Profil Protein Bakteri Pendetoksifikasi Metilmerkuri

Jurnal Kimia Indonesia
Vol. 5 (1), 2010, h.39-42
Profil Protein Bakteri Pendetoksifikasi Metilmerkuri Menggunakan
Elektroforesis Gel Native
Suheryanto1 dan Elisa Nurnawati2
Jurusan Kimia, F-MIPA, Universitas Sriwijaya
2
Jurusan Biologi, F-MIPA, Universitas Sriwijaya
1
E-mail: [email protected]
Abstrak. Enam isolat bakteri pendetoksifikasi metilmerkuri telah dikaji profil proteinnya
menggunakan Elektroforesis Gel Native Tujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui profil protein
spesifik yang diduga mempunyai aktivitas dalam mendetosifikasi metilmerkuri. Enam isolat bakteri :
strain SDM 41,(Brevundimonas dimunata), strain SDM 78 (Bacillus cereus), strain SDM 81
(Empedobacter brevis), strain SDPM 8a (Klebsiella pneumoniae ssp pneumoniae), strain SDPM 8b
(Pseudomonas aerogenosa) dan strain SDPM 24 (Spingomonas aucimobilis) serta bakteri kontrol
positif (Pseudomonas putida IFO 14796) ditumbuhkan dalam medium Luria Bertani (LB) cair yang
mengandung metilmerkuri dengan konsentrasi masing-masing : 2,5 g/mL, 2,0g/mL; 1,0g/mL;
2,0g/mL; 2,0 g/mL; 1,0g/mL. Sel diunduh setelah inkubasi selama 24 jam. Selanjutnya dilakukan
preparasi biomasa sel untuk deteksi protein dengan Elektroforesis Gel Native. Hasil penelitian
menunjukkan bahwa dua isolat bakteri berikut: isolat SDM 41 ,(Brevundimonas dimunata) dan isolat
SDM 78 (Bacillus sp), menghasilkan protein spesifik dengan berat molekul 18,67 – 21,32 kDa dan
56,48 – 64,5 kDa yang diduga mempunyai aktivitas detoksifikasi terhadap metilmerkuri.
Kata kunci: protein, elektroforesis, bakteri, detoksifikasi, metilmerkuri
Pendahuluan
Proses pemutusan ikatan CH3-Hg+ menjadi
gugus -CH4 dan ion merkuri Hg2+ disebut
demetilasi, dalam kasus ini disebut detoksifikasi
atau degradasi metilmerkuri.
CH3Hg+ + H+ 
CH4 + Hg2+
Detoksifikasi dapat berlangsung secara biologi
maupun fisik. Secara biologi reaksi demetilasi
metilmerkuri melalui mekanisme enzimatis oleh
mikrobia. Sedangkan secara fisik reaksi demetilasi
dapat
berlangsung
melalui
mekanisme
fotodegradasi. Bakteri yang resisten terhadap
metilmerkuri mempunyai kemampuan untuk
menurunkan
toksisitas
atau
detoksifikasi
metilmerkuri, karena bakteri tersebut menghasilkan enzim organomercurial lyase yang
disandi oleh gen merB. Enzim ini selanjutnya akan
mengkatalisis pemutusan ikatan H3C-Hg pada
senyawa metilmerkuri menjadi ion Hg2+.
Selanjutnya ion Hg2+ direduksi oleh enzim
mercuric reductase (MerA) menjadi Hgo yang
bersifat volatil.1-3 Beberapa strain bakteri yang
resisten terhadap metilmerkuri antara lain
Pseudomonas aeruginosa PU21, dan Escherichia
coli PWS14, serta Pseudomonas putida FB1.2
Penelitian biologi molekular membuktikan bahwa
bakteri
yang resisten terhadap metilmerkuri
mempunyai gen yang bertanggung jawab untuk
menghasilkan kedua enzim tersebut yang tersandi
pada plasmid.
