Model Perpindahan Massa pada Pemekatan Jus

3. KARAKTERISASI GEN DUGAAN PADA QUANTITATIVE
TRAIT LOCI (QTL) sting-2 LEBAH MADU Apis cerana
PENDAHULUAN
Perilaku hewan dipengaruhi oleh mekanisme fisiologi, metabolisme sel, dan
sekresi enzim yang diregulasi oleh gen. Terdapat beberapa gen yang hanya
terekspresi karena distimulus oleh faktor lingkungan (Drickamer et al. 2002).
Sifat atau perilaku hewan dapat terjadi karena adanya interaksi antara satu gen
bahkan banyak gen (poligen). Perilaku yang dipengaruhi oleh banyak gen disebut
sifat kuantitatif. Sifat kuantitatif dikatakan sebagai sifat yang kompleks, yang
tampilan fenotipenya tidak memperlihatkan adanya pewarisan sifat hukum mendel
(Pimrose 1995). Variasi genetik pada sifat kuantitatif disebabkan karena adanya
segregasi banyak lokus. Banyak sifat biologi yang diwariskan secara kuantitatif.
Sifat kuantitatif pada lebah A. mellifera contohnya adalah perilaku agresif dan non
agresif (Hunt et al. 1998; Arechavaleta-Velasco 2003) dan perilaku higienis dan
non higienis (Rothenbuhller 1964).
Quantitative Trait Loci (QTL) adalah sejumlah gen dalam kromosom suatu
individu yang bertanggung jawab terhadap variasi suatu sifat tertentu (Liu 1998).
Analisa untuk menentukan lokasi gen dalam kromosom yang bertanggung jawab
untuk suatu sifat kuantitatif tertentu disebut dengan pemetaan QTL. Pemetaan
QTL dapat dilakukan dengan melihat adanya keterpautan antara penciri genetik
dengan gen pada lokus atau QTL untuk suatu sifat kuantitatif tertentu. Untuk
mencari hubungan tersebut perlu menyusun suatu populasi yang besar dengan
rancangan tertentu dan melibatkan sejumlah besar penciri genetik.
Populasi
disusun berdasarkan sifat yang berbeda yang dimiliki oleh masing-masing
populasi tersebut. Gen yang diketahui mempengaruhi sifat tertentu akan
menunjukkan keterpautan atau linkage mapping dengan marker genetik dalam
peta genetik.
Sejumlah gen telah diketahui mempengaruhi perilaku tertentu pada lebah
madu A. mellifera. Perilaku defensif juga diketahui dikontrol oleh banyak gen.
Gen yang bertanggung jawab terhadap perilaku ini berhasil dipetakan oleh Hunt et
al (1998). Pemetaan ini dilakukan pada keturunan ratu F1 hasil kawin silang
30
antara koloni A. mellifera asal Eropa (EHB) yang sifat defensifnya rendah dengan
koloni A. mellifera asal Afrika yang sifat defensifnya tinggi (AHB). Setiap jantan
haploid dari ratu F1 dikawin silangkan dengan ratu EHB. Dari penelitian tersebut
diidentifikasi sebanyak lima QTL berdasarkan banyaknya jumlah sengat pada uji
agresivitas. Penelitian selanjutnya dilakukan Arechavaleta–Velasco (2003);
Guzman-Novoa et al. (2002) untuk melihat efek dari tiga komponen QTL yang
bertanggung
jawab
untuk
perilaku
defensif.
Komponen
QTL
tersebut
dikelompokan menjadi sting-1 yang mengekspresikan perilaku menyengat dan
menjaga sarang dan sting-2 dan sting-3 yang mengekspresikan perilaku menjaga
sarang.
Ukuran genom sebesar 81 kb berhasil disekuens dari A. mellifera yang
berhubungan dengan QTL sting-2 dalam mengendalikan perilaku defensif (Lobo
et al. 2003). Pada QTL ini ditemukan daerah mikrosatelit, Expressed Sequence
Tag (EST)1 dan EST2 yang sama dengan data pada Bee Brain Database A.
mellifera. Selain itu terdapat pula 15 gen dugaan (predicted genes 36L17.136L17.15).
Data sifat defensif A. cerana baik yang memiliki defensif tinggi maupun
rendah belum ada. Dengan demikian, untuk melakukan pemetaan QTL pada A.
cerana belum dapat dilakukan. Dalam penelitian ini, pendekatan karakterisasi gen
pengendali perilaku defensif dilakukan berdasarkan gen pengendali perilaku
defensif A. mellifera yang sudah dipetakan QTL nya dengan sekuens sejumlah
gen dugaan dalam QTL tersebut.
Berdasarkan data sekuens gen dugaan A. mellifera tersebut, penelitian ini
bertujuan untuk melakukan karakterisasi gen dugaan pengendali perilaku defensif
pada A. cerana. Karakterisasi A. cerana ini dilakukan pada gen dugaan 36L17.1,
36L17.14, dan 36L17.15.
31
BAHAN DAN METODE
Waktu dan tempat
Penelitian karakterisasi gen dugaan pada QTL sting-2 A. cerana
dilaksanakan bulan Juli 2008-Maret 2009. Analisis data dilakukan di Bagian
Fungsi Hayati dan Perilaku Hewan Departemen Biologi FMIPA IPB.
