Percobaan 08 Induksi β

Percobaan 08
Induksi β-Galaktosidase
I.
Nama
:
Gaby Almira
Nama asisten
:
Milla & Wiwit
NIM
:
10509028
Tanggal percobaan
:
12-04-2012
Kelompok
:
VII
Tanggal pengumpulan :
19-04-2012
Tujuan Percobaan
- menentukan aktivitas enzim β-galaktosidase dengan induksi oleh berbagai gula
II.
Teori Dasar
Enzim β-galaktosidase adalah enzim yang mengkatalisis reaksi hidrolisis β-galaktosida seperti
laktosa menjadi galaktosa dan glukosa. Jika substratnya adalah laktosa, maka enzim ini disebut
enzim laktase. β-galaktosida akan memotong ikatan β-glikosidik antara galaktosa dan suatu
komponen organik lain.
Sintesis β-galaktosidase dikendalikan melalui suatu sistem pengendalian ekspresi genetik,
yaitu lac operon. Operon adalah unit DNA genomik yang terdiri dari kluster gen dan berfungsi di
bawah kontrol promotor atau suatu sinyal tunggal. Lac operon adalah operon yang mengendalikan
ekspresi gen-gen untuk transpor dan metabolisme laktosa. Lac operon adalah mekanisme
pengendalian gen kompleks yang pertama dielusidasi dan menjadi contoh yang paling sering
digunakan untuk menjelaskan regulasi gen prokariotik.
Lac operon terdiri dari 2 bagian besar, yaitu gen regulator dan gen struktural.
Tiga gen struktural pada lac operon:
 lacZ: mengkode β-galaktosidase
 lacY: mengkode β-galaktosidase permease, protein transpor yang terikat pada membran dan
memompa laktosa ke dalam sel
 lacA: mengkode β-galaktosidase transasetilase, enzim yang mentransfer gugus asetil dari asetilCoA kepada β-galaktosidase
*Hanya lacZ dan lacY yang diperlukan untuk katabolisme laktosa.
Untuk proses transkripsi dari gen struktural, dibutuhkan bagian promotor dan operator. Promotor
adalah tempat RNA polimerase menempel pertamakali. RNA polimerase akan mengenali daerah
pada promotor sebagai tanda untuk dimulainya transkripsi. Operator adalah tempat RNA
polimerase terikat secara kuat, dan dari situlah proses transkripsi gen akan dimulai.
Pada bagian gen regulator, terdapat pula promotor dan gen lacI yang akan ditranskripsi.
Transkripsi lacI menghasilkan protein yang berfungsi sebagai represor. Represor akan mengikat
pada operator, di posisi setelah RNA polimerase. Akibatnya, proses transkripsi menjadi tidak dapat
berjalan. Ikatan antara represor dengan operator tidak terlalu kuat. Terkadang represor dapat lepas
dari operator, sehingga proses transkripsi dapat berjalan kembali. Pengendalian seperti ini disebut
pengendalian negatif, karena menurunkan tingkat ekspresi gen.
Jika ada substrat laktosa, maka ekspresi gen pada lac operon akan diinduksi. Induser itu
sendiri sebenarnya adalah alolaktosa, isomer dari laktosa. Laktosa diubah menjadi 1,6-alolaktosa
oleh sedikit β-galaktosidase yang ada. Alolaktosa akan mengikat specific site pada represor, dan
mengubah struktur represor. Akibatnya represor tidak dapat lagi mengikat operator, dan lepas.
Lepasnya represor meningkatkan sintesis β-galaktosidase hingga 103 kali lipat.
Selain regulasi negatif, lac operon juga dapat mengalami regulasi positif. Ketika tidak ada
glukosa, maka konsentrasi ATP menjadi rendah, dan konsentrasi cAMP menjadi tinggi. Molekul
cAMP akan terikat pada protein CRP (cAMP Receptor Protein). Kompleks CRP-cAMP mengikat di
promotor, dekat dengan posisi pengikatan RNA polimerase. Pengikatan CRP-cAMP pada promotor
akan menstimulasi juga pengikatan RNA polimerase pada promotor, dan transkripsi menjadi
mengikat 50 kali lipat.