Enam isolat bakteri yang resisten terhdap
metilmerkuri telah diisolasi dari sedimen sungai
Sangon Kulonprogo Yogyakarta.5 Isolat tersebut
telah diuji kemampuan detoksifikasinya terhadap
metilmerkuri, namun kajian molekular belum
dilakukan. Kajian molekular isolat tersebut penting
dilakukan karena untuk mengetahui mekanisme
degradasi metilmerkuri. Isolasi protein spesifik
dari bakteri tersebut merupakan langkah awal
dalam kajian molekular.
Tujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui
profil protein spesifik yang diduga mempunyai
aktivitas dalam mendetoksifikasi metilmerkuri.
Selain itu untuk menentukan kondisi pemisahan
protein menggunakan elektroforesis Gel Native.
Dapat dibaca di journal.kimiawan.org/jki
A.Hanafi S dan A. Nandang R
Percobaan
Bahan dan alat. Bakteri yang digunakan dalam
penelitian adalah isolat bakteri yang resisten
metilmerkuri yang diisolasi dari sedimen sungai
Sangon Kulonprogo Yogyakarta. Isolat tersebut
antara lain : strain SDM 41,(Brevundimonas
dimunata), strain SDM 78 (Bacillus cereus), strain
SDM 81 (Empedobacter brevis), strain SDPM 8a
(Klebsiella pneumoniae ssp pneumoniae), strain
SDPM 8b (Pseudomonas aerogenosa) dan strain
SDPM 24 (Spingomonas aucimobilis) serta bakteri
kontrol positif (Pseudomonas putida IFO 14796).
Bahan kimia yang digunakan untuk analisis
metilmerkuri dengan GLC antara lain: tolune,
aceton, isopropanol, Na2SO4., HCl, gas Argon.
Bahan kimia untuk deteksi protein dengan
elektroforsesi terdiri dari : Acrylamide, bisacrylamide (N,N-methylenebisacrylamide), Tris (2SDS
hydroximethyl-2-methyl-1,3-propanediol),
(sodium dodecyl sulfate atau sodium lauryl sulfate),
TEMED
(N,N,N,N-Tetramethyleneethylenediamine), amonium persulfat , 2-mercaptoethanol,
glycerol, bromophenol blue, glycine, asam klorida,
dithiothreitol. Marker protein (Promega MidRanger Protein MW Marker, V5234) yang
digunakan antara lain : phosporylase B (97.400
Da), Bovine serum albumin (66.000 Da), Lglutamic dehydrogenase (55.000 Da), ovalbumin
(42.700 Da), Aldolase (40.000 Da), Carbonic
anhydrase (31.000 Da) dan Soybean trypsin
inhibitor (21.500 Da).
Peralatan utama yang digunakan dalam
penelitian ini adalah GLC merk Shimadzu model
14B, Elektorforesis Kit, Sentrifus, Shaker
Incubator, Ultrasonikator dan sperangkat alat gelas.
Cara kerja. Pembuatan inokulum. Medium
pertumbuhan Luria-Bertani (LB) sebanyak 50 mL
diinokulasi dengan 5 ose isolat bakteri strain SDM
41,(Brevundimonas dimunata), strain SDM 78
(Bacillus cereus), strain SDM 81 (Empedobacter
brevis), strain SDPM 8a (Klebsiella pneumoniae
ssp pneumoniae), strain SDPM 8b (Pseudomonas
aerogenosa) dan strain SDPM 24 (Spingomonas
aucimobilis) serta bakteri kontrol positif
(Pseudomonas putida IFO 14796) dari medium
agar miring. Kultur tersebut diinkubasi pada suhu
ruang (30oC) selama 12-24 jam. Kultur dapat
digunakan untuk percobaan setelah kekeruhannya
telah mencapai OD  0,6.
Inokulasi kultur ke dalam medium pertumbuhan.
Inokulasikan 50 mL kultur di atas ke dalam 450
mL medium LB yang mengandung metilmerkuri
2,5 g/mL(isolat SDM 41), 2,0 g/mL (isolat
40
SDM 78/9a); 1,0g/mL (isolat SDM 81); 2,0
g/mL (isolat SDPM 8a); 2,0 g/mL (isolat SDPM
8b); 1,0 g/mL (isolat SDPM 24, Pseudomonas p)
dan medium LB tanpa metilmerkuri sebagai
kontrol. Kultur diinkubasi diatas meja penggojog
dengan kecepatan agitasi 120 rpm pada suhu ruang
(30C) selama 24 jam.
