METODE EVALUASI KOMPONEN NON

11/9/2007
Topik 10.2
METODE EVALUASI KOMPONEN NON
GIZI: Evaluasi in vivo aktivitas anti kanker,
imunomodulator/anti alergi,hormonal
Fransiska R Zakaria
DEPARTEMEN ILMU DAN TEKNOLOGI PANGAN
FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR - 2007
PPt e-Learning ENBP
Distance Education Program
Evaluation on Biological Value of Food (EBVF) Course
Sub topik 2:
Secara in vivo
aktivitas anti kanker,
imunomodulator/ anti
alergi, hormonal
Kanker dimulai dari kerusakan gen dalam sel,
Kerusakan gen yang lebih lanjut menghasilkan
sel kanker ganas (malignan). Penyebab utama
kerusakan gen sel adalah senyawa kimia, virus,
dan sinar UV. WHO th 2002 menyatakan bahwa
kanker adalah penyakit yang dapat dicegah
• Evaluasi aktivitas anti kanker, imunomodulator/anti
alergi dan hormonal pangan dapat dilakukan secara
in vivo, yaitu melalui pemberian makan pada
manusia maupun pada hewan percobaan.
• Merupakan sebagian dari aktivitas atau fungsi
pangan yang dapat dievaluasi.
• Fungsi-fungsi lain meliputi: anti arterosklerosis, anti
depresi, anti obesitas, anti diabetes, dsbnya
• Beberapa contoh diharapkan dapat menjadi dasar
untuk pengembangan atau penerapan evaluasi
fungsi-fungsi pangan lainnya
• Uji in vivo sering dapat digabung dengan uji in vitro..
Gabungan evaluasi in vivo dan in vitro akan
memberikan hasil yanglebih akurat meskipun biaya
dari segi waktu, tenaga dan uang.
1
11/9/2007
Evaluasi ativitas anti kanker
• secara in vivo pada hewan percobaan dapat dilakukan dengan cara
pemberian senyawa pemicu pertumbuhan kanker (mengsimulasi proses
inisiasi)
• Cara lain: mentransplantasi sel kanker pada hewan percobaan
(mensimulasi kemampuan untuk tumbuh dan kondisi metastase). Hanya
dapat dilakukan pada hewan penerima yang sejenis dan mempunyai sifat
genetika yang sama dengan hewan penghasil sel kanker (donor sel
kanker)
• Berikut ini adalah contoh evaluasi aktivitas anti kanker gel cincau hijau.
• Hewan percobaan :mencit C3H, yaitu mencit yang gennya sama dengan
gen mencit yang menjadi sumber sel kanker.
• Setiap kelompok : 5 ekor.
• Satu kelompok diberi makan diet normal (kel kontrol)
• Untuk kelompok perlakuan: diet mendapat tambahan minuman bahan uji.
• Semua kelompok mencit diberi pemicu kanker berupa suspensi sel kanker
yang ditransplantasi dibawah kulit perut (subkutanus) dengan cara
penyuntikkan.
• Percobaan dilakukan selama satu bulan. Pada akhir percobaan, limfa
mencit diambil sebagai sumber sel-sel imun (darah mencit sangat sedikit)
• Sel imun diuji secara in vitro dengan metode kultur sel secara
• Hati mencit diambil untuk dianalisa klinis aktivitas berbagai jenis enzim
antioxidan dan kapasitas antioxidan.
• Pada contoh metode evaluasi ini uji in vivo digabung dengan uji in vitro.
C3H Mice n=5
Fed with powder for
4-wk (12.1g/kg)
Tumor transplantation
Tumor latent
period (days)
Killed , Day 57
Tumor volume
(Moving pen,
Tajima)
Tumor
Healthy and necrotic
Liver
Spleen
Spleen cells
Tumor cells
Resistance to
H2O2 (MTT)
T cell
(Rosette)
In vitro cytotoxic toward tumor cell
2
11/9/2007
LIVER
SOD
(Adenochrome asay
Misra. H.P.
GSH-PX
(Paglia and Valentine,
1967
CATALASE
Colometri, Sinha 1972
MDA
(TBA, Buege and
Aust)
Total Glutathion
DTNB, Ellman. 1982
Sel darah putih (leucocyte) merupakan bagian dari sistim imun, sel-sel ini
menghancurkan dan mengeluarkan: sel-sel tubuh yang aus atau rusak, sel-sel
mikroba patogen dan makromolekul asing.
Contoh penelitian imunomodulator dan hormon klik responden manusia
Untuk contoh penelitian antikanker secara in vivo pada hewan klik
evaluasiantikanker2 . Pada evaluasi ini, mencit sebagai hewan percobaan diberi
makan diet normal..Untuk kelompok perlakuan disamping mendapat diet yang
sama dengan diet kelompok kontrol mendapat tambahan minuman bahan uji.
Mencit diberi pemicu kanker berupa sel kanker yang ditransplantasi pada tubuh
mencit.
Pada kedua penelitian ini uji in vivo digabung dengan uji in vitro. Setelah
pemberian makan pada responden sampel darah manusia diambil dan digunakan
sebagai sumber sel-sel imun untuk uji aktivitas proliferasi sel, yang merupakan uji
aktivitas imunomodulator.
