analisis toksikologi forensik

ANALISIS TOKSIKOLOGI FORENSIK
Buku Ajar
disusun oleh:
Dr.rer.nat. I Made Agus Gelgel Wirasuta, Apt., M.Si.
JURUSAN FARMASI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS UDAYANA
BUKIT JIMBARAN
KATA PENGANTAR
Dengan mengucapkan syukur ”Om Awighnam Astu Nahma Sidham” semoga tiada aral yang
melintang dan memperoleh wara nugraha Ida Sang Hyang Widhi Wasa. Bahan ajar ini disusun agar
dapat memperkaya literatur dan memberi gambaran tentang Analisis Toksikologi Forensik. Analisis
toksikologi forensik adalah integrasi berbagai disiplin ilmu diantaranya kimia analisis dan prinsipprinsip dasar toksikologi, yang mencangkup aplikasi dan telaah tentang racun, yang berhubungan
dengan tindakan melawan hukum ”kriminal”.
Pada tulisan ini diawali dengan sub bahasan: ”Pengantar Menuju Ilmu Forensik” yang menjelaskan
definisi forensic science dan bidang ilmu yang tercangkup dalam forensik sains, kemudian
dilanjutkan dengan sub bahasan ”Pengantar Toksikologi” yang memberi gambaran tentang
pengertian ilmu toksikologi dan sejarah perkembangan ilmu toksikologi. Agar mahasiswa lebih
mengerti bagaimana tokson dapat menimbulkan efek keracunan pada sub bahasan berikutnya
dibahas ”Fase Kerja Toksik”. Sub bahasan ”Analisis Toksikologi Forensik” dibahas dalam bab IV,
karena sebagaian besar sampel analisis toksikologi merupakan materi biologi, maka dalam bab
berikutnya dibahas sifat dan cara penanganan materi biologi dalam analisis toksikologi. Bab
berikutnya membahas metode analisis yang digunakan dalam penyelenggaraan analisis toksikologi
forensik.
Sangat disadari tulisan ini masih jauh dari sempurna, namun langkah/usaha sekecil apapun akan
sangat berarti sebagai daya awal untuk langkah yang lebih besar. Menyadari hal tersebut penulis
sangat mengharapkan masukan dan saran, dari berbagai pihak guna menyempurnakan materi ini.
Saran dan masukan dapat dialamatkan ke penulis
Jimbaran, Juli 2008
Hormat kami
ttd
Penulis
Pengantar Menuju Ilmu Forensik
1
DAFTAR ISI
BAB I
1.1.
1.2.
1.3.
1.4.
BAB II
2.1.
2.2.
2.3.
2.4.
2.5.
BAB III
3.1.
3.2.
3.3.
3.4.
3.5.
3.6.
BAB IV
4.1.
4.2.
4.3.
4.4.
4.5.
BAB V
5.1.
5.2.
5.3.
BAB VI
6.1.
6.2.
6.3.
BAB VIII
7.1.
7.2.
7.3.
7.4.
7.5.
7.6.
halaman
PENGANTAR MENUJU ILMU FORENSIK ……………………………………………………
Pengantar …………………………………………………………………………………………
Ruang Lingkup Ilmu Forensik …………………………………………………………………...
Peran ilmu forensik dalam penyelesaian kasus kejahatan .........
…………………………...
Langkah-langkah Penyidikan ....................................................... ………………………….
PENGANTAR TOKSIKOLOGI ...................................................... ………………………….
Perkembangan Awal Toksikologi ................................................. ………………………….
Pengertian Toksikologi dan Racun ........................................... …………………………....
Cakupan dan Subdisiplin Toksikologi ...................................... …………………………...
Perkembangan Mutahir Toksikologi ......................................... …………………………...
Prospek Masa Depan ................................................................ …………………………..
FASE KERJA TOKSIK ............................................................. …………………………....
Fase eksposisi ......................................................................... …………………………...
Fase toksokinetik ................................................................... ……………………………..
Fase Toksodinamik .................................................................. …………………………...
Pemodelan Farmakokinetik ...................................................... …………………………...
Parameter Farmakokinetik ...................................................... …………………………....
Biotransformasi (metabolisme) ................................................ …………………………...
ANALISIS TOKSIKOLOGI FORENSIK .................................... …………………………....
Pendahuluan ................................................................................ ………………………...
Bilamana memerlukan pemeriksaan toksikologik ........................ ………………………...
Langkah-langkah analisis toksikologi forensik ............................. ………………………...
Interpretasi temuan analisis ......................................................... ………………………...
Kesimpulan .................................................................................. ………………………...
CAIRAN BIOLOGI ....................................................................... ………………………...
Sifat Beberapa Cairan Biologik Tertentu ..................................... ………………………...
Pengambilan Sampel ………………………...………………………...……………………….
Faktor-Faktor yang harus diperhatikan dalam Analisis obat dalam cairan
biologi ..........
REAKSI WARNA ......................................................................... ………………………...
Interpretasi reaksi warna ............................................................. ………………………...
Faktor Teknis ............................................................................... ………………………...
Beberapa Reaksi Warna .............................................................. ………………………...
KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS .................................................. ………………………...
Fase Diam ................................................................................... ………………………...
Penotolan sampel .......................................................................... ………………………...
Sistem pelarut ................................................................................ ………………………...
Pengembangan .............................................................................. ………………………...
Deteksi Noda ................................................................................. ………………………...
Faktor-faktor yang perlu diperhatikan pada KLT ........................... ………………………...
Pengantar Menuju Ilmu Forensik
1
1
2
4
5
9
9
10
12
13
14
16
16
16
21
21
23
24
31
31
31
32
35
39
41
41
43
43
46
46
46
46
50
51
52
52
52
53
54
2
BAB VIII
8.1.
8.2.
8.3.
8.4.
8.5.
BAB IX
9.1.
9.2.
BAB X
10.1.
10.2.
10.3.
10.4.
10.5.
BAB XI
11.1.
11.2.
11.3.
11.4.
11.5.
11.6.
11.7.
PENGGUNAAN KROMATOGRAFI GAS DALAM ANALISIS TOKSIKOLOGI .................
Parameter Retensi ...................................................................... ………………………...
Peralatan ..................................................................................... ………………………...
Analisis Kualitatif ......................................................................... ………………………...
Analisis Kuantitatif ....................................................................... ………………………...
Derivatisasi Pada Kromatograti Gas Cair ..................................... ………………………...
PENGGUNAAN KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI (HPLC) DALAM ANALISIS
TOKSIKOLOGI ................................. ………………………...………………………............
Pemilihan Sistem HPLC .............................................................. ………………………...
Analisis Obat ............................................................................... ………………………...
APLIKASI SPEKTROMETRI MASSA DALAM ANALISIS PENYALAHGUNAAN OBAT ..
Pendahuluan .............................................................................. ………………………...
Aliran Analit/Sampel dalam MS ................................................... ………………………...
Sistem Pengumpulan Data dan Penampilannya ......................... ………………………...
Kepustakaan Spektrum Massa ................................................... ………………………...
Analisis Beberapa Kelompok Obat ............................................. ………………………...
APLIKASI SPEKTROSFOTOMETRI INFRA MERAH DALAM ANALISIS TOKSIKOLOGI
Pendahuluan ............................................................................. ………………………...
Hubungan spektra IR dengan struktur molekul ......................... ………………………...
Instrumen .................................................................................. ………………………...
Teknik Sampling Pada IR ......................................................... ………………………...
Berbagai Teknik Yang Dikombinasikan Dengan Spektroskopi IR ………………………
Penerjemahan Spektrum IR ....................................................... ………………………...
Spektrum IR obat-obatan yang sering disalahgunakan ............. ………………………...
Pengantar Menuju Ilmu Forensik
55
55
55
57
57
58
60
60
64
66
66
66
66
67
68
73
73
73
74
75
77
78
78
3
BAB I
PENGANTAR MENUJU ILMU FORENSIK
1.1. Pengantar
Forensik biasanya selalu dikaitkan dengan
tindak pinada (tindak melawan hukum). Dalam
buku-buku ilmu forensik pada umumnya ilmu
forensik diartikan sebagai penerapan dan
pemanfaatan ilmu pengetahuan tertentu untuk
kepentingan penegakan hukum dan keadilan.
Dalam penyidikan suatu kasus kejahatan,
observasi terhadap bukti fisik dan interpretasi
dari hasil analisis (pengujian) barang bukti
merupakan alat utama dalam penyidikan
tersebut.
Tercatat pertama kali pada abad ke 19 di
Perancis Josep Bonaventura Orfila pada suatu
pengadilan dengan percobaan keracunan pada
hewan dan dengan buku toksikologinya dapat
meyakinkan hakim, sehingga menghilangkan
anggapan bahwa kematian akibat keracunan
disebabkan oleh mistik.
Pada pertengahan abad ke 19, pertama kali
ilmu kimia, mikroskopi, dan fotografi
dimanfaatkan dalam penyidikan kasus kriminal
(Eckert, 1980). Revolusi ini merupakan
gambaran tanggungjawab dari petugas
penyidik dalam penegakan hukum.
Alphonse Bertillon (1853-1914) adalah seorang
ilmuwan yang pertamakali secara sistematis
meneliti ukuran tubuh manusia sebagai
parameter dalam personal indentifikasi. Sampai
awal 1900-an metode dari Bertillon sangat
ampuh digunakan pada personal indentifikasi.
Bertillon dikenal sebagai bapak identifikasi
kriminal (criminal identification).
Francis Galton (1822-1911) pertama kali
meneliti sidik jari dan mengembangkan metode
klasifikasi dari sidik jari. Hasil penelitiannya
sekarang ini digunakan sebagai metode dasar
dalam personal identifikasi.
Leone Lattes (1887-1954) seorang profesor di
institut kedokteran forensik di Universitas
Turin, Itali. Dalam investigasi dan identifikasi
bercak darah yang mengering „a dried
bloodstain”, Lattes menggolongkan darah ke
dalam 4 klasifikasi, yaitu A, B, AB, dan O. Dasar
Pengantar Menuju Ilmu Forensik
klasifikasi ini masih kita kenal dan
dimanfaatkan secara luas sampai sekarang.
Dalam perkembangan selanjutnya semakin
banyak bidang ilmu yang dilibatkan atau
dimanfaatkan dalam penyidikan suatu kasus
kriminal untuk kepentingan hukum dan
keadilan. Ilmu pengetahuan tersebut sering
dikenal dengan Ilmu Forensik.
Saferstein dalam bukunya “Criminalistics an
Introduction to Forensic Science” berpendapat
bahwa ilmu forensik ”forensic science“ secara
umum adalah „the application of science to
law”.
Ilmu Forensik dikatagorikan ke dalam ilmu
pengetahuan alam dan dibangun berdasarkan
metode ilmu alam. Dalam padangan ilmu alam
sesuatu sesuatu dianggap ilmiah hanya dan
hanya jika didasarkan pada fakta atau
pengalaman (empirisme), kebenaran ilmiah
harus dapat dibuktikan oleh setiap orang
melalui indranya (positivesme), analisis dan
hasilnya mampu dituangkan secara masuk
akal, baik deduktif maupun induktif dalam
struktur bahasa tertentu yang mempunyai
makna
(logika)
dan
hasilnya
dapat
dikomunikasikan ke masyarakat luas dengan
tidak mudah atau tanpa tergoyahkan (kritik
ilmu) (Purwadianto 2000).
