PENDAHULUAN A. Latar Belakang Stevia rebaudiana
advertisement
BAB I PENDAHULUAN A. Latar Belakang Stevia rebaudiana adalah tanaman herbal yang berasal dari Amerika Selatan (Paraguay dan Brazil). S. rebaudiana mengandung senyawa diterpen glikosida. Kandungan senyawa diterpen glikosida utama dalam tanaman S. rebaudiana adalah steviosida (6-10%) dan rebaudiosida A (2-4%) (Pól dkk., 2007). Senyawa steviosida dan rebaudiosida A memiliki kemiripan struktur kimia. Karena mengikat sejumlah molekul glukosa, kedua senyawa memiliki polaritas yang tinggi dan terlarut dalam akuades. Perbedaan struktur kimia kedua senyawa hanya pada jumlah glukosa yang terikat pada atom C-13. Rebaudiosida A mengikat 3 molekul glukosa pada atom C-13, sedangkan steviosida mengikat 2 molekul glukosa. Struktur tersebut menyebabkan rebaudiosida A sedikit lebih polar daripada steviosida. Struktur kimia steviosida dan rebaudiosida A ditunjukkan pada Gambar 1. Metode analisis kuantitatif kedua analit sangat perlu untuk dikembangkan berkaitan dengan beberapa faktor seperti: steviosida sangat potensial dikembangkan sebagai kandidat obat antidiabetes tipe 2 karena memiliki bioaktivitas antihiperglikemik yang berarti (Gregersen dkk., 2004). Bioaktivitas steviosida dan atau rebaudiosida A yang lain adalah antikanker (Takasaki dkk., 2009), antidiare (Wang dkk., 2014), imunomodulator (Sehar dkk., 2008), dan antioksidan (Hajihashemi dan Geuns, 2013; Kim dkk, 2011). Bioaktivitas kedua 1 senyawa aktif bersifat dose-dependent (Gregersen dkk., 2004; Kujur dkk., 2010; Melis dkk., 1991; Jepersen dkk., 2000). Oleh karena itu, aspek kuantitatif sangat penting diperhatikan dalam pengembangan penelitian-penelitian yang berhubungan dengan senyawa aktif steviosida dan rebaudiosida A terhadap bioaktivitasnya. (a) Gambar 1. (b) Struktur kimia (a) steviosida (BM = 804 g/mol) dan (b) rebaudiosida A (BM = 966 g/mol) Aspek lain pentingnya pengembangan studi metode analisis kuantitatif steviosida dan rebaudiosida A adalah pemanfaatan steviosida dan rebaudiosida A yang memiliki karakteristik kemanisan tinggi (300× lebih dibanding sukrosa) dan rendah kalori sebagai pemanis alami di beberapa negara (Liu dkk., 2010); berhubungan dengan berbagai regulasi yang mengatur kadar steviosida dan rebaudiosida A yang diijinkan serta batasannya (Well dkk., 2013); serta nilai 2 keekonomian ekstrak terpurifikasi steviosida dan rebaudiosida A ditinjau dari aspek kuantitatif senyawa analit (Gardana dkk., 2010). Lebih jauh, saat ini, Indonesia belum memiliki Standar Nasional Indonesia (SNI) sebagai acuan untuk metode analisis kuantitatif steviosida dan rebaudiosida A baik dalam daun S. rebaudiana, ekstrak dan atau ekstrak terpurifikasi yang mengandung kedua analit maupun dalam produk komersial yang mengandung kedua analit meskipun telah mengijinkan pemanfaatan kedua senyawa sebagai pemanis alami (BPOM, 2014). Penelitian Martono dkk. (2012) menunjukkan bahwa kemurnian dalam proses kristalisasi steviosida dan rebaudiosida A sangat dipengaruhi oleh kadar kedua analit dalam bahan baku daun S. rebaudiana dan setiap tahap prosesnya. Oleh karena itu, aplikasi metode analisis kuantitatif untuk penetapan kadar kedua analit dalam daun S. rebaudiana sangat diperlukan dalam kaitannya untuk keberhasilan proses kristalisasi baik steviosida maupun rebaudiosida A atau kedua-duanya. Penelitian Martono dan Hastuti (2013) serta Martono dan Soetjipto (2014) juga menunjukkan bahwa produk simulasi minuman Stevia yang dikembangkan berpotensi