deteksi enterotoksin tidak tahan panas pada escherichia coli k88

Lokakarya Fungsional Non Penelit 1997
DETEKSI ENTEROTOKSIN TIDAK TAHAN PANAS
PADA ESCHERICHIA COLI K88 ISOLAT ANAK BABI
DIARE DENGAN JARINGAN SEL ADRENAL Y1
Nina Kurniasih
Balai Penelitian Veteriner, Jalan R .E . Martadinata 30, Bogor 16114
PENDAHULUAN
Escherichia coli merupakan salah satu spesies bakteri penghuni normal
dalam saluran pencernaan hewan atau manusia, akan tetapi Escherichia coli
enterotoksigenik (ETEC) bersifat patogen dapat menyebabkan diare akut dan
fatal pada anak-anak babi (Dunne dan Leman, 1975 ; Hungerford, 1975) .
Angka kematian anak babi yang menderita diare akibat infeksi ETEC cukup
tinggi, dapat mencapat 50% (Tzipori, 1985 ; Supar dkk ., 1989) .
ETEC mempunyai kemampuan untuk memproduksi 2 macam
enterotoksin yang berbeda (Smith dan Gyles, 1970 ; Sack, 1975), yaitu toksin
tidak tahan panas (heat-labile toksin = LT) dan toksin yang tahan panas (heat
stable toksin = ST) . Di Indonesia ETEC yang mempunyai antigen K88 atau
antigen perlekatan dapat diisolasi dari anak-anak babi yang menderita diare
(Supar dkk ., 1988, 1989a, 1993, 1994) . Antigen perlekatan K88, dan
entrolotasi disebut juga antigen urelinsi .
Enterotoksin yang tidak tahan panas (LT) yang diproduksi oleh galur
ETEC dapat dideteksi dengan beberapa cara, diantaranya dengan uji secara
in vitro, yaitu dengan cara menginokuIasikan kultur hidup E. coli K88 pada
kultur jaringan sel adrenal Yl, dalam cawan mikro (Donta dkk ., 1974 ; Supar,
1996, 1987a) . Dengan cara ini LT yang diproduksi oleh galur ETEC dapat
dengan mudah terdeksi . Ini akan tampak pada waktu dengan pengamatan
mikroskopik, sel jaringan YI berubah menjadi keriput karena pengaruh LT,
dalam waktu inkubasi 24 - 48 jam .
Sifat sensitifitas terhadap panas dari toksin ini pertama kali dideskripsi
oleh SMITH dan GYLES (1970) . LT dapat berubah menjadi tidak aktif setelah
dipanaskan pada suhu 65 °C selama 15 menit, berbeda dengan ST yang tidak
dipengaruhi pada pemanasan 100 ° C selama 30 menit .
Pada makalah ini akan dikemukakan suatu teknik mendeteksi toksin
tidak tahan panas LT pada E . coli K88, dengan metode biakan jaringan sel
adrenal Y1 pada cawan mikro, untuk peneguhan diagnosis secara laboratori .
226
Lokakarya Fungsional Non Peneli6 1997
PENYIAPAN SUSPENSI KULTUR DARI ISOLAT YANG AKAN DIUJI LT
Isolat-isolat E. coli K88 yang sudah didapat melalui uji reaksi aglutinasi
kemudian diinokulasikan pada 0,5 ml media cair Casamino Acid Yeast-extract
Trace-salts (De Leeuw dan Gainee, 1980 dan Manual WHO, 1983) . Media
disiapkan dalam botol bijou dengan tutup putar. Setelah diinokulasi,
diinkubasikan pada suhu 37 ° C selama 48 jam dan tutup dikendorkan .
Suspensi kultur ini diinokulasikan pada jaringan sel adrenal YI, pada tingkat
monolayer atau satu lapis .
PENYIAPAN KULTUR JARINGAN SEL ADRENAL Y1
DALAM KULTUR MINI
Sel adrenal YI ditumbuhkan dalam media MEM (Minimal essential
medium) yang ditambah dengan foetal calf serum 10%, media disiapkan
dalam cawan mikro dasarnya datar flat bottom microculture plate, Limbro PT,
LTd sebanyak 200 mikroliter . Kultur jaringan yang monolayer dapat diperoleh
setelah diinkubasi pada suhu 37 ° C selama 48-72 jam . Cawan microculture
ditutup dengan adhesive polythene tape, diletakkan didalam candle jar dan sel
yang tumbuh dalam kondisi ini mendapat tambahan CO2 kira-kira 5%
selanjutnya candle jar dimasukkan ke dalam inkubator 37 °C . Kultur jaringan
yang tumbuh menjadi monolayer diinokulasi dengan suspensi kultur yang akan
diuji .
