21 BAB III METODE PENELITIAN A. Desain Penelitian Penelitian

advertisement
21
BAB III
METODE PENELITIAN
A. Desain Penelitian
Penelitian yang digunakan adalah deskriptif. Penelitian ini dilaksanakan untuk
mencari jawaban secara mendasar tentang sebab-akibat dengan menganalisis faktor
penyebab terjadinya fenomena tertentu (Nazir, 1983). Sesuai dengan pernyataan
tersebut, penelitian ini dilaksanakan untuk mengetahui faktor penyebab menurunya
kadar detergen di kolam fakultatif IPAL Bojongsoang Bandung.
B. Sampel Penelitian
Sampel yang akan digunakan dalam penelitian ini adalah limbah domestik pada
kolam fakultatif di Instalasi Pengolahan Air Limbah (IPAL) Bojongsoang Bandung.
C. Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian dilakukan pada bulan Maret – Mei 2011 bertempat di laboratorium
Perusahaan Daerah Air Minum (PDAM) Antapani Bandung, sedangkan pengambilan
sampel dilakukan di kolam fakultatif Instalasi Pengolahan Air Limbah (IPAL)
Bojongsoang Bandung.
D. Alat dan Bahan Penelitian
Penelitian ini memerlukan banyak alat dan bahan. Adapun alat (Tabel 3. 1) dan
bahan (Tabel 3. 2) yang diperlukan dalam penelitian ini adalah sebagai berikut:
22
Tabel 3.1. Alat-alat Penelitian
No.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
Alat-alat Laboratorium
Autoklaf
Botol sampel 250 ml
Cawan Petri
Gelas Kimia
Gelas Ukur 1000 ml
Jarum Inokulasi
Labu Erlenmeyer 500 ml
Lampu Spirtus
Mikropipet 1 ml dan 5 ml
Mikropipet 10 ml
Mikroskop
Neraca Timbangan Analitik
Oven dan Lemari Pendingin
Resiprocating water bath
Tabung Durham
Tabung Reaksi
Tips 1 ml, 5 ml san 10 ml
Vortek
Mikrometer
Merek
HL36AE
Spesifikasi
EYELAmodel
Jumlah
1 unit
3 buah
48 buah
Merek Pyrex
2 buah
3 buah
Merek Pyrex
Merek Eppendorf
Merek Eppendorf
22.103 BI.J070
Merek AND
Merek National
Merek EYELA
Merek Pyrex
Merek EYELA
3 buah
1 unit
1 buah
1 unit
1 unit
1 unit
1 unit
48 buah
300 buah
20 buah
1 unit
1 unit
Tabel 3.2. Bahan-bahan Penelitian
No.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
Bahan-bahan Kimia
Akuades
Alkohol
Alumunium foil
H2O2 3%
Indikator Methyl Red
Kapas
Larutan crystal violte
Larutan logol
Larutan safranin
Medium Agar Lipid
Medium Agar Pati
Medium DMS
Medium Kaldu Dekstrosa
Spesifikasi
70%
Merek Bagus
-
-
Jumlah
10 liter
500 ml
2 roll
100 ml
50 ml
2 Bungkus
100 ml
100 ml
100 ml
500 ml
500 ml
1 liter
500 ml
23
No.
14
15
16
17
18
19
Bahan-bahan kimia
Medium Kaldu Laktosa
Medium Kaldu Sukrosa
Medium Kasein
Medium MS
Medium NA
Medium Nutrient Agar (NA)
20
21
Medium Susu Litmus
Medium Uji Kebutuhan
Oksigen
Medium Uji Reduksi Nitrat
MR-VP Broth
Reagen Barrit
Reagen Kovac’s
Reagen Uji Reduksi Nitrat
Reagent reduksi nitrat
SIM Agar
Simmon Citrate Agar
Tryptone Agar
Urea Broth
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
Spesifikasi
Merek Merck
Analytic)
(Pure
Jumlah
500 ml
500 ml
500 ml
1 Liter
1 Liter
3 liter
500 ml
500 ml
500 ml
500 ml
50 ml
50 ml
50 ml
100 ml
500 ml
500 ml
500 ml
500 ml
E. Pembuatan Medium, Reagen dan Sterilisasi
Pembuatan media dan larutan yang diperlukan berdasarkan buku acuan, yaitu
Cappucino dan Sherman (2001). Adapuan medium yang akan dibuat terdiri dari
MSM+Detergen (DMS/Detergen Minimal Salt), MS (Minimal Salt) sebagai kontrol,
Nutrient Agar (NA), kaldu laktosa, kaldu sukrosa, kaldu dekstrosa, agar pati, agar
lipid, gelatin, kasein, uji katalase, uji reduksi nitrat, uji kebutuhan oksigen, susu
litmus, SIM agar, urea broth, tryptone agar, MR-VP broth dan Simmon Citrate agar.
Sedangkan reagen yang dibunakan terdiri dari reagen pewarnaan gram bakteri,
pembuatan H2O2 3%, reagen uji reduksi nitrat, larutan lugol, reagen Kovac’s,
indikator methyl red dan reagen Barrit.
24
Berikut cara pembuatan medium dan reagen yang diperlukan dalam penelitian ini
beserta fungsinya:
1. Medium MSM+Detergen (DMS/Detergen Minimal Salt)
Medium ini digunakan sebagai medium selektif untuk pertumbuhan bakteri yang
dapat mendegradasi detergen. Komposisi medium MSM+Detergen (DMS) terdiri
dari NaCl 5 gram, KCl 0,6 gram, MgSO4 7 gram, NH4NO3 1 gram, detergen 10
mg, agar 20 gram dan akuades 1000 ml (Fagade, 2009).
