DESAIN DNA PROBE SECARA IN SILICO SEBAGAI PENDETEKSI
advertisement
DESAIN DNA PROBE SECARA IN SILICO SEBAGAI PENDETEKSI DAERAH RRDR GEN rpoB Mycobacterium tuberculosis UNTUK METODE REALTIME POLYMERASE CHAIN REACTION Skripsi DEK PUETERI DEWI SURYANI 1208505085 JURUSAN FARMASI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS UDAYANA 2016 i ii KATA PENGANTAR Puji syukur penulis panjatkan kehadapan Tuhan Yang Maha Esa, Ida Sang Hyang Widhi Wasa, karena berkat rahmat-Nya penulis dapat menyelesaikan skripsi berjudul “DESAIN DNA PROBE SECARA IN SILICO SEBAGAI PENDETEKSI DAERAH RRDR GEN rpoB Mycobacterium tuberculosis UNTUK METODE REAL-TIME POLYMERASE CHAIN REACTION” tepat pada waktunya. Skripsi ini diajukan sebagai syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi (S.Farm) di Jurusan Farmasi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Udayana. Penulis menyadari bahwa penyusunan skripsi ini tidak berhasil tanpa dukungan, bantuan, serta bimbingan dari berbagai pihak, baik secara langsung maupun tidak langsung. Oleh karena itu, penulis ingin menyampaikan rasa terima kasih yang sebesar-besarnya kepada: 1. Tuhan Yang Maha Esa, yang selalu memberikan anugerah, tuntunan dan kekuatan bagi penulis sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi ini. 2. Drs. Ida Bagus Made Suaskara, M. Si., selaku Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Udayana 3. Dr. rer. nat. I Made Agus Gelgel Wirasuta, M.Si., Apt., selaku Ketua Jurusan Farmasi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Udayana. 4. Putu Sanna Yustiantara S.Farm., M.Si., Apt., selaku dosen pembimbing I yang telah membantu dalam membimbing serta tak hentinya memberikan semangat dan dukungan hingga akhir penyusunan skripsi ini. iii 5. Dr. Sagung Chandra Yowani, S.Si., Apt., M.Si., selaku dosen pembimbing II yang telah membantu dalam membimbing serta tak hentinya memberikan semangat dan dukungan hingga akhir penyusunan skripsi ini. 6. Rasmaya Niruri, S.Si., M. Farm. Klin., Apt., L. P. Mirah Kusuma Dewi, S. Farm., M.Sc., Apt. dan Ni Kadek Warditiani, S. Farm., M.Sc., Apt., selaku dosen penguji yang telah banyak membantu dalam membimbing penulis hingga akhir penyusunan skripsi ini. 7. Seluruh dosen pengajar beserta staf/pegawai di Jurusan Farmasi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Udayana yang telah banyak membantu penulis, terutama para staf yang telah banyak membantu dalam hal pengurusan surat dan kelengkapan administratif lainnya. 8. Kedua orang tua penulis, Putu Eka Winarsa dan Wahyu Hariyani, kakak sekaligus panutan bagi penulis, Gede Bagues Guna Harimbawan WB (Mas Rian), serta adik tercinta Sri Wisnu Opi Wulandari (Opik) yang tak pernah henti selalu mengingatkan, memberi dukungan, doa dan semangat hingga akhir penyusunan skripsi ini. 9. Keluarga besar Nengah Bendesa dan Soehari tersayang yang selalu mendukung dan memberikan semangat bagi penulis hingga akhir penyusunan skripsi ini. 10. Nenek penulis, Widyawati Bendesa dan Mulyati tersayang yang selalu mendukung, mendoakan dan memberikan semangat bagi penulis hingga akhir penyusunan skripsi ini. iv 11. Bibi tersayang penulis, alm. Nyoman Yudi Deli Astini “Bik Tini” yang tidak pernah lelah untuk selalu memotivasi penulis semasa hidupnya. 12. Sahabat seperjuangan penulis yaitu Masmitha, Dein, Pebri, Utik, Rika, Ayuk, Tata, Wichy, Krisnawan, Dewa, Sugi dan Lanang yang telah berjuang bersama sejak awal menginjakkan kaki di Jurusan Farmasi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Udayana. 13. Tim TB, Rai, Ratih, Linda, Ebi dan Widya yang telah menjadi teman diskusi dan berbagai suka duka selama penyusunan skripsi. 14. Teman terdekat sekaligus panutan bagi penulis, Gede Agastya Aparigraha yang selalu mengingatkan dan memberi motivasi untuk mengerjakan skripsi ini sampai pada akhirnya dapat terselesaikan dengan baik. 15. Seluruh Mahasiswa Jurusan Farmasi Fakultas MIPA Universitas Udayana, khususnya Dioscuri Hygeia yang telah berjuang bersama penulis. 16. Semua Pihak yang tidak bisa penulis sebutkan satu per satu. Penulis sepenuhnya menyadari bahwa penulisan skripsi ini masih sangat jauh dari kesempurnaan. Untuk itu penulis mengharapkan kritik dan saran yang bersifat membangun dari semua pihak demi karya yang lebih baik di masa yang akan datang. Semoga skripsi ini dapat bermanfaat bagi semua pihak. Jimbaran, Mei 2016 Penulis v DAFTAR ISI Halaman HALAMAN JUDUL........................................................................................... i LEMBAR PENGESAHAN ................................................................................ ii KATA PENGANTAR ........................................................................................ iii DAFTAR ISI ....................................................................................................... vi DAFTAR TABEL ............................................................................................... ix DAFTAR GAMBAR .......................................................................................... x DAFTAR LAMPIRAN ....................................................................................... xi DAFTAR SINGKATAN SECARA UMUM ...................................................... xii DAFTAR SINGKATAN ASAM AMINO ......................................................... xiii DAFTAR ISTILAH ........................................................................................... xiv ABSTRAK.......................................................................................................... xvi ABSTRACT ....................................................................................................... xvii BAB I PENDAHULUAN ................................................................................... 1 1.1 Latar Belakang .................................................................................. 1 1.2 Rumusan Masalah ............................................................................. 7 1.3 Tujuan Penelitian .............................................................................. 7 1.4 Manfaat Penelitian ............................................................................ 7 BAB II TINJAUAN PUSTAKA......................................................................... 9 2.1 Tuberkulosis (TB) ............................................................................ 9 2.2 Genomik M. Tuberculosis ................................................................ 10 2.3 Mekanisme Resistensi Rifampisin (RIF) ......................................... 11 vi 2.4 Strategi Terapi Pasien dengan Resistensi Rifampisin ...................... 14 2.5 Mutasi Gen ...................................................................................... 17 2.6 Polymerase Chain Reaction (PCR)................................................. 18 2.7. Real-Time Polymerase Chain Reaction (Real-Time PCR) ............ 21 2.8 DNA Probe ..................................................................................... 21 2.9 Label TaqMan probe ....................................................................... 26 BAB III METODE PENELITIAN..................................................................... 29 3.1 Rancangan Penelitian ...................................................................... 29 3.2 Batasan Operasional Penelitian ....................................................... 29 3.3 Lokasi dan Waktu Penelitian .......................................................... 30 3.4 Bahan Penelitian.............................................................................. 30 3.5 Alat Penelitian ................................................................................. 31 3.6 Prosedur Penelitian ......................................................................... 31 3.6.1 Pemilihan Sekuens Target Rancangan DNA Probe.................. 32 3.6.2 Perancangan DNA Probe .......................................................... 33 3.6.3 Analisis Hasil Rancangan DNA Probe ..................................... 33 3.7 Penyimpulan Hasil Penelitian ......................................................... 35 BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN .......................................................... 36 4.1 Pemilihan Sekuens Target Rancangan DNA Probe...................... 36 4.2 Hasil Perancangan DNA Probe Secara In Silico .......................... 37 4.3 Hasil Analisis Rancangan DNA Probe ......................................... 40 4.3.1 Hasil Analisis Urutan DNA Probe .......................................... 40 4.3.2 Pelabelan Urutan DNA TaqMan probe.................................... 51 vii BAB V KESIMPULAN DAN SARAN ............................................................. 56 5.1 Kesimpulan .................................................................................... 