ii. bahan dan metode

II. BAHAN DAN METODE
Kegiatan penelitian ini terbagi dalam dua tahap yaitu tahap penelitian
pendahuluan dan tahap utama. Penelitian pendahuluan meliputi hasil uji kapasitas
serap zeolit, kapasitas serap karbon aktif, kemampuan puasa ikan, laju ekskresi
total amoniak nitrogen (TAN) benih ikan gurame, dan tingkat konsumsi oksigen.
Tahap penelitian utama yaitu penentuan kepadatan optimum benih ikan gurame
pada transportasi tertutup, kualitas air, gambaran darah, kelangsungan hidup ikan
pemeliharaan, dan laju pertumbuhan harian.
2.1 Prosedur kerja.
2.1.1 Kemampuan puasa ikan
Ikan dipuasakan dalam akuarium ukuran 0,6x0,5x0,5 m3 selama lima hari.
Ikan uji dimasukkan ke dalam akuarium sebanyak 30 ekor dengan diaklimatisasi
selama 15 menit. Pergantian air dilakukan sebanyak 20% setiap hari kemudian
tingkah laku ikan uji diamati dan dicatat. Pengujian dilakukan dengan tiga
ulangan. Selama pemuasaan ikan dilakukan pengukuran kualitas air yaitu suhu,
nilai pH, dan oksigen terlarut.
2.1.2 Tingkat konsumsi oksigen
Pengukuran tingkat konsumsi oksigen (TKO) dilakukan dengan pengukuran
bobot dan panjang benih ikan gurame. Benih ikan gurame dimasukkan ke dalam
toples volume 3,5 ℓ yang telah diisi air. Jumlah benih ikan gurame yang
dimasukkan sebanyak lima ekor. Pengujian dilakukan dengan tiga ulangan.
Jumlah oksigen terlarut dalam toples diukur setiap jam selama 6 jam.
2.1.3 Laju ekskresi amoniak
Pengukuran laju ekskresi amoniak ikan terlebih dahulu dilakukan dengan
pengukuran bobot dan panjang total tubuh benih ikan gurame, kemudian benih
tersebut dimasukkan ke dalam toples kaca yang tertutup steroform sebanyak
sepuluh ekor. Setelah melakukan hal tersebut dilakukan pengambilan air sampel.
Air sampel diambil sebanyak 30 mℓ setiap 12 jam selama 48 jam untuk
pengukuran kualitas air. Parameter yang diukur adalah suhu, nilai pH, oksigen
terlarut, dan konsentrasi TAN. Pengujian ini dilakukan dengan tiga ulangan.
2.1.4 Kapasitas zeolit dan karbon aktif
Pengukuran kemampuan serap zeolit dan karbon aktif terhadap NH3 dapat
dilakukan dengan mengukur tingkat serap bahan aktif tersebut dalam
larutan TAN. Tahapan dalam proses ini diawali dengan penyiapan dua botol
plastik yang salah satu bagian tutup botol dilubangi dengan jarum. Bagian leher
botol diisi dengan zeolit dan karbon aktif masing-masing sebanyak 20 gram.
Larutan TAN dengan konsentrasi 0,766 mg/ℓ dialirkan ke dalam botol yang berisi
karbon aktif dan zeolit. Pengambilan sampel air dilakukan pada setiap menit
selama proses tersebut sebanyak 30 mℓ, kemudian dilakukan pengukuran TAN,
nilai pH, dan suhu. Pengujian ini dilakukan dengan tiga ulangan.
2.1.5 Penentuan kepadatan optimum benih ikan gurame pada pengangkutan
tertutup
Kegiatan packing diawali dengan pemuasaan benih ikan gurame selama dua
hari untuk mengosongkan lambung pada ikan. Zeolit (20 gram) dan karbon aktif
(10 gram) diikatkan pada bagian ujung plastik kemudian ujung plastik yang
lainnya diikat dengan kran yang berfungsi untuk pengambilan sampel air media
pengangkutan. Kantong plastik diisi air sebanyak 1,2 ℓ dan ikan dengan kepadatan
berbeda yaitu 20 ekor, 30 ekor, 40 ekor, dan 50 ekor. Kantong plastik diberi
oksigen murni dengan perbandingan 1:3 kemudian diikat dengan karet. Pengujian
pada setiap perlakuan dilakukan dengan tiga ulangan.