Pada percobaan ini, kultur bakteri ditumbuhkan dulu dalam media yang berisi berbagai gula
yang berbeda-beda. Gula-gula tersebut dijadikan sumber energi bakteri selama inkubasi
semalaman. Sebagai substrat, tidak digunakan laktosa, melainkan ONPG (orthonitrophenyl
galactosides), yaitu suatu senyawa β-galaktosida. Setelah ONPG dipotong oleh enzim βgalactosidase, akan dihasilkan ONP (orthonitrophenol) yang berwarna kuning (λmaks = 420 nm).
Dengan demikian, penentuan efek induksi gula pada sintesis β-galaktosidase dapat ditentukan
dengan metode spektrofotometri.
III.
Alat & Bahan
Alat:
- pipet mikro 10, 100, 1000 µL
- tip biru
- tip kuning
- tabung mikro
- sentrifuga
- Vortex
- waterbath
- penangas es
- spektrofotometer sinar tampak
- kuvet
Bahan:
- kultur E. coli dalam media NB
- kultur E. coli dalam media NB + glukosa
- kultur E. coli dalam media NB + glukosa + laktosa
- kultur E. coli dalam media NB + laktosa
- kultur E. coli dalam media NB + maltosa
- kultur E. coli dalam media NB + galaktosa
- buffer Z
- kloroform
- SDS 0.1%
- ONPG (4 mg/mL)
- Na2CO3 1M
- aqua dm
IV. Cara Kerja
Kultur E. coli dalam setiap media dipipet sebanyak 2 mL ke tabung mikro. Lalu tabung
mikro disentrifuga selama 3 menit. Supernatan dibuang, sedangkan pelet diresuspensi dengan
buffer Z sebanyak 1 mL. Sentrifuga dan resuspensi diulang 1x lagi dengan parameter yang sama.
Kemudian sentrifuga dilakukan lagi, namun hanya 30 detik. Supernatan dibuang,
sedangkan pelet diresuspensi dengan 1 mL buffer Z. Dalam ruang asam, kepada pelet ditambahkan
50 µL kloroform, dan 20 µL SDS 0,1%. Tabung diaduk dengan Vortex selama 1 menit. Setelah itu,
tabung diinkubasi selama 1 menit dalam waterbath pada suhu 37 °C.
Lalu ke dalam tabung ditambahkan 0,2 mL ONPG, dan tabung dikocok. Penambahan ONPG
dihitung sebagai t0. Untuk tabung t=0, segera ditambahkan 0,4 mL Na2CO3 dan langsung disimpan
dalam penangas es. Untuk tabung lainnya, setelah waktu inkubasi tertentu, segera ditambahkan
Na2CO3, dan langsung disimpan dalam penangas es.
Kemudian, tabung disentrifuga lagi selama 30 detik. Cairan kuning di lapisan atas dipipet ke
dalam kuvet, lalu diukur absorbansnya dengan spektrofotometer sinar tampak. Sebagai blanko,
digunakan tabung t0, namun dapat juga digunakan aqua dm.
V.
Data Pengamatan
Data Absorbans dari tabung-tabung berisi berbagai media:
t (menit)
0
10
20
30
40
Tabung
A (NB)
0
0.466
0.905
1.181
1.453
B (NB + glukosa)
0
-0.089
0.010
-0.059
-0.0014
C (NB + glukosa + laktosa)
0
-0.001
0.010
0.146
0.023
D (NB + laktosa)
2.384
2.423
2.387
2.410
2.428
E (NB + maltosa)
0
0.172
0.224
0.324
0.358
F (NB + galaktosa)
0
1.408
1.483
0.717
1.504
VI. Pengolahan Data
Kurva Absorbans vs Waktu
3
2.5
2
A
B
1.5
C
Absorbans
1
D
E
0.5
F
0
0
10
-0.5
20
30
40
t (menit)
*Interpretasi grafik untuk tabung D berbeda karena memiliki titik t0 yang tidak sama dengan nol.