56 5.2 Saran ............................................................................................... 56 DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................ 57 LAMPIRAN ........................................................................................................ 63 viii DAFTAR TABEL Halaman Tabel 2.1 Terapi Penggunaan OAT Pasien dengan MDR-TB ........................... 15 Tabel 2.2 Tipe label Reporter dan Quencher untuk TaqMan probe .................. 27 Tabel 3.1 Data Kriteria Primer yang Telah Didesain Secara In Silico dengan Clone Manager Suite 6 .......................................................... 31 Tabel 3.2 Hasil Analisis Tahap Awal Desain DNA Probe Wild-type Sensitif ............................................................................................... 34 Tabel 4.1 Hasil Rancangan DNA Probe Wild-type Sensitif Tahap Awal.......... 41 Tabel 4.2 Empat Sekuens DNA Probe Wild-Type Sensitif Terpilih dari Analisis Tahap Awal ......................................................................... 49 Tabel 4.3 Sekuens TaqMan probe Terpilih untuk Tahap Pelabelan .................. 50 ix DAFTAR GAMBAR Halaman Gambar 2.1 Genom Lengkap M. tuberculosis H37Rv................................... 11 Gambar 2.2 Diagram Skematik Prinsip Kerja Real-time PCR Menggunakan TaqMan probe .................................................... 24 Gambar 3.1 Pemetaan Urutan Nukleotida Daerah RRDR Gen rpoB M. tuberculosis yang Menjadi Target Perancangan DNA Probe ........................................................................................... 33 Gambar 4.1 Contoh Analisis Run dan Repeats Pada Software Clone Manager Suite 6................................................................ 43 Gambar 4.2 Analisis Struktur Hairpin (A) dan Gambar Hairpin yang Terbentuk Pada ∆G Berbeda dengan Suhu yang Berbeda (B dan C) ...................................................................................... 44 Gambar 4.3 Analisis Struktur Hairpin yang Sesuai dengan Kriteria Berdasarkan Suhu Annealing Secara Eksperimental (A) dan Hairpin Tidak Terbentuk Pada Suhu Annealing 60ºC (B) ....................................................................................... 46 Gambar 4.4 Contoh Analisis Dimer Pada Salah Satu Sekuens DNA Probe .......................................................................................... 47 Gambar 4.5 Daerah Penempelan 4 sekuens DNA Probe yang Telah Memenuhi Kriteria nilai TmºC untuk TaqMan probe ................ 49 Gambar 4.6 Daerah Penempelan dan Pelabelan TaqMan probe WT RRDR-24 ................................................................................... 51 x DAFTAR LAMPIRAN Halaman Lampiran 1. Peta Urutan Nukleotida Gen rpoB Mycobacterium tuberculosis H37Rv RNA-Polymerase Beta Subunit ................... 63 Lampiran 2. Skema Kerja Prosedur Penelitian Desain DNA Probe dan Analisis Hasil Rancangan ........................................... 65 Lampiran 3. Rincian Data Rancangan DNA TaqMan probe WT RRDR-24 Pada Software Clone Manager Suite 6 ................ 67 xi DAFTAR SINGKATAN SECARA UMUM ∆G : Energi Bebas bp : Base Pairs DNA : Deoxyribonucleic Acid dNTPs : Deoxynucleotide Triphosphates HEX : 6-carboxy-2’,4,4’,5’,7,7’-hexachlorofluorescein JOE : 6-carboxy-4’,5’-dichloro-2’,7’-dimethoxyfluorescein MDR : Multi-Drug Resistant mRNA : Messenger Ribonucleic Acid OAT : Obat Anti Tuberkulosis pb : Pasang Basa PCR : Polymerase Chain Reaction PNA : Peptida Nucleic Acid Q : Quencher R : Reporter RNA : Ribonucleic acid RRDR : Rifampicin Resistant – Determining Region TB : Tuberkulosis TET : 6-carboxy-2’,4’,7,7’-tetrachlorofluorescein TmºC : Temperature Melting WHO : World Health Organization WT : Wild-type xii DAFTAR SINGKATAN ASAM AMINO A : Alanin C : Sitosin D : Asam Aspartat F : Fenilalanin G : Guanin H : Histidin I : Isoleusin L : Leusin M : Metionin N : Asparagin P : Prolina S : Serin Q : Glutamin R : Arginin T : Treonina V : Valin W : Triptofan Y : Tirosin xiii DAFTAR ISTILAH Amplifikasi DNA : Perbanyakan DNA Amplikon : Produk amplifikasi DNA Asam Amino : Unit monomer penyusun protein yang dihubungkan melalui ikatan peptide DNA Template : DNA untai ganda yang membawa urutan basa fragmen atau gen yang akan digandakan Gen : Urutan DNA yang menyandi suatu protein Kodon : Deret nukleotida pada mRNA yang terdiri atas kombinasi tiga nukleotida berurutan yang menyandi suatu asam amino tertentu Mutasi : Terjadinya perubahan basa dari urutan