Alat dan bahan
Bahan untuk ekstraksi DNA terdiri atas Cetyl Trimetyl Amonium Bromide
(CTAB 2% (b/v)) (7.5 ml 1 M Tris-HCl pH 8; 3 ml 0.5 M NaEDTA pH 8; 6.135 g
NaCl; 1.5 g CTAB; dan air hingga 75 ml), proteinase K, Phenol Chloroform
Isoamyl alcohol (PCI), Chloroform Isoamyl Alcohol (CIAA), fenol, isopropanol,
etanol 70% (v/v), Tris-HCl EDTA (TE) (10 mM Tris-HCl EDTA pH 8; 1 mM
EDTA), nitrogen cair, grinder, pinset dan tabung 1.5 ml. Bahan untuk campuran
PCR (PCR mix) yaitu Mg2+ free buffer, MgCl2, dNTP, basa primer, dan Taq
polymerase. Bahan yang digunakan untuk elektroforesis adalah medium akrilamid
6% ((12.5 ml akuades; 4 ml akrilamid 30%; 5x TBE 4 ml; TEMED 15 µl; 10%
APS (Ammonium peroxo disulfat) 150 µl) 1xTBE (Tris 0.5 M, asam borat 0.65 M,
EDTA 0.02 M)), dan 5x loading dye (0.1% BPB (Bromophenol blue) dalam 1 ml
TE; 0.1% XC (Xylene cyanol) dalam 1 ml TE; 5 ml Gliserol; 3 ml TE).
Visualisasi DNA menggunakan formalin, NaOH (4 g/10 ml akuades) , NH4OH
(2.4 ml/200 ml akuades), asam asetat 1% (100 µl/ml), Na2CO3 (4 g/200 ml
akuades), AgNO3 (0.32 g/200 ml akuades), dan akuades. Enzim restriksi yang
digunakan yaitu AccIII (TCCGGA) dan CfoI (GCGC).
Metode
Koleksi lebah
Lebah untuk analisis DNA adalah pekerja A. cerana koloni 2 yang
berdasarkan observasi perilaku defensif menunjukkan respon yang rendah. A.
cerana ini berasal dari peternakan lebah swasta Gunung Geulis, Kecamatan
Tanjungsari, Kabupaten Sumedang. Lebah dikoleksi sebanyak 50 individu pekerja
dalam tabung 15 ml berisi etanol absolut.
32
Ekstraksi DNA
Sebelum ekstraksi, lebah dimasukan ke dalam TE (10 mM Tris-HCl EDTA
pH 8; 1 mM EDTA) untuk menghilangkan etanol dari jaringan. Ekstraksi
dilakukan menggunakan metode CTAB dan presipitasi alkohol mengikuti metode
Sambrook et al. (1989). Jaringan sumber DNA adalah bagian toraks lebah
pekerja. Toraks lebah dipisahkan dari bagian anggota tubuh lebah lainnya (kepala,
sayap, tungkai dan abdomen) menggunakan scalpel steril. Toraks dimasukan ke
dalam tabung 1.5 ml berisi nitrogen cair hingga jaringannya membeku (± 20
menit).
Setelah itu dengan bantuan grinder, toraks dalam tabung digerus hingga
jaringannya hancur. Sebanyak 500 µl buffer CTAB 2% (Cetyl Trimetyl Amonium
Bromide) dimasukkan ke dalam tabung yang berisi hancuran jaringan toraks.
Setelah itu ditambahkan Proteinase K (5mg/ml) sebanyak 14 μl untuk
mendegradasi protein. Tabung berisi campuran tersebut diinkubasi (2 jam) pada
suhu 55°C selanjutnya disentrifugasi 13 000 rpm (10 menit). Campuran larutan
DNA tersebut dipindahkan ke dalam tabung baru dan ditambahkan Phenol :
Chloroform : Isoamilalkohol = 25 : 24 : 1 (PCI) sebanyak 500 μl dikocok tangan
(5 menit) kemudian disentrifugasi 13 000 rpm (5 menit). Ke dalam tabung yang
berisi campuran DNA, di tambahkan Chloroform : Isoamilalkohol = 24 : 1
(CIAA) sebanyak 400 μl, disentrifugasi 13 000 rpm (5 menit). Tahapan ini
dilakukan 2x ulangan.
Lapisan DNA dibagian atas dipindahkan ke tabung baru. Campuran yang
berisi DNA dipresipitasi selama semalam pada suhu -4°C didalam 600 μl
isopropanol. Campuran DNA tersebut disentrifugasi 13 000 rpm (10 menit) pada
suhu 4°C. Larutan isopropanol dibuang lalu ditambahkan 500 μl etanol 70% (v/v)
dan disentrifugasi 13 000 rpm (10 menit). Etanol dibuang lalu dikeringkan dengan
cara divakum (30 menit). Pelet DNA yang diperoleh dilarutkan dalam Tris EDTA
0.5 mM dan disimpan pada suhu 4°C hingga saat akan dianalisis.
