Produksi Protein Heterolog Dalam Sel Eukariot

PRODUKSI PROTEIN HETEROLOG DALAM
SEL EUKARIOT
OLEH
SHABARNI GAFFAR, M.Si.
NIP: 132 313 560
JURUSAN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS PADJADJARAN
2007
PRODUKSI PROTEIN HETEROLOG DALAM
SEL EUKARIOT
OLEH
SHABARNI GAFFAR, M.Si.
NIP: 132 313 560
Bandung, September 2007
Mengatahui : Ketua Jurusan Kimia, FMIPA
Universitas Padjadjaran
Dr. Unang Supratman
NIP. 131929830
DAFTAR ISI
1. Pendahuluan...............................................................................................
1
2.
Sistem Ekspresi Saccaromyces cerevisiae...................................................
3
2.1. Vektor untuk S. Cerevisiae..................................................................
5
2.2. Produksi protein heterolog intraselular dalam S. cerevisiae.........
8
2.3. Sekresi protein heterolog oleh S. cerevisiae.....................................
10
Sistem ekspresi Pichia pastoris..................................................................
11
3.1. Vektor ekspresi untuk P. Pastoris.....................................................
14
3.2. Integrasi multicopy............................................................................
16
4.
Sistem ekspresi ragi yang lain.................................................................
16
5.
Sistem ekspresi Baculovirus untuk sel serangga..................................
17
5.1. Vektor sistem ekspresi Baculovirus.................................................
19
5.2. Peningkatan hasil rekombinan baculovirus...................................
20
5.3. Konstruksi suttle vektor Baculovirus E.coli-sel serangga.............
20
5.4. Glikosilasi dan pemrosesan protein mamalia di sel serangga.....
21
Sistem ekspresi untuk sel mamalia.........................................................
22
6.1. Sistem marker penyeleksi untuk vektor ekspresi mamalia..........
26
Daftar Pustaka............................................................................................
28
3.
6.
3
DAFTAR GAMBAR
Gambar 1. Beberapa contoh O-link dan N-link oligosakarida pada
2
ragi (A), serangga (B) dan mamalia (C)................................
Gambar 2. Skema yang menggambarkan integrasi DNA dengan
vektor YIp..................................................................................
7
Gambar 3. Vektor ekspresi S. cerevisiae. cDNA untuk gen Cu/ZnSOD manusia di kloning diantara promotor dan
terminator gen gliseraldehid fosfat dehidrogenase
(GAPDp) ragi............................................................................
10
Gambar 4. Vektor integrasi untuk P. pastoris...........................................
13
Gambar 5. Peta vektor pPICZ/pPICZα...................................................
14
Gambar 6. Peta vektor pGAPZ/pGAPZα...............................................
15
Gambar 7. Autographa californica multiple nuclear polyhidrosis
virus............................................................................................
18
Gambar 8. Organisasi vektor transfer Baculovirus (AcMVPV)............
19
Gambar 9. Konstruksi bacmid rekombinan.............................................
21
Gambar 10. Peta vektor ekspresi untuk sel mamalia...............................
23
Gambar 11. Vektor ekspresi bicistronik.....................................................
4
DAFTAR TABEL
Tabel 1. Protein rekombinan yang diproduksi oleh sistem ekspresi S.
cerevisiae............................................................................................
4
Tabel 2. Protein rekombinan yang diproduksi oleh sistem ekspresi P.
Pastoris..............................................................................................
16
5
Produksi Protein Heterolog Dalam Sel Eukariot
1. Pendahuluan
Sistem ekspresi prokariot biasanya digunakan untuk memproduksi
protein heterolog (rekombinan) dari cDNA eukariot yang dikloning. Akan
tetapi, pada beberapa penelitian, protein yang disintesis oleh bakteri tersebut
tidak stabil atau tidak punya aktifitas biologi. Selain itu, meskipun kita
menggunakan prosedur pemurnian protein yang sangat hati-hati, senyawa
yang bersifat toksin pada bakteri dan senyawa yang menyebabkan kenaikan
temperatur tubuh manusia dan binatang (pyrogen) mungkin dapat
mengkontaminasi produk.
Untuk mengatasi masalah ini beberapa peneliti telah mengembangkan
sistem ekspresi protein eukariot, yaitu ragi, serangga atau sel mamalia untuk
memproduksi protein-protein terapetik yang tidak terkontaminasi, sehingga
dapat digunakan oleh manusia atau binatang dengan jumlah yang banyak
dan stabil; aktif secara biologi untuk studi biokimia, biofisik, dan struktur;
dan protein yang digunakan untuk proses industri. Selanjutnya, protein
manusia yang ditujukan untuk penggunaan medis harus identik sifatnya
dengan protein natif.
Ketidakmampuan prokariot untuk memproduksi versi autentik dari
protein eukariot, pada umumnya disebabkan oleh pelipatan protein yang
tidak tepat dan tidak adanya mekanisme modifikasi pasca translasi. Pada
eukariot
terdapat
enzim
Protein
Disulfida
Isomerase
(PDI)
yang
mengkatalisis pembentukan ikatan disulfida pada protein. Pembentukan
ikatan disulfida yang menyimpang akan merubah konfigurasi protein,
sehingga menyebabkan protein tidak stabil dan kehilangan aktifitas.
Terdapat beberapa tipe modifikasi pasca translasi. Beberapa urutan
asam amino pada N-terminal biasanya dibuang melalui pemotongan
proteolisis protein precursor untuk menghasilkan protein fungsional.
Penambahan gula spesifik (glikosilasi) terhadap asam amino tertentu
6
merupakan modifikasi utama yang memberikan stabilitas dan sifat
pengikatan yang khusus terhadap protein. Glikosilasi yang umum terjadi
adalah pengikatan gula spesifik ke gugus hidroksil dari asam amino serin
atau asparagin (O-linked glicosylation), dan gugus amida dari asparagin (Nlinked glycosylation) (gambar 1). Sekitar 30% protein mamalia mengalami
glikosilasi.
Gambar 1. Beberapa contoh O-link dan N-link oligosakarida pada ragi (A),
serangga (B) dan mamalia (C). T adalah threonin, S adalah serin, N adalah
asparagin dan X asam sembarang asam amino. Monosakarida/oligosakarida
yang berbeda.dilambangkan oleh bentuk yang berbeda.
Kenyataanya tidak ada sel inang eukariot yang efektif secara
universal, dimana proses modifikasi terjadi dengan benar untuk setiap
protein. Dalam beberapa kasus, sel inang mungkin menambahkan gula yang
tidak lazim ke asam amino yang tidak tepat sehingga menghasilkan protein
antigen atau mungkin protein yang mempunyai fungsi yang tidak tepat.
Walaupun beberapa protein rekombinan, mungkin memiliki sifat-sifat yang
tidak cocok untuk agen terapeutik, tapi masih bisa dimanfaatkan untuk
7
penelitian atau proses industri. Sistem ekspresi eukariot yang berbeda harus
dicoba untuk menentukan sistem mana yang dapat mensintesis protein
rekombinan yang fungsional dan dalam jumlah besar. Pemilihan vektor
ekspresi
tergantung
pada
kualitas
protein
rekombinan
yang
akan
diproduksi, penggunaannya, dan biaya produksi dan purifikasi juga penting
untuk dipertimbangkan.