Pengunduhan sel dan preparasi biomasa sel
bakteri. Kultur bakteri yang telah mencapai OD600
nm  0,6 dimasukkan dalam 10 tabung conical 50
mL selanjutnya disentrifuse pada 3500 g suhu 4 oC
selama 20 menit.
Supernatan (ekstra sel)
dipisahkan dari pelet dan tampung dalam satu
wadah (erlenmeyer 500 mL). Pelet dicuci dua kali
dengan Tris-HCl+EDTA pH 7,4
kemudian
disonikasi pada 20 kHz 95 W 40 % siklus selama 5
x 10 detik. Supernatan yang telah disonikasi
disentrifus kembali pada 10.000 g suhu 4oC selama
20 menit. Hasil sentrifugasi terakhir berupa
Supernatan fraksi sitoplasmik atau CFE (Cell Free
Extract) untuk visualisasi protein dan pelet
(dinding sel atau menbran). Pelet dari dinding
sel/membran sel dicuci dua kali dengan Tris-HCl +
EDTA pH 7,4 kemudian disentrifus pada 10.000 g
suhu 4oC selama 20 menit. Hasil sentrifugasi
berupa supernatan fraksi membran sitoplasmik
atau sel debris (dinding + membran sel) digunakan
untuk visualisasi protein dan pelet sisa dibuang.6-8
Sebelum digunakan protein-protein tersebut
disimpan pada suhu -20oC.
Elektroforesis Gel NATIVE. Untuk menentukan
kondisi pemisahan protein terbaik, maka dilakukan
variasi resolving gel (10, 12 dan 15%), sedangkan
stacking gel dibuat tetap 3%. Persiapan running:
sampel protein dilarutkan dalam sampel buffer
dengan perbandingan 4 bagian sampel buffer dan 1
bagian sampel protein. Sampel direbus dalam air
mendidih selama beberapa menit, setelah
didinginkan sampel siap diaplikasikan dalam gel.
Marker protein sebanyak 5 µL ditambahkan 5 µL
sampel buffer kemudian dimasukkan ke dalam
sumuran. Sampel di running pada gel dengan
voltase konstan 100 volt. Setelah proses running
selesai sampel divisualisasi mengunakan larutan
staining 0,1 % (b/v) coomasive brilian blue R-250
selama 12 jam pada suhu ruang dan diaduk di atas
shaker pada kecepatan 40 rpm. Gel didestaining
menggunakan larutan destaining dan disimpan
dalam larutan asam asetat 10%.9
Jurnal Kimia Indonesia Vol. 5(1), 2010
Studi Pengaruh Bentuk Silika dari Abu Ampas Tebu terhadap Kekuatan Produk Keramik
M
A
B
C
D
E
F
G
Gambar 1. Profil protein isolat bakteri dengan
elektroforesis Gel Native dalam medium tanpa
MeHg
M
A
B
C
D
E
F
G
Gambar 2. Profil protein isolat bakteri dengan
elektroforesis Gel Native dalam medium MeHg.
(Ket gambar M = marker protein, A= bakteri kontrol (Pseudomonas
putida), B= isolat SDM 41; C= SDM 78; D= SDM 81; E= SDPM 8a;
F=SDPM 8b dan G=SDPM 24)
Hasil dan Pembahasan.
Deteksi protein dengan elektroforesis. Isolat
bakteri yang ditumbuhkan dalam médium LB yang
mengandung metilmerkuri akan mengalami stres
akibat toksisitas senyawa tersebut. Stres atau
cekaman metilmerkuri ini ditanggapi dengan cara
adaptasi lingkungan yaitu pertumbuhan yang
lambat antara 1 – 5 jam. Selama proses adaptasi
terjadi perubahan senyawa di dalam sel yang
dilakukan oleh enzim. Selain itu akan terjadi
perubahan kecepatan dan jalur metabolisme.
