BAB III Alat, Bahan dan Metode Penelitian

BAB III Alat, Bahan dan Metode Penelitian
Pada bagian ini akan diuraikan mengenai peralatan, bahan, dan metode yang
digunakan dalam penelitian.
III.1
Alat-alat
Peralatan yang digunakan dalam penelitian merupakan peralatan standar yang
biasa digunakan dalam pekerjaan mikrobiologi dan biologi molekular. Jenis
peralatan meliputi peralatan gelas, non gelas, dan perangkat lunak komputer.
Peralatan gelas terdiri dari cawan petri, gelas kimia, labu Erlenmeyer, gelas ukur,
tabung reaksi bertutup, botol reagen, pipet tetes, batang pengaduk, batang
bengkok gelas (spreader glass), labu Buchner dan corong penyaring (filter
holder) (Duran, Schott, Germany; Pyrex, USA). Peralatan non gelas meliputi
meliputi mikropipet dan tip mikropipet berukuran 2,5 μL, 10 μL, 100 μL, 1000
μL, dan 5000 μL serta tabung mikrosentrifuga berukuran 200 μL, 500 μL, 1500
μL, dan 2000 μL (Eppendorf, Germany; dan Gilson, France). Timbangan digital
model 682B (Mettler Toledo, Switzerland) digunakan untuk penimbangan massa
bahan kimia. Pengukuran pH larutan dapar dan media dilakukan dengan pH meter
(Beckman, USA). pH meter portable (Hanna Inc.) digunakan untuk pengukuran
pH di lapangan. Autoclave model no. 25X (Electric Pressure Steam Sterilizer,
USA) digunakan untuk sterilisasi alat dan bahan. Shaking incubator Thermolyne
digunakan untuk inkubasi yang memerlukan pengocokan dan inkubator model
2219 Multitemp II (Bromma, Sweden) untuk inkubasi tanpa pengocokan. Vortex
(Genie Scientific Industries Inc. Model G 560E, LR 45227, USA) digunakan
untuk pencampuran larutan dan pemecahan sel mikroba. Freezer -20oC (Forma
Scientific, Inc., USA) digunakan untuk penyimpanan DNA dan freezer -80oC
(Forma Scientific, Inc., USA) untuk penyimpanan stok gliserol. Refrigerator
(Sharp, Japan) digunakan untuk menyimpan larutan, biakan bakteri pada media
padat pada suhu 4oC. Mikroskop model YS100 (Nikon, Japan) digunakan untuk
mengamati bentuk sel mikroba. Pengambilan gambar mikroba dan DNA
dilakukan dengan kamera digital Coolpix P3 (Nikon, Japan).
27
Percobaan isolasi dan amplifikasi DNA menggunakan peralatan mikrosentrifuga
(Beckman) untuk sentrifugasi pada suhu kamar, mikrosentrifuga dingin model
biofuge (Heraus) untuk sentrifugasi pada suhu 4oC, alat PCR model Gene Cycler
(Bio-Rad), dan spectrophotometer 100-60 (Hitachi). Pemisahan fragmen DNA
dilakukan dengan menggunakan peralatan elektroforesis tipe EC250-9 EC
(Apparatus Corp., USA) dan visualisasi hasil elektroforesis dilakukan dengan
lampu ultraviolet (Cole Parmer Instruments, France). Dokumentasi hasil
visualisasi tersebut dilakukan dengan kamera digital Coolpix P3 (Nikon, Japan).
Pemisahan DNA dengan cara DGGE (denaturing gradient gel electrophoresis)
dilakukan dengan menggunakan alat DCode System (BioRad). Alat Atomic
Absorption Spectroscopy (AAS, GBC Avanta Ver. 2.02, Australia) digunakan
untuk penentuan kandungan logam pada sampel air.