sebagai minuman fungsional antidiabetes. Bioaktivitas produk simulasi minuman stevia sangat dipengaruhi oleh kadar senyawa analit yang terkandung di dalamnya. Kadar senyawa analit dalam produk simulasi minuman tergantung pada kadar kedua analit dalam daun S. rebaudiana sebagai bahan bakunya. Oleh karena itu, penetapan kadar kedua analit baik dalam daun S. rebaudiana maupun dalam produk simulasi minuman Stevia sangat diperlukan dalam kaitannya dengan standardisasi produk simulasi minuman Stevia berdasar kadar kedua analit. 3 Berbagai metode analisis steviosida dan rebaudiosida A telah dikembangkan. Sebagian besar metode analisis kuantitatif steviosida dan rebaudiosida A berbasis pada metode High Performance Liquid Chromatography (HPLC). Metode HPLC fase normal (normal phase, NP-HPLC) yang dikembangkan dapat memisahkan kromatogram steviosida dan rebaudiosida A secara sempurna (Kolb dkk., 2001; Dacome dkk., 2005). Namun demikian, pengkondisian kolom membutuhkan waktu yang panjang, selain itu keterulangan waktu retensi analisis sangat bervariatif sehingga reprodusibilitas metode analisis kurang (Bergs dkk., 2012). Metode HPLC fase terbalik (reversed phase, RPHPLC) dengan sistem elusi gradien juga dapat memisahkan kromatogram steviosida dan rebaudiosida A dengan baik (Cacciola dkk., 2011; Jaworska dkk., 2012; Minne dkk., 2004; Zhao dkk., 2013; Catharino dan Santos, 2012; Gardana dkk., 2010; Pól dkk., 2007; Ni dkk., 2007; Shafii dkk., 2012; Well dkk., 2013; Yang dan Chen, 2009). Penggunaan sistem elusi gradien memiliki keunggulan dapat memisahkan senyawa yang polaritasnya hampir sama. Namun, kelemahan sistem elusi gradien ini adalah jika homogenitas fase gerak tidak terjaga maka memberikan keterulangan yang kurang baik dan pada elusi yang lama dapat dihasilkan drift. Selain itu, metode yang dikembangkan masih tinggi dalam konsumsi asetonitril dan membutuhkan waktu yang lama (kurang lebih 60 menit). Metode RP-HPLC dengan sistem elusi isokratik yang dikembangkan lebih praktis dalam operasional, menekan konsumsi asetonitril, dan cepat (Bergs dkk., 2012; Samah dkk., 2013). Namun demikian, profil kromatogram steviosida dan 4 rebaudiosida A belum menunjukkan pemisahan yang sempurna seperti ditunjukkan pada Gambar 2. Sebagian besar metode HPLC yang dikembangkan menggunakan detektor UV pada panjang gelombang 210 nm. Berdasarkan struktur kimia kedua analit, kromofor yang menyerap radiasi elektromagnetik pada panjang gelombang 210 nm adalah gugus ester R-COO-R sebagai kromofor pendek dengan nilai ekstingsi atau serapan molar () 50-70 (Snyder, 1997). Intensitas penyerapan radiasi elektromagnetik oleh kromofor ini tidak tinggi sehingga sensitivitasnya akan menurun. Namun demikian, kadar kedua analit yang tinggi dalam sampel tetap memungkinkan deteksi kedua pada panjang gelombang 210 nm. Metode analisis kuantitatif steviosida dan rebaudiosida A nonkromatografi yang dikembangkan adalah metode analisis spektroskopi. Metode analisis spektroskopi memiliki keunggulan lebih cepat, efisien, praktis, dan sederhana dalam operasionalnya. Pengembangan metode analisis kuantitatif steviosida dan rebaudiosida A secara spektroskopi diantaranya adalah spektroskopi Near InfraRed (NIR) (Hearn dan Subedi, 2009; Yu dkk., 2011), dan Nuclear Magnetic Resonance (NMR) kuantitatif (Pieri dkk., 2011). Metode analisis spektroskopi Fourier Transform Infrared (FTIR) senyawa steviosida dan rebaudiosida A masih terbatas pada analisis kualitatif identifikasi gugus fungsi (Prakash Chaturvedula dkk., 2012) dan belum pernah ada yang mengembangkan untuk analisis kuantitatifnya. 