Dewasa ini dalam penyidikan suatu tindak
kriminal
merupakan
suatu
keharusan
menerapkan pembuktian dan pemeriksaan
bukti fisik secara ilmiah. Sehingga diharapkan
tujuan dari hukum acara pidana, yang menjadi
landasan proses peradilan pidana, dapat
tercapai yaitu mencari kebenaran materiil.
Tujuan ini tertuang dalam Keputusan Menteri
Kehakiman No.M.01.PW.07.03 tahun 1983 yaitu:
untuk mencari dan mendapatkan atau setidaktidaknya mendekati kebanaran materiil, ialah
kebenaran yang selengkap-lengkapnya dari
sutau perkara pidana dengan menerapkan
ketentuan hukum acara pidana secara jujur dan
tepat dengan tujuan untuk mencari siapakah
pelaku yang dapat didakwakan melakukan
suatu pelanggaran hukum, dan selanjutnya
meminta pemeriksaan dan putusan dari
pengadilan guna menemukan apakah terbukti
4
bahwa suatu tindak pidana telah dilakukan dan
apakah orang yang didakwa itu dapat
dipersalahkan.
Adanya pembuktian ilmiah diharapkan polisi,
jaksa, dan hakim tidaklah mengandalkan
pengakuan dari tersangka atau saksi hidup
dalam penyidikan dan menyelesaikan suatu
perkara. Karena saksi hidup dapat berbohong
atau disuruh berbohong, maka dengan hanya
berdasarkan keterangan saksi dimaksud, tidak
dapat dijamin tercapainya tujuan penegakan
kebenaran dalam proses perkara pidana
dimaksud.
Dalam pembuktian dan pemeriksaan secara
ilmiah, kita mengenal istilah ilmu forensik dan
kriminologi. Secara umum ilmu forensik dapat
diartikan sebagai aplikasi atau pemanfaatan
ilmu pengetahuan tertentu untuk kepentingan
penegakan hukum dan keadilan.
1.2. Ruang Lingkup Ilmu Forensik
Ilmu-ilmu yang menunjang ilmu forensik adalah
ilmu kedokteran, farmasi, kimia, biologi, fisika,
dan psikologi.
Sedangkan kriminalistik
merupakan cabang dari ilmu forensik.
Cabang-cabang ilmu forensik lainnya adalah:
kedokteran forensik, toksikologi forensik,
odontologi forensik, psikiatri forensik,
entomologi forensik, antrofologi forensik,
balistik forensik, fotografi forensik, dan
serologi / biologi molekuler forensik. Biologi
molekuler forensik lebih dikenal dengan ”DNAforensic”.
Kriminalistik merupakan penerapan atau
pemanfaatan ilmu-ilmu alam pada pengenalan,
pengumpulan / pengambilan, identifikasi,
individualisasi, dan evaluasi dari bukti fisik,
dengan menggunakan metode / teknik ilmu
alam di dalam atau untuk kepentingan hukum
atau peradilan (Sampurna 2000). Pakar
kriminalistik adalah tentunya seorang ilmuwan
forensik yang bertanggung jawab terhadap
pengujian (analisis) berbagai jenis bukti fisik,
dia melakukan indentifikasi kuantifikasi dan
dokumentasi dari bukti-bukti fisik. Dari hasil
analisisnya kemudian dievaluasi, diinterpretasi
dan dibuat sebagai laporan (keterangan ahli)
dalam atau untuk kepentingan hukum atau
peradilan (Eckert 1980). Sebelum melakukan
tugasnya,
seorang
kriminalistik
harus
mendapatkan pelatihan atau pendidikan dalam
penyidikan tempat kejadian perkara yang
Pengantar Menuju Ilmu Forensik
dibekali dengan kemampuan dalam pengenalan
dan pengumpulan bukti-bukti fisik secara
cepat. Di dalam perkara pidana, kriminalistik
sebagaimana dengan ilmu forensik lainnya,
juga berkontribusi dalam upaya pembuktian
melalui prinsip dan cara ilmiah.
Kriminalistik memiliki berbagai spesilisasi,
seperti analisis (pengujian) senjata api dan
bahan peledak, pengujian perkakas (”toolmark
examination”),
pemeriksaan
dokumen,
pemeriksaan biologis (termasuk analisis
serologi atau DNA), analisis fisika, analisis
kimia, analisis tanah, pemeriksaan sidik jari
laten, analisis suara, analisis bukti impresi dan
identifikasi.
Kedokteran Forensik adalah penerapan atau
pemanfaatan
ilmu
kedokteran
untuk
kepentingan
penegakan
hukum
dan
pengadilan. Kedokteran forensik mempelajari
hal ikhwal manusia atau organ manusia dengan
kaitannya peristiwa kejahatan.
Di Inggris kedokteran forensik pertama kali
dikenal dengan ”Coroner”. Seorang coroner
adalah seorang dokter yang bertugas
melalukan pemeriksaan jenasah, melakukan
otopsi mediko legal apabila diperlukan,
melakukan penyidikan dan penelitian semua
kematian yang terjadi karena kekerasan,
kemudian melalukan penyidikan untuk
menentukan sifat kematian tersebut.
Di Amerika Serikan juga dikenal dengan
”medical examinar”. Sistem ini tidak berbeda
jauh dengan sistem coroner di Inggris.
Dalam perkembangannya bidang kedokteran
forensik tidak hanya berhadapan dengan mayat
(atau bedah mayat), tetapi juga berhubungan
dengan orang hidup. Dalam hal ini peran
kedokteran forensik meliputi:
− melakukan otopsi medikolegal dalam
pemeriksaan
menyenai
sebab-sebab
kematian, apakah mati wajar atau tidak wajar,
penyidikan ini juga bertujuan untuk mencari
peristiwa apa sebenarnya yang telah terjadi,
− identifikasi mayat,
− meneliti waktu kapan kematian itu
berlansung ”time of death”
− penyidikan pada tidak kekerasan seperti
kekerasan seksual, kekerasan terhadap anak
dibawah umur, kekerasan dalam rumah
tangga,
− pelayanan penelusuran keturunan,
2
− di negara maju kedokteran forensik juga
menspesialisasikan dirinya pada bidang
kecelakaan lalu lintas akibat pengaruh obatobatan ”driving under drugs influence”.
Bidang ini di Jerman dikenal dengan
”Verkehrsmedizin”
Dalam prakteknya kedokteran forensik tidak
dapat dipisahkan dengan bidang ilmu yang
lainnya seperti toksikologi forensik, serologi /
biologi molekuler forensik, odontologi forensik
dan juga dengan bidang ilmu lainnya
Toksikologi Forensik, Toksikologi adalah ilmu
yang menelaah tentang kerja dan efek
berbahaya zat kimia (racun) terhadap
mekanisme biologi. Racun adalah senyawa
yang berpotensial memberikan efek berbahaya
terhadap organisme. Sifat racun dari suatu
senyawa ditentukan oleh: dosis, konsentrasi
racun di reseptor, sifat zat tersebut, kondisi
bioorganisme atau sistem bioorganisme,
paparan terhadap organisme dan bentuk efek
yang ditimbulkan. Lebih khusus, toksikologi
mempelajari sifat fisiko kimia dari racun, efek
psikologi
yang
ditimbulkannya
pada
organisme,
metode analisis racun baik
kualitativ maupun kuantitativ dari materi
biologik atau non biologik, serta mempelajari
tindakan-tidankan
pencegahan
bahaya
keracunan.
LOOMIS (1978) berdasarkan aplikasinya
toksikologi
dikelompokkan
dalam
tiga
kelompok besar, yakni: toksikologi lingkungan,
toksikologi ekonomi dan toksikologi forensik.
Tosikologi forensik menekunkan diri pada
aplikasi atau pemanfaatan ilmu toksikologi
untuk kepentingan peradilan. Kerja utama dari
toksikologi forensik adalah analisis racun baik
kualitatif maupun kuantitatif sebagai bukti
dalam tindak kriminal (forensik) di pengadilan.
Toksikologi forensik mencangkup terapan ilmu
alam dalam analisis racun sebagi bukti dalam
tindak
kriminal.
Toksikologi
forensik
merupakan gabungan antara kimia analisis dan
prinsip dasar toksikologi. Bidang kerja
toksikologi forensik meliputi:
− analisis dan mengevaluasi racun penyebab
kematian,
− analisis ada/tidaknya alkohol, obat terlarang
di dalam cairan tubuh atau napas, yang dapat
mengakibatkan
perubahan
prilaku
(menurunnya kemampuan mengendarai
kendaraan bermotor di jalan raya, tindak
Pengantar Menuju Ilmu Forensik
kekerasan dan kejahatan, penggunaan
dooping),
− analisis obat terlarang di darah dan urin pada
kasus penyalahgunaan narkotika dan obat
terlarang lainnya.
Odontologi Forensik, bidang ilmu ini
berkembang berdasarkan pada kenyataannya
bahwa: gigi, perbaikan gigi (dental restoration),
dental protese (penggantian gigi yanng rusak),
struktur rongga rahang atas “sinus maxillaris”,
rahang, struktur tulang palatal (langit-langit
keras di atas lidah), pola dari tulang trabekula,
pola penumpukan krak gigi, tengkuk, keriput
pada bibir, bentuk anatomi dari keseluruhan
mulut dan penampilan morfologi muka adalah
stabil atau konstan pada setiap individu.
Berdasarkan kharkteristik dari hal tersebut
diatas dapat dijadikan sebagai acuan dalam
penelusuran identitas seseorang (mayat tak
dikenal). Sehingga bukit peta gigi dari korban,
tanda / bekas gigitan, atau sidik bibir dapat
dijadikan sebagai bukti dalam penyidikan
tindak kejahatan.
Psikiatri forensik, seorang spikiater berperan
sangat besar dalam bebagai pemecahan
masalah tindak kriminal. Psikogram dapat
digunakan untuk mendiagnose prilaku,
kepribadian, dan masalah psikis sehingga
dapat memberi gambaran sikap (profile) dari
pelaku dan dapat menjadi petunjuk bagi
penyidik. Pada kasus pembunuhan mungkin
juga diperlukan otopsi spikologi yang
dilakukan oleh spikiater, spikolog, dan
patholog forensik, dengan tujuan penelaahan
ulang tingkah laku, kejadian seseorang
sebelum melakukan tindak kriminal atau
sebelum melakukan bunuh diri. Masalah
spikologi (jiwa) dapat memberi berpengaruh
atau dorongan bagi seseorang untuk
melakukan tindak kejahatan, atau perbuatan
bunuh diri.
Entomologi forensik, Entomologi adalah ilmu
tentang serangga. Ilmu ini memperlajari jenisjenis serangga yang hidup dalam fase waktu
tertentu pada suatu jenasah di tempat terbuka.
Berdasarkan jenis-jenis serangga yang ada
sekitar mayat tersebut, seorang entomolog
forensik dapat menduga sejak kapan mayat
tersebut telah berada di tempat kejadian
perkara (TKP).