Perangkat lunak komputer ClustalW, Phylip 6.3, GenDoc, dan Treeview
digunakan untuk analisis penjajaran urutan nukleotida, konstruksi pohon
filogenetik, dan visualisasi hasil penjajaran dan pohon filogenetik. Beberapa
program online seperti BLASTN dari National Centre of Biotechnological
Information (NCBI) melalui situs http://www.ncbi.nlm.nih.gov, dan CHECKCHIMERA
dari
Ribosomal
Database
Project
(RDP)
melalui
situs
http://rdp.cme.msu.edu masing-masing digunakan untuk penjajaran urutan
nukleotida dengan data nukleotida yang ada di GenBank dan melihat
kemungkinan adanya chimera.
III. 2
Bahan-bahan
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian meliputi zat kimia untuk
pembuatan media dan reagen, primer untuk amplifikasi, dan enzim. Zat kimia
yang digunakan mempunyai kualitas pro analysis (p.a) kecuali jika disebutkan
lain. Zat kimia yang digunakan meliputi bakto tripton, bakto pepton, ekstrak ragi,
bakto agar, beef extract, Na2HPO4, KH2PO4, NaCl, NH4Cl, MgCl2, EDTA, CaCl2,
NaNO3, KNO3, MgSO4.7H2O, CaSO4.2H2O, FeCl3, MnSO4.H2O, H3BO3,
ZnSO4.7H2O, CoCl2.6H2O, CuSO4.5H2O, Na2MoO4.2H2O, H2SO4, SDS, AgNO3,
kloroform, isoamilalkohol, etanol, basa tris, gliserol, isopropanol, asam asetat
28
glasial, dan kalium asetat (Merck, Germany); etidium bromida, gelrite, xylene
cyanol (Sigma Chemicals Co., USA); formamida, dapar PCR 10X (Tris Cl 10
mM, MgCl2 1,5 mM, KCl 59 mM) dan campuran dNTP (Amersham Pharmacia
Biotech. Inc., USA); bromophenol blue (Pharmacia LKB Biotechnology Inc.,
Piscataway, NJ); agarosa (Gibco BRL, USA); glukosa, sukrosa, urea (USB,
USA).
Enzim yang digunakan dalam penelitian meliputi proteinase K (USB Corp. USA),
lisozim (Amersham Life Science, UK), dan enzim DNA polimerase Taq
(Fermentas). Primer-primer yang digunakan untuk keperluan amplifikasi fragmen
gen 16S rRNA dan sekuensing tercantum dalam Tabel III.1.
Tabel III.1 Jenis primer yang digunakan dalam reaksi amplifikasi PCR dan
sekuensing.
1
Nama
Primer
Primer 1
2
Primer 2
3
Primer 3
4
Bact27 F
5
Uni1492 R
6
Com1-F
CAGCAGCCGCGGTAATAC
7
Com2-R
CCGTCAATTCCTTTGAGTTT
No
III. 3
Urutan (5’ → 3’)
Referensi
Keperluan
ATGGCTGTCGTCAGCT
CGCCCGCCGCGCCCCGCGCC
CGGCCCGCCGCCCCCGCCCC
ACGGGCGGTGTGTAC
CACGGGCGGTGTGTAC
AGAGTTTGATC(A/C)TGGCT
CAG
GGTTAC(G/C)TTGTTACCTGC
CGGA
Ferris et al., 1996
PCR
Ferris et al., 1996
PCR
Ferris et al., 1996
PCR/Sekuensing
Baker et al.,2001
PCR/Sekuensing
Baker et al.,2001
PCR/Sekuensing
Schwieger dan
Tebbe, 1998
Schwieger dan
Tebbe, 1998
Sekuensing
Sekuensing
Metode Penelitian
Metode penelitian meliputi semua pengerjaan yang digunakan dalam penelitian
berkaitan dengan penanganan sampel mikroba dan DNA, serta analisis
filogenetik.
