Bakteri dan Streptococcus secara tradisional digunakan sebagai
kultur starter untuk fermentasi makanan dan minuman karena berkontribusi
terhadap flavor dan aroma serta menghambat kerusakan (De Vuyst & Vandamme
1994).
ASI merupakan salah satu sumber BAL. Salminen et al. (2004), meneliti
isolat B. bifidum (yang kemudian dikenal sebagai L. bifidus) di dalam ASI. Hal ini
berkaitan dengan keberadaan N-acetylglucosamine sebagai faktor bifidus di dalam
ASI, yaitu sejenis karbohidrat yang mengandung nitrogen dan dapat menunjang
pertumbuhan bakteri L. bifidus (Surono 2004).
Nuraida et al. (2008), mengisolasi BAL yang berasal dari ASI. Dari tiga
puluh satu sampel ASI diperoleh 87 isolat macam kultur BAL. Melalui uji
13
fisiologis dan biokimia yang dilakukan pada uji identifikasi awal diperoleh
54 isolat yang teridentifikasi sebagai Lactobacillus homofermentatif, 18 isolat
teridentifikasi sebagai Lactobacillus heterofermentatif, 9 isolat teridentifikasi
sebagai Bifidobacteria, 1 isolat teridentifikasi sebagai Pediococcus, serta
6 isolat teridentifikasi sebagai Streptococcus. Bakteri asam laktat yang bersifat
heterofermentatif kurang baik untuk dikembangkan menjadi produk probiotik
yang berupa susu fermentasi. Hal ini disebabkan gas CO 2 yang dihasilkan akan
merusak tekstur produk probiotik yang berupa susu fermentasi. Sehingga dalam
pengujian ketahanan terhadap asam hanya BAL yang bersifat homofermentatif
yang diikutsertakan.
Beberapa isolat yang diperoleh dari isolasi ASI ini adalah L. rhamnosus,
yang merupakan salah satu BAL yang banyak mengkolonisasi mukosa usus.
Bakteri asam laktat jenis ini sangat stabil pada rentang suhu yang luas dan pada
berbagai tingkat pH. Pada penggunaanya L. rhamnosus sering sekali
dikombinasikan dengan bakteri lain seperti L. acidopilus maupun L. casei untuk
meningkatkan efisiensi kerja bakteri tersebut (Legowo 2007). Berdasarkan hasil
penelitian Nuraida et al. (2008), isolat L. rhamnosus R21 asal ASI yang diperoleh
memiliki ketahanan yang baik terhadap kondisi asam (pH 2) dimana terjadi
penurunan log <1 dan juga tahan pada kondisi garam empedu 0,5% dengan
penurunan jumlah bakteri sebesar 2,23 log CFU/g (Nuraida et al. 2008).
Selain isolat R21, isolat lain yang juga diperoleh oleh Nuraida et al. (2008),
asal ASI adalah L. rhamnosus R23, L. rhamnosus B16, L. rhamnosus R14,
L. rhamnosus 25, L. rhamnosus R27 dan isolat R32, memiliki ketahanan hidup
yang baik pada kondisi pH asam (pH 2 selama 5 jam) dan konsentrasi garam
empedu sebesar 0,5% secara in vitro, serta isolat-isolat ini memiliki daya hambat
terhadap Bacillus cereus, Salmonella thypii, Escherichia coli dan Staphylococcus
aureus. Hartanti (2010), juga melaporkan bahwa isolat-isolat asal ASI tersebut di
atas, mampu menghambat pertumbuhan enteropatogenik E. coli (EPEC)
K1.1. > 2 log CFU/mL dengan jumlah EPEC 105 CFU/mL dan dapat menghambat
isolat Lactobacillus lainnya sebesar 106 CFU/mL, hal ini disebabkan oleh
kemampuan isolat ini menghasilkan L-asam laktat dengan konsentrasi yang tinggi
(Wang et al. 2005). Berikut di bawah ini visualisasi BAL pada Gambar 1.