Antrofologi forensik, adalah ahli dalam mengidentifikasi sisa-sisa tulang, tengkorak, dan
3
mumi. Dari penyidikannya dapat memberikan
informasi tentang jenis kelamin, ras, perkiraan
umur, dan waktu kematian. Antrofologi forensik
mungkin juga dapat mendukung dalam
penyidikan kasus orang hidup, seperti
indentifiksi bentuk tengkorak bayi pada kasus
tertukarnya anak di rumah bersalin.
Balistik forensik, bidang ilmu ini sangat
berperan dalam melakukan penyidikan kasus
tindak kriminal dengan senjata api dan bahan
peledak. Seorang balistik forensik meneliti
senjata apa yang telah digunakan dalam
kejahatan tersebut, berapa jarak dan dari arah
mana penembakan tersebut dilakukan, meneliti
apakah senjata yang telah digunakan dalam
tindak kejahatan masih dapat beroperasi
dengan baik, dan meneliti senjata mana yang
telah digunakan dalam tindak kriminal tersebut.
Pengujian anak peluru yang ditemukan di TKP
dapat digunakan untuk merunut lebih spesifik
jenis senjata api yang telah digunakan dalam
kejahatan tersebut.
Pada bidang ini memerlukan peralatan khusus
termasuk miskroskop yang digunakan untuk
membandingkan dua anak peluru dari tubuh
korban dan dari senjata api yang diduga
digunakan dalam kejahatan tersebut, untuk
mengidentifikasi apakah memang senjata
tersebut memang benar telah digunakan dalam
kejahatan tersebut. Dalam hal ini diperlukan
juga mengidentifikasi jenis selongsong peluru
yang tertinggal.
Dalam penyidikan ini analisis kimia dan fisika
diperlukan untuk menyidikan dari senjata api
tersebut, barang bukti yang tertinggal. Misal
analisis ditribusi logam-logam seperti Antimon
(Sb) atau timbal (Pb) pada tangan pelaku atau
terduga, untuk mencari pelaku dari tindak
kriminal tersebut. Atau analisis ditribusi asap
(jelaga) pada pakaian, untuk mengidentifikasi
jarak tembak.
Kerjasama bidang ini dengan kedokteran
forensik sangat sering dilakukan, guna
menganalisis efek luka yang ditimbulkan pada
korban dalam merekonstruksi suatu tindak
kriminal dengan senjata api.
Serologi dan Biologi molekuler forensik,
Seiring dengan pesatnya perkembangan
bidang ilmu biologi molekuler (imunologi dan
genetik) belakangan ini, pemanfaatan bidang
Pengantar Menuju Ilmu Forensik
ilmu ini dalam proses peradilan meningkat
dengan sangat pesat.
Baik darah maupun cairan tubuh lainnya paling
sering digunakan / diterima sebagai bukti fisik
dalam tindak kejahatan. Seperti pada kasus
keracunan, dalam pembuktian dugaan tersebut,
seorang dokter kehakiman bekerjasama
dengan toksikolog forensik untuk melakukan
penyidikan. Dalam hal ini barang bukti yang
paling sahih adalah darah dan/atau cairan
tubuh lainnya. Toksikolog forensik akan
melakukan analisis toksikologi terhadap
sampel biologi tersebut, mencari senyawa
racun yang diduga terlibat. Berdasarkan
temuan dari dokter kehakiman selama otopsi
jenasah dan hasil analisisnya, toksikolog
forensik akan menginterpretasikan hasil
temuannya
dan
membuat
kesimpulan
keterlibatan racun dalam tindak kejahatan yang
dituduhkan.
Sejak awal perkembanganya pemanfaatan
serologi / biologi molekuler dalam bidang
forensik lebih banyak untuk keperluan
identifikasi personal (perunutan identitas
individu) baik pelaku atau korban. Sistem
penggolongan darah (sistem ABO) pertama kali
dikembangkan untuk keperluan penyidikan
(merunut asal dan sumber bercak darah pada
tempat kejadian). Belakangan dengan pesatnya
perkembangan ilmu genetika (analisi DNA)
telah membuktikan, bahwa setiap individu
memiliki kekhasan sidik DNA, sehingga
kedepan sidik DNA dapat digunakan untuk
menggantikan peran sidik jari, pada kasus
dimana sidik jari sudah tidak mungkin bisa
diperoleh. Dilain hal, analisa DNA sangat
diperlukan
pada
penyidikan
kasus
pembunuhan mutilasi (mayat terpotongpotong), penelusuran paternitas (bapak
biologis).
Analisa serologi/biologi molekuler dalam
bidang forensik bertujuan untuk:
- Uji darah untuk menentukan sumbernya
(darah manusia atau hewan, atau warna dari
getah tumbuhan, darah pelaku atau korban,
atau orang yang tidak terlibat dalam tindak
kejahatan tersebut)
- Uji cairan tubuh lainnya (seperti: air liur,
semen vagina atau sperma, rambut,
potongan
kulit)
untuk
menentukan
sumbernya (“origin”).
4
- Uji imonologi atau DNA individu untuk
mencari identitas seseorang.
1.3. Peran ilmu forensik dalam penyelesaian
kasus kejahatan
Perdanakusuma (1984) mengelompokkan ilmu
forensik berdasarkan peranannya dalam
menyelesaikan kasus-kasus kriminal ke dalam
tiga kelompok, yaitu:
1. Ilmu-ilmu forensik yang menangani tindak
kriminal sebagai masalah hukum.
Dalam kelompok ini termasuk hukum pidana
dan hukum acara pidana. Kejahatan sebagai
masalah hukum adalah aspek pertama dari
tindak kriminal itu sendiri, karena kejahatan
merupakan
perbuatan-perbuatan
yang
melanggar hukum.
2. Ilmu-Ilmu forensik yang menangani tindak
kriminal sebagai masalah teknis.
Kejahatan dipandang sebagai masalah
teknis, karena kejahatan dari segi wujud
perbuatannya
maupun
alat
yang
digunakannya memerlukan penganan secara
teknis dengan menggunakan bantuan diluar
ilmu hukum pidana maupun acara pidana.
Dalam kelompok ini termasuk ilmu
kriminalistik, kedokteran forensik, kimia
forensik, fisika forensik, toksikologi forensik,
serologi/biologi
molekuler
forensik,
odontologi forensik, dan entomogoli
forensik.
Pada
umumnya
suatu
laboratorium
kriminalistik mencangkup bidang ilmu
kedokteran forensik, kimia forensik dan ilmu
fisika forensik. Bidang kimia forensik
mencangkup juga analisa racun (toksikologi
forensik), sedangkan ilmu fisika forensik
mempunyai cabang yang amat luas
termasuk: balistik forensik, ilmu sidik jari,
fotografi forensik.
Apabila terjadi suatu kasus kejahatan, maka
pada
umumnya
timbul
pertanyaanpertanyaan seperti:
− Peristiwa apa yang terjadi?
− Di mana terjadinya?
− Bilamana terjadinya?
− Dengan alat apa dilakukannya?
− Bagaimana melakukannya?
− Mengapa perbuatan tersebut dilakukan?
− Siapa yang melakukan?
Pengantar Menuju Ilmu Forensik
Pertanyaan peristiwa apa yang terjadi adalah
mencari jenis kejahatan yang terjadi,
misalnya pembunuhan atau bunuh diri.
Dengan bantuan ilmu kedokteran forensik
atau bidang ilmu lainnya, dapat disimpulkan
penyebabnya adalah bunuh diri. Oleh sebab
itu penyidik tidak perlu melakukan
penyidikan selanjutnya guna mencari siapa
pelaku dari peristiwa tersebut, karena
kematian diakibatkan oleh perbuatannya
sendiri.
3. Ilmu-ilmu forensik yang menangani tindak
kriminal sebagai masalah manusia.
Dalam kelompok ini termasuk kriminologi,
psikologi forensik, dan psikiatri/neurologi
forensik. Kejahatan sebagai masalah
manusia, karena pelaku dan objek
penghukuman dari tindak kriminal tersebut
adalah
manusia.
Dalam
melakukan
perbuatannya, manusia tidak terlepas dari
unsur jasmani (raga) dan jiwa. Disamping itu,
kodrat manusia sebagai mahluk sosial, yang
hidup di tengah-tengah masyarakat. Oleh
karena itu perbuatan yang dilakukan juga
dipengaruhi oleh faktor internal (dorongan
dari dalam dirinya sendiri) dan faktor
eksternal (dipengaruhi oleh lingkungannya).
Atas asas keadilan, dalam pemutusan sangsi
dari tindak pidana, perlu ditelusuri faktorfaktor yang menjadi sebab seseorang itu
melakukan kejahatan. Untuk itu perlu diteliti
berbagai
aspek
yang
menyangkut
kehidupannya, seperti faktor kejiwaan,
keluarga,
dan
faktor
lingkungan
masyarakatnya.
Seseorang
melakukan
tindak kriminal mungkin didorong oleh latar
belakang kejiwaannya, atau karena keadaan
ekonomi keluarganya, ataupun karena
pengaruh
dari
keadaan
sosial
masyarakatnya. Dalam hal ini peran serta
kriminolog, psikolog forensik, dan psikiater
forensik mempunyai peran penting dalam
menyelesaikan kasus kejahatan.
Berdasarkan klasifikasi diatas peran ilmu
forensik dalam menyelesaikan masalah / kasuskasus kriminal lebih banyak pada penanganan
kejahatan dari masalah teknis dan manusia.
Sehingga pada umumnya laboratorium forensik
dimanfaatkan untuk kepentingan peradilan,
khususnya perkara pidana.
5
1.4. Langkah-langkah Penyidikan
Dalam sistem peradilan pidana yang berlaku di
Indonesia, peradilan perkara pidana diawali
oleh penyidikan yang dilakukan oleh penyidik
tunggal (lebih tepatnya penyidik umum) yang
dilakukan oleh
kepolisian (Polri), dalam
khasus-khasus khusus (tindak kejahatan
ekonomi dan pelanggaran Hak Asasi Manusia)
pihak kejaksaan dapat melakukan penyidikan.
Sampurna (2000) menggambarkan proses
penyidikan sampai ke persidangan (gambar
1.1).
Upaya penyidikan pada umumnya bermuara
pada proses penuntutan dan disusul oleh
proses pengadilan. Proses ini dikenal sebagai
upaya litigasi. Upaya penyidikan dilakukan
setelah suatu peristiwa atau kejadian dianggap
peristiwa hukum, yaitu peristiwa atau kejadian
yang dapat mengganggu kedamaian hidup
antar pribadi. Lingkup antar pribadi khususnya
antara seseorang (memikul kepentingan
pribadi) dihadapkan dengan masyarakat atau
negara yang memikul suatu kepentingan
umum.
Penyelasaian kasus-kasus kriminal diperlukan
pembuktian peristiwa kasus yang terjadi
sampai membuktikan pelaku yang terlibat
dalam tindak kriminal tersebut. Pembuktian
dari suatu perkara pidana adalah upaya untuk
membuktikan bahwa benar telah terjadi tindak
pidana yang diperkarakan dan bahwa si
terdakwalah pelaku tindak pidana tersebut.