29
III.3.1 Pengambilan sampel
Sampel diambil dari dua lokasi di sekitar Kawah Hujan (E 107°48’14.38”, N 7°8’21.7” dan ketinggian 1690 m), Kamojang, Jawa Barat. Pengambilan sampel
Kawah Hujan A dilakukan pada bulan Januari 2007, sedangkan sampel Kawah
Hujan B diambil pada bulan Juni 2006. Pengukuran suhu air kawah dan pH
(menggunakan pH indikator) di lokasi dilakukan selama 3 kali, yaitu pada bulan
Juli 2004, Juni 2006, dan Januari 2007. Pengukuran pH air kawah menggunakan
pH meter dilakukan di laboratorium. Lima liter masing-masing sampel air kawah
dibawa ke laboratorium menggunakan jerigen yang sudah disterilkan dengan
etanol dan dibilas dengan air kawah. Sampel sesegera mungkin dibawa ke
laboratorium untuk ditangani sesuai keperluannya.
III.3.2 Isolasi mikroba dengan cara filtrasi
Segera setelah tiba di laboratorium, sekitar 5 liter sampel air kawah disaring
dengan filter membran berukuran 0,22 mikro meter menggunakan filter holder
yang diisap dengan pompa vakum. Penyaringan dilakukan di laboratorium dalam
kondisi aseptik. Mikroba beserta endapan lainnya yang tersaring pada filter dicuci
dengan cara disuspensikan dalam 3 mL dapar STE (10mM Tris-HCl [pH 8.0], 0,1
M NaCl, 1mM EDTA). Suspensi dimasukkan ke dalam 2 tabung mikrosentrifuga
dan disentrifugasi pada kecepatan 3000 x g. Supernatan dibuang dan pelet
kembali dicuci dengan dapar STE sebanyak minimal 4 kali. Pelet yang telah
dicuci disimpan di freezer -20°C sampai dilakukan isolasi DNA kromosom.
III.3.3 Isolasi mikroba dengan cara kultivasi
Sampel air kawah sebanyak 50 mL ditambah dengan 1 mL media pengaya yang
sudah dipekatkan 50 kali. Penambahan media pengaya ke dalam sampel dilakukan
di lokasi pengambilan sampel. Media pengaya yang ditambahkan antara lain
pepton 5% (b/v), media LB 25x pekat, media termus 50x pekat, campuran pepton
10% (b/v) dan ekstrak ragi 5% (b/v), media Castenhold D (Atlas, 1993) 50x pekat,
media Czapek Dox (Atlas, 1993) 100x pekat, media sulfolobus 50x pekat, dan
media sulfat-reducing 50x pekat. Komposisi media Casrenhold D, Czapek Dox,
sulfolobus, dan sulfat-reducing dapat dilihat pada Lampiran A. Selama perjalanan
30
dari lokasi ke laboratorium, sampel diupayakan berada pada temperatur tinggi
dengan cara dimasukkan ke dalam termos yang berisi air kawah. Sampel tersebut
kemudian diinkubasi pada temperatur 70°C tanpa pengocokan setelah sampai di
laboratorium. Inkubasi dihentikan setelah terlihat adanya peningkatan kekeruhan
pada sampel dibandingkan dengan sebelum diinkubasi.
III.3.4 Pewarnaan Gram mikroba
Preparat mikoba dibuat dengan membuat lapisan tipis kultur mikroba di atas kaca
preparat dan difiksasi dengan cara pemanasan di atas api. Kultur terfiksasi
kemudian ditetesi dengan pewarna Hucker (crystal violet) selama 1 menit dan
dicuci dalam air mengalir selama tidak lebih dari 2 detik. Selanjutnya, lapisan
tersebut direndam dalam larutam Mordant (Gram’s iodine) selama 1 menit. Warna
dihilangkan melalui pencucian dengan etanol 95% dilanjutkan dengan pencucian
dalam air mengalir. Preparat direndam dalam counterstain (Safranin O) selama 1
menit, kemudian dicuci dalam air mengalir dan dikeringkan. Mikroba yang sudah
diwarnai dilihat di bawah mikroskop pada perbesaran 400 kali.
III.3.5 Isolasi DNA kromoson
DNA kromosom diisolasi menggunakan metode lisis berbasis enzimatis yang
merupakan modifikasi dari metode yang dikemukakan oleh Klijn et al. (1991),
dan perusakan secara fisik, modifikasi dari metode Zhou et al. (1996).
