KLONING DAN OVEREKSPRESI GEN celD DARI Clostridium

PROPOSAL METODOLOGI PENELITIAN (BM-3001)
KLONING DAN OVEREKSPRESI GEN celD DARI
Clostridium thermocellum ATCC 27405
DALAM pET-BLUE VECTOR 1
Penyusun:
Chandra
10406014
Dosen Narasumber:
Dra. Maelita Ramdani Moeis, Ph.D
Akhmaloka, Ph.D
PROGRAM STUDI SARJANA MIKROBIOLOGI
SEKOLAH ILMU DAN TEKNOLOGI HAYATI
INSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG
BANDUNG
2008
1.1 Latar Belakang
Clostridium thermocellum ATCC 27405 merupakan eubakteri gram positif
yang bersifat anaerob termofilik dan berbentuk batang. Bakteri ini sudah diketahui
dapat memproduksi enzim endoglukanase termostabil yang sangat aktif. Salah
satu enzim endoglukanase yang dihasilkan adalah endoglukanase D atau EGD.
Enzim yang termasuk ke dalam keluarga enzim selulase ini dikode oleh gen celD
(Mishra et al., 1990).
Kebutuhan akan enzim endoglukanase (terkait dengan enzim selulase) yang
termostabil semakin meningkat, terutama saat ini untuk menghasilkan kebutuhan
bioenergi berupa bioetanol. Untuk memproduksi bioetanol secara massal
dibutuhkan banyak sumber glukosa. Glukosa tersebut akan terfermentasi dan
menghasilkan bioetanol. Masalahnya ketersediaan glukosa tidak banyak namun
ketersediaan selulosa justru yang melimpah. Maka dari itu dibutuhkan banyak
enzim endoglukanase untuk menguraikan selulosa yang ada menjadi monomer
glukosa sehingga kemudian dapat digunakan untuk kebutuhan bioenergi. Salah
satu usaha untuk memperbanyak produksi enzim selulase yang termostabil adalah
lewat penelitian rekayasa genetika mikroba yang meliputi isolasi gen pengkode
enzim
endoglukanase
yang
termostabil
dari
mikroba
termofilik
dan
mengoverekspresikannya ke vektor yang sesuai sehingga diharapkan dapat
meningkatkan perolehan enzim yang banyak dibutuhkan ini.
Sebelumnya telah dilakukan penelitian tentang kloning dan overekspresi
gen celD Clostridium thermocellum ini pada vektor ekspresi pUC8 dengan inang
E. coli (Jollif et al., 1986). Pada penelitian kali ini akan dilakukan kloning dan
overekspresi gen yang sama pada pET-Blue 1 dengan inang E. coli Tuner (DE3)
pLacI. pET-Blue 1 ini digunakan karena memiliki keunggulan di antaranya dalam
hal high multiple copy numbers dan pengaturan ekspresi gen. Dengan penelitian
ini diharapkan enzim endoglukanase yang dihasilkan lebih banyak dan lebih
terkontrol.
1.2 Tujuan
•
Mengkloning gen celD Clostridium thermocellum ATCC 27405 ke vektor
ekspresi pET-Blue 1 dan mengoverekspresikannya dalam E. coli Tuner (DE3)
pLacI.
•
Menguji adanya aktivitas enzim endoglukanase D atau EGD yang dihasilkan.
1.3 Hipotesis
Gen celD Clostridium thermocellum ATCC 27405 yang dikloning ke dalam
vektor ekspresi pET-Blue 1 dapat dioverekspresikan dalam E. coli galur Tuner
(DE3) pLacI.
BAB II
METODOLOGI PENELITIAN
2.1 Metode Kerja
Vektor kloning + gen celD
- PCR
- Elektroforesis
- Purifikasi
Gen celD
pET-Blue 1
Restriksi oleh enzim EcoRV
Ligasi
pET-Blue cutted
Transformasi ke E. coli Tuner (DE3) pLacI
Screening biru-putih
SDS PAGE
Uji aktivitas
a. Desain primer
Pada tahap ini dirancang primer yang sesuai dengan gen target celD. Selain
itu pada primer juga ditambahkan sisi pengenalan enzim restriksi EcoRV. Untuk
desain primer digunakan program Primer3.
b. PCR
Pada tahap ini dilakukan PCR dengan suhu denaturasi 94oC, annealing
50oC, dan elongasi 72oC. Suhu annealing yang optimum akan dicari dengan
melakukan optimasi PCR.