Pembuktian dilakukan dengan mengajukan alat
bukti yang sah ke depan persidangan. Guna
mendapatkan atau setidak-tidaknya mendekati
kebenaraan materiil, dalam pembuktian
(penyidikan dan pemeriksaan bukti fisik) harus
dilakukan pembuktian secara ilmiah.
Menurut Kitab Hukum Acara Pidana (KUHAP)
pasal 184 ayat 1 menyebutkan bahwa alat bukti
yang sah terdiri dari 5 jenis, yaitu:
a. Keterangan saksi
b. Keterangan ahli
c. Surat
d. Petunjuk
e. Keterangan terdakwa
Pengantar Menuju Ilmu Forensik
Tindak Pidana
Dilaporkan ke
Ditemukan oleh polisi
Penyelidikan
Penyidikan
Pernyataan
dan Catatan
Identifikasi
Pemeriksaan
TKP
Bukti fisik
Penyelidikan lanjutan
Pemberkasan
Pelimpahan Berkas
ke Penuntut Umum
Persidangan
Gambar
1.1:
Skema
penyidikan (Sampurna 2000)
langkah-langkah
Alat bukti yang sah adalah alat bukti yang
sesuai dengan hukum, yaitu memenuhi prisip
”admissibility” (dapat diterima) sebagaimana
diatur oleh perundang-undangan yang berlaku.
Pengertian keterangan saksi menurut KUHAP
adalah salah satu alat bukti dalam perkara
pidana yang berupa keterangan dari saksi
mengenai suatu peristiwa yang ia dengar, ia
lihat sendiri, dan ia alami sendiri dan dengan
menyebutkan alasan dari pengetahuannya
tersebut. Keterangan saksi tidak boleh berupa
pendapat atau hasil rekaan saksi, ataupun
keterangan dari orang lain (KUHAP pasal 185).
Ketentuan keterangan saksi diatur dalam pasal
168, 170, 171 dan 185 KUHAP. Dalam pasalpasal tersebut mengatur ketentuan keterangan
saksi siapa-siapa yang berhak, tidak berhak,
atau berkompeten menjadi saksi pada suatu
tindak pidana. Keterangan saksi dianggap sah
apabila diajukan oleh sedikitnya dua orang
saksi. Bila berasal dari satu orang saja, harus
didukung oleh alat bukti sah lain. Keterangan
saksi juga harus diberikan oleh orang yang
berkompeten, yaitu orang yang mampu secara
6
hukum. Orang disebut berkompeten apabila
tidak di bawah umur dan tidak di dalam
pengampuan, misal sakit jiwa.
Perngertian umum keterangan ahli, sesuai
dengan pasal 1 butir 28 KUHAP adalah
keterangan yang diberikan oleh seorang yang
memiliki keahlian khusus tentang hal yang
diperlakukan untuk membuat terang suatu
perkara pidana guna kepentingan pemeriksaan.
Pasal 186 KUHAP menjelaskan bahwa:
keterangan ahli dapat diberikan pada waktu
pemeriksaan oleh penyidik atau jaksa penuntut
umum yang dituangkan dalam suatu bentuk
laporan dan dibuat dengan mengingat sumpah
diwaktu menerima jabatan atau pekerjaan. Jika
hal tersebut diberikan pada waktu pemeriksaan
oleh tim penyidik atau jaksa penuntut umum,
maka pada pemeriksaan di sidang, diminta
keterangan dan dicatat dalam berita acara
pemeriksaan. Keterangan tersebut diberikan
sebelum mengucapkan sumpah janji di depan
hakim.
Pasal 187 memuat ketentuan tentang surat
sebagaimana tersebutkan pada pasal 184
hurup c, surat dibuat atas sumpah jabatan atau
dikuatkan dengan sumpah. Surat dapat berupa:
a) Berita acara dan surat lain dalam bentuk
resmi yang dibuat oleh pejabat umum yang
berwenang atau yang dibuat dihadapannya,
yang memuat keterangan tentang kejadian
atau keadaan yang didengar, dilihat, atau
dialami sendiri, disertai dengan alasan
yang jelas dan tegas tetang keterangannya
itu.
b) Surat yang dibuat menurut ketentuan
peraturan perundang-undangan atau surat
yang dibuat oleh pejabat yang menangani
hal yang termasuk dalam tatalaksana yang
menjadi tanggung jawabnya dan yang
diperuntukkan bagi pembuktian suatu hal
atau suatu keadaan.
c) Surat keterangan dari seorang ahli yang
memuat pendapat berdasarkan keahliannya
yang diminta secara resmi dari padanya.
d) Surat lain yang hanya dapat berlaku jika
ada hubungannya dengan isi dari alat
pembuktian yang lain.
Yang dimaksudkan surat menurut penjelasan
diatas adalah surat yang dibuat oleh pejabatpejabat resmi yang berbentuk berita acara,
akte, surat keterangan ataupun surat yang lain
Pengantar Menuju Ilmu Forensik
yang mempunyai hubungan dengan perkara
yang sedang diadili.
Petunjuk menurut KUHAP adalah perbuatan,
kejadian atau keadaan, yang karena
persuaiannya, baik antara satu dengan yang
lain, maupun dengan tindak pidana itu sendiri,
menandakan bahwa telah terjadi suatu tindak
pidana dan siapa pelakunya. Petunjuk dapat
berupa fotografi, foto kopi, kaset rekaman,
rekaman vidio, atau barang bukti lainnya yang
diketemukan di tempat kejadian perkara (TKP).
Barang bukti tersebut dapat digunakan sebagai
rekonstruksi kasus atau penelusuran identitas
pelaku.
Alat yang paling terakhir menurut KUHAP
adalah keterangan terdakwa, merupakan
keterangan dari terdakwa tentang apa yang ia
lakukan, ia ketahui sendiri, atau ia alami
sendiri.
Bukti fisik yang diketemukan di TKP dapat
dikelompokkan menjadi 4 (Sampurna 2000),
yaitu:
a) Bukti transient. Bukti ini sesuai dengan
sifatnya hanya sementara dan akan dengan
mudah hilang atau berubah. Sebagai
contoh adalah: buah-buahan, suhu,
imprints dan indentation (tanda-tanda yang
ditimbulkan akibat tekanan, seperti tanda
jejak sepatu, atau tapak ban mobil pada
kasus kecelakaan bermotor), tanda-tanda
seperti lembam mayat, jejak bibir di
puntung rokok, bercak darah di pakaian
yang akan dicuci, dll. Bukti seperti ini
diketemukan oleh penyidik di TKP, dan
harus
segera
dicatat
dan
didokumentasikan.
b) Bukti pola, seperti percikan bercak darah,
pola pecahan kaca/gelas, pola kebakaran,
pola posisi furnitur, trayektori proyektil,
dan posisi mayat, dll.
c) Bukti kondisional, seperti derajat kekakuan
mayat, distribusi lembam mayat, apakah
pintu terkunci, apakah lampu menyala,
ketebalan dan arah geraknya asap.
d) Bukti yang dipindahkan (transfer), yang
merupakan bukti fisik yang paling klasik.
Bukti transfer terjadi karena kontak antara
orang-orang atau benda-benda, atau antar
orang dengan benda.
Dalam kriminalistik dikenal dua prinsip utama,
yaitu: prinsip Locard yang menyatakan bahwa
setiap kontak meninggalkan jejak ”every
7
contact leaves a trace”
dan prinsip
individualitas yang menyatakan bahwa dua
objek mungkin tidak dapat dibedakan, tetapi
tidak ada dua objek yang identik. Gabungan
kedua prisip ini dapat diturunkan suatu
pernyataan bahwa apabila tidak ada dua orang
atau benda yang identik, maka setiap jejak
yang ditinggalkan orang atau benda harus
berbeda dengan jejak orang atau benda yang
lain.
Ahli forensik dan kriminilalistik berperan dalam
upaya pembuktian dengan menyediakan dua
alat bukti yang sah, yaitu keterang ahli dan
surat (yang dibuat oleh ahli). Dalam hal ini
keterangan ahli tidak dibatasi dengan
ketentuan tentang ”yang merupa-kan hal-hal
yang dialami atau didengar atau dilihat sendiri
oleh saksi”, melainkan diberi peluang untuk
memberikan pendapat atau opini berdasarkan
keahliannya, sepanjang ketentuan yang
berlaku.
Keterangan ahli atau surat keterangan oleh ahli
harus diberikan oleh seseorang ahli yang
memenuhi
persyaratan
kualifikasi
dan
berisikan keterangan yang berada dalam
lingkup keahliannya (bukan keterangan bersifat
awam) (Sampurna, 2000). Dalam memberikan
atau menuliskan pendapat atau opini seorang
ahli harus berdasar-kan hasil temuan atau data
adekuat baik yang diperoleh dari pemeriksaan
bukti fisik maupun dengan membandingkannya
terhadap data di literatur, referensi ilmiah yang
terkini, dan secara teknis dianggap benar, serta
menggunakan prinsip dan metode ilmiah yang
diakui.
Pendapat ahli satu dengan yang lainnya
tentang suatu hal tentu dapat berbeda, hal ini
berdasarkan latar belakang keahliannya (ilmu
yang mendasari dalam membuat keterangan),
kecanggihan teknologi dari alat yang
digunakan memeriksa barang bukti, metode
analisis, dan berbagai aspek lainnya. Sehingga
pemeriksaan kriminalistik harus diberi peluang
untuk melakukan pemeriksaan ulang, baik oleh
institusi yang sama maupun institusi yang lain.
Secara tradisi di Indonesia, bahwa sejak lama
keputusan apakah di dalam pemecahan suatu
kasus pidana atau perdata diperlukan buktibukti ilmiah tidak berada ditangan para ahli
forensik atau kriminalistik melainkan di tangan
para penegak hukum. Para ahli forensik dan
kriminalistik cendrung bersikap sebagai
Pengantar Menuju Ilmu Forensik
pendukung saja di dalam suatu proses
peradilan pidana atau perdata. Hal ini tentunya
merupakan kendala dalam pembuktian secara
ilmiah kasus pidana maupun penegakan
hukum. Akan tetapi di lain sisi sesuai dengan
Keputusan
Menteri
Kehakiman
No.M.01.PW.07.03
tahun
1983
dituntut
pembuktian secara ilmiah dengan tujuan untuk
mendapatkan kebenaran materiil. Untuk itu
diperlukan kerjasama antara aparat penegak
hukum dan ahli forensik. Meskipun demikian
harus diakui pula bahwa pada akhir-akhir ini
memang sedang terjadi pergeseran peran ahli
forensik, yaitu dari bersifat pasif menjadi akfit.
Sampurna (2000) menggambarkan bahwa ahli
forensik maupun kriminalistik dapat terlibat
pada setiap tahap peyidikan (lihat gambar 1.1).
Bahan Bacaan
1) Eckert, W.G., 1980, Introduction to Forensic
sciences, The C.V. Mosby Company, St.
