Isolasi, Penapisan, Respon Tumbuh Dan Proses
advertisement
ISOLASI, PENAPISAN, RESPON TUMBUH DAN PROSES KOLONISASI CENDAWAN MUTUALISTIK AKAR RIDA OKTORIDA KHASTINI SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2007 @ Hak Cipta milik IPB Tahun 2007 Hak cipta dilindungi Undang-Undang 1. Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumber a. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik atau tinjauan masalah b. Pengutipan tidak merugikan kepentingan yang wajar IPB 2. Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis dalam bentuk apapun tanpa izin IPB 2 SURAT PERNYATAAN Saya yang bertanda tangan di bawah ini : Nama : Rida Oktorida Khastini NIM : G351040151 Program Studi : Biologi (BIO) dengan ini menyatakan bahwa tesis dengan judul ”Isolasi, Penapisan, Respon Tumbuh dan Proses Kolonisasi Cendawan Mutualistik Akar” adalah benarbenar merupakan hasil penelitian yang saya lakukan di bawah bimbingan Komisi Pembimbing saya, dan belum pernah diteliti oleh peneliti lain. Penelitian tersebut dilakukan di Laboratorium Pusat Penelitian Sumber Daya Hayati dan Bioteknologi (PPSHB), IPB dan di Laboratorium Bagian Mikologi, IPB dan Rumah Kaca Pusat Penelitian Kehutanan sejak Februari 2006 sampai dengan Agustus 2007. Bogor, Oktober 2007 Rida Oktorida Khastini 3 ISOLASI, PENAPISAN, RESPON TUMBUH DAN PROSES KOLONISASI CENDAWAN MUTUALISTIK AKAR RIDA OKTORIDA KHASTINI Tesis sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains pada Depertemen Biologi SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2007 4 Judul Tesis : Isolasi, Penapisan, Respon Tumbuh dan Proses Kolonisasi Cendawan Mutualistik Akar Nama : Rida Oktorida Khastini NIM : G351040151 Disetujui Komisi Pembimbing Dr. Ir. Nampiah Sukarno Ketua Dr. Ir. Utut Widyastuti Suharsono M.S Prof. Dr. Yasuyuki Hashidoko Anggota Anggota Diketahui Ketua Program Studi Biologi Dekan Sekolah Pascasarjana Dr. Ir. Dedy Duryadi S., DEA Prof. Dr. Ir. Khairil A. Notodiputro MS Tanggal Lulus : Tanggal Ujian: 5 Oktober 2007 5 Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis: Dr. Ir. Aris Tjahjoleksono 6 PRAKATA Alhamdulillah, segala puji bagi Allah SWT, yang senantiasa melimpahkan segala karunia-Nya, sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tesis yang berjudul Isolasi, Penapisan, Respon Tumbuh dan Proses Kolonisasi Cendawan Mutualistik Akar merupakan hasil penelitian yang dilakukan di Laboratorium Pusat Penelitian Sumber Daya Hayati dan Bioteknologi (PPSHB), IPB dan di Laboratorium Bagian Mikologi, Departemen Biologi, FMIPA, IPB dan Rumah Kaca Pusat Penelitian Kehutanan sejak Februari 2006 sampai dengan Agustus 2007. Terima kasih penulis ucapkan kepada berbagai pihak yang telah membantu penyelesaian karya ilmiah ini, antara lain Dr. Nampiah Sukarno, Dr. Utut Widyastuti Suharsono, dan Prof. Dr. Yasuyuki Hashidoko selaku komisi pembimbing serta Dr. Ir. Aris Tjahjoleksono selaku penguji yang telah memberikan bimbingan, saran, dan perhatian, yang sangat berarti selama penelitian hingga tersusunnya tesis ini. Tak lupa penulis ucapkan terima kasih kepada Dr. Ane Sesma dan Dr. Anne Osbourne dari John Innes Center, Inggris atas plasmid pCambGFP yang diberikan, serta SEAMEO BIOTROP atas sebagian dana penelitian. Penghargaan juga diberikan pada Staf Pusat Penelitian Sumbar Daya Hayati dan Bioteknologi (PPSHB), IPB dan di Laboratorium Bagian Mikologi, IPB dan Rumah Kaca Pusat Penelitian Kehutanan yang telah banyak membantu dalam melaksanakan penelitian dan penyusunan tesis. Ungkapan terimakasih juga disampaikan kepada Mama, Bapa, Iyu dan Ubhie yang senantiasa memberikan dukungan, kasih sayang dan doa yang tak ternilai. Kepada Ibu Dra. Sri Listyowati M.Si, Ibu Rita Tri Puspitasari M.Si, dan Ibu Dr. Happy Widyastuti, Mba Pepi, Pa Mulya, Pa Edi, Mba Retno, Kanthie, Awie, Riza, Venti dan teman-teman yang tidak dapat penulis sebutkan satu persatu, penulis ucapkan terimakasih atas kebersamaan dan bantuannya. Semoga tesis ini bermanfaat. Bogor, Oktober 2007 Rida Oktorida Khastini 7 RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Majalengka pada tanggal 28 Oktober 1981 dari ayah Khasmuin dan ibu Tatin Sustiatin, S. Pd. Penulis merupakan putri pertama dari dua bersaudara. Pada tahun 1999 penulis lulus dari SMU Negeri 1 