Wadah packing (steroform) diberi es batu pada bagian ujung yang berfungsi
untuk menurunkan suhu udara. Kantong packing diletakkan dalam wadah dan
dilakukan simulasi pengangkutan dengan perlakuan goncangan. Selama simulasi,
dilakukan pengukuran kualitas air setiap 24 jam sekali. Parameter yang diukur
adalah oksigen terlarut, TAN, suhu, dan nilai pH. Selain itu juga dilakukan
evaluasi tingkat kelangsungan hidup ikan setiap 12 jam. Rangkaian penelitian
tahap ini dilakukan selama 72 jam.
2.1.6 Gambaran darah
Gambaran darah dilakukan sebanyak dua kali yaitu pascapengangkutan dan
pemeliharaan pascapengangkutan (7 hari setelah pengangkutan). Darah diambil
menggunakan syringe yang telah dibasahi dengan antikoagulan (Na-sitrat) yang
bertujuan untuk mencegah terjadinya pembekuan darah. Darah ditampung ke
dalam tabung Eppendorf yang telah dibasahi dengan antikoagulan. Jumlah darah
yang diambil sebanyak ± 0,4 ml. Darah yang telah didapatkan dilakukan
pengukuran gambaran darah meliputi difirensiasi leukosit, jumlah sel darah
merah, jumlah sel darah putih, hemoglobin, dan hematokrit.
2.1.6.1 Jumlah sel darah merah dan sel darah putih
Perhitungan sel darah merah dilakukan dengan pengenceran darah sampel
terhadap larutan Hayem dengan perbandingan 1:200 (Svobodova dan Vykusova,
1991). Perhitungan sel dilakukan dibawah mikroskop dengan menggunakan
haemositometer dengan jumlah lapang pandang 10 kotak kecil. Pengujian ini
dilakukan dengan tiga ulangan.
Perhitungan jumlah sel darah putih dilakukan dengan cara pengenceran
darah pada larutan Turk’s dengan perbandingan 1:20 (Svobodova dan Vykusova,
1991).
Perhitungan
haemositometer
sel
dilakukan
dibawah
mikroskop
menggunakan
dengan jumlah lapang pandang lima kotak besar. Pengujian
dilakukan dengan tiga ulangan.
2.1.6.2 Hematokrit
Darah dihisap dengan menggunakan tabung mikrohematokrit berlapis
heparin pada bagian dalam (sebagai antikoagulan) dengan sistem kapiler. Setelah
darah terhisap sebanyak 4/5 dari volume tabung maka bagian ujung tabung
ditutup dengan menggunakan bahan penutup (critoseal) (Svobodova dan
Vykusova, 1991). Tabung yang telah berisi darah di sentrifuge dengan kecepatan
3000 rpm selama 5 menit. Pengukuran dilakukan dengan membandingkan bagian
darah yang mengendap dengan seluruh bagian darah yang ada dalam tabung
mikrohematokrit dan dinyatakan dalam persen. Pengujian dilakukan dengan tiga
ulangan.
2.1.6.3 Hemoglobin
Pengukuran kadar hemoglobin darah dilakukan dengan metode Sahli
(Wedemeyer dan Yasutake, 1977). Metode ini mengonversi hemoglobin darah
dalam bentuk asam hematin oleh asam klorida. Darah dihisap sampai skala
20 mm3 dengan pipet Sahli. Ujung pipet yang digunakan dibersihkan dari sisa-sisa
darah dengan menggunakan tisu, kemudian darah dipindahkan dalam tabung
Sahlinometer yang telah berisi HCl 0,1 N sampai batas tera 10. Kedua bahan
diaduk dan dibiarkan selama 3-5 menit agar hemoglobin bereaksi dengan HCl dan
membentuk asam hematin (kuning kecoklatan), kemudian ditambahkan akuades
sehingga warna sampel sama dengan warna standar. Pembacaan skala dilakukan
dengan melihat permukaan cairan dan dicocokkan dengan skala tabung
Sahlinometer yang dilihat pada lajur g%, yang berarti banyaknya hemoglobin
dalam gram per 100 mℓ darah. Pengujian dilakukan dengan tiga ulangan.