Metode enzimatis dilakukan sebagai berikut: pelet sel disuspensi dalam 200 µL
dapar Tris Cl (pH 8,0) yang mengandung 8 mg/mL lisozim dan diinkubasi pada
temperatur 37°C selama 1 jam. Sel kemudian dilisis dengan penambahan 200 µL
dapar lisis yang mengandung SDS 2%, 0,8 mg/mL proteinase K, dan 200 mM
EDTA pH 8,0. Proses lisis dilakukan pada temperatur 50°C selama 30 menit.
Selanjutnya ditambahkan 150 µL larutan C dingin (60 mL CH3COOK 5M; 11,5
mL asam asetat glasial; 28,65 mL H2O) dan divorteks selama 10 detik. Campuran
kemudian diinkubasi dalam es selama 5 menit dan selanjutnya disentrifugasi pada
16.000 x g, 4oC selama 10 menit. Supernatan dipindahkan ke dalam tabung
mikrosentrifuga baru, kemudian ditambahkan 300 µL kloroform:isoamilalkohol
31
(24:1), divorteks dan disentrifugasi pada 16.000 x g selama 30 detik. Lapisan atas
dipindahkan ke dalam tabung baru. Penambahan kloroform:isoamilalkohol (24:1)
dilakukan sebanyak 2 kali. Selanjutnya, DNA diendapkan dengan penambahan
0,6 volum isopropanol dan diinkubasi pada temperatur ruang selama 1 jam.
Setelah dilakukan sentrifugasi selama 15 menit pada kecepatan 16.000 x g, pelet
DNA dicuci dengan 70% etanol sebanyak 3x, dikeringkan, dan akhirnya
dilarutkan dalam ddH2O.
Metode perusakan fisik (bead-beating) dilakukan sebagai berikut: pelet sel
disuspensi dalam 300 µL dapar ekstraksi (100 mM Tris-Cl pH 8,0; 100mM EDTA
pH 8,0; 100mM KH2PO4; dan 1,5M NaCl) yang mengandung 0,8 mg/mL
proteinase K. Selanjutnya suspensi sel divorteks dengan kecepatan sedang selama
15 menit setelah ditambahkan glass bead steril. Ke dalam campuran kemudian
ditambahkan 30 µL SDS 20% dan diinkubasi pada temperatur 65°C selama 2 jam.
Pemurnian
DNA
dilakukan
dengan
penambahan
1x
volum
kloroform:isoamilalkohol (24:1), divorteks dan disentrifugasi pada kecepatan
maksimum selama 30 detik. Lapisan atas dipindahkan ke dalam tabung baru.
Langkah pemurnian DNA dilakukan selama 2 kali. Selanjutnya, DNA diendapkan
dengan penambahan 0,6 volum isopropanol dan diinkubasi pada temperatur ruang
selama 1 jam. Setelah dilakukan sentrifugasi selama 15 menit pada kecepatan
16.000 g, pelet DNA dicuci dengan 70% etanol sebanyak 3x, dikeringkan, dan
akhirnya dilarutkan dalam ddH2O.
III.3.6 Elektroforesis gel agarosa
Fragmen DNA dipisahkan dengan cara elektroforesis pada gel agarosa 1% dalam
dapar TAE. 0,3 g agarosa dilarutkan dalam 30 mL dapar TAE 1 X (1 L TAE 50
X: 242 g tris base, 57,1 mL asam asetat glacial, 100 mL 0,5 M EDTA pH 8,0),
dipanaskan hingga medidih kemudian didinginkan. Setelah mencapai suhu sekitar
55oC larutan (gel) dituang ke dalam cetakan yang sudah diberi sisir dan dibiarkan
membeku. Marker DNA dan sampel sebanyak 10 μL yang akan dielektroforesis
masing-masing dicampurkan dengan 2 μL loading buffer (0,25% bromphenol blue
dalam 40% sukrosa), kemudian dimasukkan ke dalam sumur gel. Elektroforesis
32
dilakukan dalam dapar TAE 1X dengan tegangan 75 volt sampai warna biru
loading buffer bermigrasi kira-kira 2/3 bagian dari panjang gel. Gel agarosa
tersebut direndam di dalam larutan etidium bromida (10 μg/mL) selama 30-60
detik, kemudian gel direndam selama 5-10 menit dalam larutan 1 mM MgSO4 dan
pita-pita DNA akan terlihat di bawah sinar UV.