5 (a) Gambar 2. (b) Profil kromatogram steviosida dan rebaudiosida A dalam (a) sampel ekstrak daun S. rebaudiana menggunakan sistem elusi isokratik, fase gerak asetonitril : akuades (80 : 20, v/v), fase diam C-18 (Samah dkk., 2013); (b) standard dan ekstrak terpurifikasi steviol glikosida menggunakan sistem elusi isokratik, fase gerak asetonitril : akuades (35 : 65, v/v), fase diam RP C-18, steviosida (4) dan rebaudiosida A (3) (Berg dkk., 2012). 6 Metode analisis spektroskopi FTIR yang dikombinasi dengan kemometrika dapat diaplikasikan untuk analisis kuantitatif senyawa bahan alam dalam ekstrak (Rohman dkk., 2105; Rohman dkk., 2014a; Rohman dkk., 2011b). Oleh karena itu, penelitian ini juga mengembangkan metode analisis kuantitatif senyawa steviosida dan rebaudiosida A dengan metode spektroskopi FTIR yang dikombinasi dengan kemometrika Partial Least Square (PLS). Metode analisis spektrofotometri FTIR yang dikembangkan dapat menjadi metode alternatif untuk analisis rutin dalam sistem kontrol kualitas secara cepat, praktis, dan efisien. Preparasi sampel sangat menentukan dalam analisis senyawa aktif. Metode preparasi sampel yang dilakukan dalam analisis HPLC diantaranya adalah ekstraksi pelarut (Dacome dkk., 2005; Jaworska dkk., 2012; Kolb dkk., 2001; Shafii dkk., 2012; Well dkk., 2013; Yang dan Chen, 2009) dan solid phase extraction (SPE) (Bergs dkk., 2012; Bovanová dkk., 1998; Gardana dkk., 2010; Woelwer-Rieck dkk., 2010b). Masing-masing metode memiliki keunggulan dan kelemahan. Metode ekstraksi sampel dengan pelarut memiliki keunggulan lebih praktis dan cepat namun belum dapat menghilangkan senyawa-senyawa pengotornya sehingga matriks sampel masih komplek. Selain itu, emulsi dapat terbentuk dalam metode ekstraksi pelarut sehingga mempersulit pemisahan senyawa analit yang dituju (Martono dkk., 2012). Metode SPE memiliki keunggulan dapat menghilangkan senyawa-senyawa pengotor sehingga matriks sampel lebih sederhana dan tidak terjadi emulsi sedangkan kekurangannya adalah lebih mahal dan dapat terjadi bias oleh faktor pengenceran pelarut (Berg dkk., 2012). Metode ekstraksi sampel dengan pelarut menggunakan jenis dan polaritas 7 pelarut serta waktu ekstraksi yang berbeda-beda sehingga diperlukan optimasi kondisi ekstraksi pelarut. Metode SPE yang pernah dikembangkan semuanya menggunakan fase terbalik (C-18) (RP-SPE) (Bergs dkk., 2012; Bovanová dkk., 1998; Gardana dkk., 2010; Woelwer-Rieck dkk., 2010b). Metode SPE fase normal (silika) (NP-SPE) belum pernah ada yang mengembangkan untuk analisis senyawa steviosida dan rebaudiosida A secara HPLC. Dalam pemrosesan bahan baku menjadi produk, senyawa analit dimungkinkan terdegradasi. Senyawa steviosida dan rebaudiosida A dalam minuman bersoda mengalami degradasi menj -Rieck dkk., 2010). Dalam minuman soda, steviosida lebih stabil dibandingkan rebaudiosida A (Woelwer-Rieck dkk., 2010a). Dalam sistem larutan, steviosida stabil pada pemanasan hingga 120oC dan mulai terdegradasi pada pemanasan > 140oC serta stabil pada pH 2,0 - 10,0 namun terdegradasi pada pH 1,00 (Kroyer, 2010). Senyawa steviosida dan rebaudiosida A tidak mengalami degradasi yang berarti oleh karena pengaruh cahaya (Clos dkk., 2008). Dalam produk susu semi skim, minuman kedelai, susu terfermentasi, es krim, yoghurt, biskuit, dan selai, senyawa steviosida dan rebaudiosida A tidak terdegradasi (Jooken dkk., 2012). Studi hidrolisis senyawa