1 EKSPRESI GEN MADS-BOX KELAS B PISTILLATA (PaphPI

EKSPRESI GEN MADS-BOX KELAS B PISTILLATA (PaphPI) PADA
PERKEMBANGAN BUNGA ANGGREK SELOP
(Paphiopedilum glaucophyllum J.J. Smith)
Putri Eka Maharani, Dahlia, Dwi Listyorini
Universitas Negeri Malang
E-mail: [email protected]
ABSTRAK: Paphiopedilum glaucophyllum J.J Smith merupakan anggrek endemik jawa
timur, Indonesia. Anggrek ini memiliki morfologi labelum berbentuk selop berwarna
merah muda keunguan dan bukaan selop berwarna kuning cerah. Petal bunga anggrek
selop berwarna cokelat keunguan membentuk spiral dan memiliki banyak trikoma.
Karakter perhiasan bunga yang unik ini akibat dari adanya gen yang berperan dalam
perkembangan bunga, adapun gen tersebut salah satunya adalah PISTILLATA (PI). Gen
PISTILLATA (PI) merupakan salah satu gen anggota dari subfamili gen MADS-box.
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui ekspresi gen PISTILLATA (PaphPI) dari
Paphiopedilum glaucophyllum J.J Smith yang diawali dengan cara isolasi RNA total dan
membuat cDNA menggunakan primer: Forward: 5’-ATG GGG CGA GGG AAG ATC
GAG AT-3’ dan Reverse: 5’-TGT TAT TTA TTT CCT TGC AAG TTG GGC T-3’.
Hasil penelitian menunjukkan ekspresi gen PaphPI dari visualisasi hasil elektroforesis
memiliki pola yang sama pada organ colum, labelum, sepal dan petal. Hal ini diduga gen
PaphPI berperan dalam keseluruhan perkembangan bunga.
Kata Kunci: Paphiopedilum glaucophyllum J.J Smith, PaphPI, Perkembangan bunga
ABSTRACT: Paphiopedilum glaucophyllum J.J Smith is endemic orchid of East Java,
Indonesia. This orchid has a slipper-shaped labellum pink to purple and bright yellow
margin. Slipper orchid has a twisted petals purplish brown and a lot of trichomes. The
unique perianth character are coordinated by floral development gene, namely
PISTILLATA (PI). PISTILLATA (PI) gene is a member of sub-family of MADS-Box
gene. This study aimed to determine PISTILLATA (PaphPI) gene expression of
Paphiopedilum glaucophyllum J.J Smith that begins with total RNA isolation and cDNA
synthesis using primer: Forward: 5’-ATG GGG CGA GGG AAG ATC GAG AT-3’ and
Reverse: 5’-TGT TAT TTA TTT CCT TGC AAG TTG GGC T-3’. The result showed the
PaphPI gene expression in organ column, labellum, sepal and petal has a same pattern.
Suspected PaphPI gene play a role in overall process of the floral development.
Keyword : Paphiopedilum glaucophyllum J.J Smith, PaphPI, Floral development
Orchidaceae dibagi menjadi 5 subfamili yaitu Apostasioideae,
Vanilloideae, Cypripedioideae, Orchidoideae, dan Epidendroideae (Chochai,
2013). Anggrek memiliki bentuk bunga yang beragam tergantung spesiesnya.
Bunga anggrek terdiri atas lima bagian utama, yaitu sepal, petal, benangsari, putik
dan ovari. Sepal adalah pelindung bunga terluar ketika bunga masih kuncup.
Tidak seperti tanaman dikotil, semua anggrek memiliki sepal yang berwarna.
Anggrek memiliki tiga helai sepal dan tiga helai petal yang berwarna indah. Sepal
dan petal pada bunga anggrek yang memiliki kemiripan bentuk dan warna disebut
tepal. Dua helai petal tersusun membentuk sudut 120o, helai ketiga terdeferensiasi
dan berukuran lebih besar disebut labelum. Bentuk, corak dan warna labelum
beragam. Putik dan benang sarinya menjadi satu membentuk suatu struktur yang
disebut colum atau gimnostemium (Palomino, 2013). Setiap spesies tumbuhan
1
2
memiliki ciri khas morfologi bunga yang membedakannya dari spesies lain.