Pada prinsipnya vektor ekspresi eukariot tidak berbeda dengan
vektor ekspresi prokariot. Vektor ekspresi eukariot memiliki promotor
eukariot yang menjalankan transkripsi gen yang dikloning, signal terminasi
transkripsi dan translasi, urutan yang dapat menyebabkan mRNA
mengalami poliadenilasi, dan gen penanda untuk menyeleksi klon yang
positif. Karena
dilakukan
prosedur DNA rekombinan secara teknik sulit untuk
menggunakan
sel
eukariot,
kebanyakan
vektor
eukariot
merupakan suttle vector dengan dua origin of replication (ORI) dan gen
penanda seleksi. Salah satunya berfungsi di E. Coli dan yang lain berfungsi di
sel inang eukariot. Jika vektor ekspresi eukariot akan digunakan sebagai
plasmid, maka vektor itu harus mempunyai ORI eukariot. Alternatif lain,
jika vektor itu didisain untuk integrasi ke kromosom, maka harus
mempunyai urutan yang komplemen dengan urutan pada inang untuk
memfalisitasi insersi ke kromosom.
2. Sistem Ekspresi Saccaromyces cerevisiae.
Saccaromyces cerevisiae telah digunakan sebagai inang untuk ekspresi gen
eukariot dengan alasan-alasan sebagai berikut:
1. Ber-sel tunggal dan sudah dipelajari secara genetik maupun fisiologi.
2. Beberapa promotor gen yang kuat telah diisolasi dari ragi ini dan
dikarakterisasi. S. cerevisiae secara alami mengandung plasmid yang
disebut plasmid 2µm dan dapat digunakan sebagai vektor ekspresi.
3. S. cerevisiae mempunyai mekanisme modifikasi pasca translasi.
8
4. Ragi ini biasanya mensekresikan beberapa protein. Jadi apabila
protein heterolog direkayasa untuk dibebaskan secara ekstraselular,
maka produk dapat segera di purifikasi.
5. Karena sudah bertahun-tahun digunakan pada industri makanan, S.
cerevisiae sudah didaftarkan oleh U.S Food and Drug Administration
sebagai organisme “generally recognize as safe” (GRAS).
Oleh karena itu penggunakan organisme ini untuk produksi agen
terapetik manusia (drug or pharmaceuticals) tidak membutuhkan penelitian
secara ekstensif seperti yang diwajibkan untuk inang yang belum terjamin
keamanannya. Dewasa ini terdapat sejumlah protein yang telah diproduksi
di S. cerevisiae, dan digunakan secara komersial sebagai vaksin, agen
terapeutik, dan untuk diagnosa (table 1). Sebagai contoh lebih dari 50%
suplai insulin dunia diproduksi oleh S. cerevisiae.
Tabel 1
Protein rekombinan yang diproduksi oleh sistem ekspresi S. cerevisiae.
Protein rekombinan
Antigen permukaan virus hepatitis B
Protein circumsporozoide malaria
Envelope protein HIV-1
Protein virus hepatitis C
Antigen HIV-1
Faktor pertumbuhan epidermal
Insulin
insulin-like growth factor
Platelet-derived growth factor
Proinsulin
Fibroblast growt factor
Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor
α1 antitripsin
faktor koagulasi darah XIIIa
hirudin
human growth factor
human serum albumin
Kegunaan
Vaksin
diagnostik
Agen terapetik untuk
manusia
9
2.1. Vektor untuk S. cerevisiae
Terdapat tiga kelas utama vektor ekspresi untuk S. cerevisiae: episom
atau plasmid, yaitu vektor Yeast Episomal plasmid [YEps], vektor integrasi
(Yeast Integrating plasmid [Yips] dan Yeast Artificial kromosom [YACs].
Vektor-vektor ini telah digunakan secara ekstensif untuk memproduksi
protein heterolog intra atau ekstraselular.
Vektor YEp direkayasa dari plasmid 2µm dengan jumlah copy tinggi. Seleksi
berdasarkan pada mutan strain inang yang membutuhkan asam amino
tertentu (histidin, triptofan atau leusin) atau nukleotida urasil untuk
pertumbuhan. Strain ini disebut bersifat auxotrof karena
medium
pertumbuhan harus diberi suplemen dengan nutrient spesifik. Dalam
prakteknya vektor ini dilengkapi dengan versi gen wild type yang menjadi
komplemen dari gen yang dimutasi di sel inang. Sebagai contoh, bila
plasmid YEp dengan gen LEU2 wild type, ditransformasi ke sel inang mutan
leu2 dan kemudian ditumbuhkan pada media yang tidak ada penambahan
leusin, maka hanya sel yang membawa plasmid yang akan tumbuh.
Sejumlah promotor dari gen S. cerevisiae
sudah diambil untuk
efisiensi rekayasa transkripsi gen heterolog dalam vektor ragi. Pada
umumnya vektor-vektor ini dapat diregulasi dengan ketat. Promotor yang
dapat diinduksi lebih disukai untuk produksi sejumlah besar protein
rekombinan selama pertumbuhan skala besar. Dalam kasus ini promotor
yang diregulasi oleh galaktosa, merespon sangat cepat penambahan
galaktosa, yang menaikkan efisiensi transkripsi sampai 1000x. Promotor
yang
dapat
direpresi,
konstitutif
dan
promotor
hibrida
yang
menggabungkan sifat promotor yang berbeda juga tersedia. Tingkat ekspresi
maksimal tergantung pada efisiensi terminasi transkripsi. Pada umumnya
untuk vektor YEp urutan terminator dan promotor diambil dari gen yang
sama.
Urutan pengode gen heterolog pada umumnya dilengkapi segmen
asam amino (urutan pengenal, peptida pengenal, dan urutan pemula) yang
10
memfasilitasi perjalanan protein rekombinan melewati membran sel dan
pelepasan protein ke luar sel. Alasan utama modifikasi ini adalah lebih
mudahnya memurnikan protein yang disekresikan dibandingkan protein
yang terdapat dalam lisat sel. Urutan pengenal yang umum untuk S.
cerevisiae diambil dari gen α mating factor. Urutan pengenal sintetik juga
sudah dirancang untuk menaikkan jumlah sekresi protein. Urutan lain yang
menstabilkan protein rekombinan, mencegah degradasi
proteolisis, dan
menyediakan urutan asam amino spesifik (affinity tag) yang digunakan
untuk purifikasi secara selektif, dapat digabungkan ke urutan pengode gen
heterolog. Asam amino tambahan ini dilengkapi oleh sisi pemotongan
protease
sehingga
bisa
dipotong
dari
protein
rekombinan
setelah
dimurnikan.