Cilegon dan pada tahun yang sama lulus seleksi masuk IPB melalui Undangan Seleksi Masuk IPB untuk program sarjana. Penulis memasuki Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam pada tahun yang sama. Setelah lulus sarjana pada tahun 2004, penulis langsung melanjutkan pendidikan ke Sekolah pascasarjana IPB, pada Program Studi Biologi. Semasa perkuliahan di tingkat sarjana, Penulis pernah aktif di organisasi kemahasiswaan sebagai anggota Himpunan Mahasiswa Biologi 2000/2001, anggota Organisasi Kewirausahaan Mahasiswa Biologi (BIOWORLD) 2001/2002. Pada tahun ajaran 2001/2002 sampai dengan tahun ajaran 2002/2003, penulis menjadi asisten mata kuliah Biologi pada Tingkat Persiapan Bersama dan Taksonomi Tumbuhan Berpembuluh. Pada tahun ajaran 2002/2003 penulis juga menjadi asisten mata kuliah Biologi, Biologi Cendawan Simbion dan Mikologi Dasar. Semasa perkuliahan di tingkat pasca sarjana, penulis juga aktif sebagai asisten mata kuliah Biologi Cendawan Simbion dan Mikologi Dasar dan mengikuti berbagai seminar dan training di bidang Biologi, Mikologi dan Molekuler di luar lingkungan IPB. 8 ABSTRAK RIDA OKTORIDA KHASTINI. Isolasi, Penapisan, Respon Tumbuh dan Proses Kolonisasi Cendawan Mutualistik Akar. Dibimbing oleh Nampiah Sukarno, Utut Widyastuti, dan Yasuyuki Hashidoko. Tujuan penelitian ini ialah untuk mengisolasi, menapis dan menganalisis cendawan mutualistik akar potensial untuk pengembangan pupuk hayati. Analsis proses kolonisasi cendawan pada akar tanaman inang juga dilakukan dengan menggunakan metode pewarnaan biru tripan dan gen penanda GFP. Sebanyak 22 isolat cendawan berhasil diisolasi dari rizoplan kebun karet dari Jasinga serta rizosfer dan rizoplan tanaman gambut dari Kalimantan Tengah. Hasil penapisan terhadap sifat simbiosis menunjukkan bahwa ke-22 isolat tersebut terdiri dari 12 isolat cendawan simbiosis mutualistik akar non mikoriza, 3 isolat cendawan simbiosis mutualistik akar mikoriza, dan 7 isolat cendawan simbiosis parasitik akar. Cendawan Aspergillus niger dan Glomus sp. yang diisolasi dari rizoplan tanaman karet menghasilkan pertumbuhan tanaman inang terbaik. Oleh karena itu kedua isolat tersebut dipilih sebagai isolat simbiosis mutualisme terbaik dan digunakan untuk uji lebih lanjut. Isolat cendawan mutualistik akar terpilih diuji respon tumbuh dan kolonisasinya pada berbagai tanaman inang yaitu Oryza sativa, Zea mays, Pharaserianthes falcataria, Acasia sp., Theobroma cacao, Phaleria macrocarpa dan Brassica sp. Hasil pengujian menunjukkan bahwa inokulasi tunggal cendawan A. niger dan Glomus sp. meningkatkan pertumbuhan seluruh tanaman yang diuji jika dibandingkan dengan kontrol. Tanaman yang diinokulasi A. niger meningkatkan pertumbuhan 3 kali lebih tinggi sedangkan inokulasi Glomus sp. meningkatkan pertumbuhan tanaman 2 kali lebih tinggi dibandingkan kontrol. Kolonisasi cendawan A. niger pada tanaman uji berkisar antara 53-75% sedangkan Glomus sp. berkisar antara 25-70%. Pengaruh berbagai taraf P terhadap peranan A. niger dalam meningkatkan pertumbuhan tanaman diuji menggunakan 8 jenis tanaman tersebut diatas. Pupuk yang digunakan ialah pupuk Johnson dengan konsentrasi P sebesar 25%, 50%, dan 100% pada medium zeolit. Uji lanjut dari kedua cendawan dilakukan dengan inokulasi ganda pada tanaman Centrosema pubescens. Hasil analisis menunjukkan bahwa inokulasi A. niger pada berbagai taraf P meningkatkan respon tumbuh seluruh tanaman secara signifikan dengan respon tertinggi diperoleh pada perlakuan P sebesar 50%. Respon tumbuh tanaman pada perlakuan P sebesar 100% masih menunjukkan respon yang lebih tinggi dibandingkan dengan perlakuan kontrol namun lebih rendah dibandingkan dengan perlakuan P 50%. Introduksi gen GFP pada genom A. niger telah berhasil dilakukan. Berdasarkan analisis PCR dan mikroskop fluoresen dengan filter 512 nm, gen GFP telah terintegrasi pada genom cendawan, bersifat stabil dan terekspresi secara konstitutif pada 3 generasi kultur yang diuji. Analisis proses kolonisasi A. niger yang diamati dengan menggunakan metode pewarnaan dan gen penanda GFP menunjukkan bahwa proses kolonisasi dimulai dengan proses penetrasi hifa ke dalam jaringan epidermis akar, kemudian terbentuk apresorium yang dilanjutkan dengan pembentukan hifa interseluler pada