33
Amplifikasi DNA dengan PCR (Polymerase Chain Reaction)
DNA lebah hasil ekstraksi diamplifikasi menggunakan mesin PCR TaKaRa
Thermal Cycler MP4. Segmen DNA yang diamplifikasi adalah gen dugaan pada
QTL sting-2 yaitu 36L17.1, 36L17.14, dan 36L17.15 (Gambar 14). Total volume
pereaksi PCR yang digunakan adalah sebayak 12.5 μl, terdiri dari; 6.4 µl air
destilata steril (DW), 1 µl dNTP 0.2 μM, 1.25 µl Mg2+ free buffer, 1.5 µl MgCl2 3
mM, 0.1 µl Taq polymerase (5 U/µl) (New England Biolabs); 1 μl (0.6 µg/µl)
DNA hasil ekstraksi, primer forward 0.625 µl (10 µM), dan primer reverse 0.625
µl (10 µM). Primer yang digunakan didisain berdasarkan DNA gen dugaan QTL
sting-2 A. mellifera (Tabel 6, Gambar 15).
Tahapan PCR meliputi; Predenaturation pada suhu 94°C selama 5 menit
kemudian dilanjutkan dengan 30 siklus yang terdiri atas tiga tahapan yaitu;
denaturation (pemisahan DNA utas ganda) 94°C selama 1 menit lalu annealing
(penempelan primer) 53°C selama 1 menit dan elongation (pemanjangan segmen
DNA) 72°C selama 2 menit. Proses PCR diakhiri dengan elongation pada suhu
72°C selama 5 menit.
Gambar 14 Gambaran hasil sekuensing hasil penelitian Lobo et al. (2003) yang terdiri dari 15 gen dugaan (predicted
genes) (36L17.1-36L17.15) dan dua daerah EST (36L17.EST1 dan EST2). Gen didalam kotak adalah gen
dugaan yang akan dikarakterisasi pada A. cerana. Kotak kuning: bagian gen yang di transkripsi,
a11.31 adalah marker yang berhubungan dengan perilaku agresif, AME509514: sekuen mikrosatelit,
kotak hitam dan segitiga: posisi sekuen repeat dan 371 bp repeat.
35
Elektroforesis dan visualisasi pita DNA
Segmen DNA yang telah diperbanyak kemudian dipisahkan dengan
Polyacrilamide Gel electrophoresis (PAGE) 6% menggunakan buffer 1XTBE.
Elektroforesis dilakukan pada tegangan 180 Volt selama 55 menit. Visualisasi
DNA pada gel poliakrilamid dilakukan dengan pewarnaan perak nitrat (silver
staining) (CTAB (0.2 g/200 ml akuades), formalin, NaOH (4 g/10 ml akuades),
NH4OH (2.4 ml/ 200 ml akuades), asam asetat (200 µl/ 200 ml akuades), Na2CO3
(4 g/200 ml akuades), AgNO3 (0.32 g/200 ml akuades), dan akuades) (Tegelstrom
1986) didalam shaking bath. Setelah dielektroforesis gel dicuci dengan larutan
CTAB (0.2 g/200 ml akuades) selama 8 menit. Kemudian dicuci dengan akuades
sebanyak dua kali, masing-masing selama 2 menit.
Selanjutnya gel tersebut direndam dalam larutan NH4OH (2.4 ml/200 ml
akuades) selama 8 menit. Kemudian gel direndam dalam campuran larutan 0.32 g
AgNO3; 0.8 ml NH4OH; 80 µl NaOH (4 g/10 ml akuades); dalam 200 ml akuades
selama 10 menit. Setelah proses ini gel dicuci kembali dengan akuades sebanyak
dua kali, masing-masing selama 2 menit. Untuk tahap pemunculan pita DNA, gel
direndam dalam campuran larutan 4 g Na2CO3; 100 µl formalin; dalam 200 ml
akuades. Tahap terakhir dalam visualisasi DNA adalah pengawetan pita DNA
pada gel poliakrilamid yang dilakukan dengan cara merendam gel pada larutan
1% asam asetat (100 µl/ml).
Tabel 6 Primer yang digunakan dan posisi penempelan berdasarkan DNA gen
dugaan A. mellifera untuk mengamplifikasi A. cerana
No
Nama
Gen dugaan
A.cerana
1
36L17.1
2
3
36L17.14
36L17.15
Primer
/Singkatan
Sekuen basa primer (5'-3')
Posisi basa pada
QTL sting-2 gen
dugaan
A. mellifera
(Lobo et al.
2003)
36L17.1for3/F3
cgatcgagcgcgcgatggaaga
44-66
36L17.1rev3/R3
gcacacgctattgcgatatatacg
368-391
36L17.14for3/F3
gatcgaggaaagagagagagagag
14-37
36L17.14rev9/R9
gctgtatatctttctctgctctcg
175-198
36L17.15for6/F6
36L17.15rev6/R6
ctcgacgagacgaccaacttgg
aaccagagtatcgcgagtgttac
10-31
187-209
36
Gen dugaan 36L17.1 A. mellifera
Gen dugaan 36L17.14 A. mellifera
Gen dugaan
36L17.15 A. mell
Gambar 15 Penempelan pasangan primer untuk amplifikasi A. cerana
berdasarkan A. mellifera pada masing-masing gen dugaan 36L17.1
(F3R3), 36L17.14 (F3R9), 36L17.15 (F6R6).