2. Medium MS (Minimal Salt/Kontrol)
Medium ini digunakan sebagai kontrol untuk membandingkan pertumbuhan
bakteri pada medium DMS. Komposisi medium MS terdiri dari NaCl 5 gram, KCl
0,6 gram, MgSO4 7 gram, NH4NO3 1 gram, agar 20 gram dan akuades 1000 ml.
3. Medium Nutrient Agar (NA)
Medium ini digunakan untuk kultur bakteri selama penelitian berlangsung.
Komposisi medium ini terdiri dari tepung agar 15 gram, pepton 10 gram, NaCl 5
gram dan beef extract 3 gram. Semua bahan dilarutkan dengan akuades hingga
volume mencapai 1000 ml. Kemudian pH medium diatur pada kisaran 6,8-7,2
kemudian dididihkan sambil dihomogenkan. Selanjutnya disterilkan menggunakan
autoclave pada suhu 121oC dengan tekanan 1,5 atm selama 15 menit.
4. Medium Kaldu Laktosa
Medium ini digunakan untuk uji fermentasi karbohidrat, yaitu Laktosa.
Komposisi medium ini terdiri dari pepton 5 gram, NaCl 5 gram, beef extract 3 gram,
laktosa 5 gram dan brom cresol purple (bcp) 0,01 gram. Semua bahan dicampurkan
25
ditambahkan akuades hingga volume mencapai 1000 ml, kemudian pH medium
diatur antara kisaran 7-7,2 dan dipanaskan hingga mendidih. Selanjutnya disterilkan
menggunakan autoclave pada suhu 121oC dengan tekanan 1,5 atm selama 15 menit.
5. Medium Kaldu Sukrosa
Medium ini juga digunakan untuk fermentasi karbohidrat, yaitu Sukrosa.
Komposisi medium ini terdiri dari pepton 5 gram, NaCl 5 gram, beef extract 3 gram,
sukrosa 5 gram dan brom cresol purple (bcp) 0,01 gram. Semua bahan dicampurkan
ditambahkan akuades hingga volume mencapai 1000 ml, kemudian pH medium
diatur antara kisaran 7-7,2 dan dipanaskan hingga mendidih. Selanjutnya disterilkan
menggunakan autoclave pada suhu 121oC dengan tekanan 1,5 atm selama 15 menit.
6. Medium Kaldu Dekstrosa
Medium ini juga digunakan untuk fermentasi karbohidrat, yaitu Dekstrosa.
Komposisi medium ini terdiri dari pepton 5 gram, NaCl 5 gram, beef extract 3 gram,
dekstrosa 5 gram dan brom cresol purple (bcp) 0,01 gram. Semua bahan
dicampurkan ditambahkan akuades hingga volume mencapai 1000 ml, kemudian
pH medium diatur antara kisaran 7-7,2 dan dipanaskan hingga mendidih.
Selanjutnya disterilkan menggunakan autoclave pada suhu 121oC dengan tekanan
1,5 atm selama 15 menit.
7. Medium Agar Pati
Medium ini digunakan untuk uji hidrolisis pati. Komposisi medium ini terdiri
dari pepton 5 gram, beef extract 3 gram, amilum 2 gram dan agar 15 gram. Semua
bahan dicampurkan ditambahkan akuades hingga volume mencapai 1000 ml,
26
kemudian pH medium diatur antara kisaran 7-7,2 dan dipanaskan hingga mendidih.
Selanjutnya disterilkan menggunakan autoclave pada suhu 121oC dengan tekanan
1,5 atm selama 15 menit.
8. Medium Agar Lipid
Medium ini digunakan untuk uji Hidrolisis Lipid. Komposisi medium ini terdiri
dari pepton 5 gram, beef extract 3 gram, lipid 10 gram, neutral red 0,02 gram dan
agar 15 gram. Semua bahan dicampurkan ditambahkan akuades hingga volume
mencapai 1000 ml, kemudian pH medium diatur antara kisaran 7-7,2 dan
dipanaskan hingga mendidih. Selanjutnya disterilkan menggunakan autoclave pada
suhu 121oC dengan tekanan 1,5 atm selama 15 menit.
9. Medium Gelatin
Medium ini digunakan untuk uji Hidrolisis Gelatin. Komposisi medium ini
terdiri dari pepton 5 gram, beef extract 3 gram, dan gelatin 120 gram. Semua bahan
dicampurkan ditambahkan akuades hingga volume mencapai 1000 ml, kemudian
pH medium diatur antara kisaran 7-7,2 dan dipanaskan hingga mendidih.
Selanjutnya disterilkan menggunakan autoclave pada suhu 121oC dengan tekanan
1,5 atm selama 15 menit.
10. Medium Kasein
Medium ini digunakan untuk uji Hidrolisis Kasein. Komposisi medium ini terdiri
dari pepton 5 gram dan agar powder 15 gram. Semua bahan dicampurkan
ditambahkan akuades hingga volume mencapai 1000 ml, kemudian dipanaskan
hingga mendidih dan homogen. Tuangkan campuran tadi ke dalam gelas kimia yang
27
berisi 100 gram susu skim sedikit demi sedikit agar tidak terjadi penggumpalan lalu
diaduk hingga homogen. Kemudian pH medium diatur antara kisaran 7-7,2.