14
(a)
(b)
Gambar 1 BAL isolat asal ASI (a) L. rhamnosus R14; (b) L. rhamnosus R21
2.4
Ketahanan Bakteri Asam Laktat Terhadap Pemanasan
Pemanasan merupakan salah satu faktor penting yang menentukan
kemampuan suatu bakteri untuk bertahan dan tumbuh. Proses pemanasan dapat
mengakibatkan terjadinya pembentukan lubang atau pori pada membran sel
bakteri. Panas juga sangat berkontribusi penting dalam menginaktifkan enzimenzim dan ribosoma, yang pada akhirnya dapat menurunkan atau mereduksi
aktivitas biologi bakteri yang terpapar sehingga dapat mengalami kematian
(Tabatabaie & Mortazavi 2008). Ketahanan panas setiap mikroba berbeda-beda,
hal ini sangat bergantung pada keragaman genetik yang dimiliki oleh masingmasing Isolat, jumlah sel, umur sel, kondisi fisiologis bakteri, suhu pertumbuhan
inokulum, air, lemak, garam dan faktor lainnya.
BAL merupakan bakteri yang mampu tumbuh pada suhu yang bervariasi.
Beberapa jenis BAL bersifat mesofilik dan termofilik, yaitu tumbuh pada suhu
5 dan 45 °C (Jay 2000). Niamsup et al. (2003), juga menjelaskan beberapa isolat
L. thermotolerans sp. dapat tumbuh pada kisaran suhu yang tinggi, seperti
L. thermotolerans G35 T dapat tumbuh pada suhu 50 °C dan L. thermotolerans
lainnya yakni G12, G22 ,G43 dan G44 mampu tumbuh pada suhu 45 °C.
Beberapa BAL juga bersifat termodurik artinya bakteri ini tahan terhadap suhu
pasteurisasi, yaitu 72 °C selama 15 detik. BAL termodurik optimum tumbuh pada
suhu 45 °C. BAL termodurik tidak harus tumbuh pada suhu tinggi. Beberapa jenis
BAL termodurik diantaranya, Streptococcus thermophilus dan Lactobacillus
bulgaricus (Fardiaz 1992; Helfrerich & Westhoff 1980).
15
Rizqiati et al. (2008), melakukan seleksi ketahanan panas BAL jenis
L. plantarum. Hasil yang diperoleh menunjukkan 10 isolat probiotik L. plantarum
yang diuji pada suhu pemanasan 100 °C selama satu menit menyebabkan
terjadinya penurunan BAL sebesar 44-75%, sehinga yang tersisa hanya 25-56%.
2.5
Cronobacter spp. (Enterobacter sakazaki)
Cronobacter sakazakii merupakan bagian dari famili Enterobacteriaceae,
genus Enterobacter dan secara biologis Cronobacter spp. merupakan bakteri yang
bersifat motil, tidak membentuk spora, Gram negatif, dan anaerob fakultatif.
Genus baru Cronobacter spp. dikelompokkan berdasarkan karakterisasi molekuler
terhadap gen 16 sRNA, gen DNAG dan gluA ; uji biokimia (API 20E, ID 32E)
dan α-glukosidase, pigmen kuning, dan pertumbuhannya pada media kromogenik
(Iversen 2007).
Cronobacter spp. merupakan bakteri patogen oportunis yang dapat
mengakibatkan infeksi pada bayi dan memiliki tingkat mortalitas yang tinggi
(40-80 %). Bakteri ini dikenal mengontaminasi susu formula bubuk untuk bayi
dan beberapa isolatnya mampu bertahan sampai 2 tahun pada susu formula bubuk.
Selain terdapat pada susu bubuk bayi, bakteri ini juga ditemukan mengontaminasi
berbagai macam produk makanan seperti sereal. Infeksi yang disebabkan
C. sakazakii mengancam seluruh kelompok usia namun bayi adalah kelompok
usia yang paling rawan terserang infeksi. C. sakazakii mampu tumbuh pada
rentang pH 5-10 dan konsentrasi NaCl hingga 7% (Iversen 2008). Bakteri ini
dapat membelah dirinya sekitar 75 menit pada suhu 21 oC dalam susu formula
bayi yang direkonstitusi (Iversen 2003). Kandhai et al. (2006) menyatakan
C. sakazakii dapat tumbuh pada suhu rekonstitusi 8 dan 47 oC pada susu formula
dengan menggunakan air steril.