epidermis dan korteks akar serta pembentukkan struktur pembengkakan hifa pada korteks akar. Pada kolonisasi A. niger tidak ditemukan struktur arbuskula seperti pada kolonisasi cendawan mikoriza. Pengamatan analisis kolonisasi menggunakan 9 mikroskop fluoresen dengan filter 512 nm menghasilkan auto fluoresen pada beberapa jaringan akar namun struktur kolonisasi cendawan A. niger-GFP pada akar tanaman masih dapat teramati dan dapat dibedakan dari jaringan akar. Kata kunci: cendawan mutualistik akar, cendawan mutualistik non mikoriza, cendawan mikoriza arbuskula, A. niger, Glomus sp., gen GFP 10 ABSTRACT RIDA OKTORIDA KHASTINI. Isolation, Screening, Growth Responses and Colonization Process of Root Mutualistic Fungi. Supervised by Nampiah Sukarno, Utut Widyastuti and Yasuyuki Hashidoko. The aim of this study was to isolate, screen and analyze the potential root mutualistic fungi for developing a good quality of biofertilizer. The fungal colonization process in the root of host plant was also studied using trypan blue staining and GFP marker gene. Twenty two isolates were successfully isolated from root system of rubber tree grown in Jasinga rubber plantation and vegetation grown in Center Kalimantan peat soil. Those isolates were screened based on growth responses and root colonization to determine the fungal symbiotic ability. The results showed that twelve isolates were mutualistic symbionts but nonmycorrhiza (non-mycorrhizal mutualistic symbionts), three isolates were mycorrhizal fungi, and seven isolates were parasitic fungi. Among twelve isolates of non-mycorrhizal mutualistic fungi, Aspergillus niger that isolated from rubber plantation was the best isolate to improve plant growth. Similarly, Glomus sp. isolated from the same location showed the best growth responses among the three mycorrhizal fungal isolates. The two fungi, therefore, were selected, compared and analyzed further using Oryza sativa, Zea mays, Pharaserianthes falcataria, Acasia sp., Theobroma cacao, Phaleria macrocarpa and Brassica sp. to determine the growth response of the host plant and fungal colonization. The results showed that A. niger colonized root of host plant ranging from 53% to 75%, while Glomus sp. was ranging from 25% to 70% and there was no colonization observed of non-inoculated control plant. A. niger produced a better plant growth responses 2 and 3 times higher than that of Glomus sp. and control treatments, respectively, for all plants tested. The plant growth response of Glomus sp. inoculation was increased 2 times higher than the control treatment. The double inoculation effect of A. niger and Glomus sp. on plant growth responses was studied using Centrosema pubescens. The result showed that the combination treatment of A. niger and Glomus sp. increased plant growth of Centrosema pubescens. The increase was higher than that of Glomus sp. and control treatments, but lower than that of A. niger treatment alone. Further analyzes of A. niger on three different P levels of Johnson fertilizer solution (25%, 50%, and 100%) using eight different host plants on zeolite medium indicated that the A. niger significantly increased the growth of all plants at all levels of P tested with the best response was observed at 50% additional P treatment. The inoculation of A. niger could save the P fertilizer application since the addition of P 25% already produced better growth response compared to that of P 100% without A. niger inoculation. Integration of GFP gene into A. niger genome was carried out for developing a marker gene to observe the colonization process of the fungus in the life symbiotic system. Based on PCR and fluorescence microscope observation using 512 nm filter, indicated that the GFP gene was successfully integrated into fungal genome, expressed constitutively and was stable at least until three subculture generations tested. Based on trypan blue staining analysis, it showed that colonization process of A. niger was started from 11 development of penetration structure, followed by development of apresorium in root epidermis, and intercellular mycelium and chlamydospore like structure in the root cortex. Similar colonization process was also observed using GFP marker gene. The root plant