Selanjutnya disterilkan menggunakan autoclave pada suhu 121oC dengan tekanan
1,5 atm selama 15 menit.
11. Medium Uji Katalase
Medium ini digunakan untuk kultur bakteri selama penelitian berlangsung.
Komposisi medium ini terdiri dari tepung agar 15 gram, pepton 10 gram, NaCl 5
gram dan beef extract 3 gram. Semua bahan dilarutkan dengan akuades hingga
volume mencapai 1000 ml. pH medium diatur pada kisaran 6,8-7,2 kemudian
dididihkan sambil dihomogenkan. Selanjutnya medium dimasukkan ke dalam
tabung reaksi sebanyak 5-7 ml untuk agar miring dan disterilkan menggunakan
autoclave pada suhu 121oC dengan tekanan 1,5 atm selama 15 menit.
12. Medium Uji Reduksi Nitrat
Medium ini digunakan untuk uji Reduksi Nitrat. Komposisi medium ini terdiri
dari Disodium Fosfat 2 gram, tripton 20 gram, dekstrosa 1 gram, agar 1 gram,
Potasium Nitrat 1 gram. Semua bahan dilarutkan dengan akuades hingga volume
mencapay 1000 ml. selanjutnya pH diatur pada kisaran 7,2 dlalu dibiarkan hingga
mendidih dan homogen. Setelah itu medium dimasukkan ke dalam tabung reaksi
sebanyak 8-10 ml dan disterilkan dengan autoclave pada suhu 121oC dengan
tekanan 1,5 atm selama 15 menit.
28
13. Medium Uji Kebutuhan Oksigen
Medium ini digunakan untuk kultur bakteri selama penelitian berlangsung.
Komposisi medium ini terdiri dari tepung agar 15 gram, pepton 10 gram, NaCl 5
gram dan beef extract 3 gram. Semua bahan dilarutkan dengan akuades hingga
volume mencapai 1000 ml. pH medium diatur pada kisaran 6,8-7,2 kemudian
dididihkan sambil dihomogenkan. Selanjutnya medium dimasukkan ke dalam
tabung reaksi sebanyak 8 ml untuk agar diri dan disterilkan menggunakan autoclave
pada suhu 121oC dengan tekanan 1,5 atm selama 15 menit.
14. Medium Susu Litmus
Medium ini digunakan untuk uji Reaksi Susu Litmus. Komposisi medium ini
terdiri dari susu skim powder 100 gram, litmus 0,75 gram, dan akuades 1000 ml.
litmus dilarutkan dengan akuades, jangan dipanaskan. Kemudian larutan tersebut
dimasukkan ke dalam gelas kimia yang berisi susu skim bubuk dan diaduk hingga
homogen. Setelah itu medium dimasukkan ke dalam tabung reaksi sebanyak 8 ml
dan disterilkan menggunakan autoclave pada suhu 121oC dengan tekanan 1,5 atm
selama 15 menit.
15. Medium SIM Agar
Medium ini digunakan untuk uji produksi H2S. komposisi medium ini terdiri dari
pepton 30 gram, beef extract 3 gram, ferrous ammonioum sulfate 0,2 gram, sodium
thiosulfate 0,025 gram dan agar 3 gram. Semua bahan dilarutkan dengan akuades
hingga volume mencapai 1000 ml. pH medium diatur pada kisaran 7,3 kemudian
dididihkan sambil dihomogenkan. Selanjutnya medium dimasukkan ke dalam
29
tabung reaksi sebanyak 8 ml untuk agar diri dan disterilkan menggunakan autoclave
pada suhu 121oC dengan tekanan 1,5 atm selama 15 menit.
16. Urea Broth
Medium ini digunakan untuk uji Urease. Komposisi medium ini terdiri dari urea
broth concentrate 10 ml dan akuades steril 90 ml (untuk 100 ml medium), kedua
bahan dicampurkan kemudian dimasukkan ke dalam tabung reaksi kecil yang telah
steril menggunakan tips steril masing-masing sebanyak 3 ml.
17. Tryptone Agar
Medium ini digunakan untuk uji Indol. Komposisi medium ini terdiri dari tripton
10 gram, calcium chloride (reagent) 0,01-0,03 M, sodium chloride 5 gram dan agar
11 gram. Semua bahan dicampur dan dilarutkan dalam 1000 ml akuades, kemudian
dipanaskan hingga mendidih dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi kecil masingmasing sebanyak 3 ml lalu disterilkan menggunakan autoclave pada suhu 121oC
dengan tekanan 1,5 atm selama 15 menit.
18. MR-VP Broth
Medium ini digunakan untuk uji Methyl Red dan Voges Proskauer. Komposisi
medium ini terdiri dari pepton 7 gram, dekstrosa 5 gram dan potassium phosphate 5
gram. Semua bahan dicampur dan dilarutkan dalam 1000 ml akuades, kemudian
dipanaskan hingga mendidih dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi kecil masingmasing sebanyak 3 ml lalu disterilkan menggunakan autoclave pada suhu 121oC
dengan tekanan 1,5 atm selama 15 menit.