Louis, Missori
2) Kansil, CST, 1991, Pengantar hukum
kesehatan Indonesia, Penerbit Rineka Cipta,
Jakarta
3) Loomis, T.A., 1978, Toksikologi Dasar,
Donatus, A. (terj.) IKIP Semarang Press,
Semarang
4) Perdanakusuma, P., 1984, Bab-bab tentang
kedokteran forensik, Ghalia Indonesia,
Jakarta
5) Purwandianto, A. 2000, Pemanfaatan
Laboratorium Forensik Untuk Kepentingan
Non-Litigasi, dalam Tim IBA Kriminalistik,
Laporan Kegiatan Buku II, Proyek
Pengembangan Kewirahusaan Melalui
Itegratif Bahan Ajar Kriminalistik, Lembaga
Pengabdian Kepada Masyarakat Universitas
Indonesia, Jakarta
6) Saferstein R., 1995, Criminalistics, an
Introduction to Forensic Science, 5th Ed., A
Simon & Schuster Co., Englewood Cliffs,
New Jersey
7) Sampurna,
B.,
2000,
Laboratorium
Kriminalistik Segabai Sarana Pembuktian
Ilmiah, dalam Tim IBA Kriminalistik, Laporan
Kegiatan Buku II, Proyek Pengembangan
Kewirahusaan Melalui Itegratif Bahan Ajar
Kriminalistik, Lembaga Pengabdian Kepada
Masyarakat Universitas Indonesia, Jakarta
8
BAB II
PENGANTAR TOKSIKOLOGI
2.1. Perkembangan Awal Toksikologi
Sejak perkembangan peradaban manusia
dalam mencari makannya, tentu telah mencoba
beragam bahan baik botani, nabati, maupun
dari mineral. Melalui pengalamannya ini ia
mengenal makanan, yang aman dan berbaya.
Dalam kontek ini kata makanan dikonotasikan
ke dalam bahan yang aman bagi tubuhnya jika
disantap, bermanfaat serta diperlukan oleh
tubuh agar dapat hidup atau menjalankan
fungsinya. Sedangkan kata racun merupakan
istilah yang digunakan untuk menjelaskan dan
mengambarkan berbagai bahan ”zat kimia”
yang dengan jelas berbahaya bagi badan.
Kata racun ”toxic” adalah bersaral dari bahasa
Yunani, yaitu dari akar kata tox, dimana dalam
bahasa Yunani berarti panah. Dimana panah
pada saat itu digunakan sebagai senjata dalam
peperangan, yang selalu pada anak panahnya
terdapat racun. Di dalam ”Papyrus Ebers (1552
B.C.) orang Mesir kuno memuat informasi
lengkap tentang pengobatan dan obat. Di
Papyrus ini juga memuat ramuan untuk racun,
seperti antimon (Sb), tembaga, timbal,
hiosiamus, opium, terpentine, dan verdigris
(kerak hijau pada permukaan tembaga).
Sedangkan di India (500 - 600 B.C.) di dalam
Charaka Samhita disebutkan, bahwa tembaga,
besi, emas, timbal, perak, seng, bersifat
sebagai racun, dan di dalam Susrata Samhita
banyak menulis racun dari makanan,
tananaman, hewan, dan penangkal racun
gigitan ular.
Hippocrates (460-370 B.C.), dikenal sebagai
bapak kedokteran, disamping itu dia juga
dikenal sebagai toksikolog dijamannya. Dia
banyak menulis racun bisa ular dan didalam
bukunya juga menggambarkan, bahwa orang
Mesir
kuno telah memiliki pengetahuan
penangkal racun, yaitu dengan menghambat
laju absorpsi racun dari saluran pencernaan.
Disamping banyak lagi nama besar toksikolog
pada jaman ini, terdapat satu nama yang perlu
mendapat catatan disini, yaitu besar pada
jaman Mesir dan Romawi kuno adalah
Pendacious Dioscorides (A.D. 50), dikenal
sebagai bapak Materia Medika, adalah seorang
dokter tentara. Di dalam bukunya dia
Pengantar Toksikologi
mengelompok-kan racun dari tanaman, hewan,
dan mineral.
Hal ini membuktikan, bahwa efek berbahaya
(toksik) yang ditimbulkan oleh zat racun
(tokson) telah dikenal oleh manusia sejak awal
perkembangan beradaban manusia. Oleh
manusia efek toksik ini banyak dimanfaatkan
untuk tujuan seperti membunuh atau bunuh
diri. Untuk mencegah peracunan, orang
senantiasa
berusaha
menemukan
dan
mengembangkan upaya pencegahan atau
menawarkan racun. Usaha ini seiring dengan
perkembangan toksikologi itu sendiri. Namun,
evaluasi yang lebih kritis terhadap usaha ini
baru dimulai oleh Maimonides (1135 - 1204)
dalam bukunya yang terkenal Racun dan
Andotumnya.
Sumbangan yang lebih penting bagi kemajuan
toksikologi terjadi dalam abad ke-16 dan
sesudahnya. Paracelcius adalah nama samaran
dari Philippus Aureolus Theophratus Bombast
von Hohenheim (1493-1541), toksikolog besar,
yang pertama kali meletakkan konsep dasar
dasar dari toksikologi. Dalam postulatnya
menyatakan: “Semua zat adalah racun dan
tidak ada zat yang tidak beracun, hanya dosis
yang membuatnya menjadi tidak beracun”.
Pernyataan-pernyataan ini menjadi dasar bagi
konsep hubungan dosis reseptor dan indeks
terapi yang berkembang dikemudian hari.
Matthieu Joseph Bonaventura Orfila dikenal
sebagai bapak toksikologi modern. Ia adalah
orang Spayol yang terlahir di pulau Minorca,
yang hidup antara tahun 1787 sampai tahun
1853. Pada awak karirnya ia mempelajari kimia
dan matematika, dan selanjutnya mempelajari
ilmu kedokteran di Paris. Dalam tulisannya
(1814-1815)
mengembangkan hubungan
sistematik antara suatu informasi kimia dan
biologi tentang racun. Dia adalah orang
pertama, yang menjelaskan nilai pentingnya
analisis kimia guna membuktikan bahwa
simtomatologi yang ada berkaitan dengan
adanya zat kimia tertentu di dalam badan.
Orfila juga merancang berbagai metode untuk
mendeteksi
racun
dan
menunjukkan
pentingnya analisis kimia sebagai bukti hukum
pada kasus kematian akibat keracunan. Orfila
9
bekerja sebagai ahli medikolegal di Sorbonne
di Paris. Orfila memainkan peranan penting
pada kasus LaFarge (kasus pembunuhan
dengan arsen) di Paris, dengan metode analisis
arsen, ia membuktikan kematian diakibatkan
oleh keracuanan arsen. M.J.B. Orfila dikenal
sebagai bapak toksikologi modern karena
minatnya terpusat pada efek zat tokson, selain
itu karena ia memperkenalkan metodologi
kuantitatif ke dalam studi aksi zat tokson pada
hewan, pendekatan ini melahirkan suatu bidang
toksikologi modern, yaitu toksikologi forensik.
Dalam bukunya Traite des poison, terbit pada
tahun 1814, dia membagi racun menjadi enam
kelompok, yaitu: corrosives, astringents,
acrids, stupefying or narcotic, narcoticacid,
dan septica atau putreficants.
2.2. Pengertian Toksikologi dan Racun
Secara sederhana dan ringkas, toksikologi
dapat didefinisikan sebagai kajian tentang
hakikat dan mekanisme efek berbahaya (efek
toksik) berbagai bahan kimia terhadap makhluk
hidup dan sistem biologik lainnya. Ia dapt juga
membahas penilaian kuantitatif tentang berat
dan kekerapan efek tersebut sehubungan
dengan terpejannya (exposed) makhluk tadi.
Apabila zat kimia dikatakan berracun (toksik),
maka kebanyakan diartikan sebagai zat yang
berpotensial memberikan efek berbahaya
terhadap mekanisme biologi tertentu pada
suatu organisme. Sifat toksik dari suatu
senyawa ditentukan oleh: dosis, konsentrasi
racun di reseptor, sifat zat tersebut, kondisi
bioorganisme atau sistem bioorganisme,
paparan terhadap organisme dan bentuk efek
yang
ditimbulkan.
Sehingga
apabila
menggunakan istilah toksik atau toksisitas,
maka perlu untuk mengidentifikasi mekanisme
biologi di mana efek berbahaya itu timbul.
Sedangkan toksisitas merupakan sifat relatif
dari suatu zat kimia, dalam kemampuannya
menimbulkan
efek
berbahaya
atau
penyimpangan mekanisme biologi pada suatu
organisme.
Toksisitas merupakan istilah relatif yang biasa
dipergunakan dalam memperbandingkan satu
zat kimia dengan lainnya. Adalah biasa untuk
mengatakan bahwa satu zat kimia lebih toksik
daripada zat kimia lain. Perbandingan sangat
kurang informatif, kecuali jika pernyataan
tersebut
melibatkan
informasi
tentang
mekanisme
biologi
yang
sedang
Pengantar Toksikologi
dipermasalahkan dan juga dalam kondisi
bagaimana zat kimia tersebut berbahaya. Oleh
sebab itu, pendekatan toksikologi seharusnya
dari sudut telaah / studi tentang berbagai efek
zat kimia atas berbagai sistem biologi, dengan
penekanan pada mekanisme efek berbahaya
zat kimia itu dan berbagai kondisi di mana efek
berbahaya itu terjadi.
Pada umumnya efek berbahaya (efek
farmakologik) timbul apabila terjadi interaksi
antara zat kimia (tokson atau zat aktif biologis)
dengan reseptor (tempat berikatnya tokson).
Terdapat dua aspek yang harus diperhatikan
dalam mempelajari interakasi antara zat kimia
(zat aktif biologis) dengan organisme hidup,
yaitu kerja farmakon pada suatu organisme
(aspek farmakodinamik / toksodinamik) dan
pengaruh organisme terhadap zat aktif (aspek
farmakokinetik / toksokinetik) aspek ini akan
lebih detail dibahas pada sub bahasan kerja
toksik.
Telah dipostulatkan oleh Paracelcius, bahwa
sifat toksik suatu tokson sangat ditentukan
oleh dosis (konsentrasi tokson pada
reseptornya). Artinya kehadiran suatu zat yang
berpotensial toksik di dalam suatu organisme
belum tentu menghasilkan juga keracunan.
Misal insektisida rumah tangga (DDT) dalam
dosis tertentu tidak akan menimbulkan efek
yang berbahaya bagi manusia, namun pada
dosis tersebut memberikan efek yang
mematikan bagi serangga. Hal ini disebabkan
karena konsentrasi tersebut berada jauh
dibawah konsentrasi minimal efek pada
manusia. Namun sebaliknya apabila kita
terpejan oleh DDT dalam waktu yang relatif
lama, dimana telah diketahui bahwa sifat DDT
yang sangat sukar terurai dilingkungan dan
sangat lifofil, akan terjadi absorpsi DDT dari
lingkungan ke dalam tubuh dalam waktu relatif
lama. Karena sifat fisiko kimia dari DDT,
mengakibatkan DDT akan terakumulasi
(tertimbun) dalam waktu yang lama di jaringan
lemak. Sehingga apabila batas konsentrasi
toksiknya terlampaui, barulah akan muncul
efek toksik. Efek atau kerja toksik seperti ini
lebih dikenal dengan efek toksik yang bersifat
kronis.