Diversifikasi morfologi bunga ini merupakan ekspresi kombinasi dari gen-gen
MADS-Box (Aceto & Gaudio, 2011). Cypripedioidae merupakan kelompok
anggrek selop dimana semua anggotanya memiliki persamaan yaitu memiliki
bentuk labelum seperti selop. Cypripedioidae dibagi menjadi 5 genus yaitu
Cypripedium, Mexipedium, Paphiopedilum, Phragmipedium dan Selenipedium
(Guo et al., 2012; Chocai, 2013). Paphiopedilum glaucophyllum J.J. Smith
merupakan salah satu spesies yang termasuk kedalam kelompok genus
Paphiopedilum Subgenus Cochlopetalum. Anggrek ini endemik Jawa Timur,
Indonesia. Semua spesies Paphiopedilum sudah terancam punah dan masuk dalam
daftar apendiks 1 CITES (McGough, et al., 2006; De et al., 2014), meskipun
demikian anggrek ini masih banyak diperdagangkan. Banyaknya peminat yang
memperdagangkan anggrek Paphiopedilum tidak seimbang dengan sedikitnya
penelitian mengenai anggrek tersebut, terutama penelitian mengenai gen MADSBox kelas B. Oleh karena itu untuk menambah wawasan tentang gen pada
Paphiopedilum maka sangat perlu dilakukan penelitian tentang gen MADS-Box
kelas B PISTILLATA pada Paphiopedilum galucophyllum J. J. Smith.
METODE
Analisi ekspresi gen PaphPI dilakukan dengan metode semi-kuantitatif
RT-PCR yaitu mendeskripsikan visualisasi hasil elektroforesis dan dibandingkan
dengan Housekeeping gene Actin.
Isolasi RNA dan Sintesis cDNA
Isolasi RNA kuncup bunga anggrek Paphiopedilum glaucophyllum J.J.
Smith menggunakan regaen TriPure. Masing-masing organ kuncup bunga
diisolasi secara terpisah yaitu Colum, Labelum, Sepal dan Petal. Total RNA yang
didapatkan disintesis 8 macam cDNA. Amplifikasi gen PISTILLATA (PaphPI)
dilakukan dengan teknik RT-PCR (Reverse Transcriptase-Polymerase Chain
Reaction) menggunakan sepasang primer yaitu gen PaphPI pada Paphiopedilum
macabre, yaitu primer forward F : (5’- ATG GGG CGA GGG AAG ATC GAG
AT-3’) dan primer reverse R : (5’-TGT TAT TTA TTT CCT TGC AAG TTG
GGC T-3’) (Pan, et al.,2011).
PCR dan Elektroforesis
Tahap PCR (Poly Chain Reaction) dilakukan sesuai dengan protokol
modifikasi kit PCR My TaqTM Red Mix. Siklus PCR yang dilakukan meliputi Initial
denaturation selama 10 menit dengan suhu 94oC sebanyak 1 kali, Denaturation
selama 15 detik dengan suhu 94oC, Annealing selama 1 menit dengan suhu yang
disesuaikan (PaphPI = 59oC dan Actin = 54oC), dan Extention selama 20 detik
dengan suhu 72oC masing-masing sebanyak 40 kali. Final Extention dilakukan
sebagai tahap penutup selama 10 menit dengan suhu 72oC. Hasil pada tahap ini
diteruskan ke tahap elektroforesis.
3
Analisis Data
Penelitian ini menggunakan metode deskriptif analitik semi-kuantitatif.
Data yang diperoleh berupa hasil elektroforesis Gen PaphPI pada Paphiopedilum
glaucophyllum J.J. Smith dianalisis secara deskriptif dibandingkan dengan nilai
kuantifikasi relatif Housekeeping gene (gen Actin).
HASIL PENELITIAN
A. Kajian Biologis Anggrek Paphiopedilum glaucophyllum J.J. Smith
Terdapat sekitar 200 spesies anggrek selop yang terbagi menjadi lima
genus, yaitu Cypripedium, Mexipedium, Paphiopedilum, Phragmipedium dan
Selenipedium. Cypripedium memiliki distribusi yang paling luas meliputi belahan
bumi utara dan daerah subtropis, genus Selenipedium endemik di daerah Amerika
Selatan, genus Mexipedium dan Phragmipedium tersebar di daerah neotropis serta
Paphiopedilum yang tersebar di daerah tropis Asia (Guo et al., 2012). Genus
Paphiopedilum dibagi menjadi 6 subgenus, yaitu Cochlopetalum, Brachypetalum,
Paphiopedilum, Parvisepalum, Sigmapetalum dan Polyantha. Beberapa spesies
yang termasuk dalam subgenus Cochlopetalum adalah Paphiopedilum
glaucophyllum, P. chamberlianum, P. moquetteanum, P. Liemianum, dan P.