30
19. Simmon Citrate Agar
Medium ini digunakan untuk uji Citrat. Komposisi medium ini terdiri dari
ammonioum dihydrogen phosphate 1 gram, dipotassium phosphate 1 gram, sodium
chloride 5 gram, sodium citrate 2 gram, magnesium sulfate 0,2 gram, agar 15 gram
dan brom thymol blue 0,08 gram. Semua bahan dicampur dan dilarutkan dalam
1000 ml akuades, kemudian dipanaskan hingga mendidih dan dimasukkan ke dalam
tabung reaksi kecil masing-masing sebanyak 3 ml lalu disterilkan menggunakan
autoclave pada suhu 121oC dengan tekanan 1,5 atm selama 15 menit
20. Pembuatan Reagen Pewarnaan Gram Bakteri
Komposisi reagen pewarnaan Gram terdiri dari Kristal violet 2 gram dilarutkan
dalam 20 ml athanol 95% dan ditambahkan ammonioum oxalate 0,8 gram yang
dilarutkan dengan akuades 80 ml. Dalam membuat lugol, Kristal iodium 0,06 gram
ditambahkan dengan 0,12 gram Kristal KI dan 20 ml akuades. Selain itu, alkohol
96% dan pembuatan Safranin O denga melarukan 125 mg dalam larutan 5 ml
ethanol 95% dan akuades 50 ml. beberapa larutan tersebut dimasukkan ke dalam
botol gelap dan diberi label sesuai ketentuan.
21. Pembuatan H2O2 3%
Sebanyak 3 ml H2O2 diencerkan dengan aquades menjadi 10 ml, kemudian
dimasukkan ke dalam botol gelap dan diberi label sesuai ketentuan.
22. Pembuatan Reagen Uji Reduksi Nitrat
Komposisi reagen untuk uji Reduksi Nitrat ini terdiri dari Asam Sulfanilat 8
gram dilarutkan dalam 1000 ml asam asetat, larutan ini sebagai larutan A. kemudian
31
alpha-naphhthylamine 5 gram dilarutkan dalam 1000 ml Asam Asetat 5 N, larutan
ini sebagai larutan B. Selain kedua larutan tersebut, zinc powder sebanyak 10 gram
juga disiapkan.
23. Pembuatan Larutan Lugol
Larutan ini digunakan sebagai reagen untuk uji hidrolisis Pati. Komposisi reagen
ini terdiri dari kristal iodium 0,06 gram ditambahkan kristal KI 0,12 gram dan 20 ml
akuades. Selanjutnya larutan tersebut dimasukkan ke dalam botol gelap dan diberi
label sesuai ketentuan.
24. Pembuatan Reagen Kovac’s
Reagen ini digunakan untuk uji Indol. Komposisi reagen ini terdiri dari pdimethylaminobenzaldehyde 5 gram, amyl alcohol 75 ml dan hydrochloric acid
(concentrated) 25 ml. Kemudian p-dimethylaminobenzaldehyde dilarutkan dalam
amyl alcohol kemudian ditambahkan hydrochloric acid (concentrated). Setelah itu
reagen dimasukkan ke dalam botol gelap dan diberi label sesuai ketentuan.
25. Pembuatan Indikator Methyl Red
Larutan indikator ini digunakan dalam uji Methyl Red. Komposisi larutan ini
terdiri dari methyl red 0,1 gram, ethyl alcohol (95%) 3000 ml dan akuades 2000 ml.
methyl red dilarutkan dalam ethyl alcohol 95% kemudian ditambahakan akuades
hingga volume mencapai 500 ml. Setelah itu larutan dimasukkan ke dalam botol
gelap dan diberi label sesuai ketentuan.
32
26. Pembuatan Reagen Barrit
Reagen ini digunakan untuk uji Voges-Proskauer, terdiri dari larutan A dan
larutan B. Untuk larutan A, Alpha-naphthol 5 gram dilarutkan dalam ethanol
absolute 95 ml menggunakan stirrer. Untuk larutan B teridiri dari potassium
hydroxide 40 gram, creatine 0,3 gram dan akuades 100 ml. potassium hydroxide
dilarutkan dalam akuades (larutan akan menjadi panas), biarkan hingga menjadi
dingin (temperatur ruang) kemudian dimasukkan
creatin dan dilarutkan
menggunakan stirrer. Setelah itu kedua larutan dimasukkan ke dalam botol gelap
dan diberi label sesuai ketentuan.
F. Rancangan Penelitian
Penelitian yang digunakan adalah penelitian deskripsi eksploratif untuk
mengidentifikasi bakteri pendegradasi detergen yang diisolasi dari limbah domestik
yang ada di kolam fakultatif Instalasi Pengolahan Air Limbah (IPAL) Bojongsoang
Bandung.
G. Prosedur Penelitian
Prosedur penelitian yang dilakukan terdiri dari 1. Tahap Persiapan, 2. Uji
Pendahuluan, 3. Pengambilan Sampel Bakteri dari Limbah Cair Kolam Fakultatif
dan Inokulasi pada Medium Selektif, 4. Identifikasi atau Karakterisasi Bakteri, 5.
Analisis Data.
Identifikasi atau Karakterisasi Bakteri yang terdiri dari a. Pengamatan Morfologi
Koloni Bakteri, b. Pembuatan Preparat dengan Metode Pewarnaan Gram, c. Uji
Motilitas, d. Uji Aktivitas Biokimia Bakteri Limbah Detergen pada Kolam
33
Maturasi. Uji aktivitas biokimia bakteri limbah detergen pada kolam maturasi terdiri
dari 1). Uji Motilitas, 2). Uji Kebutuhan Oksigen (aerob atau anaerob), 3). Uji
Enzimatis Katalase, 4). Uji Fermentasi Karbohidrat, 5). Uji Hidrolisis yaitu Pati,
Lipid, Gelatin dan Kasein, 6). Uji Reduksi Nitrat, 7). Reaksi Susu Litmus, 8).