Toksin Clostridium botulinum, adalah salah
satu contoh tokson, dimana dalam konsentrasi
yang sangat rendah (10-9 mg/kg berat badan),
sudah dapat mengakibatkan efek kematian.
10
Berbeda dengan metanol, baru bekerja toksik
pada dosis yang melebihi 10 g. Pengobatan
parasetamol yang direkomendasikan dalam
satu periode 24 jam adalah 4 gram untuk orang
dewasa dan 90 mg / kg untuk anak-anak.
Namun pada penggunaan lebih dari 7 gram
pada orang dewasa dan 150 mg/kg pada anakanak akan menimbulkan efek toksik.
Dengan demikian, resiko keracunan tidak
hanya tergantung pada sifat zatnya sendiri,
tetapi juga pada kemungkinan untuk berkontak
dengannya dan pada jumlah yang masuk dan
diabsorpsi. Dengan kata lain tergantung
dengan cara kerja, frekuensi kerja dan waktu
kerja. Antara kerja (atau mekanisme kerja)
sesuatu obat dan sesuatu tokson tidak terdapat
perbedaan yang prinsipil, ia hanya relatif.
Semua kerja dari suatu obat yang tidak
mempunyai sangkut paut dengan indikasi obat
yang sebenarnya, dapat dinyatakan sebagai
kerja toksik.
Kerja medriatik (pelebaran pupil), dari sudut
pandangan ahli mata merupakan efek terapi
yang dinginkan, namun kerja hambatan
sekresi, dilihat sebagai kerja samping yang
tidak diinginkan. Bila seorang ahli penyakit
dalam menggunakan zat yang sama untuk
terapi, lazimnya keadaan ini manjadi terbalik.
Pada seorang anak yang tanpa menyadarinya
telah memakan buah Atropa belladonna, maka
mediaris maupun mulut kering harus dilihat
sebagai gejala keracuanan. Oleh sebab itu
ungkapan kerja terapi maupun kerja toksik
tidak pernah dinilai secara mutlak. Hanya
tujuan penggunaan suatu zat yang mempunyai
kerja farmakologi dan dengan demikian
sekaligus berpotensial toksik, memungkinkan
untuk membedakan apakah kerjanya sebagai
obat atai sebagai zat racun.
Tidak jarang dari hasil penelitian toksikologi,
justru diperoleh senyawa obat baru. Seperti
penelitian racun (glikosida digitalis) dari
tanaman Digitalis purpurea dan lanata, yaitu
diperoleh antikuagulan yang bekerja tidak
langsung, yang diturunkan dari zat racun yang
terdapat di dalam semanggi yang busuk.
Inhibitor asetilkolinesterase jenis ester fosfat,
pada mulanya dikembangkan sebagai zat kimia
untuk perang, kemudian digunakan sebagai
insektisida dan kini juga dipakai untuk
menangani glaukoma.
Farmakologi
Immunologi
Patologi
Biologi
Kimia
Kesehatan masyarakat
Matematika
Lingkungan:
- Pencemaran
- Akumulasi
pencemaran
- Kesehatan lingkungan
kerja
Fisiologi
Toksikologi
Ekonomi (dari segi
manfaat):
- Perkembangan obat,
zat tambahan pada
makanan dan pestisida
Forensik:
- Aspek medikolegal
- Diagnosis
- Terapi
Gambar 2.1: Hubungan ilmu dasar dan terapan dengan cabang toksikologi.
Toksikologi modern merupakan bidang yang
didasari oleh multi displin ilmu, ia dengan
dapat dengan bebas meminjam bebarapa ilmu
dasar, guna mempelajari interaksi antara zat
tokson dan mekanisme biologi yang
ditimbulkan (lihat gambar 2.1). Ilmu toksikologi
ditunjang oleh berbagai ilmu dasar, seperti
Pengantar Toksikologi
kimia, biologi, fisika, matematika. Kimia
analisis dibutuhkan untuk mengetahui jumlah
toksikan yang melakukan ikatan dengan
reseptor sehingga dapat memberikan efek
toksik. Bidang ilmu biokimia diperlukan guna
mengetahui informasi penyimpangan reaksi
kimia pada organisme yang diakibatkan oleh
11
zat tokson. Perubahan biologis yang
diakibatkan oleh zat tokson dapat diungkap
melalui bantuan ilmu patologi, immonologi,
fisiologi. Untuk mengetahui efek berbahaya
dari suatu zat kimia pada suatu sel, jaringan
atau organisme memerlukan dukungan ilmu
patologi, yaitu dalam menunjukan wujud
perubahan / penyimpangan kasar, mikroskopi,
atau penyimpangan submikroskopi dari
normalnya. Perubahan biologi akibat paparan
tokson dapat termanisfestasi dalam bentuk
perubahan sistem kekebakan (immun) tubuh,
untuk itu diperlukan bidang ilmu immunologi
guna lebih dalam mengungkap efek zat toksik
pada sistem kekebalan organisme.
Mengadopsi konsep dasar yang dikemukakan
oleh Paracelcius, manusia menggolongkan
efek yang ditimbulkan oleh zat tokson menjadi
konsentrasi batas minimum memberikan efek,
daerah konsentrasi dimana memberikan efek
yang menguntungkan (efek terapeutik , lebih
dikenal dengan efek farmakologi), batas
konsentrasi dimana sudah memberikan efek
berbahaya (konsetrasi toksik), dan konstrasi
tertinggi yang dapat menimbulkan efek
kematian. Agar dapat menetapkan batasan
konsentrasi ini toksikologi memerlukan
dukungan ilmu kimia analisis, biokimia,
maupun kimia instrmentasi, serta hubungannya
dengan biologi. Ilmu statistik sangat diperlukan
oleh toksikologi dalam mengolah baik data
kualitatif maupun data kuantitatif yang nantinya
dapat dijadikan sebagai besaran ekspresi
parameter-parameter angka yang mewakili
populasi.
Bidang yang paling berkaitan dengan
toksikologi adalam farmakologi, karena ahli
farmakologi harus memahami tidak hanya efek
bermanfaat zat kimia, tetapi juga efek
berbahayanya yang mungkin diterapkan pada
penggunaan
terapi.
Farmakologi
pada
umumnya menelaah efek toksik, mekanisme
kerja toksik, hubungan dosis respon, dari suatu
tokson.
2.3. Cakupan dan Subdisiplin Toksikologi
Toksikologi sangat luas cakupannya. Ia
menangani studi efek toksik “toksisitas” di
berbagai bidang, LU (1995) mengelompokkan
ke dalam empat bidang, yaitu:
− bidang kedokteran untuk tujuan
diagnostik, pencegahan, dan terapeutik,
Pengantar Toksikologi
− dalam industri makanan sebagai zat
tambahan baik langsung maupun tidak
langsung,
− dalam pertanian sebagai pestisida zat
pengatur
pertumbuhan,
peyerbuk
bantuan, dan zat tambahan pada
makanan hewan,
− dalam bidang industri kimia sebagai
pelarut, komponen, dan bahan antara
bagi plstik serta banyak jenis bahan
kimia lainnya.
Di dalam industri kimia juga dipelajari
pengaruh logam (misal dalam dalam
pertambangan dan tempat peleburan), produk
minyak bumi, kertas dan pulpa, tumbuhan
beracun, dan racun hewan terhadap kesehatan.
LOOMIS (1979) berdasarkan aplikasinya
toksikologi
dikelompokkan
dalam
tiga
kelompok besar, yakni: toksikologi lingkungan,
toksikologi ekonomi dan toksikologi forensik.
Toksikologi lingkungan lebih memfokuskan
telaah racun pada lingkungan, seperti
pencemaran lingkungan, dampak negatif dari
akumulasi residu senyawa kimia pada
lingkungan, kesehatan lingkungan kerja.
Toksikologi ekonomi membahas segi manfaat
dan nilai ekonomis dari senobiotik. Tosikologi
forensik menekunkan diri pada aplikasi ilmu
toksikologi untuk kepentingan peradilan. Kerja
utama dari toksikologi forensik adalah analisis
racun baik kualitatif maupun kuantitatif sebagai
bukti dalam tindak kriminal (forensik) di
pengadilan.
Masih dijumpai subdisiplin toksikologi lainnya
selain tiga golongan besar diatas, seperti
toksikologi analisis, toksikologi klinik,
toksikologi kerja, toksikologi hukum, dan
toksikologi mekanistik.
Untuk menegakan terapi keracunan yang
spesifik dan terarah, diperlukan kerjasama
antara dokter dan toksikolog klinik. Hasil
analisis toksikologi dapat memastikan
diagnose klinis, dimana diagnose ini dapat
dijadikan dasar dalam melakukan terapi yang
cepat dan tepat, serta lebih terarah, sehingga
ancaman kegagalan pengobatan (kematian)
dapat dihindarkan. Analisis toksikologi klinik
dapat berupa analisis kualitatif maupun
kuantitatif. Dari hasil analisis kualitatif dapat
dipastikan bahwa kasus keracunan adalah
memang benar diakibatkan oleh instoksikasi.
Sedangkan dari hasil analisis kuantitatif dapat
12
diperoleh informasi tingkat toksisitas pasien.
Dalam hal ini diperlukan interpretasi
konsentrasi toksikan, baik di darah maupun di
urin, yang lebih seksama. Untuk mengetahui
tepatnya tingkat toksisitas pasien, biasanya
diperlukan analisis toksikan yang berulang baik
dari darah maupun urin. Dari perubahan
konsentrasi di darah akan diperoleh gambaran
apakah toksisitas pada fase eksposisi atau
sudah dalam fase eleminiasi.
Keracunan mungkin terjadi akibat pejanan
tokson di tempat kerja. Hal ini mungkin dapat
mengkibatkan efek buruk yang akut maupun
kronik. Efek toksik yang ditimbulkan oleh
kesehatan dan keselamatan kerja merupakan
masalah bidang toksikologi kerja. Toksikologi
kerja merupakan subbagian dari toksikologi
lingkungan.
Toksikologi hukum mencoba melindungi
masyarakat umum dari efek berbahaya tokson
dengan membuat undang-undang, peraturan,
dan standar yang membatasi atau melarang
penggunaan zat kimia yang sangat beracun,
juga dengan menentukan syarat penggunaan
zat kimia lainnya. Gambaran lengkap tentang
efek toksik sangat diperlukan untuk
menetapkan peraturan dan standar yang baik.
Profil semacam itu hanya dapan ditentukan
lewat berbagai jenis penelititan toksikologi
yang relevan, dan ini membentuk dasar bagi
toksikologi hukum.
2.4. Perkembangan Mutahir Toksikologi
Dalam perkembangan beradaban modern,
masyarakat menuntut perbaikan kondisi
kesehatan dan kehidupan, diantaranya
makanan bergizi, mutu kesehatan yang tinggi,
pakaian, transportasi. Untuk memenuhi tujuan
ini, berbagai jenis bahan kimia harus
diproduksi dan digunakan, banyak diantaranya
dalam jumlah besar. Diperkirakan berribu-ribu
bahan kimia telah diproduksi secara komersial
baik di negara-negara industri maupun di
negara berkembang. Melalui berbagai cara
bahan kimia ini kontak dengan penduduk, dari
terlibatnya manusia pada proses produksi,
distribusi ke konsumen, dan terakhir pada
tingkat pemakai.