𝐴𝑘𝑡𝑖𝑣𝑖𝑡𝑎𝑠 𝑒𝑛𝑧𝑖𝑚 =
𝐴420
𝑡𝑖𝑛𝑘𝑢𝑏𝑎𝑠𝑖 × 𝑉𝑘𝑢𝑙𝑡𝑢𝑟 × 𝑂𝐷600
contoh: tabung A, t = 10 menit
𝐴𝑘𝑡𝑖𝑣𝑖𝑡𝑎𝑠 𝑒𝑛𝑧𝑖𝑚 =
0.466
= 51.78 𝑚𝑒𝑛𝑖𝑡 −1 𝐿−1
10 𝑚𝑒𝑛𝑖𝑡 × 1.5 × 10−3 𝐿 × 0.6
Dengan perhitungan yang sama, didapatkan:
Data aktivitas dari tabung-tabung berisi berbagai media
0
10
20
30
40
A (NB)
0
51.78
50.28
43.74
40.36
B (NB + glukosa)
0
-9.89
0.56
-2.19
-0.04
C (NB + glukosa + laktosa)
0
-0.11
0.56
5.41
0.64
D (NB + laktosa)
0
269.22
132.61
89.26
67.44
E (NB + maltosa)
0
19.11
12.44
12.00
9.94
F (NB + galaktosa)
0
156.44
82.39
26.56
41.78
t (menit)
Tabung
Kurva Aktivitas vs Waktu
300
250
A
200
B
150
C
Aktivitas
100
D
50
E
F
0
0
-50
10
20
30
40
t (menit)
*Interpretasi grafik untuk tabung D berbeda karena memiliki titik t0 yang tidak sama dengan nol.
VII. Pembahasan
Pada percobaan ini, dilakukan penentuan aktivitas β-galaktosidase dengan induksi oleh berbagai
gula. Gula-gula tersebut ditambahkan di dalam media, dan bakteri diinkubasi semalaman. Selama
itu, bakteri akan mengkatabolisir gula-gula tersebut dan mengubahnya menjadi ATP.
Pada tahap awal, kultur bakteri disentrifugasi dengan tujuan untuk mengendapkan bakteri dan
memisahkan dari media. Penambahan buffer Z bertujuan untuk mencuci sisa-sisa media yang
masih ada. Sentrifugasi dan pencucian dengan buffer Z dilakukan berkali-kali supaya pemisahan
bakteri dari media berlangsung dengan baik.
SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) adalah molekul deterjen dan ditambahkan untuk proses lisis sel. SDS
akan mengikat dan merusak membran sel, sehingga sel akan pecah. Kloroform sebagai pelarut
organik ditambahkan untuk mengekstrak komponen-komponen sel yang sudah tidak dibutuhkan.
Setelah itu, tabung diinkubasi dalam suhu 37°C. Suhu 37°C yang sama dengan suhu tubuh adalah
suhu optimum bagi kerja enzim β-galaktosidase. Dengan inkubasi terlebih dahulu, enzim menjadi
siap untuk bekerja.
Kemudian ditambahkan ONPG sebagai substrat. ONPG (orthonitrophenyl-galactosides) adalah
suatu senyawa β-galaktosidase. Setelah ONPG ditambahkan, larutan dikocok agar homogen, dan
diinkubasi untuk memberikan waktu bagi enzim untuk bekerja. Tabung dengan t = 0 menit tidak
diinkubasi, melainkan langsung ditambahkan Na2CO3 dan dimasukkan ke dalam es. Na2CO3 bersifat
basa, dan akan mengubah pH larutan. Kondisi pH menjadi tidak optimum lagi bagi kerja enzim, dan
aktivitas enzim akan menurun. Penyimpanan dalam es juga akan membuat suhu larutan turun secara
drastis. Dengan suhu sedingin itu, enzim hampir tidak bekerja sama sekali.
Untuk tabung-tabung lainnya, waktu inkubasi disesuaikan. Setelah inkubasi selesai, reaksi juga lansung
dihentikan dengan Na2CO3 dan disimpan dalam es. Kemudian dilakukan sentrifugasi lagi dan akan
dihasilkan dua lapisan cairan. Lapisan atas yang berupa cairan kuning menganung ONP hasil hidrolisis.
Sedangkan, cairan di bawahnya adalah fasa organik yang mengandung kloroform dan SDS. Untuk
pengukuran, yang diambil adalah cairan kuning. Fasa organik tidak boleh sampai terambil karena
dapat merusak kuvet.