Sekuensing (perunutan) dan Penjajaran (Alignment) DNA
Proses sekuensing DNA menggunakan jasa Lembaga Biologi Charoen
Phockphand Jakarta. Sekuensing DNA dilakukan untuk mengetahui sekuen basa
pada gen dugaan 36L17.1, 36L17.14, dan 36L17.15 A. cerana. DNA yang telah
dirunutkan kemudian dimasukkan kedalam program Genetyx Win versi 4.0.
selanjutnya disimpan sebagai data base. Analisis homologi dengan A. mellifera
dilakukan dengan program Clustal X (Thompson et al. 1997) dan dengan data
genom lebah A. mellifera (BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) Honey
bee Sequences) melalui situs NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov).
Analisis PCR-Restriction Fragment Length Polymorphism (PCR-RFLP)
Berdasarkan hasil sekuens DNA, dieksplorasi keragaman pada gen dugaan
A. cerana. Keragaman DNA dianalisis dengan memotong produk PCR
menggunakan enzim restriksi. Enzim restriksi yang digunakan adalah AccIII
(TCCGGA) dan CfoI (GCGC). Volume total pereaksi untuk restriksi enzim
adalah 4 µl. Pereaksi terdiri atas produk PCR sebanyak 2 µl, enzim restriksi AccIII
dan CfoI 0.5 µl (10 U/ µl), 10x buffer enzim 0.4 µl, dan air steril 1.1 µl. semua
37
pereaksi dicampur dalam tabung 0.6 ml lalu disentrifugasi 4500 rpm (1 menit).
Campuran tersebut selanjutnya diinkubasi pada suhu 37⁰C selama semalam.
Hasil pemotongan dimigrasikan pada gel poliakrilamid 6% menggunakan
buffer 1XTBE pada 180 Volt selama 65 menit. Penanda DNA yang digunakan
adalah DNA ladder 100 bp (promega). Visualisasi DNA dalam gel poliakrilamid
dilakukan dengan pewarnaan perak nitrat (Tegelstrom 1986).
Analisis data
Hasil sekuensing DNA berupa kromatogram diedit secara manual
menggunakan program genetix win versi 4.0. Penjajaran DNA dilakukan dengan
program ClustalX (Thompson et al.1997). Situs restriksi dieksplorasi untuk
mempelajari variasi gen dugaan A. cerana menggunakan program Genetyx Win
versi 4.0. Analisis kesamaan (homologi) dilakukan antara gen dugaan A. cerana
dengan gen dugaan A. mellifera (Lobo et al. 2003) dan dengan data genom lebah
A.
mellifera
(BLAST
(www.ncbi.nlm.nih.gov).
Honey
bee
Sequences)
melalui
situs
NCBI
38
HASIL
Karakterisasi gen dugaan pada QTL sting-2 A. cerana
Ukuran pita DNA hasil amplifikasi (amplikon) pada gen dugaan 36L17.1,
36L17.14 dan 36L17.15 A. cerana pada gel berturut-turut sekitar 180, 185, dan
200 pasang basa (pb) (Gambar 16). Ukuran pita DNA ini masing-masing
diprediksi berdasarkan sekuen DNA yang diapit tiap pasang primer berdasarkan
sekuen DNA gen dugaan pada QTL sting-2 A. mellifera.
180 pb
185 pb
200 pb
180 pb
185 pb
200 pb
Gambar 16 Amplikon dan skematik DNA gen dugaan A. cerana pada gel
poliakrilamid lajur 1-2 = 36L17.1; lajur 3-6 = gen dugaan yang
tidak teramplifikasi; lajur 7-8 = 36L17.14; lajur 9-10 = 36L17.15;
M= penanda 100 pb DNA ladder (Promega).
Hasil sekuensing gen dugaan A. cerana 36L17.1 menggunakan pasangan
primer F3R3 menghasilkan panjang basa sebesar 179 pasang basa (pb). Hasil
sekuensing gen 36L17.14 menggunakan pasangan primer F3R9 dan 36L17.15
menggunakan pasangan primer F6R6 berturut-turut sebesar 171, dan 206 pb
(Gambar 17). Kandungan GC masing-masing gen dugaan 36L17.1, 36L17.14, dan
36L17.15 berturut-turut adalah 42.82, 45.25 dan 49.64%.
Hasil sekuensing tersebut kemudian disejajarkan untuk menganalisis
kemiripan atau homologi sekuen DNA. Penjajaran DNA dilakukan pada gen
dugaan A. cerana dengan gen dugaan A. mellifera (Lobo et al. 2003) dan data
genom lebah A. mellifera (BLAST Honey bee Sequences) melalui situs NCBI
(www.ncbi.nlm.nih.gov) (Gambar 18) Hasil analisis BLAST gen dugaan 36L71.1
homolog pada data genom A. mellifera GenBank dengan nomor aksesi
NW_001253228 (Lampiran14). Sedangkan gen dugaan 36L17.14 dan 36L17.15
39
A. cerana dengan data genom A. mellifera homolog pada GenBank dengan nomor
aksesi NW_001253303 (Lampiran 15, 16). Karakteristik gen dugaan A. cerana
36L17.1, 36L17.14 dan 36L17.15 terhadap A. mellifera melalui analisis BLAST
menunjukkan nilai E-value berturut-turut 3e-22, 2e-38 dan 1e-92 (Tabel 7).