Meningkatnya jumlah penduduk dunia
menuntut, salah satunya meningkatnya jumlah
produksi pangan. Dalam hal ini diperlukan
bahan kimia, seperti pupuk, pestisida,rebisida.
Pengantar Toksikologi
Tidak jarang pemakaian pestisida yang tidak
sesuai dengan atuaran, atau berlebih justru
memberi
beban
pencemaran
terhadap
lingkungan, perubahan ekosistem, karena
pembasmian pada salah satu insteksida akan
berefek pada rantai makanan dari organisme
tersebut, sehingga dapan juga mengakibatkan
berkurangnya atau bahkan musnahnya
predator insek tersebut. Pemakaian pestisida,
telah ditengarai mengakibatkan mutasi
genetika dari insektisida tersebut, sehingga
pada akhirnya melahirkan mutan insek yang
justru resisten terhadap pestisida jenis
tertentu. Pemakaian pertisida yang tidak benar
juga merupakan salah satu penginduksi
toksisitas
kronik
(menahun).
Petani
berkeinginan mendapatkan untung yang tinggi
dari hasil pertaniannya, tidak jarang
penyemprotan pestisida berlebih justru
dilakukan pada produk pertanian satu-dua hari
sebelum panen, dengan tujuan buah atau daun
sayuran tidak termakan insek sebelum panen,
dengan jalan demikian akan diperoleh buah
atau sayuran yang ranun, tidak termakan oleh
insek.
Namun
tindakan
ini
justru
membahayakan konsumen, karena pestisida
kemungkinan dapat terakumulasi secara
perlahan di dalam tubuh konsumen, melalui
konsumsi buah atau sayuran yang sebelumnya
diberikan pestisida sebelum panen.
Banyaknya kasus keracunan masif akut dan
keracunan kronis, yang diakibatkan oleh
pencemaran lingkungan akibat proses
produksi. Seperti pada tahun 1930 di Detroit,
Mich. kontaminasi ginger jake oleh Tri-o-kresil,
mengakibatkan
neurotksis,
telah
mengakibatkan keracunan syaraf pada 16 ribu
penduduk.
Di London, pada tahun 1952, terjadi
peningkatan jumlah kematian penduduk akibat
penyakit jantung dan paru-paru. Hal ini
disebabkan oleh kontaminasi udara oleh
Belerang dioksida dan partikel tersuspensi,
yang merupakan limbah buangan pabrik di
Ingris pada saat itu.
Penyakit Minamata di Jepang pada tahun 1950an diakibatkan karena pembuangan limbah
industri yang mengandung metil merkuri ke
teluk Minamata, yang mengakibatkan ikan di
teluk tersebut terkontaminasi oleh metil
merkuri. Ikan terkontaminasi ini dikonsumsi
oleh penduduk disekitar teluk, mengakibatkan
13
deposisi (pengendapan) metil merkuri di dalam
tubuh. Metil merkuri adalah senyawa toksik
yang mengakibatkan penyakit neurologik berat,
salah satunya mengakibatkan kebutaan.
Pada akhir 1950-an sampai awal tahun 1960-an,
di Eropa Barat terjadi kasus keracunan yang
dikenal dengan kasus Talidomid. Talidomid
adalah senyawa kimia yang pertama disintesa
untuk obat menekan rasa mual, muntah.
Karena efeknya tersebut pada waktu itu banyak
diresepkan pada ibu-ibu hamil, dengan tujuan
menekan mual-mutah yang sering muncul pada
trimester pertama pada kehamilan. Efek
samping yang muncul dari pemakaian ini
adalah terlahir janin dengan pertumbuhan
organ tubuh yang tidak lengkap, belakangan
diketahui bahwa salah satu dari bentuk rasemat
Talidomid ini memberikan efek menghambat
tertumbuhan organ tubuh pada janin di masa
kandungan.
Salah satu contoh, kasus pencemaran
lingkungan di Indonesia akibat proses produksi
adalah kasus teluk Buyat. Sampai saat ini
masih kontropersial didiskusikan.
Kejadian-kejadian di atas dan peristiwa tragis
keracunan masif lainnya telah menghasilkan
program pengujian yang lebih intensif, yang
telah mengungkapkan beragamnya sifat dan
sasaran efek toksik. Pada gilirannya ini
menuntut lebih banyak penelitian pada hewan,
lebih banyak indikator toksisitas, persyaratan
yang lebih ketat sebelum suatu bahan kimia
baru dapat dilepas pemakaiannya ke
masyarakat, serta melakukan evaluasi dan
pemantauan efek toksik senyawa kimia yang
telah beredar dan dimanfaatkan oleh
masyarakat. Oleh karena itu, ada kebutuhan
untuk
mempermudah
tugas
penilaian
toksikologik atas begitu banyak bahan kimia,
dimana prosedur pengujian toksisitasnya
menjadi semakin komplek. Untuk memenuhi
kebutuhan ini, beberapa kreteria telah diajukan
dan dipakai untuk memilih menurut
prioritasnya bahan kimia yang akan diuji.
Disamping itu, ”sistem penilaian berlapis”
memungkinkan keputusan dibuat pada
berbagai tahap pengujian toksikologik,
sehingga dapat dihindarkan penelitian yang
tidak perlu. Prosedur ini sangat berguna dalam
pengujian karsinogenisitas, mutagenisitas, dan
imunotoksisitas karena besarnya biaya yang
terlibat dan banyaknya sistem uji yang tersedia.
Pengantar Toksikologi
Karena banyaknya orang yang terpejan dengan
bahan-bahan kimia ini, maka kita harus
berupaya mencari pengendalian yang tepat
sebelum terjadi kerusakan yang hebat. Karena
itu, bila mungkin, ahli toksikologi modern harus
mencoba
mengidentifikasikan
berbagai
indikator pejanan dan tanda efeknya terhadap
kesehatan yang dini dan reversibel. Hal ini
penting
untuk
menentukan
ketentuan
keputusan, pada saat yang tepat untuk
melindungi kesehatan masyarakat baik sebagai
individu yang bekerja maupun masyasakat
yang terpejan. Pencapaian di bidang ini telah
terbukti dapat membantu para mengambil
keputusan
(pemerintah)
yang
bertanggungjawab
dalam
menjalankan
surveilan medik yang sesuai pada pekerja atau
masyarakat yang terpejan. Contoh yang
menonjol adalah penggunaan penghambat
kolinesterase sebagai indikator pejanan
pestisida organofosfat dan berbagai parameter
biokimia untuk memantau pejanan timbal.
Menggunakan indikator biologi seperti jenis
ikan tertentu untuk memantau tingkat cemaran
limbah cair insdustri sebelum dinyatakan aman
untuk dilepaskan ke lingkungan. ”Petanda
biologik” semacam itu dimaksudkan untuk
mengukur pejanan terhadap toksikan atau
efeknya di samping untuk mendeteksi
kelompok masyarakat yang retan.
Kemajuan yang dicapai dalam bidang biokimia
dan toksikokinetik, toksikologi genetika,
imunotoksikologi, morfologik pada tingkat
subsel,
serta
perkembangan
ilmu
biologimolekular berperan dalam memberikan
pengertian yang lebih baik tentang sifat,
tempat, dan cara kerja berbagai toksikan.
Misalnya perkembangan bidang ilmu tersebut
dapat memberikan berbagai metode uji
toksikologi secara invitro, dimana target uji
langsung pada tingkat sel, seperti uji senyawa
yang mengakibatkan kerusakan sel hati
”hepato toksik” dapat dilakukan langsung pada
kultur sel hati secara invitro, atau uji toksikan
yang mempunyai sifat sebagai karsinogen juga
dapat dilakukan pada kultur sel normal, disini
dilihat tingkat pertumbuhan sel dan perubahan
DNA yang dialamai oleh sel akiat pejanan
toksikan uji. Banyak lagi metode uji invitro
yang sangat bermanfaat dalam menunjang
perkembangan ilmu toksikologi itu sendiri.
14
Salah satu wujud perlindungan kesehatan
masyarakat, ahli toksikologi akan selalu terlibat
dalam menentukan batas pejanan yang aman
atau penilaian resiko dari pejanan. Batas
pejanan yang aman mencangkup ”asupan
(intake) harian yang diperbolehkan, dan ”nilia
ambang batas” dari toksikan yang masih dapat
ditolerir, sedangkan penilaian resiko digunakan
dalam hubungan dengan efek bahan yang
diketahui tidak berrabang batas atau ambang
batasnya tak dapat ditentukan. Penentuan ini
merupakan penelitian menyeluruh tentang sifat
toksik, pembuktian dosis yang aman,
penentuan hubungan dosis-efek dan dosisrespon,
serta
penelitian
toksokinetik,
biotransformasi.
Meluasnya bidang cakupan dan makin
banyaknya subdisiplin toksikologi seperti
digambarkan di atas memberikan gambaran
tersendiri tentang kemajuan akhir dalam
toksikologi.
2.5. Prospek Masa Depan
Kemajuan di bidang bioteknologi pertanian,
telah terbukti memberikan bebagai kemajuan
jika dibandingkan pertanian konvensional.
Melalui rekayasa genetika pada tanaman
pertanian telah terbukti diperoleh bibit unggul,
yang
dibandingkan
dengan
pertanian
konvensional sangat sedikit membutuhkan
tanah,
merupakan
andalan
dalam
meningkatkan pasokan makanan kita. Kemanan
makanan semacam ini membutuhkan evaluasi
keamanan yang memadai.
Bersama dengan ilmu-ilmu lain, toksikologi
dapat menyediakan bahan kimia alternatif yang
lebih aman untuk pertanian, industri, dan
kebutuhan konsumen melalui penentuan
hubungan strukter-toksisitas. Pengurangan
sifat toksik mungkin dapat dicapai dengan
mengubah toksisitas sasaran atau dengan
mengubah sifat toksokinetiknya. Toksikologi
juga berperan dalam pengembangan obat baru,
sudah menjadi prasat dalam pengembangan
obat baru harus dibarengi baik uji toksisitas
akut maupun toksisitas krinis, dengan
persyaratan uji yang ketat. Penilaian tentang
keamanannya merupakan tantangan dang
tunggung jawab toksikologi.
Karena imbauan masyarakat untuk mengurangi
penggunaan hewan coba dengan alasan
Pengantar Toksikologi
prikemanusiaan, maka lebih sering digunakan
organ terisolasi, jaringan biakan, sel, dan
bentuk-bentuk kehidupan yang lebih rendah.
Sistem ini memiliki banyak keuntungan, seperti
pengujian yang lebih cepat dan lebih murah,
miningkatkan
keragaman
penelitian
terutamanya
yang
berkaitan
dengan
mekanisme keracunan. Dengan meningkatnya
tuntutan ini akan mendorong perbaikan
prosedur pengujian yang lebih sederhana dan
handal, seperti misal pengujian karsinogen “uji
kanker”, uji mutagenesis, menggunakan
“petanda biologik” (biomarker) yaitu kultur sel
kanker.