UJI LT DENGAN CARA INOKULASI SUSPENSI E.COU K88 HIDUP
PADA JARINGAN SEL ADRENAL YL
Pengujian dilakukan mengikuti prosedur yang ditulis oleh Sack dan
Sack (1975) dan disesuaikan dengan fasilitas dan kondisi laboratorium .
Medium kultur jaringan sel adrenal YI yang tumbuh Momolayer disiapkan di atas dibuang dengan alat pengisap cairan (pasteur pipet yang dihubungkan dengan pompa vakum), secara hati-hati supaya sel tidak rusak .
Sebanyak 50 mikroliter suspensi kultur hidup yang akan diuji dimasukkan ke
dalam kultur jaringan sel YI . Tiap sampel dilakukan secara duplikat (dua
Iubang) . Didiamkan selama 5-10 menit . Supaya sel jaringan tidak kekeringan
dilakukan dengan cara bertahap (sebagian cawan, setelah selesai, sebagian
berikutnya) . Suspensi kultur dibuang dengan alat pengisap seperti sebelumnya, kemudian jaringan sel dicuci dengan PBS steril . Cara membuang larutan
PBS dengan menggunakan alat pengisap . Setelah kultur jaringan sel dicuci,
sebanyak 200 mikroliter media MEM yang sudah ditambah dengan foetal calf
serum 10% dimasukkan ke dalam tiap-tiap lubang . Cawan microculture ditutup
dengan adhesive polythere tape dan diinkubasikan seperti sebelumnya .
Pengamatan perubahan bentuk morfologi jaringan sel, dilakukan setelah inkubasi 18 jam dengan mikroskop dengan lensa terbalik . Setiap kali melakukan
pengujian sampel, kontrol E. coli positif LT, negatif LT dan media tanpa
diinokulasi kuman diikutkan dalam setiap cawan microculture .
22 7
Lokakarya Fungsional Non Peneliti 1997
KESIMPULAN
Isolat E. coli K88 isolat anak babi diare dapat memproduksi enterotoksin
LT, dari 32 isolat yang diuji semua menunjukkan LT positif. Metode kultur
jaringan sel adrenal YI yang telah dikembangkan dapat mendeteksi LT .
Pengujian ini semua dilakukan dengan suspensi sel bakteri hidup yang
diinokulasikan pada kultur jaringan sel adrenal YI . Metode pengujian ini dapat
diaplikasikan pada laboratorium diagnostik untuk konfirmasi diagnosis
kolibasilosis yang disebabkan oleh E . coli yang bersifat enterotoksigenik
membentuk entotoksi tidak tahan panas .
DAFTAR BACAAN
De Leeuw, P .W . and P .A .M . Guinee (Editors) . 1980 . Laboratory Diagnosis in
neonatal calf and pig diarrhoea . Current topics in Veterinary and Animal
Science . 13, 126-196 .
Donta S .T ., H .W . Moon, T . Gojobori and T . Yokota . 1987 . Evolutinary origin of
pathogenic determinat in enterotoxigenic Escherichia coli and Vibrio
cholerae 01 . J . Bact . 169 :1352-1357 .
Dunne, H .W . and A .D . Leman . 1975 . Diseases of Swine . Forth edition . Iowa
State University Press . Ames, Iowa, U .S .A . 655-686 .
Hngerford, T .G . 1975 . Diseases of livestock . Eighth Edit . MoGraw-Hill Boo Co .
Sydney, Aucland, New York London, Johanesburg, Singopore, Panama,
Sao Paulo, Duseldorf, New Delhi, Tokyo, 360-367, 505-507 .
Sack, D .A . and Sack, R .B . 1975 . Test for enterotoxigenic Escherichia coli
using YI adrenal cell in miniculture . Infect . Imun . 11 : 334-336 .
Smith, H .W. and C .L . Gyles . 1970 . The relationship between two different
enterotoxin produced by enterotoxigenic strains of Escherichia coli of
porcine origin . J . Med Microbiol . 3 : 387-401 .