also produce auto fluorescence under 515 nm wavelength filter that made the complication in the observation of fungal colonization process using GFP gene, but the fungal structure within the root was still able to be discriminated from that of root cells. Key word: root mutualistic fungi, non mycorrhizal mutualistic fungi, arbuscular mycorrhizal fungi, Aspergillus niger, Glomus sp., GFP gene 12 DAFTAR ISI Halaman DAFTAR TABEL ....................................................................................... xi DAFTAR GAMBAR ................................................................................... xii DAFTAR LAMPIRAN................................................................................. xiii PENDAHULUAN ....................................................................................... Latar Belakang ............................................................................................. Tujuan Penelitian ......................................................................................... Hipotesis ....................................................................................................... 1 1 3 3 TINJAUAN PUSTAKA .............................................................................. A. Cendawan Mutualistik Akar ............................................................... A.1 Cendawan Mikoriza Arbuskula (CMA) ........................................ A.2 Cendawan mutualistik akar non mikoriza...................................... B. Analisis proses kolonisasi dan peningkatan pertumbuhan oleh endofit akar ....................................................................................... B.1 Pewarnaan cendawan pada akar.................................................... B.2 Gen Penanda Khusus ................................................................... 4 4 4 6 BAHAN DAN METODE ........................................................................... Waktu dan Tempat Penelitian ..................................................................... Bahan ........................................................................................................... Metode Penelitian ......................................................................................... A. Isolasi dan penapisan cendawan mutualistik akar................................ A.1. Cendawan mutualistik akar non mikoriza .................................. A.2. Cendawan mikoriza arbuskula (CMA) ....................................... B. Analisis respon tumbuh tanaman inang yang diinokulasi cendawan mutualistik akar ................................................................................... C. Analisis proses kolonisasi cendawan mutualistik akar non mikoriza .. C.1. Metode pewarnaan biru tripan .................................................... C.2. Penggunaan gen penanda GFP (Green Fluorescent Protein) .... C.2.1 Produksi Speroplas Cendawan (Hasiba 1992)................... C.2.2 Introduksi Gen Fluoresen Hijau (GFP) pada cendawan mutualistik akar Aspergilus niger...................................... C.2.2.1 Isolasi plasmid pCamb-GFP................................. C.2.2.2 Introduksi gen GFP .............................................. C.2.3 Uji integrasi dan stabilitas gen GFP di dalam genom cendawan ......................................................................... C.2.3.1 Isolasi DNA Genom Cendawan ........................... C.2.3.2 Amplifikasi DNA Cendawan Aspergillus-GFP ... 10 10 10 10 12 12 13 13 15 15 15 16 HASIL DAN PEMBAHASAN..................................................................... 21 7 7 8 16 16 18 18 19 20 13 Hasil Pengamatan ......................................................................................... A. Isolasi dan penapisan cendawan mutualistik akar................................ B. Analisis respon tumbuh tanaman inang yang diinokulasi cendawan mutualistik akar ................................................................................... B.1 Pengaruh isolat terpilih cendawan mutualistik akar terhadap pertumbuhan berbagai tanaman inang........................................... B.1.1 Uji spesifisititas respon tumbuh dan kolonisasi ................ B.1.2 Pengaruh inokulasi ganda A. niger 1 dan Glomus sp.1 ..... B.2 Pengaruh cendawan mutualistik akar non mikoriza terhadap penyerapan fosfat (P) tanaman inang ........................................... C. Analisis proses kolonisasi cendawan mutualistik akar non mikoriza... C.1 Metode pewarnaan biru tripan ...................................................... C.2. Penggunaan gen penanda GFP (Green Fluorescent Protein)...... Pembahasan................................................................................................... A. Isolasi dan penapisan cendawan mutualistik akar................................ B. Analisis respon tumbuh tanaman inang yang diinokulasi cendawan mutualistik akar ................................................................................... C. Analisis proses kolonisasi cendawan mutualistik akar......................... C.1 Metode pewarnaan biru tripan...................................................... C.2. Penggunaan gen penanda GFP (Green Fluorescent Protein)..... 21 21 23 23 23 25 26 27 27 28 33 33 36 38 38 39 SIMPULAN DAN SARAN .......................................................................... 42 DAFTAR PUSTAKA .................................................................................. 42 LAMPIRAN.................................................................................................. 43 14 DAFTAR TABEL Halaman 1 Cendawan yang berhasil diisolasi dari rizosfir dan rizoplan tanaman karet dan tumbuhan pada tanah gambut. ........................................... 21 2 Penapisan isolat-isolat cendawan pada tanaman Centrosema pubescens ........................................................................................... 22 3 Respon tumbuh berbagai tanaman inang yang diinokulasi cendawan mutualistik akar pada P 50%.............................................................. 23 3 Pengaruh perlakuan P terhadap pertumbuhan berbagai tanaman inang yang diinokulasi A. niger 1 ....................................................... 26 DAFTAR GAMBAR Halaman 1 Struktur taksonomi secara umum pada CMA dan kaitannya dengan cendawan lain berdasarkan urutan gen SSU rRNA (Walker & Schüßler 2004) ................................................................................... 4 2 Bagan alur penelitian ......................................................................... 11 3 Peta plasmid pCamb-GFP (Sesma & Osbourne 2004) ..................... 16 4 Gambar 4 Parameter respon tumbuh berbagai tanaman inang yang diinokulasi cendawan mutualistik akar pada P 50% ....... 24 5 Struktur kolonisasi Glomus sp. 1 pada akar Brassica sp. pada perbesaran 10 x. a. apresorium, b. hifa internal ................................. 27 6 Pengaruh inokulasi ganda cendawan mutualistik akar mikoriza dan non mikoriza pada Centrosema pubescen umur 3 bulan pada taraf P 50%. .................................. ............................................................... 27 7 Struktur kolonisasi fungi A. niger 1 di dalam akar pada umur 6 minggu setelah inokulasi pebesaran 10x. a. apresorium, b. hifa internal, c. Struktur yang menyerupai klamidospora......................... 28 8 Jumlah speroplas yang dihasilkan dari miselia dan spora A. niger.... 29 15 9 Speroplas segar cendawan A. niger setelah pemurnian dengan sistem dua fase sukrosa dan manitol. a. perbesaran 10x, b. perbesaran 40x ................................................................................ 29 10 Persentase perkecambahan protoplas ................................................ 30 11 Gen GFP diekspresikan secara konstitutif di seluruh struktur cendawan pada perbesaran 40x. a. struktur aseksual (kepala konidia), b. miselium.......................................................................... 31 12 Miselium cendawan transgenik pada berbagai subkultur (generasi). (a) generasi T0, (b) generasi T1, dan (c) generasi T2. ....................... 31 13 Hasil amplifikasi gen ........................................................................ 32 14 Struktur kolonisasi A. niger transgenik di dalam akar. a. hifa interseluler, b. Struktur klamidospora................................................ 33 DAFTAR LAMPIRAN 1 Tabel komposisi larutan baku hara Johnson....................................... 51 16