Primulinum.
Gambar 1. Anggota Subgenus Cochlopetalum (Sumber: Slipperorchids, tanpa tahun).
Paphiopedilum glaucophyllum J.J. Smith adalah salah satu spesies
anggrek selop yang termasuk tanaman endemik Jawa Timur, Indonesia .
Habitat alami Anggrek Selop berada di kawasan selatan lereng Gunung
Semeru, Lumajang, Jawa Timur (Dyer, 1906; Lawless, 2005). anggrek ini
termasuk kedalam appendiks 1 CITES (Convention on International Trade in
Endangered Species; konvensi perdagangan internasional untuk spesies-spesies
tumbuhan dan satwa liar) (De, et al, 2014), yaitu spesies tumbuhan dan satwa liar
yang terancam sehingga dilarang dari segala bentuk perdagangan internasional.
B. Gen MADS-Box pada Anggrek
Pada Phalaenopsis aphrodite terdapat 5 gen yang termasuk kedalam kelas
B, yaitu empat gen APETALA3 dan satu gen PISTILLATA. Empat gen yang
termasuk kedalam kelas A yaitu APETALA1 dan AGAMOUS-like6. Empat gen
yang termasuk dalam kelas C dan D yaitu gen AGAMOUS dan gen SEEDSTICK.
4
Tiga gen SEPALATA yang termasuk kelas E yaitu PaSEP-1, PaSEP-2, dan
PaSEP-3 (Su et al., 2013).
Tabel 2.1. ABCDE Kelas fungsional dari gen MADS-Box pada Phalaenopsis aphrodite.
Kelas
B
A
C/D
E
Clade
AP3
AP3
AP3
AP3
PI
AP1
AP1
AGL6
AGL6
AG
AG
AG
STK
SEP
SEP
SEP
Nama
PaAP3-1
PaAP3-2
PaAP3-3
PaAP3-4
PaPI-1
PaAP1-1
PaAP1-2
PaAGL6-1
PaAGL6-2
PaAG-1
PaAG-2
PaAG-3
PaAG-4
PaSEP-1
PaSEP-2
PaSEP-3
Phalaeonopsis aphrodite yang memperlihatkan tiga pola ekspresi. Pola
pertama diwakili oleh PaAP3-1 yang dominan diekspresikan di sepal dan petal,
pada lingkaran pertama dan dua. Pola kedua diwakili oleh PaAP3-4 dan PaAP3-3
yang sangat tinggi diekspresikan di labelum dan colum. Pola ketiga diwakili oleh
PaPI-1 dan PaAP3-2 yang diekspresikan di semua organ bunga kecuali polinia.
Hasil dari penelitian yang lainnya menunjukkan bahwa semua kelompok gen PI di
Orchidaceae diekspresikan pada semua organ bunga, yaitu sepal, petal, labelum,
dan column (Su et al., 2013). Selain itu, kelomok gen PI juga diekspresikan pada
ovarium yang sedang berkembang (Cantone, et al, 2009).
C. Housekeeping Gene Actin
Housekeeping gene mengkode protein esensial yang memelihara fungsi sel
(Roche, 2002). Housekeeping gene merupakan gen yang terus menerus
diekspresikan selama suatu organisme hidup. Housekeeping gene memiliki tingkat
eksperesi yang stabil di berbagai jaringan pada semua tahapan perkembangan
(Coker & Davies, 2003; Libault et al., 2008). Housekeeping gene biasa digunakan
sebagai kontrol dalam studi analisis ekspresi gen (Glare et al., 2002; Roche, 2002;
Dheda et al., 2004; Jain et al., 2006; Hannum et al., 2010).
Gen Actin adalah protein yang sangat penting bagi sel eukariotik. Actin
berperan penting dalam membentuk jaringan yang memberikan dukungan
mekanik sel, menentukan bentuk sel, pergerakan sel, dan juga pembelahan sel
(Thellin et al., 1999; Libault et al., 2008). Actin juga penting dalam morfogenesis
sel pada tumbuhan, sebagai komponen dinding sel, terlibat dalam pertumbuhan
rambut akar, sel trikom, tabung pollen, perpanjangan sel dan apikal meristem
(Gestel et al., 2003; Scheuring et al., 2016).