Produksi H2S, 9). Tes Urease, 10). Tes IMVIC.
1. Tahap Persiapan
Dalam tahap ini dilakukan pengecekan alat dan bahan yang akan digunakan
selama penelitian. Setelah lengkap maka dilakukan sterilisasi botol sampel, gelas
kimia, cawan petri, gelas ukur, dan tabung reaksi serta peralatan lainnya yang harus
disterilisasi sehingga tidak terkontaminasi. Setelah sterilisasi, kemudian membuat
medium selektif karena bakteri yang akan ditumbuhkan mempunyai sifat spesifik
yang tidak sama dengan bakteri lain, maka pembiakannya membutuhkan media
yang berbeda pula. Dalam penelitian ini digunakan media selektif, yaitu
MSM+Detergen (DMS/Detergen Minimal Salt media). Selanjutnya dilakukan
pembuatan medium untuk pengujian biokimia. Setelah itu, dilakukan pengenceran
sampel agar bakteri yang tumbuh pada medium tidak terlalu banyak dan semua
medium disterilkan.
2. Uji Pendahuluan
Uji pendahuluan ini dilakukan untuk mengetahui pertumbuhan koloni bakteri
yang baik. Pada uji pendahuluan ini digunakan medium DMS dengan konsentrasi
detergen yang berbeda yaitu 10 ppm dan 1 ppm, serta medium MS sebagai kontrol.
Konsentrasi 10 ppm dipilih berdasarkan penelitian sebelumnya yang dilakukan oleh
34
Fagade (2009). Sedangkan konsentrasi detergen 1 ppm digunakan karena
penyesuaian dengan kadar detergen dalam kolam fakultatif. Sedangkan medium MS
digunakan sebagai kontrol, yaitu tidak mengandung detergen sehingga dapat
diketahui jenis bakteri yang dapat mendegradasi detergen atau tidak.
Selain menggunakan medium dengan konsentrasi detergen berbeda, digunakan
pula pengenceran sampel yang berbeda, yaitu 10-1 – 10-7. Sampel yang diisolasi
adalah pengenceran 10-5, 10-6 dan 10-7, namun pada pengenceran ini tidak ada
bakteri yang tumbuh pada ketiga medium. Selanjutnya pengenceran dikurangi
menjadi 10-1 – 10-5, kemudian yang diisolasi adalah sampel dengan pengenceran 102
, 10-3, 10-4 dan 10-5 karena pada pengenceran ini jumlah koloni bakteri yang hidup
tidak terlalu padat di medium sehingga dalam indentifikasi tidak mengalami
kesulitan. Namun, pertumbuhan koloni bakteri pada pengenceran 10-2 lebih baik dari
pada sampel dengan pengenceran 10-3, 10-4 dan 10-5 dan pertumbuhan tersebut
terjadi pada medium DMS 10 ppm. Pertumbuhan koloni bakteri tersebut memiliki
ukuran yang lebih besar (lebih mudah diamati) dan jarak antar koloni jelas.
Berdasarkan uji pendahuluan inilah maka digunakan medium DMS 10 ppm dan
sampel dengan pengenceran 10-2. Untuk lebih jelas, berikut ini (Tabel 3. 3)
pertumbuhan koloni bakteri saat uji pendahuluan.
35
Tabel 3. 3.
3 Pertumbuhan Koloni Bakteri pada Uji Pendahuluan
Replikasi
I
II
III
10-2
11
2
Medium DMS
D
1 ppm
10-3
10-4
10-5
7
1
-
10-2
137
39
9
Medium DMS 10 ppm
10-33
10-4
3
1
5
2
-
10-5
1
-
3. Pengambilan Sampel Bakteri dari Limbah Cair Kolam Fakultatif dan
Inokulasi pada Medium Selektif
Pengambilan sampel akan dilakukan ditiga titik pada kolam Fakultatif IPAL
Bojongsoang. Sebelum melakukan sampling air akan diamati terlebih dahulu faktor
aquatik, yaitu suhu, pH, turbiditas dan DO. Sampel air limbah yang akan diambil
sebanyak 100 ml menggunakan botol gelap 250 ml yang sudah steril dengan tiga
replikasi.
Titik 2
Titik 1
Titik 3
Gambar 3.1
3.1.. Titik pengambilan sampel di kolam
fakultatif IPAL Bojongsoang Bandung
Kemudian, sampel dibawa ke laboratorium untuk diinokulasikan pada medium
selektif untuk melihat jenis koloni bakteri yang ada pada limbah tersebut. Sebelum
dilakukan inokulasi bakteri ke medium selektif, sampel dari titik 1, 2 dan 3
36
dihomogenkan kemudian diencerkan melalui metode pengenceran mulai dari
pengenceran 10-1 hingga 10-2, dengan cara mengambil 1 ml air limbah dari botol
sampel sumber air limbah kolam fakultatif dengan menggunakan tips 1 ml melalui
mikropipet 1 ml kemudian di masukkan ke dalam tabung reaksi 10-1 yang berisi
akuades steril sebanyak 9 ml dan dilakukan kemudian pada pengenceran 10-2. Hasil
pengenceran yang dapat kita gunakan untuk kemudian dimasukkan ke dalam cawan
petri yang berisi medium selektif yaitu pada pengenceran 10-2. Larutan dari tabung
10-2 diambil sebanyak 0,5 ml dengan menggunakan tips yang telah steril lalu
memasukkannya ke dalam cawan petri steril medium DMS 10 ppm (Detergen
Minimal Salt media) dan MS (Minimal Salt media) sebagai kontrol masing-masing
sebanyak 9 ml (Fagade et al.. 2009). Kemudian cawan petri hasil inokulasi
diinkubasi pada suhu 370C selama 48 jam (Suharjono et al., 2009) dan diamati
koloni yang terbentuk dalam setiap cawan petri dengan menggunakan colony
counter (Budiawan et al., 2009).