Sistem ekspresi ragi yang menggunakan plasmid kadang-kadang
tidak stabil pada kondisi pertumbuhan skala besar (≥ 10 L) walaupun diberi
tekanan. Untuk mengatasi masalah ini, peneliti telah menguji apakah
integrasi gen heterolog dapat menyediakan sistem produksi yang dapat
diandalkan. Pendekatan yang berbeda telah dilakukan untuk ko-integrasi
klon dan gen penanda seleksi ke kromosom S. cerevisiae . Lebih jelasnya gen
penanda seleksi fungsional dan gen heterolog ditambahkan dengan urutan
pengontrol transkripsi dan translasi yang spesifik untuk ragi, di insersikan
antara dua segmen DNA yang berasal dari ujung gen non esensial pada ragi.
Pada contoh ini, plasmid tidak selalu membawa ORI yang berfungsi pada sel
ragi. Plasmid dipotong pada ujung dari dua segmen ragi. Setelah
transformasi, melalui peristiwa rekombinasi ganda terjadi insersi DNA
dengan dua gen ke sisi kromosom spesifik (gambar 2). DNA plasmid
dilinearisasi karena DNA dalam bentuk ini lebih disukai dibanding DNA
sirkular untuk berekombinasi dengan DNA kromosom. DNA yang tidak
terintegrasi hilang selama pembelahan sel. Kekurangan utama strategi ini
adalah rendahnya hasil protein rekombinan dari satu copy gen.
11
Gambar 2. Skema yang menggambarkan integrasi DNA dengan vektor YIp.
Gen marker seleksi (LEU2) dan gen yang diinsersi (GOI) diinsersikan ke
vektor diantara dua segmen yang merupakan ujung gen nonesensial ragi (A1
dan A2). Urutan ini mengalami rekombinasi dengan kromosom sehingga
GOI dan LEU2 terintegrasi ke kromosom.
Beberapa pendekatan sedang dilakukan untuk menaikkan jumlah gen
heterolog yang terintegrasi melalui penentuan urutan DNA yang berulang.
Kira-kira terdapat 200 copy urutan DNA untuk RNA ribosom (rRNA) dan
sekitar 400 copy urutan δ pada genom S. cerevisiae. Urutan δ merupakan
bagian dari DNA yang non esensial, yang diambil dari retrotransposon.
Retrotransposon merupakan urutan DNA kromosom yang ditranskripsi.
Molekul RNA ini berperan sebagai templat untuk reverse transcriptase, dan
urutan DNA yang disalinnya mengalami integrasi ke kromosom pada sisi
yang berbeda. Pada studi awal, 10 copy gen yang diinsersikan ke urutan δ
memproduksi sejumlah rekombinan protein.
Vektor YAC dirancang untuk mengkloning segmen DNA dengan
ukuran besar (100 kb), yang kemudian dipertahankan sebagai bagian dari
12
kromosom dalam sel inang. Sistem YAC sangat stabil dan sudah digunakan
untuk pemetaan fisik genom manusia, analisis unit transkripsi yang besar
dan pembentukan perpustakaan genom yang mengandung DNA dari
kromosom
manusia.
Vektor
YAC
menyerupai
kromosom
karena
mempunyai urutan yang berperan sebagai ORI (autonomous replicating
sequence), urutan centromer ragi dan urutan yang muncul pada dua sisi
setelah linearisasi DNA yang berfungsi sebagai telomer kromosom untuk
mempertahankan kestabilan kromosom. (gambar 2). Dalam beberapa kasus,
input DNA diklon ke sisi yang merusak gen marker yeast. Tanpa adanya
produk gen ini, respon kolorimetri bisa diamati bila sel penerima
ditumbuhkan pada medium khusus. Beberapa vector YAC mengandung gen
marker penanda seleksi yang terpisah dari sisi cloning. YAC tidak pernah
digunakan sebagai system ekspresi untuk produksi protein heterolog
komersial walaupun punya potensi untuk produksi sejumlah besar protein
tunggal dari gen yang punya jumlah copy banyak atau protein heterolog
dengan subunit berbeda.
2.2. Produksi protein heterolog intraselular dalam S. cerevisiae
Kebanyakan system ekspresi intraselular S. cerevisiae
mempunyai
dasar yang sama. Produksi enzim manusia superoksida dismutase akan
digunakan sebagai ilustrasi. Anion superoksida merupakan produk samping
dari penyediaan oksigen pada organisme aerob. Pada manusia anion ini
membantu
merangsang
respon
inflamasi
dari
fagosit
dan
untuk
mengarahkan lekosit ke sisi infeksi. Akan tetapi bila molekul ini terlalu
banyak,
turunannya
dapat
menyebabkan
kerusakan
sel.
Untuk
meminimalkan efek cytotoxic, enzim Cu/Zn superoksida dismutase (Cu/ZnSOD) mencari radikal superoksida dan menggabungkannya dengan ion
hidrogen untuk membentuk hidrogen peroksida yang kemudian didegradasi
menjadi air dan oksigen oleh katalase atau peroksidase. Anion superoksida
juga dihasilkan bila darah masuk kembali ke organ-organ (reperfusion)
13
setelah kehilangan darah selama proses operasi. Untuk mencegah hal ini,
dokter berspekulasi bahwa Cu/Zn-SOD dapat dimasukkan ke organ yang
sedang mengalami reperfusi. Cu/Zn-SOD mungkin bisa bertindak sebagai
agen terapi terhadap penyakit-penyakit inflamasi seperti osteoarthritis,
rheumathoid arthritis scleroderma dan ankylosing spondylitis. Untuk
penggunaan ini bentuk natif dari Cu/Zn-SOD lebih disukai untuk mencegah
respon immunologi yang merugikan yang mungkin dihasilkan dari
penggunaan enzim dari spesies lain.
Pada awalnya, cDNA untuk Cu/Zn-SOD manusia di kloning di
sistem ekspresi E. Coli. Seperti telah diduga, sel inang E. Coli membuang N
terminal metionin dari protein Cu/Zn-SOD, dan asam amino selanjutnya
(alanin) tidak di asetilasi, seperti yang terdapat pada sel manusia. Sehingga
kemudian, cDNA Cu/Zn-SOD manusia dikloning ke vektor YEp (gambar 3).
Vektor YEp mengandung: (1) gen untuk biosintesis leusin (LEU2); (2) ORI
plasmid 2 µm; (3) gen resistan ampisilin (Ampr); (4) ORI dari E. Coli; dan (5)
cDNA Cu/Zn-SOD manusia yang diinsersikan diantara daerah promotor
gen gliseraldehid fosfat dehidrogenase (GAPDp) dan urutan yang
mengandung signal terminasi transkripsi dan poliadenilasi mRNA dari gen
yang sama (GAPDp). Strain ragi dengan leusin defektif (leu2) ditransformasi
dengan vektor ini, dan sel di tumbuhkan pada medium tanpa leusin. Hanya
sel dengan gen LEU2 fungsional (yang terdapat pada vektor) yang akan
tumbuh.
Promotor
GAPD
di
transkripsi
secara
konstitutif
selama
pertumbuhan sel. Pada percobaan ini sel ragi memproduksi Cu/Zn-SOD
intraselular dengan level tinggi, dan residu alanin pada N terminal di
asetilasi seperti protein yang sama pada manusia (Gambar 3).