5
PEMBAHASAN
Sintesis cDNA dengan RT-PCR
Hasil isolasi total RNA disintesis 8 macam cDNA menggunakan teknik
RT-PCR yaitu cDNA PI Column, cDNA PI Labelum, cDNA PI Sepal, cDNA PI
Petal, cDNA Actin Column, cDNA Actin Labelum, cDNA Actin Sepal, dan cDNA
Actin Petal. Hasil sintesis cDNA yang diperoleh adalah cDNA PI Column
sebanyak 429,7 ng/µl, Labelum 471,4 ng/µl, PI Sepal 326,7 ng/µl, PI Petal 394,8
ng/µl, Actin Column 416,3 ng/µl, Actin Labelum 396,8 ng/µl, Actin Sepal 370,1
ng/µl, dan Actin Petal 391,9 ng/µl. Ringkasan kuantifikasi konsentrasi cDNA
disajikan pada Tabel 1.
Tabel 1. Hasil kuantifikasi konsentrasi sampel cDNA
Kode Isolat cDNA
CO
LA
SE
PE
Konsentrasi cDNA (ng/µl)
PISTILLATA
(PI)
429,7
471,4
326,7
394,8
ACTIN
416,3
396,8
370,1
391,9
Keterangan: Co = Colum, La = Labelum, Se = Sepal, Pe = Petal.
Pola Ekspresi Gen PaphPI
Pola ekspresi dari gen PaphPI secara semi-kuantitatif RT-PCR pada
Paphiopedilum glaucophyllum J.J. Smith menunjukkan ketebalan pita yang sama
antara organ colum, labelum, sepal dan petal (Gambar 4.1). Hal ini diduga gen
PaphPI berperan dalam perkembangan seluruh bagian bunga. Seperti dilaporkan
pada jenis anggrek yang lain, PISTILLATA (PI) memicu pembelahan sel dan
pembesaran sel dalam proses perkembangan bunga, sehingga gen ini terekspresi
diseluruh bagian organ bunga (Zik & Irish, 2003; Mara, et al., 2010).
Gambar 2. Hasil visualisasi elektroforesis pola ekspresi gen PaphPI dan gen Actin pada
Paphiopedilum glaucophyllum J.J. Smith
SIMPULAN DAN SARAN
Visualisasi hasil elektroforesis gen PaphPI menunjukkan pola ekspresi
yang sama pada semua organ yaitu colum, labelum, sepal dan petal. Hal ini
diduga gen PaphPI berperan dalam keseluruhan perkembangan bunga. Ekspresi
6
gen PaphPI terlihat lebih tipis, dibandingkan dengan ekspresi House keeping gene
yaitu gen Actin.
Penelitian lebih lanjut menggunakan metode Real-Time RT-PCR (qRTPCR) diperlukan untuk memperoleh pola ekspresi gen PaphPI yang lebih akurat.
DAFTAR RUJUKAN
Aceto. S., & Gaudio, L. 2001. The MADS and the Beauty : Genes Inved in the
Development of Orchid Flowers. Current Genomics, 12: 342-356.
Cantone C., Sica M., Gaudio L. & Aceto S. 2009. The OrcPI locus: Genomic
organization, expression pattern, and noncoding regions variability in
Orchis italica (Orchidaceae) and related species. Gene, 434: 9–15.De,
L.C., Rao, A.N., Rajeevan, P.K., Dhiman, S.R., Srivastava, M. &
Geetamani, C. 2014. Morphological Characterization In Paphiopedilum
Species. Electronic Journal of Biosciences, 2 (3): 131-145.
Chocai, A. 2013. Phylogenetics genome size eution and population genetics of
slipper orchids in the subfamily Cypripedioideae (Orchidaceae). Thesis.
School of Science Birkbeck, University of London And Genetic Section,
Jodrell Laboratory Royal Botanic Gardens, KewDyer, W.T.T. 1906.
Curtis’s Botanical Magazine II. London : Lovell Reeve & Co., LTD.
Coker, J.S & Davies, E. 2003. Selection of candidate housekeeping controls in
tomato plants using EST data. BioTechniques, 35 (4): 740-748.