Persentase kesamaan sekuen A. cerana yang berhasil dikarakterisasi
terhadap A. mellifera (Lobo et al. 2003) berdasarkan penjajaran untuk gen dugaan
36L17.1, 36L17.14, dan 36L17.15 berturut-turut adalah 23.40, 38.52, dan 72.10%
(Gambar 19).
a. Gen dugaan 36L17.1 A. cerana amplifikasi dengan primer F3R3
F3
CTCGATCGAGCGCGCGATGGAAGATCTAATTAATTGAATATGTTCGACGTTTATTTAAAATTAATGAAACGGA
GCACGAACGAAACGACGAACGTCAATCGTCATATCAATCGGCCACCACCGGTTCTCTTTCTCGCGTTAATTAC
GACACGATGCACACGCTATTGCGATATATACGA
R3
b. Gen dugaan 36L17.14 A. cerana amplifikasi dengan primer F3R9
F3
ATAGATGTGATTTCTCGATCGAGGAAAGAGAGAGAGAGAGAGAAAAAACAGAGTACGTTCTCGACCTTCGAGC
CATTAAAGAACAACGGGTTTCGCTGCTCTCTAAACAACAGCAAAGCAAGCATGGGAATTCAAGAGAGACCGCG
TGTACGTATGTACCTACTCTCTAGA
c. Gen dugaan 36L17.15 A. cerana amplifikasi dengan primer F6R6
F6
TCTCGACGAGACGACCAACTTGGAGAGCCCCGCAATGCGTTCATTTCATTAGACGGTGGATACTTAGTGAAAT
TAGTATTAACACTCGTAACGAGTACGGCCGCTCTACACTCTCGAGCCATTGTGGCAAATGTTTTCCGGAAAAG
AAAGCTCTTCGCATTGCCTCGCGAAAACTGCCGCGCCAACCAGAGTATCGCGAGTGTTAC
R6
Gambar 17 Hasil sekuensing gen dugaan A. cerana (a) 36L17.1, (b) 36L1714, dan
(c) 36L1715. Basa yang digaris bawahi menunjukkan posisi primer
a)
Ac_36L17.1
Am_36L17.1
Ac_36L17.1
Am_36L17.1
Ac_36L17.1
Am_36L17.1
Ac_36L17.1
Am_36L17.1
Ac_36L17.1
Am_36L17.1
Ac_36L17.1
Am_36L17.1
------------------------------------------CTCGATCGAGCGCGCGAT
AAAAAAAAAAAGAGGAATCCACTAGAAACAAATTTCTGGGAATCCGATCGAGCGCGCGAT
****************
GGAAGATCTAATTAATTGA--------------------------ATATGTTCGACGTTT
GGAAGAGCAAAACGATCGAGAAATAAACCGGGAGGAGGGAGAGGGAAACAAGCGGTCTCC
****** * **
** **
* *
**
*
ATTTAAAATT--AATGAAACGGAGCACGAACGAAACGACG-----AACGTCAATCGTCAT
GATAAACGTTCCAATAAAGAGGCACTCGGAGCAAACAGCGCCATAAATAAAAACGGACTT
* ** ** *** ** ** * ** * **** **
**
** * * *
ATCAATCGGCCACCACCGGTTCTCTTTCTCGCGTTAATTACGACACGATGCACACGCTAT
GCCACTCGCCTGCAACAATCTCTCCACCTCCCCTCCCCTCCGCCGC--CGCTCCCCCACT
** *** * * **
****
*** * *
* ** * *
** * * * *
TGCGATATATACGA---------------------------------------------CCAGACACTTTCGATGCATTTCCCGGGCCGCGACGAACAAAGGACACGGCGGCAAGGGGT
** * * ***
-----------------------------------------------------------TAAAAAAAGGAAGCAATCGAAATATTGCCCCGATAATATTGGACGACCGCGTGACACAAG
18
60
52
120
105
180
165
238
179
298
358
40
Ac_36L17.1
Am_36L17.1
-----------------------------------------------------------CGCGCGTGTGCACACGCTATTGCGATATATACGTGTGCAATAATACAATCAAAGCGGTGG 418
Ac_36L17.1
Am_36L17.1
----AATGA 423
b)
Ac_36L17.1
88
NW001253228 938020
Ac_36L17.1
148
NW001253228
937962
c)
Ac_36L17.14
Am_36L17.14
ACGAACGTCAATCGTCATATCAATCGGCCACCACCGGTTCTCTTTCTCGCGTTAATTACG
||||||| ||||||||||||||||||||||| || |||||||||||||||||||||||
ACGAACG--AATCGTCATATCAATCGGCCACCGCCTATTCTCTTTCTCGCGTTAATTACG
ACACGATGCACAC 160
|||||||||||||
ACACGATGCACAC 937950
147
937963
Ac_36L17.14
Am_36L17.14
ATAGATGTGATTTCTCGATCGAGGAAAGAGAGAGAGAGAGAGAAAAAACAGAGTACGTTC
ATGGATGTA--T-CTCGATCGAGGAAAGAGAGAGAGAGAGAGAAAAATCAGAGTACGTTC
** ***** * ********************************** ************
T-CGACC---TTCGAGCCATTAAAGAACAACGGGTTTCGCTGCTCTCTAAACAACAGCAA
AACGACCGAGTTCGAGCCATTAAAGAGCAACAGGTTTCGCTGCTCTCTAAGCAACAGCAA
*****
**************** **** ****************** *********
AGCAAGCATGGGAATTCAAGAGAGACCGCGTGTACGTATGTACCTACTCTCTAGA----AGCAAGCACGGGAAT-CAAGAGAG-CCGCGTG-ACGTATGTACCTACTCTCTATACACCG