14
Gambar 3. Vektor ekspresi S. cerevisiae. cDNA untuk gen Cu/Zn-SOD
manusia di kloning diantara promotor dan terminator gen gliseraldehid
fosfat dehidrogenase (GAPDp) ragi.
2.3. Sekresi protein heterolog oleh S. cerevisiae
Semua protein yang mengalami glikosilasi pada S. cerevisiae,
disekresikan ke luar sel. Protein ini harus mempunyai urutan pemula supaya
bisa melewati sistem sekresi. Konsekuensinya urutan pengode dari protein
rekombinan yang membutuhkan gula O-linked atau N-linked untuk aktifitas
biologi harus dilengkapi dengan urutan pemula. Biasanya urutan pemula
dari gen yeast mating factor type α (prepro-α-factor) diinsersikan pada bagian
depan cDNA gen yang akan di ekspresikan. Dengan kondisi ini,
pembentukan ikatan disulfida yang tepat, pemotongan proteolitik dari
urutan pemula, dan modifikasi pascatranslasi yang tepat sering terjadi, dan
protein rekombinan yang aktif akan disekresikan. Selama proses ini peptida
pemula dibuang oleh endopeptidase yang mengenali dipeptida Lys-Arg.
Kodon Lys-Arg harus ditempatkan berdekatan dengan N terminal cDNA,
sehingga setelah peptida pemula dibuang, protein rekombinan akan
memperoleh residu asam amino yang benar pada posisi N terminal.
Strategi tambahan juga sudah ditemukan untuk meningkatkan sekresi
protein rekombinan oleh S. cerevisiae. Sebagai contoh, overproduksi PDI
(Protein Disulfide Isomerase) yang secara natural terdapat pada sistem enzim
sekresi. PDI menyebabkan terjadinya pelipatan protein (folding) yang tepat
15
selama proses sekresi, sehingga PDI mungkin meningkatkan pelepasan
protein rekombinan, terutama yang memiliki ikatan disulfida. Untuk
memeriksa hipotesa ini, urutan promotor dan terminator transkripsi
gliseraldehid fosfat dehidrogenase yang konstitutif ditempatkan pada ujung
gen PDI ragi yang dikloning dalam vektor YIp, dan diintegrasikan ke
kromosom. Strain transforman menunjukkan peningkatan produksi PDI 16x
dibandingkan dengan strain wild type. Bila sel yang meng-overproduksi PDI
ini ditransformasi dengan vektor YEp yang membawa gen platelet-growth
factor B manusia, terdapat peningkatan sekresi proten rekombinan 10x lebih
tinggi dibandingkan dengan sel yang mempunyai level PDI normal.
Sehingga overproduksi PDI secara spesifik meningkatkan sekresi protein
dengan pembentukan ikatan disulfida.
3. Sistem ekspresi Pichia pastoris.
Ekspresi protein rekombinan dalam S. cerevisiae
telah berhasil
digunakan untuk ekspresi berbagai protein dari sumber yang berbeda.
Namun dalam beberapa kasus level ekspresinya rendah. Pada contoh lain
protein rekombinan mengalami hiperglikosilasi dengan lebih dari 100 residu
manosa pada rantai samping N-linked oligosakarida. Kelebihan manosa ini
sering merubah fungsi protein dan menghasilkan protein rekombinan yang
bersifat antigen. Selain itu protein yang dirancang untuk sekresi pada S.
cerevisiae sering tertahan pada membran periplasma, sehingga menambah
biaya dan waktu untuk pemurnian. Selanjutnya, bila densitas sel tinggi maka
S. cerevisiae
akan memproduksi etanol, yang merupakan racun bagi sel.
Sebagai konsekuensinya menurunkan jumlah protein yang disekresikan.
Untuk alasan ini beberapa peneliti mencoba spesies ragi yang lain dan sel
eukariot yang dapat berperan sebagai sel inang yang efektif untuk produksi
protein rekombinan.
Sebagai eukariot, P. pastoris memiliki berbagai manfaat seperti sistem
ekspresi eukariot lain, seperti pemrosesan protein, pelipatan protein, dan
16
modifikasi pascatranslasi, serta mudah dimanipulasi seperti E. coli dan S.
cerevisieae. Penggunaannya juga mudah, mudah, cepat dan mengekspresikan
protein dengan level tinggi.
P. pastoris merupakan ragi metilotropik yang memiliki beberapa
keunggulan dibandingkan dengan S. cerevisiae, yaitu:
1.
P. pastoris memiliki promotor yang diregulasi dengan ketat, yaitu
promotor gen AOX1 yang mengkode enzim alkohol oksidase yang
dapat diinduksi oleh metanol. Apabila ada metanol, 30% dari protein
selular adalah alkohol oksidase. Sedangkan bila tidak ada metanol,
gen AOX1 tidak bekerja. Selanjutnya promotor gen AOX1 dengan
cepat merespons penambahan metanol ke medium. Dengan kata lain,
promotor AOX1 merupakan kandidat yang baik untuk menjalankan
transkripsi gen yang dikloning dan memproduksi protein rekombinan
dalam jumlah besar;
2.
Tingkat sekresi protein rekombinan pada P. pastoris tinggi, hal ini
disebabkan oleh konsentrasi sel yang tinggi dan tidak dihasilkannya
etanol yang merupakan racun bagi sel; dan
3.
P. pastoris biasanya mensekresikan sangat sedikit proteinnya sendiri,
sehingga
memudahkan
pemurnian
protein
rekombinan
yang
disekresikan.
Vektor ekspresi P. pastoris pada umumnya memiliki format yang
sama. Gen yang diekspresi berada dibawah kontrol promotor dan urutan
terminator transkripsi dari gen AOX1 P. pastoris , ORI dan gen marker seleksi
dari E. Coli dan gen marker seleksi dari ragi (gambar 4). Selain itu juga
terdapat penambahan urutan signal dari gen fosfatase PHO1 P. pastoris atau
gen dari ragi lain yang memfasilitasi sekresi protein rekombinan. Vektor P.
pastoris pada umumnya dirancang sebagai plasmid integrasi untuk
mencegah masalah ketidakstabilan plasmid selama pertumbuhan jangka
panjang. Gen asing dan marker seleksi ragi diinsersikan ke kromosom
17
spesifik melalui proses rekombinasi homolog antara DNA pada vektor
dengan daerah yang homolog pada genom P. pastoris.
Gambar 4. Vektor integrasi untuk P. pastoris. Gen yang dikloning (GOI)
diinsersikan diantara promotor dan terminator gen alkohol oksidase (AOX1).
Kemampuan P. pastoris mensekresikan protein tertentu dengan
tingkat sekresi tinggi tidak terlepas dari kemampuan ragi tersebut
melakukan metabolisme terhadap alkohol. Metabolisme yang dimaksud
adalah oksidasi metanol menjadi formaldehid dengan menggunakan
molekul oksigen oleh alkohol oksidase. Salah satu produk samping dari
oksidasi metanol adalah hidrogen peroksida (H2O2). Untuk mencegah sifat
racun dari H2O2, maka metabolisme metanol ini dilakukan disebuah organel
sel khusus yang disebut dengan peroksisom. Karena alkohol oksidase
memiliki afinitas yang sangat rendah terhadap oksigen, maka kompensasi P.
pastoris adalah dengan cara mensekresi protein dengan jumlah sangat
banyak (Invitrogen, 2004).