C. sakazakii merupakan patogen yang dapat menyebabkan meningitis yaitu,
infeksi dan inflamasi pada meninges atau lapisan penutup otak; sepsis adalah
beredarnya bakteri pembentuk nanah atau toksinnya melalui sirkulasi darah yang
dapat berada dalam darah atau jaringan; sedangkan brain cyst adalah munculnya
kista pada otak. Van Acker et al. (2001) dan Hunter et al. (2008) melaporkan
bahwa C. sakazakii dapat menyebabkan penyakit necrotizing enterocolitis (NEC).
Adanya C. sakazakii memicu apoptosis pada sel epitelial usus atau Intestinal
16
Epithelial Cell (IEC) dan meningkatkan produksi interleukin-6 di dalam sel IEC-6
pada hewan percobaan (Hunter et al. 2008).
Meskipun tidak ada bukti secara epidemiologis tentang dosis infeksinya,
laporan Iversen dan Forsythe (2003) memperkirakan 1000 sel sebagai konsentrasi
awal Cronobacter spp. yang dapat menyebabkan infeksi. Jumlah ini sama dengan
dosis infeksi bakteri patogen lain seperti Neiserria meningitis, E. coli O157, dan
L. monocytogenes 4b. Dosis infeksi C. sakazakii bervariasi tergantung pada
respon bakteri ini terhadap stres, kondisi kesehatan inang, dan komponen pada
makanan (Iversen & Forsythe 2003). Penderita imuno-compromised akan cepat
terinfeksi dengan dosis lebih kecil jika dibandingkan dengan manusia sehat.
Nazarowec-White dan Farber (1997) melaporkan bahwa C. sakazakii dapat
menimbulkan infeksi pada mencit bila diinokulasikan sebanyak 105 CFU/mL
secara oral dan sebanyak 103 CFU/mL secara interperitoneal. Muytjens et al.
(1988) dan Nazarowec-White dan Farber (1997) menyatakan laju pertumbuhan
organisme ini dapat digunakan untuk menghitung waktu yang diperlukan untuk
menggandakan diri (14 generasi) pada dosis infeksi (103 sel) dengan suhu
inkubasi yang berbeda. Suhu inkubasi yang digunakan yakni 10, 18, 21, dan 37 oC
dengan waktu penggandaan berturut-turut 13,6; 2,9; 1,3; dan 0,5 jam. Bakteri
C. sakazakii pada level yang rendah (≤0,36 sel/100 g) diduga tidak menyebabkan
infeksi asalkan tidak ada penyimpangan suhu atau kontaminasi dalam preparasi.
Di Indonesia tidak ada laporan mengenai kasus infeksi yang disebabkan oleh
C. sakazakii.
2.6
Sumber Cronobacter sakazakii
Bakteri ini dapat diisolasi dari berbagai makanan termasuk keju, roti, tahu,
teh asam, daging yang di-curing, minced beef, dan sosis. C. sakazakii juga
ditemukan pada kamir roti dikarenakan bakteri ini merupakan bagian dari flora
permukaan biji sorgum (Gassem 1999). Bakteri ini juga ditemukan pada biji padi
(Cottyn et al. 2001). Sumber utama bakteri C. sakazakii yang terkait pada kasuskasus infeksi pada bayi yang baru dilahirkan adalah dari makanan bayi dan susu
formula, namun beberapa peneliti juga telah mengisolasinya dari berbagai sumber
seperti lingkungan dan makanan lain, karena bakteri ini bukan merupakan bagian
17
dari flora normal manusia dan hewan, maka dimungkinkan bahwa tanah, air, dan
sayur-sayuran merupakan sumber kontaminasinya pada makanan.
Susu formula bayi diasosiasikan sebagai sumber kontaminan bakteri
C. sakazakii penyebab infeksi pada bayi. Beberapa penelitian mutakhir telah
dilakukan, seperti hasil penelitian Estuningsih et al. (2006) yang menjelaskan
bahwa dari 74 sampel makanan bayi di Indonesia dan
Malaysia, ditemukan
35 sampel (47%) positif Enterobactericiae dan 10 sampel (13,5%) positif
mengandung C. sakazakii. Meutia (2009) juga berhasil mengisolasi 8 isolat
C. sakazakii dari 4 sampel susu formula bayi (n=25). Identifikasi dengan API 20E
dan DNA sekuensing menunjukkan bahwa isolatnya memiliki kemiripan sebesar
92-97% dengan genom lengkap C. sakazakii ATCC BAA-894. Dewanti-Haryadi
et al. (2010), juga telah berhasil mengisolasi beberapa isolat yang diduga sebagai
kelompok C. sakazakii, berdasarkan hasil identifikasi takson dan tingkat
kemiripan isolat dengan program apiwebTM, dimana hasil penelitiannya
menunjukkan bahwa terdapat 6 isolat yang diisolasi dari produk makanan bayi,
maizena, dan bubuk coklat diantaranya DES c13, DES b10, DES b7a, DES d3 dan
lainnya (Dewanti-Hariyadi et al. 2010). Selain itu C. sakazakii juga telah berhasil
diisolasi dari sumber pangan jenis bumbu bubuk komersial dan produk bubuk
lainnya (Hamdani 2012 in press).
