8. SOP Perhitungan Sel
advertisement
CANCER CHEMOPREVENTION RESEARCH CENTER FAKULTAS FARMASI UGM Dokumen nomor : Mengganti nomor : CCRC-02-008-00 - URAIAN Jabatan Paraf DIBUAT OLEH Staf CCRC DIPERIKSA OLEH Staf CCRC Nama Tanggal Sendy Junedi Adam Hermawan Tanggal : Tanggal : Hal. 1 dari 4 - DIPERIKSA OLEH DISETUJU OLEH Supervisor CCRC Pimpinan CCRC Muthi’ Ikawati Edy Meiyanto PROSEDUR TETAP PERHITUNGAN SEL DAFTAR ISI HALAMAN DAFTAR ISI 1 A. RIWAYAT REVISI DOKUMEN 2 B. TUJUAN 2 C. PENDAHULUAN 2 D. OPERASIONAL 2 I. Alat 2 II. Bahan 2 III. Prosedur Kerja 3 IV. Cara Perhitungan 4 CANCER CHEMOPREVENTION RESEARCH CENTER FAKULTAS FARMASI UGM Dokumen nomor : Mengganti nomor : CCRC-02-008-00 - Tanggal : Tanggal : Hal. 2 dari 4 - A. RIWAYAT REVISI DOKUMEN No Dokumen - Isi No Dokumen CCRC-02008-00 Isi Tanggal Dibuat oleh Endah P Septi Staff CCRC Menggunakan format lama Belum ada penomoran dokumen Tanggal Dibuat oleh Adam Hermawan Staff CCRC Menggunakan format baru Sudah ada penomoran dokumen Diperiksa oleh Diperiksa oleh Disetujui oleh Riris Istighfari J Supervisor CCRC Edy Meiyanto Pimpinan CCRC Diperiksa oleh Diperiksa oleh Disetujui oleh Aditya Fitriasari Staff CCRC Muthi’ Ikawati Supervisor CCRC Edy Meiyanto Pimpinan CCRC B. TUJUAN Memberikan panduan secara bertahap dan detail mengenai cara perhitungan sel. C. PENDAHULUAN Sel yang akan digunakan untuk uji dengan out put data melibatkan jumlah sel (misal uji sitotoksik, flowcytometri dan doubling time) harus memiliki jumlah tertentu dan antar kelompok perlakuan harus homogen. Perhitungan sel tersebut dapat dilakukan dengan hemositometer dibawah mikroskop. Syarat penghitungan sel dengan metode hemositometri adalah sel harus ”berdiri” sendiri-sendiri/ tidak menggerombol. D. OPERASIONAL I. Alat 1. Pipet Pasteur steril 2. Mikropipet 1 ml, 200 µL 3. Blue tip steril 4. Yellow tip steril 5. White tip 6. Conical tube 14 mL 7. Mikroskop inverted/cahaya 8. Hemositometer 9. Counter II. Bahan 1. Phosphat Buffer Saline 1x 2. Tripsin-EDTA 1x (Tripsin 0,25%) 3. Media Kultur (DMEM/RPMI) CANCER CHEMOPREVENTION RESEARCH CENTER FAKULTAS FARMASI UGM Dokumen nomor : Mengganti nomor : CCRC-02-008-00 - Tanggal : Tanggal : Hal. 3 dari 4 - III. Prosedur Kerja No Prosedur Kerja 1. Ambil sel dari inkubator CO2, amati kondisi sel. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. Perhatian Pastikan panen sel dilakukan setelah sel 80% konfluen. Buang media dengan menggunakan pipet pasteur Lakukan secara aseptis dan hati-hati steril. Cuci sel 2 kali dengan PBS 1x (volume PBS + ½ Misal volume media 7 ml, maka PBS volume media awal). yang dibutuhkan adalah 3,5 ml Tambahkan tripsin-EDTA 1x (tripsin 0,25%) Untuk dish diameter 10 cm, tripsinsecara merata dan inkubasi di dalam inkubator EDTA 1x = 450 µl, untuk flask= 300 selama 3 menit. µl; dekantir tripsin yang berlebih. Tripsin-EDTA digunakan untuk melepaskan sel dari matrik. Tambahkan media kurang lebih 2-3 ml untuk Pastikan sel sudah terlepas satu-satu menginaktifkan tripsin. Resuspensi sel dengan (tidak menggerombol). pipet sampai sel terlepas satu-satu (tidak menggerombol). Amati keadaan sel di mikroskop. Resuspensi kembali jika masih ada sel yang menggerombol. Transfer sel yang telah lepas satu-satu ke dalam Pastikan conical yang digunakan sudah conical steril baru. Tambahkan MK kurang lebih steril. 2-3 ml. Resuspensi sel. Ambil 10 µl panenan sel dan pipetkan ke hemasitometer. Hemositmeter 9. Hitung sel di bawah mikroskop (inverted atau mikroskop cahaya) dengan counter. Lihat prosedur penghitungan sel dibawah. counter 10. Sisa sel pada conical (no 7) dilakukan cryopreservation, atau dilakukan sub kultur. 11. Untuk sel yang akan ditanam (untuk perlakuan) Lihat cara perhitungan sel lakukan transfer sejumlah sel yang diperlukan ke dalam conical yang lain dan tambahkan MK sesuai dengan konsentrasi yang dikehendaki. CANCER CHEMOPREVENTION RESEARCH CENTER FAKULTAS FARMASI UGM Dokumen nomor : Mengganti nomor : CCRC-02-008-00 - Tanggal : Tanggal : Hal. 4 dari 4 - IV. Cara Perhitungan Hemositometer terdiri dari 4 kamar hitung. Setiap kamar hitung terdiri dari 16 kotak. 1. Hitung sel pada 4 kamar hemositometer. Sel yang gelap (mati) dan sel yang berada dibatas luar di sebelah atas dan di sebelah kanan tidak ikut dihitung. Sel di batas kiri dan batas bawah ikut dihitung. 2. Hitung jumlah sel per mL dengan rumus dibawah. ∑ sel kamar A + ∑ sel kamar B + ∑ sel kamar C + ∑ sel kamar D x 104 Jumlah sel terhitung /mL= 4 3. Hitung jumlah total sel yang diperlukan. Misal untuk menanam sel pada tiap sumuran 96-well plate maka jumlah total sel yang diperlukan adalah 5x103/sumuran x 100 sumuran (dibuat lebih) = 5x 105 4. Hitung volume panenan sel yang diperlukan (dalam mL) dengan rumus seperti di bawah ini Jumlah total sel yang diperlukan Volume panenan sel yang ditransfer = Jumlah sel terhitung /mL 5. Ambil volume panenan sel transfer ke conical tube baru kemudian tambahkan MK sampai total volume yang diperlukan. Perhitungan volume yang diperlukan adalah setiap sumuran akan diisi 100 µl MK berisi sel, maka total volume yang diperlukan untuk menanam sel = 100 µl x 100 sumuran = 10 mL.