Sistem ekpresi P. pastoris telah digunakan untuk memproduksi lebih
dari 100 protein aktif dari bakteri, jamur, invertebrata, tumbuh-tumbuhan,
dan mamalia, termasuk manusia (Tabel 2). Protein-protein rekombinan ini,
seperti antigen permukaan hepatitis B, serum albumin manusia, dan bovine
lysozyme, memiliki sifat identik dengan protein natifnya.
Menurut Shi-Hwei et al. (2005), beberapa masalah yang sangat
potensial dalam sekresi protein, termasuk dalam P. pastoris adalah: (1) jenis
18
penggunaan kodon dari gen yang diekspresikan, (2) jumlah gen yang
digunakan, (3) efisiensi dan kekuatan promoter, (4) efisiensi sinyal translasi,
(5) jenis peptida sinyal, (6) proses dan pelipatan di dalam retikulum
endoplasma dan badan Golgi, (7) faktor lingkungan dalam sekresi
ekstraseluler, dan (8) hidrolisis protein oleh protease. Berdasarkan
pertimbangan di atas, peptida sinyal dan proses pelipatan protein menjadi
perhatian utama dalam peningkatan sekresi protein. Untuk menyelesaikan
permasalahan di atas, beberapa penelitian dengan menggunakan teknik
manipulasi genetik telah berhasil meningkatkan tingkat sekresi dari protein
dalam P. pastoris.
3.1. Vektor ekspresi untuk P. pastoris.
Vektor pPICZ dan pPICZα merupakan vektor dengan tingkat ekspresi
tinggi. Keduanya membawa marker Zeosin, sehingga seleksi dapat
dilakukan secara langsung dan multi-copy integran dapat diketahui
langsung tanpa menggunakan banyak medium. Zeosin juga dapat
digunakan untuk E. coli, sehingga mengurangi penggunaan antibiotik lain
dan mengurangi ukuran vektor (Gambar 5).
Gambar 5. Peta vektor pPICZ/pPICZα
19
Kedua
vektor
ini
memiliki:
(1)
promotor
AOX1,
untuk
mengekspresikan protein dengan level tinggi yang diinduksi oleh metanol.
(2) C-terminal c-myc epitope dan urutan polihistidin (6xHis) untuk
memudahkan deteksi dan purifikasi protein. (3) gen 5’ AOX1 yang berfungsi
untuk
menargetkan
integrasi
ke
genom
P.
pastoris.
pPICZα
juga
mengandung signal sekresi a-faktor, yang berfungsi untuk menargetkan
protein rekombinan ke medium.
Vektor pGAPZ dan pGAPZα dapat mengekspresikan protein tanpa
menggunakan metanol. Vektor ini lebih disukai untuk ekspresi skala besar.
Vektor ini memiliki promotor GAP untuk mengekspresikan protein dengan
level tinggi, gen resistan Zeosin untuk seleksi langsung, dan C-terminal cmyc epitope dan urutan polihistidin (6xHis) untuk memudahkan deteksi dan
purifikasi protein. pGAPα juga mengandung signal sekresi a-faktor, yang
berfungsi untuk menargetkan protein rekombinan ke medium (Gambar 6).
Gambar 6. Peta vektor pGAPZ/pGAPZα
20
3.2. Integrasi multicopy.
Beberapa
vektor
ekspresi
untuk
Pichia
yang
tersedia
dapat
meningkatkan jumlah copy gen dalam P. Pastoris. Sehingga protein akan
diekspresikan lebih tinggi. Vektor pPIC3.5K dan pIC9K membawa gen
resistan kanamycin, sehingga seleksi transforman yang membawa multi
copy vektor terintegrasi dapat dilakukan. Multi insersi dapat diidentifikasi
melalui peningkatan resistensi terhadap Geneticin.
Tabel 2
Protein rekombinan yang diproduksi oleh sistem ekspresi P. pastoris
Protein rekombinan
Protein bakteri:
Toksin tetanus fragmen C
a-amilase
T2A peroksidase
Fragmen neurotoxin C. botulinum
Protein Ragi:
Catalase L
Glukoamilase
Lipase
Protein tumbuhan:
Hidroksinitril liase
Aeroallergen
Wheat lipid transfer protein
Protein mamalia:
Mouse gelatin
Human tumor necrosis factor
Human IGF-1
Human CD-38
Tingkat ekspresi (mg/L)
12000
2500
2470
78
2300
400
60
22000
720
60
14000
10000
600
455
4. Sistem ekspresi ragi yang lain
Protein heterolog untuk kepentingan industri dan pengobatan juga
telah diekspresikan di yeast lain. Contohnya cDNA untuk rantai α dan β
globin dari hemoglobin A manusia, masing-masingnya diklon diantara
promotor metanol oksidase (MOXp) dan urutan terminator transkripsi
(MOXt) dari ragi metilotropik Hansenula polymorpha, dan ditempatkan secara
21
berurutan pada vektor ekspresi. Secara kebetulan terjadi integrasi dan
setelah 40 generasi dihasilkan hemoglobin A fungsional yang memiliki
tetramer yang tepat yaitu dua rantai globin α dan dua rantai globin β.
Sejumlah spesies jamur Aspergillus juga telah digunakan secara
ekstensif untuk produksi enzim komersial, seperti α-amilase, lipase,
amyloglukosidase, katalase, dan selulase untuk industri makanan dan kertas.
Jamur ini mensekresikan sejumlah besar natif protein, tumbuh dengan cepat
pada medium yang tidak mahal, memproses mRNA eukariot dan
melakukan modifiksi pasca translasi. Beberapa vektor telah dicocokkan
dengan elemen pengontrol trankripsi dan translasi jamur, untuk ekspresi
protein rekombinan. Chymosin manusia, laktoferin tikus, interleukin-6
manusia, xantin oksidase Drosophilla
dan protein lain telah berhasil
diproduksi pada sel inang jamur.
Sebagai kesimpulan sistem ekspresi ragi telah memberikan peranan
yang penting dalam memproduksi protein rekombinan untuk kepentingan
penelitian, industri, dan aplikasi medik. Bagaimanapun, pengalaman telah
menunjukkan bahwa tidak ada satu sistempun yang dapat memproduksi
versi autentik dari protein heterolog, sehingga sistem ekspresi yang
menggunakan insek atau sel mamalia juga dikembangkan.
5. Sistem ekspresi Baculovirus untuk sel serangga
Baculovirus menginveksi invertebrata, termasuk beberapa spesies
serangga. Selama siklus infeksi dihasilkan dua bentuk Baculovirus. Pertama
single nucleocapsid (partikel virus) dikeluarkan dari sel yang terinfeksi, dan
dapat menginfeksi sel lain. Kedua, kluster dari nucleocapsid (virion) yang
terperangkap dalam matriks protein. Protein matriks ini disebut polyhedrin
dan
keseluruhannya
disebut
polyhedron
(Gambar
7).