Pada pelaksanaannya, tabung dengan t = 0 menit memiliki jeda yang terlalu lama hingga ditambahkan
Na2CO3. Apalagi tabung tidak langsung ditaruh di dalam es. Akibatnya, pada beberapa tabung t = 0
menit, sudah terbentuk warna kuning, menandakan enzim sudah bekerja. Berarti, semua tabung t = 0
menit sudah tidak memberikan data yang valid (t ≠ 0 menit). Sebenarnya, efek penghentian reaksi
oleh penyimpanan dalam es lebih besar daripada penambahan Na2CO3. Pada suhu yang dingin, enzim
memiliki energi kinetik yang sangat rendah, sehingga hampir tidak dapat bekerja sama sekali.
Sedangkan perubahan pH masih memungkinkan enzim untuk memiliki aktivitas (jika tidak
terdenaturasi). Hal itu terbukti dari tabung yang belum dimasukkan ke dalam es ternyata
menunjukkan warna kuning walaupun sudah ditambahkan Na2CO3.
Tabung t0 digunakan sebagai blanko untuk tabung A, B, C, E, dan F (kecuali D). Pada tabung D,
absorbans tabung t0-nya sudah terlalu besar, dan tidak dapat diubah menjadi 0 (sebagai blanko) oleh
spektrofotometer. Penggunaan tabung t0 yang sudah tidak valid ini sebagai blanko sebenarnya akan
mempengaruhi interpretasi data. Kita jadi tidak dapat menginterpretasi secara benar tabung mana
yang memberikan absorbans paling besar, karena tiap tabung memiliki titik 0 yang berbeda.
Pada tabung A, tampak bahwa warnanya cukup kuning dibandingkan tabung-tabung lain. Hal tersebut
menunjukkan bahwa ONP yang terbentuk cukup banyak, dan berarti enzim β-galaktosidase juga
banyak. Tabung A hanya mengandung NB tanpa gula apapun. Ekspresi gen terjadi karena bakteri
hanya memiliki sedikit ATP. Jika jumlah ATP sedikit, berarti jumlah cAMP banyak. Molekul cAMP akan
mengikat protein CRP. Kompleks CRP-cAMP akan mengikat di promotor dan menginduksi pengikatan
RNA polimerase juga sebesar 50x lipat. Akibatnya proses transkripsi berjalan dengan lebih lancar.
Represor tetap ada, namun tidak selalu menempel pada operator. Saat represor tidak menempel,
transkripsi dapat berjalan. Tren data absorbans pada tabung A cukup baik, yaitu terus naik. Jika waktu
inkubasi makin lama, ONP yang terbentuk akan semakin banyak, dan absorbans memang seharusnya
makin naik.
Pada tabung B, tampak bahwa warna kuning yang terbentuk sangat sedikit. Tren data kurang baik
karena naik turun. Namun data-data pada tiap waktu inkubasi hanya berbeda sedikit. Hal itu
menunjukkan bahwa ONP yang terbentuk memang sangat sedikit. Penyebabnya yaitu karena tabung B
mengandung glukosa. Glukosa dapat dengan mudah dikatabolisir oleh bakteri menjadi ATP. Akibatnya
jumlah ATP menjadi banyak, dan jumlah cAMP sedikit. Pengikatan RNA polimerase
menjadi menurun, sehingga transkripsi juga menurun. Selain itu, represor juga terkadang mengikat
operator dan menghalangi proses transkripsi β-galaktosidase.
Pada tabung C, warna kuning yang terbentuk juga sangat sedikit dan tren data naik turun. Data-data
tiap waktu inkubasi pun hanya berbeda sedikit, mirip dengan tabung B. Hal itu menunjukkan
bahwa ONP yang terbentuk memang sedikit. Sebenarnya laktosa dapat berperan sebagai induser. Cara
kerjanya yaitu laktosa diisomerisasi menjadi alolaktosa. Alolaktosa dapat mengikat represor dan
mengubah struktur represor. Akibatnya represor tidak dapat mengikat operator lagi, sehingga
proses transkripsi berjalan lancar tanpa halangan. Namun karena ada glukosa yang mudah diubah
menjadi ATP, jumlah cAMP menjadi sedikit. Kompleks CRP-cAMP hanya sedikit sehingga proses
pengikatan RNA polimerase tidak diinduksi. Transkripsi pun menjadi menurun, dan ONP yang
terbentuk menjadi sedikit. Bakteri memilih untuk menggunakan glukosa dahulu sebagai sumber
energi dibandingkan laktosa, karena glukosa lebih mudah dimetabolisir.