Supar . 1986 . Studi tentang Escherichia coli Enterotoksigenik pada Anak Sapi
dan Anak babi : Isolasi dan Identifikasi Escherichia coli K99 dan K88 .
Fakultas Pasca Sarjana . Institut Pertanian, Bogor .
Supar . 1987 . Studi perbandingan uji ELISA dan biakan jaringan sel adrenal Yl
pada enterotoksin yang tidak tahan panas kuman Escherichia coli K88
berasal dari anak babi penderita diare . Penyakit Hewan XIX (34) 58-64 .
Supar, 1993 . Prospek pengendalian kolibasilosis neonatal dengan vaksin
Escherichia coli multivalen pada peternakan babi intensif di Tangerang,
Jawa Barat . Penyakit Hewan XXV (46) :114-119 .
Supar . 1994 . Distribusi infeksi Eschechia coli enterotoksigenik pada anak babi
di Sumatera Utara dan prospek pengendaliannya dengan vaksin .
23 0
Lokakarya Fungsional Non Penelifi 1997
HASIL PENGAMATAN
Sampel-sampel E. coli K88 yang diuji dengan metode kultur jaringan sel
adrenal YI, menunjukkan bentuk morfologi dari monolayer menjadi bulat dan
mengecil, perubahan ini sama dengan perubahan pada kontrol E. coli positif
LT (Gambar 1) . Berbeda bila dibandingkan dengan bentuk morfologi jaringan
sel yang tidak diinokulasi kultur cairan hidup (Gambar 2) . Perubahan ini dapat
diamati sesudah diinokulasikan selama 18 jam . Kontrol E . coli negatif LT (E.
coli K99) tidak menunjukkan perubahan morfologi jaringan sel monolayer
setelah diinkubasikan sampai 38 jam (Gambar 3) . Hasil dari uji LT secara
keseluruhan dapat dilihat pada tabel di bawah ini :
Isolat Yang Diuji
Kultur Cair Hidup
Pengamatan
18 jam 38 jam
+
+
+
+
Kontrol G7
G205
Kontrol negatif E . coli Compt .
K1 21<99
Medium yang tidak diinokulasi
32 sampel ETEC K88
16/32*
32/32
Keterangan
perubahan morfologik jaringan sel sama dengan
kontrol positif
Keterangan : * Jumlah isolat yang positif LT/ jumlah isolat yang di uji
Gambar 1 . Biakan jaringan sel adrenal Yl yang diinokulasi dengan suspensi
kultur hidup E . coli K88, sama dengan kontrol positif, sel menjadi
keriput dan mengecil
22 8
Lokakarya Fungsional Non Peneliti 1997
Gambar 2 . Biakan jaringan sel adrenal Yl yang monolayer diinokulasi
/medium yang tidak diinokulasi bakteri E. coli sama dengan
kontrol negatif, sel tidal berubah
Gambar 3.
Biakan jaringansel adrenal Yl yang diinokulasi dengan suspensi
kultur hidup E. coli K99/ kontrol negatif, sel tidak berubah
229
Lokakarya Fungsional Non Peneliti 1997
Prosiding Seminar Nasional Teknologi Veteriner untuk meningkatkan
kesehatan hewan dan pengamanan bahan pangan asal ternak . Cisarua,
Bogor . 173-179 .
Supar, R .G . Hirst and B .E . Patten . 1988 . K-adhesins and O-serogroup of
enterotoxigenic Escherichia coli in calves and piglets in Indonesia .
Proceeding of the Sixth Federation of Asia Veterinary Association
Congress, Den Pasar, Bali, Indonesia . 479-485 .
Supar, R .G . Hirst and B .E . Patten . 1989 . Studies on the epidemiology of neonatal colibacillosis in food producing animals in Indonesia . Proceeding
of the first Seminar on Veterinary Epidemiology . Desember, 6th 1989,
Yogyakarta Indonesia : 103-132 .
Supar, R .G . Hirst and B .E . Patten . 1989a . Detection of enterotoxic Escherichia
coli with F41 fibrial antigen from pigs in Indonesia . Penyakit Hewan XXI
(37) : 13-17 .
Tzipori, S . 1985 . The relative importance of pathogens affecting neonates of
domestic animals . Adv . Vet . Sci . and Comp . 29 : 103-206 .
World Health Organization . 1983 . Programe for control of diarhoeal disease .
Manual of laboratory investigations of acute enteric infection . CCD/83 .3,
37 .
231