Haryani et al. (2008) mengisolasi bakteri ini dari sumber makanan ready-toeat (street food) di Malaysia. Dari tujuh isolat diketahui enam isolat positif
C. sakazakii berdasarkan uji biokimiawi standar (API 20E) dan uji genetik dengan
metode RAPD PCR finger printing. Isolat didapatkan dari lima lokasi berbeda di
Malaysia yakni yang berasal dari kuah chutney, curry samosa, surimi lobster, kuih
lapis, dan kuih koci.
Tiga puluh isolat C. sakazakii juga berhasil diisolasi dari tiga sumber yang
berbeda di industri, yakni penyaring udara (24 isolat), lingkungan (3 isolat), dan
produk bubuk (3 isolat) dengan metode Pulsed-Field Gel Electrophoresis (PFGE)
(Mullane et al. 2008). Meskipun bakteri ini terdapat secara luas namun Muytjens
dan Kollee (1990) tidak berhasil mengisolasi bakteri ini dari susu sapi mentah,
ternak, tikus, padi-padian, kotoran burung, hewan peliharaan, permukaan air,
tanah, lumpur, atau akar kayu (Iversen & Forsythe 2003).
18
2.7
Ketahanan C. sakazakii Terhadap Suhu Tinggi dan Kekeringan
Menurut Iversen dan Forsythe (2003) Cronobacter spp., dapat tumbuh pada
kisaran suhu yang luas (6-47 oC). Kondisi optimum perkembangan bakteri ini
berada pada kisaran suhu 37-44 oC, namun tidak termasuk dalam golongan tahan
panas karena pada suhu 60 oC dapat mengalami kematian (Edelson et al. 2004).
Karakteristik adaptasi dan berkembang bakteri ini menurut Food Safety Athority
of Ireland, dapat dilihat pada Tabel 1.
Tabel 1 Karakter tingkat adaptasi dan perkembangan C. sakazakii
Parameter
Suhu untuk pertumbuhan
Waktu generasi 0) saat suhu 22 °C
D-value pada suhu 60 °C
(isolat Cronobacter spp. berasal dari PIF)
Keterangan :
0)
Kisaran
6- 45 °C
Optimum
37-43 °C
37-44 menit
-
3,52-3,58
-
Waktu generasi adalah waktu yang dibutuhkan untuk membuat populasi bakteri
menjadi 2x lipat. Sumber: Iversen & Forsythe (2003)
C. sakazakii merupakan jenis bakteri yang mungkin terdapat pada makanan
pendamping ASI, jenis patogen ini memiliki karakteristik yang kurang tahan
terhadap panas namun beberapa galur bakteri ini memiliki ketahanan panas yang
bervariasi. Hal ini dapat dilihat dari hasil pengujian nilai D 56 pada berbagai isolat
lokal asal susu formula, MP-ASI, dan lainnya seperti DESc13;
DESb10;
DESb7a; YRC3a; dan YRT2a yakni masing-masing 11,36; 5,48; 8,55; 4,10; dan
5,83 menit (Seftiono 2012).
Banyak faktor yang mempengaruhi ketahanan panas bakteri. Beberapa
diantaranya yakni perbedaan galur, kondisi fisiologis bakteri, suhu pertumbuhan
dari inokulum, dan menstruum pemanasan (termasuk kadar lemak, total solid, dan
total gula), metode yang digunakan, dan metodologi dalam recovery mikroba
(Nazarowec-White & Farber 1997; Kim & Park 2007). Selain memiliki ketahanan
terhadap panas, bakteri patogen ini juga memiliki kemampuan untuk bertahan
pada kondisi kering. Beberapa penelitian yang telah dilakukan menjelaskan bahwa
bakteri ini mampu bertahan pada kondisi kering selama 2,5 tahun pada susu
bubuk formula.