Pada hewan percobaan, limfa hewan (dalam penelitian ini, mencit) yang diambil
sebagai sumber sel-sel imun karena darah mencit sangat sedikit dan tidak cukup
sebagai sumber sel untuk analisis.
Pada manusia, sumber sel imun yang aman dan banyak adalah darah. 1ml darah
manusia mengandung 9 × 106 leukocytes (1.0% of blood volume) : Untuk satu
analisis secara micro culture diperlukan hanya 105 sel.
Uji in vitro tsb merupakan uji fungsi sel. ika fungsi sel lebih baik dari kontrol maka
dapat disimpulkan bahwa zat/bahan uji bersifat imunomodulator.
Peralatan laboratorium kultur sel hewan
terdiri dari :
1. Laminar hood (lemari steril)
2. Inkubator CO2
Semua pekerjaan dilaksanakan
dalam laminar hood secara aseptis
Kontaminasi oleh mikroorganisme
(bakteri, cendawan, virus) akan
menggagalkan percobaan
3
11/9/2007
Pelaksanaan Intervensi Uji in vivo dengan manusia
sebagai subjek. Evaluasi nilai biologis bubuk bebas lemak
kakao terhadap fungsi sel imun (limfosit)
Waktu pelaksanaan sesuai rancangan, mis 25 hari, setiap hari jam
07.00 pagi
Kelompok kakao, mengkonsumsi minuman bubuk kakao
bebas lemak, sedangkan kelompok kontrol hanya mengkonsumsi
minuman yang terdiri atas susu skim + gula
Semua responden disediakan sarapan pagi dan juga makan
malam
Dilakukan pengukuran status gizi berdasarkan Body Mass Index
(BMI), dua kali sebelum dan sesudah pelaksanaan intervansi
Pembuatan Minuman Bubuk Kakao Bebas
Lemak Untuk intervensi (pemberian minum).
Semua minuman harus standar (takaran
sama) untuk semua responden
Persiapan Responden
Mahasiswa IPB,
umur 22 – 27 Tahun,
perempuan, tandatangan
inform consent, sehat
Kelompok kakao
9 orang
Kelompok kontrol
9 orang
4
11/9/2007
Pengambilan Darah
Tempat : Klinik Farfa Darmaga
Sebelum dan sesudah intervensi
Pengambilan darah sebagai sampeluntuk isolasi sel-sel
limfosit yang akan diuji aktivitasnya. Makin tinggi aktivitas
makin baik nilai biologis bubuk kakao
Tabung vakutener yg telah
terisi sampel darah
Isolasi Sel Limfosit
Lapisan
limfosit
Sentrifuse
Dilewatkan
dalam ficoll
Sentrifus
Cincin
limfosit
Suspensi sel
limfosit
+ Serum AB 10%
Analisa Kadar Glutation Sel Limfosit
Suspensi sel limfosit yang telah dilisis
Glutation (GSH)
adalah
antioksidan
endogenus
(dihasilkan dalam
tubuh) dan
merupakan tripeptida
yang terdiri dari
asam-asam amino
glisin, glutamat dan
sistein (.gamma.-LGlutamyl-Lcysteinylglycine).
Kadar GSH yang
tinggi dalamsel
limfosit menunjukkan
kapasitas antioksidan
sel yang tinggi
+ Asam sulfosalisilat,
disentrifus pada 2500 rpm
Supernatan (100 μl)
Dimasukkan ke lempeng mikro 96 sumur
Ditambah larutan PBS, pereaksi Ellman
Diukur Absorbansi,λ = 415 nm,
kadar glutation sel limfosit ditentukan
berdasarkan kurva standar
5
11/9/2007
Analisa Aktivitas Antiradikal Bebas
Sel Limfosit Dengan Metode DPPH
Suspensi sel limfosit yang telah lisis
+ metanol pa dan DPPH, dikocok,
disimpan dalam ruang gelap
Diukur dengan spektrofotometer, λ = 517 nm
Antiradikal
=
Bebas
X 100%
Kontrol : campuran larutan
DPPH dan metanol
Uji Respon Proliferasi Limfosit dengan Metode MTT: uji
in vitro, sehingga merupakan gabungan evaluasi in
vivo dan in vitro
ditambah mitogen Con
A, mitogen LPS, kontrol
ditambahkan RPMI
+ garam MTT,
inkubasi 4 jam, +
HCl dlm
isopropanol
Di inkubasi,
3 x 24 jam
Dihitung aktivitas proliferasi (Nilai IS)
IS =
Makin tinggi abrosbansi makin tinggi aktivitas
proliferasi makin baik fungsi sel limfosit, makin baik
nilai imunomodulator bubukkkao
Uji Ketahanan Sel Limfosit Terhadap Oksidator: uji in vitro,
sehingga merupakan gabungan evaluasi in vivo dan in vitro
Inkubasi
1 jam
H2O2 Formalin Erithrosin RPMI
Aktivitas
Proliferasi
Aktivitas
Proliferasi
dengan
Metode MTT
IS =
6
11/9/2007
Terima Kasih
7