Pada tabung D, warna kuningnya paling pekat dibandingkan tabung-tabung lainnya. Berarti, dalan
tabung ini, ada sangat banyak ONP yang terbentuk. Alasannya yaitu karena ada laktosa yang dapat
berperan sebagai induser. Selain itu, jumlah ATP tidak terlalu banyak karena laktosa lebih sulit
dimetabolisir menjadi ATP dibandingkan glukosa. Karena jumlah ATP tidak banyak, jumlah cAMP
menjadi cukup banyak, dan kompleks CRP-cAMP dapat menginduksi pengikatan RNA polimerase.
Transkripsi pun dapat berjalan dengan baik, dan β-galaktosidase yang dihasilkan juga banyak. Tren
data pada tabung D mendatar, menunjukkan bahwa dari awal sudah langsung terbentuk banyak
produk ONP, dan inkubasi lebih lama tidak menambah jumlah produk yang terbentuk.
Pada tabung E, ada sedikit warna kuning yang terbentuk, lebih pekat dari tabung B dan C, namun
kurang pekat dibanding tabung A, D, dan F. Berarti, terbentuk sedikit ONP. Alasannya yaitu karena
gula yang ada adalah maltosa. Maltosa adalah disakarida, dan lebih sulit dikatabolisir menjadi ATP
dibandingkan glukosa. Karena ATP yang terbentuk tidak terlalu banyak, makan jumlah cAMP cukup
banyak. Kompleks CRP-cAMP kembali menginduksi pengikatan RNA polimerase dan transkripsi
meningkat. Pada tabung ini tidak ada induser, sehingga represor terkadang menghalangi
transkripsi. Tren data pada tabung E cukup baik, yaitu naik perlahan secara konstan.
Pada tabung F, warnanya cukup kuning juga, mirip dengan tabung A. Berarti ONP yang terbentuk
cukup banyak juga. Pada tabung ini, gula yang digunakan adalah galaktosa. Galaktosa adalah
monosakarida dan dapat dikatabolisir dengan cukup mudah menjadi ATP, namun tidak lebih
mudah dibandingkan glukosa. Jumlah ATP menjadi cukup banyak, dan cAMP menjadi agak sedikit.
Pengikatan RNA polimerase menjadi kurang terinduksi. Berarti, berjalannya proses transkripsi
bukan dipengaruhi oleh cAMP, melainkan oleh regulasi negatif, yaitu pelepasan represor. Dari sini,
dapat disimpulkan bahwa ternyata galaktosa dapat berperan sebagai induser dengan mengikat
represor. Represor akan lepas dari operator dan proses transkripsi pun meningkat.
VIII. Kesimpulan




IX.
Tabung D menunjukkan aktivitas β-galaktosidase yang paling tinggi.
Tabung A dan F menunjukkan aktivitas β-galaktosidase yang cukup tinggi.
Tabung E menunjukkan sedikit aktivitas β-galaktosidase.
Tabung B dan C menunjukkan aktivitas β-galaktosidase yang paling rendah.
Daftar Pustaka
Berg, Jeremy M., Tymoczko, John L., Stryer, Lubert. “Biochemistry”, 6th ed. 2006. W. H. Freeman
and Company. (page 892-901)
Lehninger, Albert L., Nelson, David Lee., Cox, Michael M. “Lehninger Principles of Biochemistry”, 4th
ed. 2004. W. H. Freeman and Company. (page 1081-1088)
http://en.wikipedia.org/wiki/Beta-galactosidase (17-04-2012)
http://en.wikipedia.org/wiki/Operon (17-04-2012)
http://en.wikipedia.org/wiki/Lac_operon (17-04-2012)