4. Identifikasi atau Karakterisasi Bakteri
Ini meruakan tahap akhir dalam langkah penelitian ini, yaitu melakukan
identifikasi dan karakterisasi. Identifikasi ini di lakukan dengan berbagai macam
metode, yaitu membuat preparat dengan metode pewarnaan Gram dan melakukan
uji aktivitas biokimia terhadap bakteri hasil isolasi limbah (Syulasmi et al., 2003).
Setiap tahapan identifikasi dilakukan secara triplo. Tahap identifikasi atau
karakterisasi dalam penelitian ini meliputi :
37
a. Pengamatan Morfologi Koloni Bakteri
Pengamatan morfologi koloni bakteri meliputi warna, bentuk, kenaikan
permukaan/elevasi, tepian serta penampakan (suram/mengkilat) koloni.
b. Pengamatan Reaksi Pewarnaan Gram
Pengamatan reaksi pewarnaan Gram terdiri dari bentuk dan rangkaian sel, ukuran
sel serta reaksi pewarnaan Gram positif atau negatif. Namun sebelum diamati
terlebih dahulu harus dibuat preparat. Berikut ini cara pembuatan preparat
pewarnaan Gram, pengamatan bentuk dan rangkaian sel, ukuran sel dan pengamatan
reaksi pewarnaan Gram positif atau negatif.
1) Pembuatan Preparat Pewarnaan Gram
Pembuatan preparat dengan metode pewarnaan Gram dilakukan melalui 2 tahap
yaitu dibuat olesan bakteri dan dilakukan pewarnaan Gram pada olesan bakteri.
Untuk pembuatan olesan bakteri, dibutuhkan objek gelas dan 1 ose biakan murni
bakteri yang telah ditumbuhkan di medium selektif DMS 10 ppm dan MS dari
limbah detergen, satu ose biakan murni bakteri tersebut disuspensikan dengan satu
tetes aquades di atas objek gelas tersebut dan difiksasi di atas api sebanyak 3 kali.
Kemudian dilakukan pewarnaan Gram yang bertujuan untuk menentukan apakah
bakteri yang kita dapat itu bakteri Gram positif atau Gram negatif, dalam proses
pewarnaan Gram ini digunakan pewarna karbol kristal violet, larutan alkohol 96 % ,
larutan lugol, safranin O, akuades dan minyak imersi.
38
2) Bentuk dan Rangkaian Sel
Bentuk dan rangkaian sel dapat dilihat dengan menggunakan mikroskop pada
perbesaran 10x100 kali.
3) Ukuran Sel
Pengukuran sel bakteri menggunakan alat yang disebut mikrometer sehingga
diperoleh kalibrasi untuk satu garis yang ditempati oleh satu sel bakteri pada skala
yang setara dengan mikrometer (µm) (Caprette, 2000). Skala kalibrasi ditentukan
dengan menggunakan perbesaran yang sama saat pengamatan pewaraan Gram
bakteri, yaitu 10x100 kali. Skala kalibrasi diperoleh dengan adanya skala objektif
dan skala okuler yang berhimpit. Berikut rumus untuk kalibrasi:
0,01 0,01 0,0011 1,1 μm
11
0,01 0,0011 1,1 μm
96
Sehingga diperoleh skala kalibrasi satu garis adalah 1,1 μm
Skala Berhimpit
Gambar 3. 2. Skala pada Mikrometer
39
4) Reaksi Pewaraan Gram
Reaksi pewarnaan Gram dilihat melalui warna yang dihasilkan setelah pewaraan
Gram. jika berwarna merah maka bakteri tersebut adalah Gram negatif, sedangkan
jika berwarna biru maka bakteri tersebut adalah Gram Positif.
c. Uji Motilitas
Bakteri dinokulasikan pada medium NA dengan cara stab kemudian dilihat
pertumbuhannya, jika bakteri tersebut bersifat motil maka terdapat pertumbuhan
disekitar strip bakteri yang diinokulasi, sedangkan apabila bakteri tidak bersifat
motil maka tidak telihat pertumbuhan sama sekali di sekitar strib dari inokulasi
bakteri tersebut (Cappucino dan Sherman, 2001).