III.3.7 Amplifikasi DNA 1
Amplifikasi DNA 1 merupakan amplifikasi fragmen gen 16S rRNA. Proses
amplifikasi dilakukan dengan menggunakan metode PCR touchdown berdasarkan
metode yang dikemukakan oleh Ferris et al. (1996). Enzim DNA polimerase yang
digunakan untuk PCR adalah enzim Taq DNA polimerase. Sebanyak 25 μL
campuran reaksi PCR (dapar PCR 1X; 20 pmol Primer 1; 20 pmol Primer 2; 10
mM dNTPs; MgCl2 1,5mM; 1 unit enzim DNA polimerase Taq; 0,5-2 μL DNA
templat) digunakan untuk amplifikasi DNA kromosom. Siklus PCR adalah 1
menit untuk denaturasi pada 94°C, 1 menit untuk annealing, dan 1 menit untuk
pemanjangan primer pada 72°C. Pada 10 siklus pertama, temperatur annealing
menurun secara teratur dari 53°C sampai 43°C dengan interval 1°C per siklus. 20
siklus selanjutnya, temperatur annealing dilakukan pada 43°C. Pemanjangan
primer terakhir dilakukan selama 10 menit.
III.3.8 Amplifikasi DNA 2
Amplifikasi DNA 2 merupakan proses amplifikasi DNA menggunakan metode
standar PCR. Campuran total reaksi PCR (50 μl) mengandung dapar PCR 1X, 10
mM dNTP, pasangan primer masing-masing 20 pmol, MgCl2 3 mM, 2 unit enzim
DNA polimerase Taq, dan ~10 ng DNA templat. Proses amplifikasi dilakukan
dengan tahap denaturasi awal 94oC selama 4 menit dilanjutkan dengan 30 kali
siklus PCR yang terdiri dari 1 menit untuk denaturasi pada 94oC, 1 menit untuk
annealing pada 50oC, dan 1 menit untuk pemanjangan pada 72oC, diikuti oleh
tahap akhir pemanjangan pada 72oC selama 10 menit. Kondisi PCR ini digunakan
untuk mengamplifikasi pita-pita DNA hasil DGGE dan gen 16S rRNA utuh,
masing-masing menggunakan pasangan primer P1 dengan P3 dan Bact27F
dengan uni1492R.
33
III.3.9 Denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE)
Teknik pemisahan dengan cara DGGE (denaturing gradient gel electrophoresis)
dilakukan berdasarkan metode Fischer dan Lerman (1983). Ada beberapa tahapan
dalam melakukan elektroforesis tersebut, antara lain: penyiapan larutan,
pembuatan gel, penyiapan sampel, dan elektroforesis. Semua peralatan dalam
elektroforesis harus dalam keadaan bersih dan bebas lemak. Untuk keperluan
tersebut maka pelat kaca yang digunakan sebagai cetakan dalam pembuatan gel
dicuci terlebih dahulu dengan deterjen hingga bersih, kemudian dikeringkan dan
terakhir dibersihkan dengan 70% alkohol teknis. Cetakan gel dengan ketebalan
1,5 mm berikut pompa pembuat gradien (gradient delivery system) dipersiapkan
sesuai dengan petunjuk pada buku manual alatnya. Pembuatan reagen bervariasi
sesuai dengan konsentrasi denaturan dan akrilamid yang akan digunakan.