************** ******** ******* ******************** *
-----------------------------------------------------------GCTGTATATCTTTCTCTGCTCTCGAAGGCCTGCCCGCGAACGCGGATAAAAGGCGAGAAT
Ac_36L17.14
Am_36L17.14
-----------------------------------------------------------AAAGTCGAAAGGCATTCACCCTTGGTGAAAGTAGTTCTTCGATCGATGTCGCAGGCGTGT 294
Ac_36L17.14
Am_36L17.14
-----------------------------------------------------------TGTGTGCACGCGCCAGCGCACCACGACCGACAAGCTTCGAGCTTCTGTGTCCACCAGCTT 354
Ac_36L17.14
Am_36L17.14
--------------------------------------------------TCACGAGATTCGATTTTCCGGTTATTTGGTTTTTTTCCCGCCTTTTCGTAA 405
Ac_36L17.14
Am_36L17.14
Ac_36L17.14
Am_36L17.14
60
57
116
117
171
174
234
d)
Ac_36L17.14
44
NW001253303
48650
Ac_36L17.14
100
NW001253303
48590
Ac_36L17.14
160
NW001253303
48533
e)
Am_36L17.15
Ac_36L17.15
Am_36L17.15
Ac_36L17.15
Am_36L17.15
Ac_36L17.15
Am_36L17.15
Ac_36L17.15
Am_36L17.15
Ac_36L17.15
AAAAACAGAGTACGTTCT-CGACC---TTCGAGCCATTAAAGAACAACGGGTTTCGCTGC
|||| |||||||||||| |||||
|||||||||||||||| |||| |||||||||||
AAAATCAGAGTACGTTCAACGACCGAGTTCGAGCCATTAAAGAGCAACAGGTTTCGCTGC
TCTCTAAACAACAGCAAAGCAAGCATGGGAATTCAAGAGAGACCGCGTGTACGTATGTAC
||||||| ||||||||||||||||| ||||| ||||||||| ||||||| ||||||||||
TCTCTAAGCAACAGCAAAGCAAGCACGGGAA-TCAAGAGAG-CCGCGTG-ACGTATGTAC
CTACTCTCTA
||||||||||
CTACTCTCTA
99
48591
159
48534
169
48524
GTCAGCGACCTCGACGAGACGACCAACTTGGAG--CCCCGCAACGCGTTCATTTCATTAG
--------TCTCGACGAGACGACCAACTTGGAGAGCCCCGCAATGCGTTCATTTCATTAG
************************ ******** ****************
ACGGTGGATACTTAGTGAAATTAGTATTAACACTCG-AACGAG-ACGGCCGCTCT-CACT
ACGGTGGATACTTAGTGAAATTAGTATTAACACTCGTAACGAGTACGGCCGCTCTACACT
************************************ ****** *********** ****
CTCGAGCCATTGTGGCAAATGTTTTCCGGAAAAGAAAGCTCTTCGCATTGCCTCGCGAAA
CTCGAGCCATTGTGGCAAATGTTTTCCGGAAAAGAAAGCTCTTCGCATTGCCTCGCGAAA
************************************************************
ACTGCCGCGCCAACCAGAGTATCGCGAGTGTTACGGCGCATGCGCAACCGCGAATCGATT
ACTGCCGCGCCAACCAGAGTATCGCGAGTGTTAC-------------------------**********************************
CGACGCACAACGCCGTCCTGCCGTTGATTTCACGCGGTTGA 276
-----------------------------------------
58
52
115
112
175
172
235
206
41
f)
Ac_36L17.15
2
NW001253303
46433
Ac_36L17.15
62
NW001253303
Ac_36L17.15
46491
122
NW001253303
46548
Ac_36L17.15
182
NW001253303
46608
CTCGACGAGACGACCAACTTGGAGAGCCCCGCAATGCGTTCATTTCATTAGACGGTGGAT
|||||||||||||||||||| | ||||||||||| |||||||||||||||||||||||||
CTCGACGAGACGACCAACTT-G-GAGCCCCGCAACGCGTTCATTTCATTAGACGGTGGAT
61
ACTTAGTGAAATTAGTATTAACACTCGTAACGAGTACGGCCGCTCTACACTCTCGAGCCA
||||||||||||||||||||||||||| |||||| ||||||||||| |||||||||||||
ACTTAGTGAAATTAGTATTAACACTCG-AACGAG-ACGGCCGCTCT-CACTCTCGAGCCA
TTGTGGCAAATGTTTTCCGGAAAAGAAAGCTCTTCGCATTGCCTCGCGAAAACTGCCGCG
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
TTGTGGCAAATGTTTTCCGGAAAAGAAAGCTCTTCGCATTGCCTCGCGAAAACTGCCGCG
121
CCAACCAGAGTATCGCGAGTGTTAC
|||||||||||||||||||||||||
CCAACCAGAGTATCGCGAGTGTTAC
46490
46547
181
46607
206
46632
Gambar 18 Hasil penjajaran gen dugaan: (a, b) A. cerana (Ac) 36L17.1 dengan data
genom A. mellifera (Am) dan hasil BLAST GenBank Acc No.