Sekumpulan
polyhedron (polyhedra) dibebaskan ke lingkungan setelah sel lisis dan mati.
Polyhedron memproteksi virion dari inaktifasi oleh agen-agen asing. Selama
siklus akhir infeksi Baculovirus, protein polyhedrin diproduksi dalam
22
jumlah besar. Sintesis polyhedrin dimulai sekitar 36-48 jam setelah infeksi
dan berlanjut selama 4-5 hari, sampai infeksi selesai dan sel inang mati.
Gambar 7. Autographa californica multiple
nuclear polyhidrosis virus. (A) single
nucleocapsid (partikel virus) dikeluarkan
dari sel yang terinfeksi. (B) kluster dari
nucleocapsid (virion) yang terperangkap
dalam matriks protein.
Promotor untuk gen polyhedrin (polyh) sangat kuat, dan tidak
dibutuhkan untuk produksi virus. Sehingga penggantian daerah pengkode
polyhedrin dengan protein heterolog dan diikuti dengan infeksi sel
serangga, akan menghasilkan produksi sejumlah besar protein heterolog.
Selanjutnya, karena kesamaan sistem modifikasi pascatranslasi antara
serangga dan mamalia, maka protein rekombinan yang dihasilkan akan
sangat mirip dengan bentuk aslinya.
Baculovirus yang telah digunakan secara ekstensif sebagai vektor
ekspresi adalah Autographa californica multiple nuclear polyhedrosis virus
(AcMNPV). Sel yang umum digunakan adalah Spadoptera frugiperda. Dalam
sel ini promotor polyhedrin aktif, dan selama infeksi dengan Baculovirus
wild type, polyhedrin dengan level tinggi di sintesis.
23
5.1. Vektor sistem ekspresi Baculovirus
Langkah pertama dalam produksi rekombinan AcMNPV adalah
merancang vektor transfer. Transfer vektor merupakan plasmid E. coli-based
yang membawa segmen DNA dari AcMNPV yang mengandung promotor
polyhedrin dan sebagian segmen upstream DNA AcMNPV, multiple cloning
site, terminator polihedrin dan daerah signal poliadenilasi, serta sebagian
segmen downstream DNA AcMNPV. Daerah pengkode untuk gen polyhedrin
telah di delesi. Segmen upstream dan downstream AcMNPV menyediakan
daerah untuk rekombinasi homolog dengan AcMNPV. Gen yang diinginkan
di klon diantara promotor dan terminator polyhedrin dan kemudian
dipropagasi ke E. coli (Gambar 8).
Kemudian sel serangga dalam kultur di ko-transfeksi dengan DNA
AcMNPV dan vektor transfer yang membawa gen yang diklon. Selama
proses transfeksi, terjadi peristiwa double crossover dan gen yang diklon
dengan promotor dan terminator polyhedrin terintegrasi ke DNA AcMNPV.
Virion yang tidak memiliki gen polyhedrin menghasilkan zona yang berbeda
pada lisis sel (plak negatif) yang merupakan rekombinan Baculovirus.
Gambar 8. Organisasi vektor transfer Baculovirus (AcMVPV). Gen asing
diinsersikan ke multiple cloning site (MCS) yang berada diantara promotor
gen polyhedrin (Pp) dan urutan terminasi transkripsi polyhedrin (Pt).
Urutan 5’ AcMNPV DNA dan 3’AcMNPV DNA menyediakan urutan untuk
integrasi unit ekspresi melalui rekombinasi homolog ke genom AcMNPV.
Jika gen lacZ E. coli yang mengkode β-galaktosidase diinsersikan pada
promotor baculovirus yang di-on kan selama fasa awal sampai akhir siklus
litik, dan menjadi bagian dari DNA yang diinkorporasikan ke genom
baculovirus, maka plak rekombinan akan menjadi biru, bila ke dalam
24
medium ditambahkan substrat untuk β-galaktosidase. Penambahan siklus
infeksi terhadap plak negatif akan meningkatkan konsentrasi virus
rekombinan. Protein heterolog dipanen 4 sampai 5 hari setelah sel serangga
terinfeksi.
Sistem
ekspresi
baculovirus
ini
telah
digunakan
untuk
memproduksi lebih dari 500 protein heterolog.
5.2. Peningkatan hasil rekombinan baculovirus.
Linearisasi dari genom AcMNPV sebelum transfeksi ke sel serangga,
meningkatkan
frekuensi
plak
rekombinan.
Prosedur
sederhana
ini
menurunkan jumlah plak non-rekombinan, karena linearisasi genom
baculovirus mengurangi ketidak efektifan dan double crossover antara DNA
AcMNPV linear dengan vektor transfer sirkular. Untuk menjamin proses
linearisasi terjadi secara konsisten, sisi restriksi Bsu31 telah diinsersikan
kedalam gen polyhedrin dari genom AcMNPV wild type. Pada kondisi ini
sekitar 30% plak mengandung baculovirus rekombinan.
5.3. Konstruksi suttle vektor Baculovirus E.coli-sel serangga.
Sistem yang memungkinkan untuk melakukan semua manipulasi
genetik untuk menghasilkan vektor ekspresi baculovirus dalam E. coli juga
telah dikembangkan. Dalam kasus ini transfeksi sel serangga hanya
dibutuhkan untuk produksi protein heterolog. Plasmid E. coli dikonstruksi
dimana suatu segmen DNA diapit oleh urutan DNA yang berada diluar
ujung 5’ dan 3’ gen polyhedrin. Urutan DNA pada segmen ini mengandung
gen resistensi kanamycin, sisi integrasi (sisi pengikatan) yang diinsersikan ke
gen LacZ tanpa merusak fungsinya dan ORI E. coli. Plasmid dan DNA
AcMNPV dimasukkan ke E. coli, setelah terjadi peristiwa rekombinasi, DNA
antara segmen AcMNPV terintegrasi ke genom AcMNPV tanpa kehilangan
gen polyhedrin. Double crossover antara plasmid E. coli dan genom AcMNPV
membentuk DNA single sirkular yang dapat dipertahankan di E. coli sebagai
plasmid, setelah transfeksi ke sel inang serangga, akan langsung
25
memproduksi baculovirus. Shuttle vektor baculovirus E. coli-sel serangga ini
disebut bacmid.
Gambar 9. Konstruksi bacmid rekombinan. Plasmid E. Coli digabungkan ke
genom AcMNPV dengan cara double crossover antara segmen DNA (5’ dan
3’) yang mengapit gen polyhedrin untuk membentuk suttle vektor yang
dapat bereplikasi di E. Coli dan di sel serangga.