19
2.8
Susu Formula Bayi dan Proses Produksinya
Susu formula bayi adalah susu yang dihasilkan secara fabrikasi untuk
memenuhi keperluan asupan gizi bayi. Produk susu formula diformulasikan
menyerupai nilai gizi ASI (Breeuwer et al. 2003).
Proses pembuatan susu formula (Gambar 2) dapat dilakukan dengan dua
metode, yaitu pencampuran kering (dry mixing), pencampuran basah (wet mixing)
atau kombinasi keduanya. Proses pencampuran kering adalah proses pengolahan
dimana seluruh bahan yang berbentuk kering (bahan baku dan bahan tambahan)
dicampurkan dengan pencampur kering untuk mendapatkan produk akhir dengan
tingkat homogenitas yang diinginkan. Kelebihan dari pencampuran kering adalah
tidak adanya air yang terlibat dalam proses pengolahan sehingga lini proses dapat
dijaga tetap kering dalam jangka waktu lama (BPOM 2011). Metode
pencampuran kering memiliki kekurangan dari segi kualitas dan keamanannya
karena semua bahan baku yang digunakan tidak memiliki ukuran partikel yang
sama sehingga akan sangat sulit untuk menghasilkan pencampuran yang homogen
(Heredia et al. 2009). Hal ini akan mempengaruhi kualitas nutrisi susu yang
dihasilkan. Proses produksi susu formula dengan tipe pencampuran basah
dilakukan
dengan
mencampurkan
seluruh
bahan
dalam
kondisi
basah
(pencampuran bahan baku dalam wujud cair, proses pasteurisasi, penambahan
ingredient yang sensitif terhadap perlakuan termal serta spray drying) (BPOM
2011). Secara teoritis proses panas yang dilakukan dalam proses pembuatan susu
dapat membunuh semua sel vegetatif bakteri yang ada sebelum proses spray
drying, namun kontaminasi setelah perlakuan panas (post heat treatment
contamination) seperti kontaminasi dari lingkungan pabrik juga harus
dipertimbangkan.
Kontaminasi bakteri C. sakazakii (Gambar 2) pada proses produksi susu
dapat berasal dari faktor instrinsik dan ekstrinsik. Kontaminasi intrinsik terjadi
ketika susu formula terpapar C. sakazakii pada tahapan pemrosesan susu formula,
misalnya ketika penambahan bahan baku yang sensitif terhadap perlakuan panas
seperti, vitamin, mineral, dan lesitin setelah proses spray drying. Kontaminasi
ekstrinsik terjadi melalui peralatan, misalnya blender, sendok pada saat penyiapan
susu formula.
20
Bahan baku basah
(susu segar)
Bahan baku kering
(premix vitamin atau BTP
Penerimaan di pabrik
SOP
Penyimpanan di gudang
SOP
Penimbangan bahan baku & BTP
Pencampuran
SOP
Homogenisasi
SOP
Pasteurisasi
Evaporasi
Penampungan sementara
SOP
Pemindahan ke jalur pengeringan
Pengeringan dengan pengeringan semprot
Pendinginan
Aglomerasi
SOP
Pengayakan
Kemasan
Pengisian ke dalam pengemas
N2 atau CO2
Penghembusan dengan gas inert
SOP
SOP
Penutupan kemasan
Pemberian label atau kode
Distribusi
Pengepakan ke dalam kemasan sekunder
Susu formula
Penyimpanan sementara untuk konfirmasi hasil uji
Gambar 2 Proses pengolahan susu formula dengan tipe pengolahan pencampuran
basah yang berasal dari bahan basah dan kering (CAC 2004)
SOP
21
Selama proses produksi dan penyiapan susu formula bubuk ada
kemungkinan terjadinya kontaminasi oleh bakteri-bakteri patogen seperti
Bacillus
spp.,
Cronobacter
spp.,
Salmonella
spp.,
L.
monocytogenes,
Staphylococcus spp. dan Enterobacter spp. Sehingga diperlukan regulasi batas
cemaran mikroba yang boleh terdapat dalam produk akhir. Indonesia mengatur
batas cemaran mikroba produk susu formula bayi dan formula untuk keperluan
medis khusus bagi bayi Peraturan Kepala Badan POM RI (2009) (Tabel 2).