d. Uji Aktivitas Biokimia Bakteri Limbah Detergen pada Kolam Fakultatif
Pengujian aktivitas biokimia dilakukan terhadap kultur murni bakteri yang
terbagi menjadi 2 tahap yaitu tes primer dan tes sekunder. Tes primer meliputi
reaksi gram, spora, motilitas, uji kebutuhan oksigen, katalase, oksidasi, fermentasi
dan tes glukosa. Sedangkan tes sekunder meliputi tes karbohidrat, urease, indole,
dan reduksi nitrat. Adapun tahap-tahap dari uji biokimia dalam penelitian ini yaitu :
1) Uji Kebutuhan Oksigen (Aerob atau Anaerob)
Bakteri dinokulasikan pada tabung yang berisi medium kaldu nutrisi agar dan
diberi label tabung berisi agar diri NA dengan nama mikroorganisme. Medium NA
dicairkan, kemudian diturnkan suhunya hingga 47 0C dengan tehnik sterilisasi, lalu
dilakukan inokulasi mikroorganisme. Kemudian kultur dikocok dengan hati-hati
menggunakan telapak tangan, jangan sampai terbentuk gelembung udara. Kemudian
40
kultur didinginkan dengan cepat dalam waterbath dengan posisi tegak dan sumbat
kapas ditekan sampai jarak 2 cm dari mulut tabung dan dituangkan sedikit paraffin
cair di atas sumbat kapas. Lalu diinkubasi pada suhu 22-37 0C selama 1x 24 jam dan
diamati distribusi pertumbuhan mikroorganisme dalam kultur apakah di dasar atau
di atas permukaan kultur (Syulasmi et al., 2008).
2) Uji Enzimatis Katalase
Bakteri dinokulasikan pada tabung reaksi yang berisi 7 ml medium NA dan
diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 0C, kemudian ditetesi H2O2 3%, kemudian
diamati perubahan yang terjadi yaitu ada atau tidaknya gelembung udara di atas
permukaan kultur bakteri. Kemampuan menghasilkan katalase dapat dideteksi
dengan ditambahkannya H2O2 di atas agar miring yang telah ditumbuhi
mikroorganisme. Uji positif ditandai dengan oleh terbentuknya gelembunggelembung oksigen yang menunjukkan mikroorganisme tersebut menghasilakn
enzim katalase, begitupun sebaliknya (Syulasmi et al., 2008).
3) Uji Fermentasi Karbohidrat
Bakteri dinokulasikan pada satu tabung reaksi yang berisi medium brom cresol
purple (bcp) laktosa dan tabung Durham, satu tabung reaksi yang berisi medium bcp
sukrosa dan tabung Durham, dan satu tabung reaksi yang berisi medium bcp
dekstrosa dan tabung Durham. Semuanya diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37
0
C, kemudian dilihat perubahan yang terjadi, yaitu ada tidaknya gelembung udara
pada tabung durham (Syulasmi et al., 2008).
41
4) Uji Hidrolisis yaitu Pati, Lipid, Gelatin dan Kasein
a) Hidrolisis Pati
Pati dapat dihidrolisis oleh bakteri tertentu dengan hasil akhir dekstrin. Hidrolisis
ini terjadi karena adanya amilase yang dihasilkan oleh bakteri tertentu yang dapat
digunakan dalam penentuan jenis. Kemampuan bakteri untuk menghidrolisis pati
dapat diuji dengan terbentuknya zona bening di sekitar koloni setelah ditetesi
dengan larutan iodin (Cappucino dan Sherman, 2001).
b) Hidrolisis Lipid
Kemampuan bakteri untuk menghidrolisis lipid dengan bantuan enzim lipase
dapat digunakan medium lipid agar. Bakteri yang mampu menghasilkan lipase akan
memperlihatkan zona lipolisis, ditunjukan dengan adanya daerah terang disekitar
pertumbuhan koloni. Pada medium lipid agar ditambahkan indicator neutral red,
pertumbuhan koloni pemecah lipid pada medium lipid neutral red akan berwarna
merah pada bagian bawahnya. Hal ini disebabkan terbentuknya asam lemak
mengakibatkan pH medium menurun (Cappucino dan Sherman, 2001).
c) Hidrolisis Gelatin
Pada medium nutrient gelatin bakteri diisolasi kemudian diinkubasi selama 24
jam pada suhu 37 0C, kemudian disimpan pada inkubator dengan suhu 4 0C selama
30 menit. Beberapa bakteri mampu menghidrolisis gelatin karena dapat
menghasilkan eksoenzim proteolitik yang disebut gelatinase. Gelatin yang telah
dihirolisis akan tetap cair meskipun disimpan pada suhu 4 0C, begitupun sebaliknya
(Cappucino dan Sherman, 2001).
42
d) Hidrolisis Kasein
Pada medium agar kasein bakteri diinokulasi kemudian diinkubasi selama 24 jam
pada suhu 37 0C. Kemampuan bakteri untuk menghidrolisis dapat dibuktikan
dengan menginokulasi bakteri pada medium susu skim agar. Pertumbuhan koloni
bakteri pemecah protein pada medium susu skim agar akan dikelilingi oleh areal
bening (Cappucino dan Sherman, 2001).
5) Uji Reduksi Nitrat
Bakteri dinokulasikan pada tabung yang telah diberi nama bakteri tersebut.
Setelah itu diinkubasi pada suhu 22-370C selama 24 sampai 1 x 24 jam. Kemudian
medium ditetesi 3-4 tetes larutan nitrat A dan larutan B di atas permukaan kultur,
didiamkan beberapa menit kemudian lihat perubahan yang terjadi. Perubahan warna
medium putih kekuningan menjadi merah cherry menunjukkan reaksi positif uji
reduksi nitrat. Untuk medium yang tidak mengalami perubahan warna, selanjutnya
ditambahkan zinc powder secukupnya dan diamati perubahan yang terjadi. Jika
terjadi perubahan warna medium putih kekuningan menjadi merah cherry, maka
reaksi menunjukkan negatif dan bila tidak menunnjukkan perubahan warna, maka
reaksi menunjukkan positif dalam uji reduksi nitrat (Cappucino dan Sherman,
2001).