baku steviosida dan rebaudiosida A dalam larutan asam dan basa dengan pemanasan menggunakan refluks menunjukkan pemutusan ikatan glikosida pada atom C-19 dan satu ikatan glikosida pada atom C-13 (Chaturvedula dan Prakash, 2011) yang mempengaruhi polaritasnya. Hal tersebut menunjukkan studi degradasi steviosida dan rebaudiosida A terhadap asam dan 8 basa dalam sistem larutan, termal dan cahaya sangat penting dipelajari dalam kaitannya dengan degradasi senyawa. Berg dkk. (2012) yang mengembangkan metode analisis HPLC fase terbalik isokratik untuk analisis steviosida dan rebaudiosida A belum melaporkan studi kemampuan metode analisis yang dikembangkan dalam kaitannya dengan selektivitas kromatogram kedua analit dengan senyawa hasil degradasi terdekat. Oleh karena itu, penelitian ini juga melakukan studi degradasi kedua analit secara hidrolisis larutan asam, netral dan basa, termal dan cahaya untuk menentukan selektivitas antara kromatogrram analit dengan senyawa hasil degradasi terdekat menggunakan metode HPLC yang dikembangkan serta identifikasi senyawa hasil degradasinya. Diagram alir garis besar konsep penelitian disertasi ini disajikan pada Gambar 3. 1. Perumusan Masalah Berdasarkan latar belakang penelitian di atas, rumusan masalah penelitian ini adalah: a) Apakah metode analisis RP-HPLC isokratik yang dikembangkan memenuhi validasi metode dan dapat digunakan untuk penetapan kadar steviosida dan rebaudiosida A dari daun S. rebaudiana dan produk simulasi minuman Stevia? b) Apakah metode preparasi sampel SPE baik fase terbalik maupun fase normal dapat memenuhi jaminan akurasi dan presisi untuk analisis senyawa analit yang dituju menggunakan metode RP-HPLC isokratik yang dikembangkan? 9 Standar steviosida dan rebaudiosida A Daun S.rebaudiana Studi degradasi Analisis HPLC Ekstrak etanolik kering daun Optimasi Pemisahan simulasi minuman Stevia Stresor: hidrolisis, termal, cahaya Optimasi Preparasi Sampel Kadar aktual analit secara HPLC Komposisi fase gerak dan kecepatan alir Uji Kesesuaian Sistem Validasi Metode Aplikasi Sampel: Daun S. rebaudiana Simulasi minuman Stevia Permen rendah kalori Analisis HPLC Ekstraksi Pelarut SPE (NP-SPE dan RP-SPE) Uji akurasi dan presisi secara HPLC Pemindaian spektra FTIR Pemrosesan data dan optimasi frekuensi identifikasi senyawa hasil degradasi secara MS/MS Kalibrasi multivariat secara PLS Validasi metode berdasar prediksi kadar analit dalam sampel menggunakan kalibrasi PLS Gambar 3. Diagram alir garis besar konsep penelitian disertasi Studi Analisis Kimia Kuantitatif Steviosida dan Rebaudiosida A 10 c) Bagaimana degradasi kedua analit terhadap hidrolisis, termal, dan cahaya? dan bagaimana selektivitas senyawa analit dengan senyawa hasil degradasi-nya yang dianalisis menggunakan metode RP-HPLC isokratik yang dikembangkan? d) Apakah metode analisis FTIR yang dikembangkan dapat digunakan untuk penetapan kadar steviosida dan rebaudiosida A dalam daun S. rebaudiana dan produk simulasi minuman Stevia? 