Cancer Chemoprevention Research Center

Cancer Chemoprevention Research Center (CCRC), Fakultas Farmasi, UGM 2008 PENGHITUNGAN SEL
Alat:
1.
2.
3.
4.
Mikropipet 20 µl
Hemacytometer/ hemocytometer
Counter
Mikroskop (inverted/cahaya)
Bahan:
1. Suspense sel hasil panen sel (protokol 6)
Langkah
Pekerjaan
1.
Ambil sel dari inkubator CO2, amati kondisi sel. Panen sel dilakukan setelah sel 80%
konfluen.
2.
Buang media dengan menggunakan pipet Pasteur steril.
3.
Cuci sel 2 kali dengan PBS 1x (volume PBS + ½ volume media awal).
4.
Tambahkan tripsin-EDTA 1x (tripsin 0,25%) secara merata dan inkubasi di dalam
inkubator selama 3-5 menit1.
5.
Tambahkan media + 2-3 ml untuk menginaktifkan tripsin. Resuspensi sel dengan pipet
sampai sel terlepas satu-satu (tidak menggerombol).
6.
Amati keadaan sel di mikroskop. Resuspensi kembali jika masih ada sel yang
menggerombol.
7.
Transfer sel yang telah lepas satu-satu ke dalam conical steril baru. Tambahkan MK + 23 ml. Resuspensi sel.
8.
Ambil 10 µl panenan sel dan pipetkan ke hemacytometer.
9.
Hitung sel di bawah mikroskop (inverted atau mikroskop cahaya biasa) dengan counter2.
10.
Transfer sejumlah sel yang diperlukan ke dalam conical yang lain dan tambahkan MK
sesuai dengan konsentrasi sel yang dikehendaki3.
Keterangan:
1. Untuk dish, tripsin-EDTA = 0,75 ml, untuk flask = 0,5 ml; dekantir tripsin yang berlebih. TripsinEDTA digunakan untuk melepaskan sel.
hal 1 dari 2
Protokol in vitro – 8. Penghitungan sel Cancer Chemoprevention Research Center (CCRC), Fakultas Farmasi, UGM 2008 2. Hemacytometer memiliki 4 kamar hitung (chamber), sbb:
(A)
(B)
Gambar 1. (A) Hemacytometer terdiri dari 4 kamar
hitung. Setiap kamar hitung terdiri dari 16 kotak.
Sel yang gelap (mati) dan sel yang berada di
batas luar di sebelah atas dan di sebelah kanan
tidak ikut dihitung. Sel di batas kiri dan batas
bawah ikut dihitung. (B) Counter untuk
memudahkan dalam penghitungan sel.
Jumlah sel yang dihitung/ml = Σsel kamar A + Σsel kamar B + Σsel kamar C + Σsel kamar D x 104
4
3. Jumlah ml panenan sel yang ditransfer = Jumlah total sel yang diperlukan ;
Jumlah sel terhitung/ml
kemudian ditambahkan MK ad sejumlah ml yang diperlukan.
misal:
a. Jumlah total sel yang diperlukan untuk menanam 5x103 sel WiDr di setiap sumuran pada
96-well plate Æ 5x103 x 100 sumuran (dibuat lebih) = 5x105 sel.
b. Volume panenan sel yang diperlukan (dalam ml) = 5x105 : jumlah sel terhitung/ml
c. Karena setiap sumuran akan diisi 100 µl MK berisi sel, maka total volume yang
diperlukan untuk menanam sel = 100 µl x 100 sumuran = 10 ml.
d. Jadi, setelah sejumlah volume panenan sel ditransfer ke conical baru, ditambahkan MK
ad 10 ml.
Untuk perlakuan sel MCF-7 = 5x103 sel/sumuran,
sel T47D = 5x103 sel/sumuran,
sel HeLa = 5x103 sel/sumuran,
hal 2 dari 2
Protokol in vitro – 8. Penghitungan sel