Dalam prakteknya hampir semua sistem ekspresi prokariot dan
eukariot membawa satu kopi gen yang diklon. Ekspresi simultan dari dua
atau lebih gen yang diklon akan membentuk protein multimer yang
fungsional. Pada suatu studi sejumlah gen dari virus bluetongue (BTV)
sukses diinsersikan ke vektor baculovirus, sehingga terbentuk vektor dengan
tujuh gen insersi. Sistem ini ditest dengan vektor yang membawa empat
protein BTV. Ekspresi dari gen ini menghasilkan partikel yang secara
struktur mirip dengan virus pada siklus perakitan. Virus-like partikel ini
diinjeksikan ke domba dan menghasilkan antibodi terhadap protein BTV
yang bertahan untuk waktu lama. Dalam studi yang lain, antibodi manusia
dan elemen antibodi di produksi dari vektor dua gen dengan urutan
pengkode kombinasi variasi rantai immunoglobulin ringan dan berat.
5.4. Glikosilasi dan pemrosesan protein mamalia di sel serangga.
Sel serangga tidak rutin menambahkan galaktosa atau terminal asam
sialat ke N-link glikoprotein. Konsekuensinya sistem baculovirus tidak dapat
digunakan untuk memproduksi sejumlah gliprotein mamalia. Untuk
26
mengatasi kekurangan ini, sel serangga yang stabil diintegrasi dengan gen
α-2,6-sialiltransferase dan vektor kloning baculovirus diintegrasi dengan gen
β-1,4 glaktotransferase mamalia, dibawah kontrol promotor early-stage. Pada
kondisi uji, sistem ini mensintesis N-link glikan dengan galaktosa dan asam
sialat.
Dalam beberapa kasus, protein heterolog juga tidak diproses dengan
tepat dari prekursor inaktif yang besar menjadi bentuk aktif dalam sel
serangga. Sel mamalia mengandung sejumlah enzim pemroses protein
(proprotein konvertase). cDNA untuk salah satu enzim ini, yaitu furin, telah
diklon kedalam vektor ekspresi baculovirus dibawah kontrol promotor
polyhedrin dan dikotransfeksi ke sel serangga dengan vektor ekspresi
baculovirus lain dengan urutan untuk preproprotein yang normalnya tidak
diproses oleh sel serangga. Pada kondisi ini terjadi konversi penuh menjadi
protein aktif.
6. Sistem ekspresi untuk sel mamalia.
Sistem ekspresi sel mamalia penting untuk produksi protein heterolog
dengan modifikasi pascatranslasi yang lengkap. Sejumlah sel telah
dikembangkan untuk tujuan ini. Contohnya sel yang diambil dari ginjal
monyet hijau dari Afrika (COS), sel ginjal bayi hamster (BHK), dan sel ginjal
embrio manusia (HEK-239), digunakan untuk mempercepat ekspresi gen
dan mempercepat produksi sejumlah kecil protein heterolog, atau untuk
mengetahui integritas dari konstruksi selama pengembangan vektor. Sel
Chinnese hamster ovary (CHO) telah umum digunakan untuk ekspresi gen
jangka panjang dan untuk produksi protein jumlah banyak. Sejauh ini telah
ratusan vektor ekspresi mamalia yang dikembangkan, dan semuanya tidak
berbeda dalam disainnya.
Vektor ekspresi mamalia mengandung origin of replication eukariot,
biasanya dari virus binatang, seperti simian virus 40 (SV40). Urutan
promotor yang menjalankan gen yang diklon dan gen marker seleksi, dan
27
urutan terminasi transkripsi (signal poliadenilasi) harus dari eukariot dan
secara teratur diambil dari virus lain (cytomegalovirus, SV40, virus herpes
simpleks) atau gen mamalia (β-actin, metallothionein, thymin kinase, bovine
growth hormone). Promotor konstitutif yang kuat dan signal poliadenilasi
dibutuhkan.
Gambar 10. Peta vektor ekspresi untuk sel mamalia. Multiple cloning site
(MCS) dan selectable marker gene (SMG) berada dibawah kontrol promotor
(p), poliadenilasi (pa), dan terminasi transkripsi (TT) untuk eukariot. Intron
(I) mempercepat produksi protein heterolog.
Promotor yang dapat diinduksi sering digunakan bila sintesis secara
kontinu dari protein heterolog bersifat toksid terhadap sel inang. Ekspresi
dari gen yang diinginkan dapat ditingkatkan dengan menempatkan urutan
intron antara promotor dan sisi kloning dari konstruksi transkripsi (cassette).
Intron hibrida yang terdiri dari bagian donor dan sisi akseptor dari dua gen
yang berbeda cukup efektif untuk berbagai sel. Urutan yang dibutuhkan
untuk seleksi dan propagasi dari vektor ekspresi mamalia dalam E. coli
diambil dari vektor kloning E. coli seperti pBR322.
Untuk mendapatkan hasil yang baik, maka gen yang akan diklon
ditambah dengan urutan kontrol translasi. Inisiasi translasi pada eukariot
tingkat tinggi tergantung pada urutan spesifik nukleotida disekitar kodon
start
(AUG)
yang
disebut
dengan
urutan
Kozak,
yaitu:
CC(AatauG)CCAUGG. Urutan Kozak biasanya diikuti oleh urutan signal
yang memfasilitasi sekresi, urutan protein (tag) untuk memudahkan
purifikasi protein heterolog, dan urutan pemotongan proteolitik sehingga tag
dapat dibuang dari protein heterolog. Kodon stop ditambahkan untuk
28
meyakinkan bahwa translasi terjadi pada lokasi yang tepat. Sedangkan
urutan yang mengandung 5’ dan 3’ untranslated region (UTR) penting untuk
efisiensi translasi dan kestabilan mRNA. Sintetik 5’ dan 3’ UTR atau dari gen
β-globin manusia digunakan pada vektor ekspresi mamalia.
Vektor ekspresi sel mamalia pada umumnya membawa satu gen yang
mengkode polipeptida fungsional. Bentuk aktif dari beberapa protein
komersial mengandung dua rantai protein yang berbeda. Contohnya,
hormon tyhroid manusia merupakan dua rantai polipeptida (heterodimer),
hemoglobin, dan antibodi merupakan tetramer dengan dua copy masingmasing subunit (yaitu α2β2 dan H2L2). Gen atau cDNA dari masing-masing
subunit dapat diklon, disintesis dan masing-masing subunit dipurifikasi
secara terpisah, dan kemudian semua rantai polipeptida digabung dalam
tabung reaksi. Namun, hanya sedikit protein multi-rantai yang dapat dirakit
in vitro. Sebaliknya perakitan in vivo dari protein dimer atau tetramer cukup
efisien. Sehingga sejumlah strategi telah dikembangkan untuk produksi dua
rekombinan protein dalam sel yang sama.