Denaturan 0% dan 100% harus dibuat sebagai stock solution. Larutan 100%
denaturan terdiri dari campuran urea 7 M dan formamida 40% (b/v) ditambah
larutan akrilamid dengan konsentrasi sesuai yang akan digunakan dalam dapar
TAE 1x. Larutan dengan konsentrasi denaturan tinggi dan denaturan rendah yang
akan digunakan dibuat dengan mencampurkan larutan stock denaturan 0% dan
100% tersebut. Kedua larutan dibuat dalam 2 wadah terpisah. Setelah
ditambahkan
larutan
amonium
persulfat
(APS)
10%
(b/v)
dan
tetrametiletilendiamin (TEMED), masing-masing larutan dimasukkan ke dalam
syringe dan dipasangkan pada pompa pembuat gradien yang kemudian
disambungkan dengan selang kecil untuk dimasukkan ke dalam cetakan gel.
Larutan dimasukkan ke dalam cetakan gel kemudian dipasang sisir di bagian
atasnya dan dibiarkan sampai memadat. Gel yang sudah membeku dipasangkan ke
dalam alat untuk elektroporesis, kemudian dimasukkan ke dalam tangki
elektroforesis berisi dapar TAE 1x yang sudah dipanaskan sebelumnya sampai
temperatur 60°C. Sisir di atas gel dibuka dan masing-masing sumur dibersihkan
dari sisa-sisa larutan dengan cara menyemprotkan dapar TAE dengan pipet atau
syringe kecil. Electrophoresis control module dipasangkan dan dijalankan sampai
sistem kembali mencapai temperatur 60°C. Sampel DNA sebanyak 5 – 10 μL
DNA dicampurkan (1:1) dengan gel loading dye 2x (0,05% (b/v) bromophenol
34
blue, 0,05% (b/v) xylene cyanol, dan 70% gliserol) kemudian dimasukkan ke
dalam masing-masing sumur di dalam gel. Elektroporesis dijalankan pada
tegangan 200 volt dan temperatur 60°C selama 3-4 jam hingga warna loading dye
mencapai batas tertentu bagian bawah gel. Setelah elektroforesis selesai, gel
dilepas dari alat elektroforesis untuk diwarnai.
III.3.10 Pewarnaan DNA dengan perak nitrat (Silver staining)
Pewarnaan DNA yang terdapat di dalam gel akrilamid didasarkan pada metode
yang dikembangkan oleh Bassam et al. (1991). Gel hasil elektroforesis difiksasi
dengan larutan asam asetat 10% (b/v) sebanyak 2 kali masing-masing selama 10
menit. Gel dicuci 3 kali dengan aqua dm masing-masing selama 2 menit kemudian
direndam dalam larutan pewarna (AgNO3 0,1% (b/v), formaldehid 0,5% (v/v))
selama 30 menit. Setelah gel dicuci kembali dengan aquadest sebanyak 2 kali, gel
direndam di larutan developing (Na2CO3 3% (b/v), formaldehid 0,5% (v/v), Natiosulfat 0,002 mg/mL) pada temperatur 4°C sampai pita pita DNA muncul.
Tahap akhir dari pewarnaan adalah fiksasi dengan menggunakan asam asetat 10%
(b/v) dan pencucian kembali dengan aqua dm. Gel kemudian dikeringkan di
antara 2 plastik selofan.
III.3.11 Ekstraksi DNA dari gel DGGE
Masing-masing pita yang terdapat pada gel DGGE dipotong dan disuspensi dalam
50 μL ddH2O, kemudian dididihkan selama 5 menit dan dibiarkan terdifusi selama
satu malam pada 37oC. Larutan DNA dibiarkan di temperatur 4°C sampai
dijadikan templat untuk proses re-PCR (Muyzer et al., 1993).
III.3.12 Penentuan urutan DNA
Penetuan urutan DNA (sekuensing) dilakukan melalui jasa komersial di Macrogen
Inc., Korea. Proses penentuannya adalah menggunakan metode Dye Terminator
(3’-dye labelled dideoxynucleotide triphosphate) yang meliputi beberapa tahap,
yaitu: penyiapan template, reaksi sekuensing, pemurnian produk PCR, dan
elekroforesis dengan scanning fluoresence.