2.1.6.4 Diferensiasi leukosit
Darah diambil sebanyak 0,05 mℓ yang diletakkan diatas gelas objek,
kemudian diratakan dengan gelas objek yang lain dengan cara sekali ulas baik dari
arah depan maupun dari arah belakang, setelah itu difiksasi udara sampai kering.
Setelah kering, preparat difiksasi dengan metanol selama 10 menit, kemudian
dikeringkan dan direndam dengan larutan Giemsa selama 15-30 menit setelah itu
dicuci dengan akuades. Preparat kemudian dikeringkan dan diamati dengan cara
menghitung jumlah neutrofil dan limfosit dalam darah tersebut dengan
pengamatan dilakukan sebanyak lima lapang pandang kemudian perhitungan
dalam bentuk persentase. Pengujian dilakukan dengan tiga ulangan.
2.1.7 Pemeliharaan ikan
Pemeliharaan ikan dilakukan selama 21 hari setelah ikan dibongkar. Ikan
dipelihara sebanyak 15 ekor di akuarium dengan dimensi 60x50x50 cm3 yang
telah dicuci dan dikeringkan selama tiga hari. Sumber air yang digunakan yaitu
berasal
dari
tandon
laboratorium
lingkungan
dan
ditreatment
dengan
menggunakan filter fisik melalui sistem pengendapan. Akuarium diisi air dengan
ketinggian 25 cm dan diaerasi selama tiga hari.
Ikan dipelihara dengan pemberian pakan berupa cacing dan pellet secara
at satiation. Penyiponan dilakukan setiap pagi dan sore dengan pergantian air
sebanyak 20% setiap hari. Pengukuran laju pertumbuhan harian dilakukan dengan
mengukur bobot ikan awal dan ikan akhir sedangkan kelangsungan hidup ikan
selama pemeliharaan yaitu setiap hari dengan mengamati ada atau tidaknya ikan
yang mati.
Pengukuran kualitas air selama pemeliharaan ikan pascapengangkutan yaitu
dilakukan satu minggu sekali dengan parameter yang diukur yaitu nilai pH,
oksigen terlarut, suhu, dan TAN. Suhu optimal dalam pemeliharaan ikan gurame
yaitu 28-30 0C sehingga media pemeliharaan menggunakan heater di setiap
akuarium.
2.2 Rancangan percobaan
Rancangan yang dilakukan dalam penelitian ini adalah rancangan acak
lengkap (RAL) dengan empat perlakuan yaitu:
A = 20 g zeolit + 10 g karbon aktif + kepadatan 20 ekor/ℓ
B = 20 g zeolit + 10 g karbon aktif + kepadatan 30 ekor/ℓ
C = 20 g zeolit + 10 g karbon aktif + kepadatan 40 ekor/ℓ
D = 20 g zeolit + 10 g karbon aktif + kepadatan 50 ekor/ℓ
Masing-masing perlakuan terdiri dari 3 ulangan. Model rancangan yang
digunakan yaitu: yij = µ + τi + έij (Steel dan Torrie, 1982)
Keterangan:
yij
= data pada perlakuan kepadatan ke-i dan ulangan ke-j
µ
= nilai tengah data
τi
= pengaruh perlakuan ke-i
έij
= kesalahan percobaan pada perlakuan kepadatan ke-j dan ulangan ke-i
Data yang diperoleh dianalisa secara statistik menggunakan analisis ragam
(anova) dengan uji F pada selang kepercayaan 95% menggunakan progam
MS.exel 2007 dan SPSS 16.0 untuk menentukan apakah perlakuan berpengaruh
terhadap parameter yang diamati. Apabila berpengaruh nyata, untuk melihat
perbedaan antara perlakuan akan diuji lanjut dengan menggunakan uji Tukey.