Tabel 2 Batas maksimum cemaran mikroba untuk produk susu formula bayi dan
formula untuk keperluan medis khusus bagi bayi
No.
1
2
3
4
5
6
Jenis mikroba
ALT (30 °C, 72 jam)
Enterobacteriaceae
Enterobacter sakazakii
Salmonella sp.
Staphylococcus aureus
Bacillus cereus
Batas cemaran
1 x 104 koloni/mL
negatif/10 g*
negatif/10 g**
negatif/25 g
1 x 101 koloni/mL
1 x 102 koloni/mL
Sumber: BPOM (2009)
2.9
Rekonstitusi Susu Formula Bayi
Rekonstitusi adalah proses persiapan susu formula atau makanan bayi yang
berbentuk bubuk dengan cara mencampurkannya dengan air sehingga susu bubuk
atau makanan bayi tersebut siap dikonsumsi. Pada saat melakukan praktek
rekonstitusi ada beberapa faktor penting yang perlu diperhatikan, salah satunnya
adalaha suhu rekonstitusi. Suhu rekonstitusi menjadi sangat penting bilamana
pada produk pangan yang akan direkonstitusi ada kemungkinan terkontaminasi
oleh mikroba patogen yang dapat memberikan dampak serius terhadap kesehatan
konsumen.
Suhu rekonstitusi merupakan salah satu faktor penting dalam mereduksi
jumlah bakteri patogen berbahaya salah satu contonya adalah C. sakazakii yang
dewasa ini banyak ditemukan pada makanan atau susu formula bubuk bayi.
Efektivitas suhu rekonstitusi menjadi sangat penting dikaji untuk menentukan
seberapa besar pengaruh suhu rekonstitusi untuk mereduksi bakteri-bakteri
patogen yang mungkin mengontaminasi produk pangan.
22
Beberapa suhu rekonstitusi yang digunakan pada praktek di rumah tangga
yakni 45, 50, 60, dan 70 oC. Beberapa penelitian telah menguji efektivitas
beberapa suhu untuk merekonstitusi susu formula dan prroduk pangan lainnya
diantaranya adalah suhu 50, 60, dan 70 oC. Pemilihan suhu rekonstitusi 50 oC
didasarkan pada pertimbangan pola kebiasaan masyarakat Indonesia ketika
menyeduh atau menyiapkan minuman hangat, termasuk susu formula dengan
Penggunaan suhu sekitar 50
o
C ini dikenal dengan istilah suwam kuku.
o
Suhu rekonstitusi 60 C dipilih karena merupakan suhu rekonstitusi yang umum
digunakan pada praktek rekonstitusi di rumah tangga. Selain itu suhu rekonstitusi
60 oC sering digunakan pada beberapa penelitian uji inaktivasi patogen jenis
Cronobacter spp. Ogihara et al. (2009) pada penelitian uji ketahanan panas
bakteri C. sakazakii menggunakan suhu 60 oC. Hasil yang diperoleh menunjukkan
bahwa suhu rekonstitusi 60 oC mampu menurunkan jumlah bakteri C. sakazakii
ATCC 29004 sebesar 0,37-1 siklus log. Selain itu penggunaan suhu rekonstitusi
60 oC ini dinilai lebih aman untuk menjaga kerusakan nutrien yang terkandung
pada produk pangan, seperti yang dijelaskan oleh FAO/WHO (2004) bahwa
penggunaan suhu yang tidak terlalu tinggi dapat mencegah terjadinya kehilangan
dan kerusakan nutrien komponen pangan lainnya, salah satunya adalah vitamin C
yang terdapat pada produk pangan termasuk susu formula bubuk . Sementara itu,
pemilihan suhu 70 oC pada penelitian ini didasarkan atas rekomendasi FAO/WHO
(2004) dan BPOM (2009) tentang prosedur persiapan susu formula rekonstitusi.
Suhu rekonstitusi 70 oC juga dinilai efektif untuk menghambat pertumbuhan
bakteri patogen berbahaya seperti laporan Meutia (2009) yang menyebutkan
bahwa suhu rekonstitusi 70 oC dapat mengurangi jumlah sel C. sakazakii sebesar
2,74-6,72 log (CFU/mL).