2. Keaslian penelitian Berdasarkan penelusuran penulis melalui indeks jurnal-jurnal internasional (American Chemistry Society, Elsevier, PubMed, Scopus, Science Direct dan lainlain), disertasi online, website institusi, pengembang instrumen analisis dan lainlain, berbagai metode analisis steviosida dan rebaudiosida A yang telah dikembangkan diantaranya adalah metode analisis RP-HPLC (Kolb dkk., 2001; Minne dkk., 2004; Dacome dkk., 2005; Cacciola dkk., 2011; Bergs dkk., 2012; Jaworska dkk., 2012; Zhao dkk., 2013). Metode analisis secara Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (LC-MS) (P´ol dkk., 2007; Yang dkk., 2009; Gardana dkk., 2010; Catharino dkk., 2012; Shafii dkk., 2012; Well dkk., 2013). Pengembangan metode analisis RP-HPLC dengan sistem elusi isokratik oleh Berg dkk. (2012) telah dapat menekan penggunaan asetonitril dan mempersingkat waktu analisis. Namun demikian, kromatogram senyawa steviosida dan rebaudiosida A masih belum terpisah secara sempurna, sampel yang digunakan masih terbatas pada ekstrak terpurifikasi dan validasi metode masih terbatas pada senyawa rebaudiosida A. Oleh karena itu, penelitian disertasi 11 ini mengembangkan metode analisis kuantitatif senyawa steviosida dan rebaudiosida A secara RP-HPLC dengan sistem elusi isokratik yang menghasilkan pemisahan sempurna kromatogram senyawa analit yang dituju. Metode yang dikembangkan divalidasi baik untuk analisis senyawa steviosida maupun rebaudiosida A. Metode yang dikembangkan diaplikasikan pada sampel yang memiliki matriks sederhana hingga komplek untuk penetapan kadar senyawa analit dalam daun S. rebaudiana, produk permen rendah kalori, dan produk simulasi minuman Stevia. Metode preparasi sampel dalam analisis senyawa steviosida dan rebaudiosida A secara RP-HPLC yang telah dikembangkan adalah ekstraksi pelarut (Dacome dkk., 2005; Jaworska dkk., 2012; Kolb dkk., 2001; Shafii dkk., 2012; Well dkk., 2013; Yang dan Chen, 2009) dan SPE (Bergs dkk., 2012; Bovanová dkk., 1998; Gardana dkk., 2010; Woelwer-Rieck dkk., 2010b). Masingmasing metode ekstraksi pelarut menggunakan pelarut organik dan konsentrasi yang berbeda-beda. Penelitian ini mengoptimalisasi metode ekstraksi pelarut dengan variasi pelarut organik yang digunakan, konsentrasi pelarut, lama ekstraksi dan siklus atau frekuensi re-ekstraksi. Metode preparasi sampel SPE yang telah dikembangkan semuanya menggunakan SPE fase terbalik dengan catridge C-18 sedangkan SPE fase normal belum pernah dikembangkan. Metode analisis kuantitatif spektroskopi senyawa steviosida dan rebaudiosida A yang dikembangkan diantaranya spektroskopi NIR (Hearn dkk., 2009; Yu dkk., 2010) dan NMR kuantitatif (Pieri dkk., 2011), sedangkan metode analisis FTIR untuk senyawa tersebut masih terbatas secara kualitatif (Prakash 12 Chaturvedula dkk., 2012). Oleh karena itu, penelitian ini mengembangkan metode analisis kuantitatif spektroskopi FTIR yang dikombinasi dengan kemometrika PLS untuk penetapan kadar senyawa steviosida dan rebaudiosida A dalam sampel ekstrak daun S. rebaudiana dan produk simulasi minuman Stevia. Studi degradasi senyawa steviosida dan rebaudiosida A yang telah dilakukan adalah degradasi steviosida dalam sistem minuman bersoda (Prakash dkk., 2012; Woelwer-Rieck dkk., 2010a), sistem larutan dengan pengaruh suhu pemanasan dan pH larutan (Kroyer, 2010), sistem makanan (Jooken dkk., 2012), dan fotodegradasi (Clos dkk., 2012). Selain itu, studi hidrolisis senyawa steviosida dan rebaudiosida A dalam larutan asam dan basa dikembangkan oleh Chaturvedula dan Prakash (2011) dan Musa dkk. (2014). Penelitian yang telah dilakukan tersebut menekankan pada stabilitas dan identifikasi hasil degradasi senyawa analit, sedangkan penelitian ini lebih menekankan pada studi selektivitas antara senyawa analit dengan senyawa hasil degradasi pada metode RP-HPLC isokratik yang dikembangkan. Faktor stressor pendegradasi meliputi hidrolisis larutan asam, netral, dan basa; pemanasan termal; paparan cahaya UV254 nm. 3. Urgensi atau kepentingan