Enzim adalah protein, oleh karena itu pengendalian
metabolik dapat diketahui dengan mendeteksi
perubahan profil protein yang terjadi.
Profil protein pada Gambar 1 merupakan hasil
pemisahan terbaik dari variasi Gel Native yang
dilakukan (10%, 12% dan 15%). Penggunaan Gel
Native 12% dan 15% menunjukkan pita protein
tidak terpisah sempurna dan pita marker terlihat
menumpuk di atas. Keenam isolat ditumbuhkan
pada medium yang mengandung metilmerkuri,
ternyata menghasilkan dua protein spesifik dengan
berat molekul yang berbeda, yang ditunjukkan
pada Gambar 2.
Isolat 78 menghasilkan protein spesifik dengan
berat molekul 59,22 dan 21,59 kDa, isolat 81
menghasilkan protein spesifik dengan berat
molekul 55.97 dan 22,62 kDa, isolat 8a
menghasilkan protein spesifik dengan berat
molekul 59,22 dan 18,45 kDa, isolat 8b
menghasilkan protein spesifik dengan berat
molekul 63,43 dan 19,76 kDa,
isolat 24
menghasilkan protein spesifik dengan berat
molekul 55.97 dan 24,27 kDa, Protein tersebut
mempunyai berat molekul yang mirip dengan
enzim merkurireduktase (EC 1.16.1.1) yaitu 56 –
65 kDa7 dan organomerkuriliase (EC 4.99.1.2)
yaitu 19 – 27 kDa.10 Protein spesifik yang
dihasilkan oleh isolat tersebut diduga merupakan
enzim yang berperan dalam proses degradasi
metilmerkuri.
Kadar protein isolat SDM 81 dan SDPM 8b
lebih tinggi dibanding isolat lain. Tingginya kadar
protein pada kedua isolat berpengaruh pada kadar
enzim yang dihasilkan oleh isolat tersebut.
Kuantitas maupun kualitas enzim yang dihasilkan
akan berpengaruh pada aktivitas detoksifikasi
kedua isolat tersebut. Bakteri yang resisten
terhadap metilmerkuri akan memproduksi enzim
organomerkuriliase yang berfungsi memutus ikatan
CH3-Hg+ menjadi CH4 dan Hg2.2,3,4,11 Suheryanto
dkk.12 melaporkan bahwa isolat SDPM 8b dan
isolat SDM 81 mempunyai kemampuan
detoksifikasi lebih tinggi dibanding isolat lain.
Hal ini berkaitan erat dengan protein enzim
yang dihasilkan oleh bakteri tersebut. Kadar
protein enzim isolat SDPM 8b adalah 7,69 g/mL
dan isolat SDM 81 sebesar 9,78 g/mL. Enzim
adalah biokatalis yang berperan mempercepat laju
reaksi. Secara kinetis laju reaksi kimia selain
dipengaruhi oleh konsentrasi reaktan dan suhu,
juga dipengeruhi oleh katalis.13 Kadar protein
enzim pada dua isolat di atas lebih tinggi dibanding
isolat lain. Hal ini berarti organomerkuriliase yang
dihasilkan oleh kedua isolat lebih besar. Oleh
karena itu kemampuan kedua isolat tersebut dalam
mendetoksifikasi metilmerkuri lebih tinggi
dibanding isolat lain.
41
A.Hanafi S dan A. Nandang R
Tabel 1. Kadar protein lima isolat bakteri resisten
metilmerkuri
No
Kode
Isolat
1
2
3
4
5
SDM 41
SDM 78
SDM 81
SDPM 8a
SDPM 8b
SDPM 24
Kadar
Protein CFE
(g/mL)
0,17 ± 0,01
0,98 ± 0,01
9,70 ± 0,19
0,84 ± 0,01
7,69 ± 0,15
7,15 ± 0,18
Kadar Protein
Debris
(g/mL)
0,74 ± 0,02
0,38 ± 0,01
1,03 ± 0,02
0,43 ± 0,01
1,90 ± 0,04
1,03 ± 0,02
Kesimpulan
Berdasarkan hasil penelitian dapat disimpulkan
sebagai berikut bahwa rotein-protein isolat bakteri
pendetoksifikasi metilmerkuri dapat terpisah
dengan baik dengan Elektroforesis 10% Gel
Native. Protein spesifik yang divisualisasikan
melalui Elektroforesis Gel Native diduga
merupakan protein enzim yang berperan dalam
detoksifikasi metilmerkuri.