NW_001253228, (c, d) A. cerana 36L17.14 dan hasil BLAST GenBank
Acc No. NW_001253303, (e, f) A. cerana 36L17.15 dan hasil BLAST
GenBank Acc No. NW_001253303).
a)
1
423
42
252
162
235
b)
405
1
1
168
50
167
c)
1
276
9
206
10
206
Gambar 19 Skematik100pb
posisi bagian sekuen gen dugaan A. cerana yang berhasil
dikarakterisasi a) gen dugaan A. cerana 36L17.1, b) gen dugaan
A. cerana 36L7.14, c) gen dugaan A. cerana 36L17.15.
= gen dugaan A.
mellifera (Lobo et al. 2003),
= gen dugaan A. cerana,
= gen
dugaan A. cerana yang homolog dengan A. mellifera berdasarkan hasil BLAST
di GenBank. Angka disamping garis adalah ukuran sekuen gen dugaan.
42
Tabel 7 Hasil sekuensing dan penjajaran gen dugaan 36L17.1, 36L17.14, dan
36L17.15 A. cerana dengan BLAST Honey bee Sequence
(www.ncbi.nlm.nih.gov)
Gen Dugaan A. cerana
Karakter
36L17.1
36L17.14
36L17.15
Panjang DNA (pb)
179
171
206
Kandungan GC (%)
42.82
42.25
49.64
NW_001253228
NW_001253303
NW_001253303
3e-22
2e-38
1e-92
68/73 (93%)
117/130 (90%)
199/205 (97%)
2/73 (2%)
7/130 (5%)
5/205 (2%)
423
405
276
99/423 (23.40%)
156/405 (38.52%)
199/276 (72.10%)
Hasil BLAST:
Acc number
E-value
Persentase kesamaan
Gaps
Ukuran gen dugaan A.
mellifera (Lobo et al. 2003)
Persentase kesamaan dengan
A. mellifera (Lobo et al.
2003)
Analisis PCR-RFLP
Terdapat 1 situs pemotongan pada gen dugaan 36L17.15 untuk masingmasing enzim restriksi dengan dua pita DNA pada gel poliakrilamid (Gambar 20).
Hasil pemotongan gen dugaan 36L17.15 dengan enzim restriksi AccIII dan CfoI
menunjukkan pola pemotongan basa yang sama dengan A. mellifera (Lobo et al.
2003) namun berbeda pada posisi pemotongan (Gambar 21).
Pb
200
M
1 2 3 4
5
6 7
8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
M
1 2 3 4
5
6
7
8
9 10 11 12 13 14 15 16 17
Pb
200
100
100
a
b
Gambar 20 Pita DNA hasil pemotongan dengan enzim restriksi gen dugaan A. cerana
36L17.15 pada gen poliakrilamid dengan a) Acc III, b) CfoI. M = Penanda
DNA 100 pb DNA ladder (Promega),
= pita DNA hasil pemotongan
enzim restriksi, nomor 1-17 adalah sampel DNA.
43
a)
10
20
30
40
50
60
CTCGACGAGACGACCAACTTGGAGAGCCCCGCAATGCGTTCATTTCATTAGACGGTGGAT
70
80
90
100
110
120
ACTTAGTGAAATTAGTATTAACACTCGtAACGAGtACGGCCGCTCTACACTCTCGAGCCA
130
140
150
160
170
180
TTGTGGCAAATGTTtTCCGGAAAAGAAAGCTCTTCGCATTGCCTCGCGAAAACTGCCGCG
/
/
AccIII
CfoI
190
200
CCAACCAGAGTATCGCGAGtGTTAC
b)
69
137
Ac_36L17.15
AccIII
10
69
206
131
Am_36L17.15
25
Ac_36L17.15
10
25
181
175
CfoI
206
Am_36L17.15
100pb
Gambar 21 Posisi pemotongan pita DNA dengan enzim restriksi AccIII dan CfoI a)
gen dugaan 36L17.15 A. cerana (Ac), b) skema posisi pemotongan pita DNA
antara gen dugaan 36L17.15 A. cerana dengan A. mellifera (Am) (Lobo et al.
2003). Angka menunjukkan posisi basa dalam urutan sekuen gen dugaan
36L17.15.
44
PEMBAHASAN
Tiga dari 15 gen dugaan QTL sting-2 A. mellifera berhasil dikarakterisasi
pada A. cerana yaitu 36L17.1, 36L17.14 dan 36L17.15. Panjang basa masingmasing gen dugaan tersebut berturut-turut adalah 179, 171 dan 206 pasang basa.
Sedangkan panjang basa gen dugaan 36L17.1, 36L17.14, dan 36L17.15 A.
mellifera berturut-turut adalah 423, 405, dan 276 pb.
Berdasarkan analisis homologi diketahui bahwa sebagian besar sekuen gen
dugaan A. cerana yang berhasil dikarakterisasi juga terdapat pada sekuen gen
dugaan A. mellifera (Lobo et al. 2003). Persentase kesamaan sekuen gen dugaan
A. cerana 36L17.1, 36L17.14, dan 36L17.15 dengan sekuen A. mellifera berturutturut adalah 23.40, 38.52, dan 72.10%.
Nilai probabilitas atau peluang yang terhitung secara statistik dalam
kesamaan sekuen antara A. cerana dan data genom A. mellifera di GenBank
(www.ncbi.nlm.nih.gov) digambarkan dengan nilai Expectation value (E-value).