6) Reaksi Susu Litmus
Bakteri dinokulasikan pada medium susu litmus yang telah diberi label pada
tabung reaksi, kemudian diinkubasi pada suhu 37oC selama 1x24 jam dan diamati
perubahan yang terjadi. Menurut Syulasmi et al. (2008) reaksi susu litmus meliputi :
43
a) Fermentasi Laktosa
Hasil dari fermentasi laktosa ini akan membentuk asam laktat. Adanya asam
laktat sangat mudah diamati, litmus yang berwarna ungu pada pH netral berubah
menjadi merah muda ketika medium menjadi asam (mendekati pH 4).
b) Produksi Gas
Fermentasi laktosa selain menghasilkan asam laktat juga menghasilkan gas CO2
dan H2. Adanya gas terlihat dari terpisahnya dadih (curd) atau terpecah-pecah.
c) Reduksi Litmus
Fermentasi laktosa merupakan reaksi anaerob, jadi tidak ada oksigen sebagai
akseptor electron. Artinya H2 tidak berikatan dengan O2. Dalam reaksi susu litmus,
litmus sebagai akseptor electron. Dalam kondisi teroksidasi litmus berwarna ungu,
ketika menerima hydrogen dari substrat akan tereduksi dan berubah warna menjadi
putih susu.
d) Pembentukan Curd (Dadih)
Adanya aktifitas biokimia oleh mikroorganisme yang berbeda terhadap susu
litmus dapat menghasilkan dadih yang berbeda. Dadih dapat berupa dadih asam dan
dadih rennet (keju). Dadi asam akan tetap menempel (tidak lepas) bila tabung
dibalikkan, sedangkan dadih rennet (keju) akan terlepas (tumpah) bila tabung
dibalikkan.
44
e) Proteolisis
Reaksi ini dapat dilihat dengan terkumpulnya litmus di permukaan berwarna
ungu tua sedangkan medium akan terlihat sebagai cairan yang kecoklatan dan
translusen karena merupakan larutan asam amino.
f) Reaksi Alkalis
Reaksi ini tidak menunjukkan adanya perubahan medium (medium tetap
berwarna ungu seperti tidak terjadi perubahan apa-apa).
7) Produksi H2S
Bakteri diinokulasikan ke dalam medium SIM agar kemudian diinkubasi pada
suhu 37oC selama 1-2x 24 jam. Hasil positif (terbentuknya H2S) ditandai dengan
perubahan warna medium menjadi hitam.
8) Tes Urease
Bakteri diinokulasikan ke dalam medium Urea kemudian diinkubasi pada suhu
37oC selama 1-2x 24 jam. Reaksi positif ditunjukkan dengan adanya perubahan
warna medium dari kuning menjadi pink yang sangat pekat.
9) Tes Indole, Methyl Red, Voges-Proskauer, Citrate (IMVIC)
Merujuk pada buku Cappucino dan Sherman (2001), berikut ini tahap untuk uji
IMVIC:
a) Indole
Bakteri diinokulasikan ke dalam medium Tryptone agar kemudian diinkubasi
pada suhu 37oC selama 1-2x 24 jam. Hasil positif ditandai dengan adanya lapisan
cincin berwarna ungu pada permukaan kultur setelah ditetsi dengan reagen Kovac’s.
45
b) Methyl Red
Bakteri diinokulasikan ke dalam medium MR-VP broth kemudian diinkubasi
pada suhu 37oC selama 1-2x 24 jam. Hasil positif ditandai dengan perubahan warna
medium menjadi merah setelah ditetesi indikator Methyl red.
c) Voges-Proskauer
Bakteri diinokulasikan ke dalam medium MR-VP broth kemudian diinkubasi
pada suhu 37oC selama 1-2x 24 jam. Kultur kemudian ditetesi dengan Barrit A dan
Barrit B dengan perbandingan 1:1, setelah itu dibirkan selama 15-20 menit. Hasil
positif ditandai dengan perubahan warna medium menjadi merah mawar.
d) Uji Citrate
Bakteri diinokulasi ke medium Simmon Citrate dengan cara distreak. kemudian
diinkubasi pada suhu 37oC selama 1-2x 24 jam. Hasil positif ditandai dengan
adanya perubahan warna medium dari hijau menjadi biru tua.
5. Analisis data
Setelah sampling air limbah selesai dilakukan dan di hasilkan kultur bakteri
biakan murni pada medium agar miring, maka kultur bakteri dari air limbah
detergen akan diidentifikasi melalui reaksi pewarnaan gram dan uji biokimia agar
diketahui karakteristik bakteri pendegradasi detergen pada kolam fakultatif sebagai
tahap identifikasi yang diharapkan. Kemudian hasil identifikasi bakteri akan di
cocokkan dengan Bergey’s Manual Determinative Bacteriology Ninth Edition.
46
Alur Penelitian
Prosedur Penelitian
Sterilisasi alat dan medium
Tahap Persiapan
Pembuatan medium
dan reagent
Uji Pendahuluan
Sampling air limbah dan inokulasi ke
medium selektif
Dikultivasi pada suhu 30 OC selama 24 – 48 jam
Identifikasi atau Karakterisasi Bakteri
Pengramatan Morfologi Koloni
Perwarnaan Gram Bakteri dan Uji Aktifitas Biokimia Bakteri
Analisa data
Laporan penelitian (Skripsi)
Grambar 3. 3. Diagram Alir Penelitian
Download