KAJIAN MOLEKULER GEN PROTEKTIF ANTIGEN

KAJIAN MOLEKULER GEN PROTEKTIF ANTIGEN
Bacillus anthracis ISOLAT INDONESIA
Maxs Urias Ebenhaizar Sanam
INTISARI
Bacillus anthracis adalah bakteri berbentuk batang, gram-positif, dan
membentuk spora. Kuman ini adalah penyebab antraks pada hewan terutama
herbivora, dan manusia. Antraks tersebar di banyak negara di dunia termasuk di
sejumlah provinsi di Indonesia. Virulensi B. anthracis ditentukan oleh 2 plasmid
virulen yaitu pXO1 yang mengandung gen penyandi toksin antraks, dan pXO2
yang menyandi pembentukan kapsula. Gen protective antigenic (pagA) terdapat
pada pXO1 dan menyandi protein antigenic (PA) yang berperan penting dalam
patogenesis antraks dan bersifat imunogenik. Data tentang sekuen gen pagA isolat
asal Indonesia sangat terbatas dan variasi genotipenya belum pernah diungkapkan.
Penelitian ini bertujuan mengungkapkan model, genotipe, dan hubungan
filogenetik sekuen gen pagAB. anthracis isolat asal Indonesia. Dua puluh tujuh
isolat terkait kasus antraks di Jawa Tengah, Yogyakarta, Nusa Tenggara Timur,
Nusa Tenggara Barat dan Papua diisolasi DNA-nya dengan metode lisis panas,
dilanjutkan dengan reaksi PCR dan sekuensing. Sekuen yang diperoleh
disejajarkan dan dibandingkan dengan sekuen rujukan B. anthracis dan sekuen
strain B. cereus yang ada di GenBank. Visualisasi produk PCR multiplex
mengungkapkan 2 isolat telah kehilangan salah satu plasmid pXO1 ataupun
pXO2. Tiga sekuen parsial pagA dihasilkan melalui amplifikasi dan dilanjutkan
sekuensing oleh 3 pasang primer berbeda untuk setiap sekuen yaitu PA8/PA5, PA
1846F/PA 2443R dan PA 5F/ PA 5R. Hasil penyejajaran sekuen dengan metode
ClustalW dari MEGA5 mengungkapkan tingkat homogenitas sekuen yang tinggi,
namun pada 5 isolat asal NTT dan NTB ditemukan 2 mutasi titik pada posisi
nukleotida 195 dan 1799 sehingga digolongkan ke dalam genotipe 5. Sementara
19 sekuen gen pagA dari isolat lainnya tidak ditemukan mutasi titik dan
digolongkan sebagai genotipe 1. Analisis filogenetik dengan metode UPGMA
mengungkapkan 2 klaster yaitu klaster B. anthracis dan klaster strain B. cereus
yang memiliki plasmid mirip pXO1. Dalam klaster B. anthracis, kedua kelompok
genotipe tersebut menempati subklaster yang berbeda. Berdasarkan hasil yang
diperoleh dapat disimpulkan bahwa di Indonesia terdapat 2 genotipe gen pagA B.
anthracis yaitu genotipe 1 (79%) dan genotipe 5 (21%). Disimpulkan pula bahwa
sekuen gen pagA B. anthracis dapat dibedakan secara nyata dari gen pagA strain
B. cereus yang memiliki plasmid mirip pXO1 dan tergolong ke dalam genotipe 9.
Kata Kunci: Bacillus anthracis, protective antigenic, pagA, genotipe, antraks,
PCR
xv
MOLECULAR STUDY ON PROTECTIVE ANTIGENIC GENE
of Bacillus anthracis ISOLATES FROM INDONESIA
Maxs Urias Ebenhaizar Sanam
ABSTRACT
Bacillus anthracis is a rod-shaped, gram-positive, spore-forming bacteria
that causing anthrax in animals, especially herbivores, and in humans. Anthrax is
spread in many countries around the world including a number of provinces in
Indonesia. The virulence of B.anthracisis determined by two virulence plasmid
namely, the pXO1 containing genes encoding anthrax toxins, and the pXO2 which
encodes for the formation of bacterial capsule. Protective antigenic gene (PagA)
located on pXO1 encodes for antigenic protein (PA) which is immunogenic and
plays an important role in the pathogenesis of anthrax. Data on pagA gene
sequences of isolates from Indonesia is very limited and the variation of their
genotypes has not been disclosed. This study aims to reveal the model, genotypes,
sequences and phylogenetic relationships of pagA gene of B. anthracisi solates
from Indonesia. Twenty-seven anthrax-related isolates of Central Java,
Yogyakarta, East Nusa Tenggara, West Nusa Tenggara and Papua were studied
and their DNA was extracted by heat lysis method, followed by PCR and
sequencing reactions. Aligned sequences were obtained and compared to a
number of reference sequences of B. anthracis and B.cereus strain derived from
GenBank. Visualization of multiplex PCR products revealed 2 isolates had lost
either pXO1 or pXO2. Three primer pairs PA8 / PA5, PA1846F / PA2443R and
PA5F / PA5 R respectively used to amplify and sequence partial gene of PagA.
The results of sequence alignment with ClustalW method of MEGA5 software
revealed a high degree of homogeneity. However five isolates from NTT and
NTB were found to have two point mutations at nucleotide positions of 195 and
1799 which then be classified as genotype 5. Meanwhile, none of the rest nineteen isolates has point mutation or single nucleotide polymorphism (SNP) and
therefore being grouped as pagA genotype 1. Phylogenetic analysis conducted
with UPGMA methode produced 2 clusters, namely B. anthracis and B. cereus
pXO1-like clusters. In B. anthracis cluster, the two groups of genotype occupy
different subclusters. Based on the results obtained it can be concluded that in
Indonesia there are 2 PagA genotypes of B. anthracis strains of which the
dominant type is the genotype 1 (79%) and genotype 5 (21%). It was also
concluded that the pagA sequences of B. anthracis is significantly distinguishable
from that of B. cereus pXO1-like strains which is being classified as genotype 9.
Keywords: Bacillus anthracis, protective antigenic, PagA, genotype, anthrax,
PCR
xvi