Saran
Perlu dilakukan penelitian lanjut untuk
mengisolasi, karakterisasi serta uji aktivitas enzim
yang
dihasilkan
oleh
strain
bakteri
pendetoksifikasi metilmerkuri.
Ucapan Terimakasih
Ucapan terimakasih penulis sampaikan kepada
Yth Pimpinan Proyek DP2M Dirjen DIKTI yang
telah mendanani penelitian ini. Ucapan serupa
kami sampaikan kepada Staf Laboratorium
Mikrobiologi Pusat Antar Universitas (PAU)
Universitas Gadjah Mada, Staf Laboratoium
Mikrobiologi Jurusan Biologi FMIPA Universitas
Sriwijaya dan Staf Laboratorium Bioikimia
Jurusan Kimia FMIPA Universitas Sriwijaya yang
telah memfasilitasi penelitian.
5. Suheryanto; Soetarto, E.S; Sugiharto, E.; Djohan,
T.S. Bakteri Resisten Metilmerkuri dari Sedimen
Sungai Sangon Kulonprogo, Daerah Istimewa
Yogyakarta. Berkala Ilmiah Biologi, 2008, 7(2), 4351.
6. Manz, A.; Pamme, N.; Lossifidis, D. Bioanalytical
Chemistry. Imperial Colleges Press: London, p.2963, 2004.
7. Bollag, D.M.; Rozycki, M.D.; Edelstein,S.J. Protein
Methode 2nd Edition. John Wiley and Sons
Publication: New York1996.
8. Schottel, J.L. The mercuric and organomercurial
detoxifying enzymes from a plasmide-bearing strain
of Escherichia coli. J.Biol.Chem., 1978, 253(12),
4341-4349.
9. Laemmli, U.K. Cleavage of Structural Proteins
During The Assembly of The Head of Bacteriophage
T4. Nature, 1970, 227, 680-685
10. Ogunseitan, O.A. Protein Methode for Investigating
Mercuric Reducatse Gene Expression in Aquatic
Environments. Appl. Environ. Microbiol., 1998,
64(2), 695-702
11. Nakamura, K.; Sakamoto, N.; Uchiyama,H.; Hagi, O.
Organomercurial-Volatilizing Bacteria in The
Mercury Polluted Sediment of Minamata Bay Japan.
Appl. Environ. Microbiol ,1990, 56(4), 304-305
12. Suheryanto; Soetarto, E.S.; Sugiharto, E.; Djohan,
T.S. Biodegradasi metimerkuri oleh bakteri tanah
yang diisolasi dari sedimen sungai Sangon
Kulonprogo Yogyakarta, Jurnal Pengelolaan
Lingkungan dan Sumber Daya Alam Program
Pascasarjana Universitas Sriwijaya, 2006
13. Liese, A.; Seelbach, K.; Wandrey, C. Industrial
Biotransformations 2nd ed., Wiley-VCH Verlag
GmbH & Co.KgaA, Weinheim, p. 24-29, 2006.
Pustaka
1. Summers, A.O. Organization, expression, and
evolotion of genes for mercury resistance. Annu. Rev.
Microbiol., 1986, 40, 607-634
2. Baldi, F.; Semplici, F.; Filippeli, M. Enviromental
Applications Resistant Bacteria. Wat. Air Soil
Pollut. , 1991, 56, 465-475.
3. Misra, T.K. Heavy Metals, Bacterial Resistance.
Encyclopedia of Mycrobiology 2nd Ed. Academic
Press, 618-626, 2000.
4. Chang, J.S.; Chao, Y.; Law, W.S. Repeated fedbatch operations for microbial of mercury using
wild-type and recombinant mercury-resistant
bacteria. J. Biotechnol. , 1998, 64, 219-230
42
Jurnal Kimia Indonesia Vol. 5(1), 2010