Dua vektor ekspresi mamalia, masing-masing dengan gen atau cDNA
untuk satu subunit dan gen penyeleksi yang berbeda, dapat dikotransfeksi
ke sel inang. Sel yang ditransfeksi diperlakukan dengan kedua agen
penyeleksi, dan sel yang bertahan hidup membawa kedua vektor. Dua jenis
sistem vektor telah sukses digunakan untuk memproduksi protein
rekombinan dimer dan tetramer. Namun sering ditemui salah satu vektor
bisa hilang, dan dua vektor jarang dipertahankan dengan jumlah copy yang
sama, sehingga kedua subunit protein diproduksi dengan jumlah yang
berbeda, dan mengurangi jumlah produk akhir. Untuk mengatasi masalah
ini,
vektor
tunggal
yang
membawa
dua
gen
yang
diklon
telah
dikembangkan. Kedua gen ditempatkan dibawah kontrol promotor dan
signal poliadenilasi yang indipenden (double cassette vector). Alternatif lain,
untuk meyakinkan bahwa sejumlah protein rekombinan yang sama
disintesis, vektor (vektor bicistronik) dikonstruksi dengan dua gen yang
29
diklon terpisah satu dengan yang lain oleh urutan DNA yang mengandung
sisi pemasukan internal ribosom (IRES= internal ribosomal entry site). IRES
ditemukan pada genom virus mamalia, dan menyebabkan terjadinya
translasi simultan dari protein yang berbeda pada mulekul mRNA
policistronik. Transkripsi dari konstruksi ”gen a-IRES-gen b” dikontrol oleh
satu promotor dan signal poliadenilasi. Pada kondisi ini ”dua gen” tunggal
(bicistronik) ditranskripsi dan translasi berlangsung dari ujung 5’ mRNA
untuk memproduksi rantai pertama (rantai a) dan didalam elemen IRES
memproduksi rantai kedua (rantai b). Biasanya, konstruksi vektor ekspresi
mamalia memakan waktu lama dan membutuhkan usaha yang gigih untuk
mendapatkan produksi protein yang optimum.
Gambar 11. Vektor ekspresi bicistronik. Gen yang diklon (gen a dan gen b)
mengkode subunit protein dimer (ab). Masing-masing gen diinsersikan ke
vektor pada dua sisi urutan IRES. Kedua gen tersebut dan IRES ditranskripsi
di bawah kontrol satu promotor, urutan poliadenilasi dan terminasi
transkripsi eukariot.
30
6.1. Sistem marker penyeleksi untuk vektor ekspresi mamalia.
Beberapa skema seleksi telah di disain yang fungsinya tidak hanya
untuk identifikasi sel yang mengalami transfeksi, juga untuk meningkatkan
produksi protein heterolog melalui amplifikasi jumlah copy vektor ekspresi.
Sistem dihidrofolat reduktase methotrexate (DHFR-MTX) termasuk ke dalam
kategori
ini.
DHFR
mengkatalisis
reduksi
dihidrofolat
menjadi
tetrahidrofolat, yang dibutuhkan untuk produksi purin. MTX merupakan
inhibitor kompetitif dari DHFR. Sensitifitas MTX dapat diatasi jika sel
memproduksi DHFR berlebih. Bila konsentrasi MTX meningkat dalam
jangka waktu tertentu, gen DHFR dalam kultur sel akan diperbanyak. Pada
protokol standar DHFR-MTX, sel defisien DHFR ditransfeksi dengan vektor
ekspresi yang membawa gen DHFR sebagai marker seleksi dan kemudian
sel diperlakukan dengan MTX. Setelah seleksi awal terhadap sel yang
mengalami transfeksi, konsentrasi MTX ditingkatkan, sehingga sel dengan
jumlah copy tinggi vektor dapat diseleksi.
Cara seleksi yang lain adalah menggunakan sistem glutamin
sintetase-metionin sulfoximin (GS-MSX). GS terlibat dalam sintesis glutamin,
yang digunakan pada sintesis protein, produksi purin dan pyrimidin, dan
proses penting lain. MSX secara irreversibel menghambat GS. Sel yang
ditransfeksi dengan vektor yang membawa gen GS, reristan terhadap efek
toksik dari MSX dan memiliki suplai aktif GS yang cukup untuk proliferasi
sel. Setelah seleksi dengan MSX, sel yang memproduksi protein heterolog
dengan level tinggi biasanya memiliki vektor ekspresi tidak lebih dari 10
copy. Sejumlah protein untuk penelitian dan terapi telah diproduksi dengan
sistem ini, termasuk dua antibodi yang telah digunakan untuk terapi
manusia. Gen pengkode rantai berat dan ringan dari monoklonal antibodi
diklon menggunakan dua promotor yang kuat dan gen GS dijalankan oleh
promotor-medium pada vektor ekspresi. Monoklonal antibodi ini telah
digunakan untuk terapi manusia dan tidak terdapat rejeksi organ.
31
Sebagai kesimpulan vektor ekspresi mamalia efektif dan serbaguna
sebagai vektor untuk ekspresi protein eukariot lain. Namun produksi skala
industri protein rekombinan oleh sel mamalia yang direkayasa menjadi
cukup mahal. Sebagai konsekuensinya sistem ekspresi yang tidak terlalu
mahal lebih disukai walaupun protein rekombinan penting yang autentik
hanya dapat diperoleh dari sel mamalia.
32
DAFTAR PUSTAKA
Ansari, A., V. C. Emery. 1998. Baculoviruses, 219-233. Dalam R. Rabley and J.
M. Walker (ed.) Molecular Biomethods Handbook. Humana Press Inc.,
Totowa, N.J.
Barnes, L. M., C. M. Bentley, and A. J. Dickson. 2000. Advances in animal cell
recombinant protein production: GS-NSO expression system.
Cytotechnology 32: 109-123.
Cregg, J. M. 1999. Expression in the methylotropic yeast Pichia pastoris, 157191. Dalam J. Fernandez and J. P. Hoeffler (ed.) Gene Expression Systems:
Using nature for the Art of Expression. Academic Press, Inc., San Diego,
Calif.
Glick, B.R., Pasternak, J.J. 2003. Molecular biotechnology, principles and
applications of recombinant DNA. ASM Press (Washington DC). 163173.
Geisse, S., and H. P. Kocher. 1999. Protein expression in mamalian and insect
cells, Methods Enzymol. 306:19-42.
Invitrogen, A manual of methods for expresion of recombinant proteins in
Pichia Pastoris, 2004. California. 7-10.
Robinson, A. S., Hines, V., Wittrup, K. D. 1994. Protein disulphide isomerase
overexpression increases secretion of foreign proteins in Saccharomyces
cerevisiae. Bio/Technology. 12, 381-384
Schultz, L. D., Markus, H. Z., Hofmann, K. J., Montgomery, D. L.,
Dunwiddier, C. T., Kniskern, P. J., Freedman, R. B., Ellis, R. W., Tuite,
M. F. 1994. Using molecular genetic to improve the production of
recombinant proteins by the yeast Saccharomyces cerevisiae. Ann. N. Y.
Acad. Sci. 721, 148-157
Shi-Hwei, L., Wei-I, C., Chia-Chin, S., Margaret Dah-Tsyr, C. 2005. Improved
secretory production of glucoamylase in Pichia pastoris by combination
of genetic manipulation. Biochem. Biophys. Res. Comm. 326, 817-824
Tuite, M.F. and Freedman, R.B. 1994, Improving secretion of recombinant
proteins from yeast and mammalian cells; rational of empirical design?
Trends in Biotechnology.
33