penelitian Indonesia mengijinkan penggunaan ekstrak S. rebaudiana sebagai pemanis alami yang tertuang dalam aturan Peraturan Kepala Badan Pengawas Obat Dan Makanan Republik Indonesia Nomor 4 Tahun 2014 Tentang Batas Maksimum Penggunaan Bahan Tambahan Pangan Pemanis. Selain itu, Indonesia juga mengembangkan steviosida dari S. rebaudiana sebagai pemanis seperti yang tertuang dalam Peraturan Menteri Kesehatan Republik Indonesia Nomor 87 Tahun 13 2013 Tentang Peta Jalan Pengembangan Bahan Baku Obat. Namun demikian, Indonesia belum memiliki acuan SNI tentang penetapan kadar steviosida dan rebaudiosida A. Metode analisis kuantitatif steviosida dan rebaudiosida A yang dikembangkan dapat menjadi acuan SNI tentang penetapan kadar steviosida dan rebaudiosida A yang hingga saat ini belum dirumuskan. Studi pengembangan metode analisis kuantitatif steviosida dan rebaudiosida A sangat mendukung dalam penelitian-penelitian bioaktivitas kedua analit untuk dikembangkan sebagai bahan aktif obat. Bioaktivitas kedua analit bersifat dose dependent sehingga sangat penting untuk mengontrol kadar kedua analit. Selain itu, penelitian ini juga sangat berarti dalam pengembangan teknologi budidaya tanaman S. rebaudiana berdasarkan aspek kadar kedua analit. Metode analisis yang dikembangkan juga sangat berarti dalam pengembangan teknologi proses purifikasi dan kristalisasi kedua analit karena keberhasilan metode sangat dipengaruhi oleh kadar kedua analit dalam produk dan setiap tahap prosesnya. Penelitian ini juga mengembangkan metode analisis kuantitatif steviosida dan rebaudiosida A secara spektrofotometri FTIR yang dikombinasi dengan kemometrika PLS yang selama ini belum pernah dikembangkan. Metode spektrofotometri FTIR yang dikembangkan tidak saja diaplikasikan dalam sampel padatan namun juga cairan. Hasil yang didapat memberikan terobosan bahwa metode analisis kuantitatif FTIR yang dikombinasi dengan kemometrika PLS dapat diaplikasikan pada sistem cairan walupun ikatan hidrogen dalam sistem sampel cairan memiliki serapan yang kuat terhadap sinar mid-infrared dan menutup serapan puncak-puncak yang lain. 14 Metode analisis kuantitatif spektrofotometri FTIR memiliki keunggulan lebih cepat, praktis, dan sederhana dalam operasional sehingga sangat cocok untuk analisis rutin kontrol kualitas di industri. Metode analisis spektrofotometri FTIR yang dikembangkan untuk penetapan kadar steviosida dan rebaudiosida A baik dalam ekstrak daun S. rebaudiana maupun produk simulasi minuman Stevia dapat dijadikan metode alternatif yang valid dan reliable. B. Tujuan Penelitian ini bertujuan: 1. Mengembangkan metode analisis kuantitatif steviosida dan rebaudiosida A secara RP-HPLC isokratik yang memenuhi jaminan validasi metode dan mengaplikasikannya untuk penetapan kadar kedua senyawa dalam daun S. rebaudiana dan produk simulasi minuman Stevia. 2. Mengembangkan metode preparasi sampel dengan metode Solid Phase Extraction (SPE) baik fase terbalik maupun fase normal yang memenuhi jaminan akurasi dan presisi. 3. Melakukan studi degradasi senyawa steviosida dan rebaudiosida A dan menentukan pengaruhnya terhadap selektivitas analit dengan senyawa hasil degradasi menggunakan metode HPLC yang dikembangkan. 4. Mengembangkan metode analisis kuantitatif steviosida dan rebaudiosida A dengan metode spektroskopi FTIR yang dikombinasi dengan analisis multivariat PLS dan mengaplikasikannya untuk penetapan kadar kedua analit dalam daun S. rebaudiana dan produk simulasi minuman Stevia. 15