c. Elektroforesis
Fragmen DNA hasil PCR dimasukkan ke dalam jel agarosa kemudian
dialirkan aliran listrik untuk memisahkan fragmen DNA target. Untuk mengetahui
DNA target (berdasarkan panjangnya), maka digunakan ladder sebagai
pembanding.
d. Purifikasi DNA
Fragmen DNA target pada jel agarosa dipotong kemudian dipurifikasi
dengan menggunakan kit purifikasi sehingga didapatkan fragmen DNA target
dalam bentuk cair.
e. Restriksi
Fragmen DNA target dan vektor ekspresi diberi enzim restriksi EcoRV
sehingga keduanya menghasilkan ujung lekat yang saling melengkapi.
f. Ligasi
Fragmen DNA dan vektor ekspresi yang dilekatkan satu sama lain dengan
kit ligasi.
g. Transformasi
Fragmen DNA yang sudah terinsert ke dalam pET-Blue 1 dimasukkan ke
dalam sel E. coli Tuner (DE3) pLacI dengan metode heat-shock.
h. Seleksi biru-putih
E. coli galur Tuner (DE3) pLacI yang telah ditransformasi kemudian
ditumbuhkan ke dalam medium yang mengandung IPTG dan X-gal. Koloni yang
tumbuh dan berwarna putih kemudian diambil dengan tusuk gigi steril dan
ditumbuhkan dalam LB yang mengandung IPTG.
i. SDS PAGE
Kultur tersebut disentrifuga kemudian diambil supernatannya dan dilakukan
SDS PAGE.
j. Uji aktivitas
Crude extract enzyme yang didapat dari proses sebelumnya diuji aktivitas
selulasenya secara kualitatif.
2.2 Rencana Kerja
No
Perihal
Bulan ke1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
1
Studi literatur
v v v v v v v v v v
2
Desain primer
v v
3
PCR-elektroforesis
4
Kloning ke vektor ekspresi
5
Transformasi-skrining biru
putih
v
v
v v
v v
v v
6
SDS PAGE
v v
7
Uji aktivitas
v
v
8
Pembuatan laporan
v v v
v
v
DAFTAR PUSTAKA
Mishra, Saroj, Beguin, Pierre, dan Jean-Paul Aubert. 1990. Transcription of
Clostridium thermocellum Endoglucanase Genes celF and celD, Journal of
Bacteriology volume 173 nomor 1 halaman 80-85. Washington: American
Society for Microbiology.
Joliff, Gwennael, Pierre Bdguin, dan Jean-Paul Aubert. 1986.
Nucleotide
sequence of the cellulase gene celD encoding endoglucanase D of
Clostridium thermocellum, Nucleic Acids Research Journal halaman 86058613. Oxford: Oxford University Press.
LAMPIRAN
Rincian Biaya Penelitian
Total Biaya
No.
Justifikasi
Jumlah
1
PCR mix (PROMEGA)
1 kit
1,700,000
100
2,000,000
100 mg
2,500,000
2
Oligonucleotide primers sythesis @ US$
2/nucleotide
(Rp)
3
X-GAL (PROMEGA)
4
Kultur E. coli Tuner (DE3) pLacI
5
IPTG-dioxan free (PROMEGA)
1g
1,500,000
6
Agarose (PROMEGA)
100 g
3,000,000
7
Ethidium bromide (PROMEGA)
0,5 mL
2,500,000
8
Chloramphenicol
9
Medium kultur bakteri (Luria Bertani):
500,000
200,000
Yeast extract
500 g
1,000,000
Bacto tryptone
250 g
1,500,000
Bacto peptone
500 g
1,500,000
Bacto agar
1 lb
1,500,000
10
Gel extraction Kit (PROMEGA)
1
2,500,000
11
Plasmid isolation kit (PROMEGA)
1
2,000,000
12
Enzim restriksi EcoRV(PROMEGA)
13
Enzim ligasi (PROMEGA)
2 kit
2,000,000
14
Vektor ekspresi pET-Blue 1 (Novagen)
1 kit
2,000,000
15
Cawan Petri
3 buah
37,500
16
Pipet tips
1 pack
1,000,000
17
PCR tube
1 pack
1,000,000
18
Mikrotube 1,5 mL
1 pack
1,000,000
19
Sekuensing dan pengiriman sampel
2 enzim @ 1
kit
1,600,000
1,000,000
TOTAL
33,537,500