nukleotida yang lazim dari suatu sekuens DNA organisme yang dapat menyebabkan perubahan sifat fenotip Nukleotida : Unit monomer pembentuk DNA PCR : Teknik amplifikasi sekuens DNA dengan menggunakan reaksi enzimatis Primer Oligonukleotida : Oligonukleotida pendek yang mempunyai urutan nukleotida yang komplementer dengan urutan nukleotida DNA template Probe : Molekul asam nukleat yang memiliki afinitas kuat dan dapat berikatan dengan target spesifik DNA atau xiv RNA sekuens Resistensi : Hilangnya kepekaan bakteri terhadap obat yang sebelumnya dapat membunuh bakteri RNA Polimerase : Enzim yang diperlukan dalam proses sintesis RNA dari DNA Sekuens Nukleotida : Urutan nukleotida Transkripsi : Proses pembentukan RNA dengan menggunakan DNA sebagai templat Wild-type : Bakteri yang tidak mengalami mutasi dan digunakan sebagai sekuens pembanding terjadinya mutasi xv ABSTRAK Mutasi pada rifampisin ditemukan sebanyak 96,1% pada daerah RRDR (kodon 507-533). Deteksi secara molekuler adanya mutasi dapat dilakukan dengan metode real-time PCR menggunakan DNA probe spesifik. Penelitian ini bertujuan untuk mendesain DNA probe yang mampu mendeteksi urutan wild-type yang dapat didesain secara in silico dan dilabel dengan metode TaqMan. Desain DNA probe dilakukan dalam dua tahap analisis. Pertama, analisis DNA probe berdasarkan kriteria DNA probe secara umum. Kedua, analisis DNA probe berdasarkan kriteria TaqMan probe. Hasil dari penelitian ini, diperoleh 27 sekuens yang memenuhi kriteria DNA probe secara umum. Dari 27 sekuens tersebut diperoleh 4 sekuens berdasarkan seleksi kriteria nilai TmºC yang dipersyaratkan TaqMan probe. Empat sekuens tersebut yaitu WT RRDR-18 (5'-AG CTG AGC CAA TTC ATG GAC CAG AAC A-3'), WT RRDR-19 (5'-G CTG AGC CAA TTC ATG GAC CAG AAC AA-3'), WT RRDR-23 (5'-G CTG AGC CAA TTC ATG GAC CAG AAC AAC-3') dan WT RRDR-24 (5'-CTG AGC CAA TTC ATG GAC CAG AAC AAC C-3'). Dari keempat sekuens tersebut, diperoleh satu sekuens terpilih yaitu WT RRDR-24. Sekuens yang terpilih memiliki posisi basa G yang berada pada urutan basa ke-3 dari ujung 5’ serta memiliki jumlah basa C lebih banyak dibandingkan basa G. Hal tersebut akan memudahkan proses pelabelan, karena memberi kesempatan bagi reporter (FAM) dapat ditempelkan pada ujung 5’ dan quencher (TAMRA) pada ujung 3’. Kesimpulan dari penelitian ini, telah diperoleh 4 sekuens DNA probe yang memenuhi kriteria nilai TmºC untuk TaqMan probe. Dari keempat sekuens tersebut diperoleh satu sekuens terbaik yang telah sesuai dengan kriteria TaqMan probe, yaitu desain probe WT RRDR-24 yang dapat digunakan untuk mendeteksi adanya mutasi pada daerah RRDR gen rpoB M. tuberculosis untuk metode realtime PCR. Kata kunci : Tuberkulosis, gen rpoB, In Silico, TaqMan probe, Real-time PCR xvi ABSTRACT Mutations in rifampicin was found 96.1% in the area of RRDR (codons 507533). Molecular detection of mutation can be performed by real-time PCR using specific DNA probe. The purpose of this research was design a DNA probe by in silico based on TaqMan probe labeling that can detect wild-type sequence. Design of DNA probe was performed in two step of analysis. The first, analysis of DNA probe based on general criteria of DNA probe. The second, analysis of DNA probe based on TaqMan probe criteria. The results of this study, were 27 sequences of DNA probe obtained. All of sequences were meet to general criteria of DNA probe. There were 4 sequences of 27 sequences which were based on TmºC value meet the TaqMan probe criteria. The probe were WT RRDR-18 (5'-AG CTG AGC CAA TTC ATG GAC CAG AAC A-3'), WT RRDR-19 (5'-G CTG AGC CAA TTC ATG GAC CAG AAC AA-3'), WT RRDR-23 (5'-G CTG AGC CAA TTC ATG GAC CAG AAC AAC3') and WT RRDR-24 (5'-CTG AGC CAA TTC ATG GAC CAG AAC AAC C3'). Within 4 sequences, one selected sequences was WT RRDR-24. It had G bases position at 3rd base and the number of C bases more than the G base. It will be easier for labeling process, therefore it allowed reporter (FAM) to be attached to the 5 'end and quencher (Tamra) at the 3' end. The conclusion of this study, there were 4 sequences of DNA probe which were meet to TmºC value of TaqMan probe criteria. Within 4 sequences, one of the best sequences that meet to criteria of TaqMan probe has been selected. It was WT RRDR-24, that can be used to detect mutation in the area RRDR of M. tuberculosis rpoB gene for real-time PCR method. Key words: Tuberculosis, rpoB gene, In Silico, TaqMan probe, Real-time PCR xvii