2.3 Pengumpulan data
Adapun data yang dikumpulkan dalam penelitian ini adalah data tingkat
kematian ikan, data kualitas air (oksigen terlarut, nilai pH, suhu dan
total amoniak nitrogen), bobot ikan, jumlah sel darah merah, jumlah sel darah
putih, hematokrit, hemoglobin, dan diferensiasi leukosit. Data tersebut akan
digunakan untuk menghitung parameter yang diamati meliputi derajat
kelangsungan hidup, pertumbuhan bobot harian, NH3, dan gambaran darah ikan.
2.3.1 Derajat kelangsungan hidup
Derajat kelangsungan hidup (SR) adalah perbandingan jumlah ikan yang
hidup sampai akhir pemeliharaan dengan jumlah ikan awal pemeliharaan.
Perhitungan SR digunakan rumus dari Goddart (1996):
%
%
Keterangan :
SR = Kelangsungan Hidup
Nt = Jumlah ikan akhir (ekor)
No = Jumlah ikan awal (ekor)
2.3.2 Total Amoniak Nitrogen (TAN) dan Amoniak
Nilai TAN didapatkan dari perbandingan nilai absorban sampel dan standar
kemudian dilakukan konsentrasi larutan standar yang digunakan
NH3 = nilai TAN dikalikan dengan persentase amoniak yang tidak terionisasi
berdasarkan nilai pH dan suhu.
Tabel 1. Persentase amoniak tidak terionisasi (NH3) pada pH dan suhu yang
berbeda (Boyd, 1990)
pH
Suhu (0C)
18
20
22
24
26
6,5
0,1
0,1
0,1
0,2
0,2
7
0,3
0,3
0,4
0,5
0,5
7,5
0,9
1,1
1,2
1,4
1,7
8
2,9
3,3
3,8
4,4
5
8,5
8,5
9,8
11,2
12,7
14,4
2.3.3 Laju pertumbuhan bobot harian
Laju pertumbuhan bobot harian (α) ditentukan berdasarkan selisih bobot
rata-rata akhir (Wt) dengan bobot rata-rata awal (Wo) pemeliharaan kemudian
dibandingkan dengan waktu pemeliharaan (t) dengan rumus dari Huisman (1989):
%
2.3.4 Tingkat konsumsi oksigen
Tingkat konsumsi oksigen ditentukan berdasarkan selisih oksigen terlarut
akhir (DOt) dengan oksigen terlarut awal (DOo) kemudian dibagi selisih waktu
pengamatan akhir (t1) dengan waktu pengamatan awal (t0) dan dibagi banyaknya
biomas (W) kemudian dikalikan volume air (V) dengan rumus dari Pavlovskii
(1964):
2.3.4 Jumlah sel darah merah
Perhitungan sel darah merah dilakukan dengan menghitung sel darah merah
pada haemasitometer dengan jumlah lapang pandang sepuluh kotak kecil dan
jumlahnya dihitung dengan rumus (Nabib dan Pasaribu, 1989):
SDM = (A/N) x (1/V) x Fp
SDM
= Jumlah sel darah merah
A
= Jumlah sel darah merah
N
= Jumlah kotak haemasitometer yang diamati
V
= Volume haemasitometer
Fp
= Faktor pengenceran
2.3.5 Jumlah sel darah putih
Perhitungan sel darah putih dilakukan dengan menghitung sel darah putih
pada haemasitometer dengan jumlah lapang pandang lima kotak besar dan
jumlahnya dihitung dengan rumus (Nabib dan Pasaribu, 1989):
SDP = (A/N) x (1/V) x Fp
SDP
= Jumlah sel darah putih
A
= Jumlah sel darah putih
N
= Jumlah kotak haemasitometer yang diamati
V
= Volume haemasitometer
Fp
= Faktor pengenceran