35
III.3.13 Analisis filogenetik
Dalam penelitian ini beberapa data perlu dilakukan analisis dengan bantuan
program komputer, antara lain: analisis adanya chimera pada urutan DNA sampel,
penjajaran urutan DNA sampel dengan urutan DNA yang ada di GenBank,
pengambilan urutan DNA dari GenBank, penyuntingan urutan DNA, penjajaran
urutan DNA menggunakan program ClustalW versi 1.83, dan konstruksi pohon
filogenetik menggunakan program Phylip 3.62.
III.3.13.1 Analisis chimera dan penjajaran urutan DNA
Semua urutan DNA sampel yang akan dianalisis dikonfirmasi keberadaan urutan
chimera sebelum dilakukan penjajaran. Analisis chimera dilakukan menggunakan
program komputer CHECK-CHIMERA dari Ribosomal Database Project
(Maidak et al. 2000) yang dapat diakses dari dari situs http://rdp.cme.msu.edu.
Urutan yang diduga merupakan chimera tidak dianalisis lebih lanjut.
Kemiripan urutan DNA sampel dengan urutan DNA yang sudah dideposit di
GenBank dapat diketahui melalui penjajaran urutan DNA sampel dengan data
nukleotida di NCBI melalui situs http://www.ncbi.nlm.nih.gov. Penjajaran
dilakukan dengan menggunakan program BLASTN (Altschul et al. 1997).
Selanjutnya, sekitar 100 urutan DNA yang mempunyai kemiripan tertinggi
dengan sampel di-download melalui situs yang sama. File disimpan dalam bentuk
FASTA (teks) untuk mempemudah penyuntingan.
Data yang diambil dari GenBank memiliki ukuran yang berbeda-beda. Untuk
mendapatkan analisa yang benar, harus digunakan urutan DNA dengan ukuran
dan posisi yang sama pada gen. Untuk mengetahui posisi tersebut dilakukan
penjajaran menggunakan program ClustalW versi 1.83 (Thomson et al. 1994).
Selanjutnya, daerah di luar posisi tersebut dihilangkan. Data yang sudah sama
ukuran dan posisinya dikelompokkan ke dalam satu file dalam bentuk Text
Document menggunakan program notepad. Prosedur untuk melakukan penjajaran
nukleotida menggunakan program ClustalW disampaikan pada Lampiran B.
36
III.3.13.2 Konstruksi pohon filogenetik
Pohon filogenetik dikonstruksi menggunakan program Phylip 3.62 (Felsenstein,
1989). Data masukan (input file) yang digunakan untuk mengkonstruksi pohon
filogenetik adalah urutan nukleotida yang sudah dijajarkan menggunakan program
ClustalW dalam format phy. Jarak evolusi dihitung dengan menggunakan metode
F84 sesuai dengan default program DNADIST. Pohon filogenetik dikonstruksi
berdasarkan perhitungan matriks jarak dengan metode neighbor-joining (Saitou
dan Nei, 1987) menggunakan program NEIGHBOR. Program SEQBOOT
digunakan untuk analisis bootstrap dengan memasukkan nilai set data 1000.
Prosedur untuk mengkonstruksi pohon filogenetik disampaikan pada Lampiran B.
III.3.14 Analisis kandungan kimia air kawah
Analisis kadar logam dalam air kawah dilakukan dengan metode spektroskopi
serapan atom atau AAS. Untuk pembuatan kurva standar, dibuat larutan standar
1000 ppm dari masing-masing logam yang akan dianalisis. Zat yang digunakan
sebagai standar antara lain: (NH4)2Fe(SO4)2, CaCO3, MnSO4, MgCl2, NaCl,
Al2(SO4)3, KCl. Larutan standar dengan konsentrasi lebih kecil yang berada dalam
rentang pengukuran serapan yang baik dibuat dengan cara mengencerkan larutan
standar 1000 ppm. Selanjutnya, terhadap sampel dan larutan standar dilakukan
pengukuran serapannya pada panjang gelombang yang sesuai.
Analisis kadar Cl- dan SO42- dilakukan di Lab Kimia Analitik FMIPA ITB. Kadar
NO3-, NO2-, dan F- dianalisis di Lab Air Teknik Lingkungan ITB, menggunakan
jasa layanan masyarakat.
37