Dheda, K., Huggett, J. F., Bustin, S. A., Johnson, M. A., Rook, G. & Zumla, A.
2004. Validation of Housekeeping genes for Normalizing RNA Expression
in real-time PCR. BioTechnique, 37: 112-119.Guo, Y.Y., Luo, Y.B. &
Wang, X.Q. 2012. Eution and biogeography of the slipper orchids: eocene
vicariance of the conduplicate genera in the old and new world Tropics.
PloS ONE, 7 (6): 1-13.
Gestel, K. V., Slegers H., Witsch M. V., Samaj, J., Baluˇska, F. & Verbelen J. P.
2003. Immunological evidence for the presence of plant homologues of the
actin-related Arp3 in tobacco and maize: subcellular localization to actinenriched pit fields and emerging root hairs. Protoplasma, 222: 45-52.
Glare, E. M., Divjak, M., Bailey, M. J. & Walters, E. H. 2002. b-Actin and
GAPDH housekeeping gene expression in asthmatic airways is variable
and not suitable for normalising mRNA levels. Thorax, 57: 756-770.
Hannum, S., Akashi, K., Suharsono, U. W., Hartana, A., Yokota, A. & Suharsono.
2010. Isolasi fragmen cDNA dari gen penyandi aktin dari Melastoma
malabathricum. Makara, Sains, 14 (2): 163-167.
Jian, M., Nijhawan, A., Tyagi, A. K. & Khurana, J. P. 2006. Validation of
housekeeping genes as internal control for studying gene expression in rice
by quantitative real-time PCR. Biochemical and Biophysical Research
Communication, 345: 646-651.
Libault, M., Thibivilliers, S., Bilgin, D. D., Radwan, O., Benitez, M., Clough, S. J.
& Stacey, G. 2008. Identification of four soybean reference genes for gene
expression normalization. The Plant Genome, 1: 44-54.
Mara, C.D., Huang, T. & Irish, V.F. 2010. The Arabidopsis Floral Homeotic
Proteins APETALA3 and PISTILLATA Negatively Regulate the
7
BANQUO Genes Implicated in Light Signaling. The Plant Cell, 22: 690–
702.
McGough, H. N., Brodie, C. & Kowalczyk, J. 2006. CITES and Slipper orchids:
An introduction to slipper orchids covered by the convention on
international trade in endangered species. United Kingdomg: The Board
Trustees, Royal Botanic Gardens, Kew.
Palomino, M. M. 2013. Perspectives on MADS-box expression during orchid
flower eution and development. Specht, C. D. (Ed.), Frontiers in Plant
Science, 4: 377-386.
Pan, Z.J., Cheng, C.C., Tsai, W.C., Chung, M.C., Chen, W.H., Hu, J.M. & Chen,
H.H. 2011. The Duplicated B-class MADS-Box Genes Display Dualistic
Characters in Orchid Floral Organ Identity and Growth. Journal Plant Cell
Physiol, 52 (9): 1515-1531.
Roche. 2002. Roche applied science: Technical note no. LC15/2002.
Scheuring , D., Löfkea, C., Krügerb, F., Kittelmannc, M., Eisaa, A., Hughesc, L.,
Smithd, R. S., Hawesc, C., Schumacherb, K., & Vehn, J. K. 2016. Actindependent vacuolar occupancy of the cell determines auxin-induced
growth repression. PNAS, 113 (2): 452-547.
Slipperorchid. Tanpa tahun. Paphiopedilum Subgenus cochlopetalum. (Online),
(http://slipperorchids.info/paphspecies/index.html).
Su, C.l., Chen, W.C., Lee, A.Y., Chen, C.Y., Chang, Y.C.A., Chao, Y.T. & Shih,
M.C. 2013. A Modified ABCDE Model of Flowering in Orchids Based on
Gene Expression Profiling Studies of the Moth Orchid Phalaenopsis
aphrodite. Journal Gene Expression Profiles of Orchid Flower, 8 (11): 114.
Thellin, O., Zorzi, W., Lakaye, B., Borman, B. D., Coumans, B., Hennen, G.,
Grisar, T., Igout, A. & E. Heinen. 1999. Housekeeping genes as internal
standards: use and limits. Journal of Biotechnology, 75: 291–295.
Zik, M. & Irish, V.F. 2003. Global identification of target genes regulated by
APETALA3 and PISTILLATA floral homeotic gene action. The Plant Cell,
15: 207-222