Gen dugaan 36L17.15 memperlihatkan nilai E-value yang rendah terhadap data
genom A. mellifera yaitu 1e-92 dengan daerah genom yang homolog sebesar 199
pb dari 205 pb A. mellifera. Nilai tersebut lebih rendah dari nilai E-value yang
ditunjukkan oleh gen dugaan 36L17.1 dan 36L17.14 berturut-turut sebesar 3e-22
dan 2e-38.
Semakin rendah nilai E-value menunjukkan bahwa sekuen DNA A. cerana
terhadap A. mellifera semakin tepat. Dua fragment DNA dikatakan homolog jika
70% sekuen basanya atau 25% sekuen asam aminonya identik (panjang sekuen
minimal 100 pasang basa) dan memiliki nilai E-value yang rendah (dibawah nilai
10-4) (Claviere & Notredame 2003).
Gen dugaan 36L17.15 pada penelitian ini memiliki nilai E-value yang lebih
rendah daripada dua gen dugaan lainnya (36L17.1 dan 36L17.14). Berdasarkan
data tersebut analisis enzim restriksi (PCR-RFLP) dilakukan untuk melihat variasi
basa. Analisis enzim restriksi menunjukkan bahwa terdapat satu situs pemotongan
dengan enzim restriksi AccIII dan CfoI. Pada A. mellifera (Lobo et al. 2003) juga
ditemukan situs pemotongan kedua enzim tersebut. Namun berbeda pada posisi
pemotongannya.
45
Apis mellifera asal Afrika (AHB) merupakan subspecies A. m scutellata
yang memiliki sifat defensif tinggi dibandingkan A. mellifera asal Eropa (EHB)
yaitu A. m ligustica (Collins et al. 1982). Berdasarkan kedua sifat yang berbeda
tersebut, dilakukan perkawinan silang untuk mendapatkan keturunan (F1) dan
mendeteksi karakter gen yang menyandikan defensif yang dibawanya. Selanjutnya
dilakukan pemetaan terhadap gen tersebut melalui pemetaan Quantitative Trait
loci (QTL). Sejumlah gen yang bertanggung jawab terhadap perilaku defensif A.
mellifera diketahui berada pada QTL sting-1, sting-2, sting-3 melalui analisa
RAPD (Hunt et al. 1995). QTL sting-2 berhasil dikarakterisasi Lobo et al. (2003)
untuk perilaku defensif menjaga sarang.
Pada penelitian ini, untuk mengkarakterisasi gen dugaan pada QTL sting-2
tidak dilakukan proses pemetaan QTL seperti yang dilakukan pada A. mellifera
(Lobo et al. 2003). Karakterisasi gen dugaan pada QTL sting-2 A. cerana
dilakukan dengan mendesain primer berdasarkan hasil karakterisasi gen dugaan A.
mellifera (Lobo et al. 2003). Berdasarkan hasil penelitian ini terdapat perbedaan
sekuen DNA antara gen dugaan hasil karakterisasi pada A. cerana dengan A.
mellifera. Perbedaan tersebut terutama terlihat dari hasil penjajaran antara sekuen
gen dugaan A. cerana dengan A. mellifera. Namun kesamaan maupun perbedaan
sifat genetik yang dimiliki antara kedua spesies lebah madu tersebut baru benarbenar dapat terlihat apabila dilakukan pemetaan QTL sting-2 pada A. cerana.
Sehingga baik posisi linkage maupun pola sifat defensif antara A. cerana dengan
A. mellifera dapat dibandingkan.
Besarnya ukuran gen dugaan QTL sting-2 A. cerana yang telah berhasil
dikarakterisasi pada penelitian ini adalah 556 pasang basa. Sedangkan gen dugaan
sting-2 A. mellifera yang telah dikarakterisasi Lobo et al. (2003) total besarnya
sekitar 81.000 pasang basa. Hal ini menandakan bahwa masih sebagian besar gen
dugaan QTL sting-2 A. cerana yang belum diketahui sekuen basanya dan perlu
dilakukan karakterisasi. QTL sting-2 pada A. mellifera diketahui mengekspresikan
perilaku menjaga sarang. Untuk membuktikan bahwa benar antara pola perilaku
A. cerana berbeda dengan A. mellifera perlu dilakukan analisis mRNA pada gen
dugaan A. cerana terutama pada A. cerana penjaga sarang.
46
SIMPULAN
Ukuran gen dugaan QTL sting-2 A. cerana 36L17.1, 36L17.14, dan
36L17.15 adalah 179, 171 dan 206 pb. Persentase kesamaan (%) dan E-value
antara A. cerana dan A. mellifera yang berhasil dikarakterisasi berturut-turut yaitu
93% (3e-22), 90% (2e-38) dan 97% (1e-92). Ukuran total gen dugaan QTL sting2 yang berhasil dikarakterisasi pada A. cerana adalah 556 pasang basa. Terdapat
satu situs pemotongan pada gen dugaan 36L17.15 A. cerana menggunakan enzim
restriksi AccIII dan CfoI.