Mingkatnya kebutuhan akan uji toksikologik,
namun
pada
kenyataannya
terdapat
keterbatasan akan fasilitas dan sumber daya
manusia yang memenuhi syarat, Oleh sebab itu
maka data toksisitas yang dihasilkan dimana
saja sebaiknya dapat diterima secara
international. Agar data-data tersebut dapat
diterima secara umum, kama data tersebut
harus memenuhi standar tertentu. Untuk itu
lembaga terkemuka dunia mengeluarkan
standar seperti yang dikeluarkan oleh Lembaga
pengawas obat dan makanan Amerika (FDA)
mengeluarkan “Good Laboratory Practice” ,
dimana standar ini dapat diterima secara
international.
Pada akhirnya, ahli toksikologi harus terus
memperbaiki prosedur uji untuk mengurangi
hasil positif palsu dan negatif palsu, dan terus
melakukan penelitian yang dirancang untuk
meningkatkan pemahaman yang lebih baik
akan pentingnya efek toksik sehingga penilaian
keamanan/resiko berbagai tokson dapt
dilakukan dengan hasil lebih memuaskan.
Bahan Bacaan:
1. Lu, F.C., 1995, Toksikologi Dasar, Asas,
Organ Sasaran, dan Penilaian Resiko,
Nugroho, E. (terj.), UI Press, Jakarta
2. Loomis, T.A., 1978, Toksikologi Dasar,
Donatus, A. (terj.) IKIP Semarang Press,
Semarang
3. Ariens,E.J., Mutschler,E., Simonis,A.M.,
1985, Toksikologi Umum, Pengantar,
Wattimena,Y.R.(terj.),
Gadjah
Mada
University Press,Yogyakarta.
4. Ling, L.J., 2000, Toxikology Secrets, Hanley
& Belfus, Inc. Philadelphia
15
BAB III
FASE KERJA TOKSIK
Dua aspek yang perlu diperhatikan dalam
menelaah
interaksi
senobitika
dengan
organisme hidup yaitu: kerja senobiotika pada
organisme dan reaksi atau efek yang
ditimbulkan. Kerja toksik pada umumnya
I
Kontak/
Penggunaa
- Bentuk
farmasetik
hancur
- Zat aktif
melarut
merupakan hasil sejumlah besar proses biologi
yang komplek. Secara umum kerja toksik dapat
digambarkan dalam rantai kerja yang terdiri
dari: fase eksposisi, toksokinetik dan fase
toksodinamik (lihat. Gam. 3.1).
II
Zat aktif
tersedia untuk
diabsorpsi
Ketersediaan
Farmasetik
III
- Adsorpsi
- Distribusi
-
Fase:
Eksposisi
Metabolism
e
Zat aktif
tersedia untuk
memberikan
efek
Ketersediaa
n biologik
Ekskresi
Fase:
Toksokinetik
Interaksi
toksonreseptor
dalam organ
efektor
Efek
Fase:
Toksodinamik
Gambar 3.1: Rantai fase kerja tokson (racun) pada organisme
3.1. Fase eksposisi:
Dalam fase ini organisme terpapar (terkontak)
dengan senobiotika. Paparan dapat melalui
kulit, oral, saluran pernafasan (inhalasi) atau
dengan cara injeksi.
Pada pemakaian oral (misal sediaan dalam
bentuk padat), maka terlebih dahulu
kapsul/tablet akan terdistegrasi, sehingga
xenobiotika akan telarut di dalam cairan
saluran pencernaan. Xenobiotika yang terlarut
akan siap terabsorpsi secara normal dalam
duodenal dari usus halus dan ditraspor
melalui pembuluh kapiler mesenterika menuju
vena porta hepatika menuju hati sebelum ke
sirkulasi sistemik.
Paparan xenobiotika (rute administrasi) dapat
melalui oral, inhalasi, topikal, rektal, atau
vaginal. Sedangkan pemasukan xenobiotika
langsung ke sirkulasi sistemik (injeksi), dapat
dikatakan bahwa xenobiotika tidak mengalami
proses
absorpsi.
Tabel 3.1. Beberapa contoh rute pemakaian obat-obat terlarang
Rute
Drugs (Obat-Obat terlarang)
Oral
cannabinoide, opiate, LSD, meskalin, benzodiazepin, barbiturate, anti depresan trisiklik, ecstasy
Inhalasi
pelarut-pelarut perangsang (terpentin, kloroform, eter, dll), alkaloid dengan titik didih
yang rendah (nikotin, kokain, amfetamin)
Merokok
marijuana, daun ganja, Crack ”kokain”, metamfetamin,
Intravenus
heroin, morfin, kokain, metamfetamin, fensilidin
Intranasal
kokain, heroin, methamfetamin
Dermal
fentanyl, nikotin.
Fase Kerja Toksik
16
3.2. Fase toksokinetik
Efek toksik timbul jika tokson terabsorpsi
kemudian ditransfer bersama sistem peredaran
darah menuju reseptor, hasil interaksi tokson
dengan reseptor akan menimbulkan efek
farmakologi. Untuk mengakhiri efek yang timbul,
oleh tubuh tokson akan dimetabolisme dan
dieliminasi dari dalam tubuh. Proses absorpsi,
distribusi, metabolisme dan eliminasi (ADME)
terangkum dalam fase toksokinetik.
Tubuh mengenal drug sebagai senyawa asing
atau xenobiotika. Jika tubuh terpejan oleh
xenobiotika, maka tubuh akan berusaha
menghancurkan dan kemudian mengeliminasi
senyawa xenobiotika ini dari dalam tubuh.
Farmakokinetik dapat juga dipandang suatu
bidang ilmu, yang mengkaji perubahan
konsentrasi (kinetika) dari xenobiotika di dalam
tubuh organisme sebagai fungsi waktu.
Perubahan konsentrasi xenobiotika ditentukan
oleh: dimana dan berapa cepat xenobiotika
diabsorpsi menuju ke sirkulasi sistemik,
bagaimana terdistribusi di dalam tubuh
organisme, bagaimana enzim tubuh merubah
struktur molekulnya, serta dari mana dan berapa
cepat dieksresi dari dalam tubuh (Mutschler dan
Schäfer-Korting, 1997).
Toksokinetik
(farmakokinetik)
menelaah
perubahan konsentrasi tokson terhadap waktu di
dalam organisme. Secara umum toksokinetik
menelaah dari mana dan berapa laju absorpsi
tokson dari lingkungan ke sistem peredaran
darah, bagaimana distribusinya ke seluruh tubuh,
bagaimana enzim tubuh memetabolismenya, dari
mana dan bagaimana tokson atau metabolitnya
dieliminasi dari dalam tubuh.
Farmakokinetik melibatkan proses invasi
(masuknya xenobiotika ke tubuh), trasportasi dan
distribusi (pergerakan xenobiotika di dalam
tubuh), serta proses eleminasi (proses hilangnya
xenobiotika dari dalam tubuh). Proses ini semua
menentukan efficacy (kemampuan xenobiotika
mengasilkan efek), efektifitas dari xenobiotika,
konsentrasi xenobiotika di reseptor, dan durasi
dari
efek
farmakodinamiknya.
Sifat-sifat
farmakokinetik suatu xenobiotika digunakan oleh
farmakolog, ilmuwan klinik dan toksikolog untuk
mengembangkan pengobatan, untuk mengertikan
faktor-faktor
yang
dapat
mendorong
penyalahgunaan xenobiotika tersebut, serta
dijadikan dasar untuk mengetahui kapan dan
Fase Kerja Toksik
dalam bentuk apa xenobiotika tersebut masih
dapat dideteksi setelah selang waktu pemakaian
dan menginterpretasikan efek-efek xenobitika
tersebut.
3.2.1. Absorpsi (Proses Invasi)
Semua proses transfer tokson dari lingkungan
menuju sistem peredaran darah dirangkum
kedalam proses invasi, proses ini juga
digambarkan sebagai resorpsi. Tokson dapat
teresorpsi umumnya berada dalam bentuk
terlarut atau terdispersi molekular. Laju resorpsi
tokson ditentukan oleh daerah paparan (topikal,
oral, inhalasi atau injeksi), bentuk farmasetik
tokson (tablet, salep, sirop, aerosol, suspensi
atau larutan), proses resorpsi, sifat fisikokimia
tokson dan konsentrasinya.
Proses invasi disebut juga dengan absorpsi,
yang ditandai oleh masuknya xenobiotika dari
tempat kontak (paparan) menuju sirkulasi
sistemik tubuh. Laju absorpsi xenobiotika
ditentukan oleh sifat membran biologis dan aliran
kapiler darah tempat kontak serta sifat fisiko
kimia dari xenobiotika itu sendiri. Pada
pemakaian oral (misal sediaan dalam bentuk
padat), maka terlebih dahulu kapsul/tablet akan
terdistegrasi, sehingga xenobiotika akan telarut
di dalam cairan saluran pencernaan. Xenobiotika
yang terlarut ini akan terabsorpsi secara normal
dalam duodenal dari usus halus dan ditraspor
melalui pembuluh kapiler mesenterika menuju
vena porta hepatika menuju hati sebelum ke
sirkulasi sistemik. Kelarutan xenobiotika akan
sangat mempengaruhi laju absorpsinya, jika
xenobiotika terlalu non polar, maka dia akan
terlarut cukup kuat dalam lapisan lipofil dari
membran sel. Demikian juga jika terlalu polar
xenobiotika ini akan mudah terlarut di dalam
saluran cerna namun transport melalui membran
biologis akan terhambat.
Paparan xenobiotika (rute administrasi) dapat
melalui oral, inhalasi, topikal, rektal, atau vaginal.
Sedangkan pemasukan xenobiotika langsung ke
sirkulasi sistemik (injeksi), dapat dikatakan
bahwa xenobiotika tidak mengalami proses
absorpsi.
Rute
pemakaian
obat
akan
mempengaruhi onset dari aksi, durasi efek,
intensitas dan qualitas efek dari obat. Pada
pemakaian intravenus obat dapat langsung
ditranspor ke reseptor, rute pemakaian ini
tentunya akan memberikan efek yang paling
maksimum dan onset aksi yang singkat. Namun
pemakaian intravenus pada penyalahgunaan obat
17
terlarang lebih banyak menimbulkan resiko yang
berbahanya, oleh sebab itu pada kasus ini
pemakaian melalui inhalasi dan merokok
merupakan alternatif yang lebih poluler
dikalangan junkies. Jika drug dihisap melalui
hidung atau bersamaan dengan rokok, maka drug
akan sangat cepat terabsorpsi di alveoli paruparu, dan selanjutnya melalui pembuluh darah
arteri dibawa ke otak. Oleh sebab itu efek akan
lebih cepat timbul. Pemakaian ”crack” (bentuk
kokain yang digunakan secara merokok) dengan
menghisap akan menimbulkan onset aksi yang
sangat singkat, sehingga intesitas eforia akan
cepat tercapai. Demikian juga pada pemakain
heroin secara inhalasi, efek eforia akan relatif
sama
tercapainya
dibandingkan
dengan
pemakaian secara intravenus.
Heroin biasanya digunakan dengan cara
menguapkan dan kemudian uap dihirup, dengan
merokok, atau injeksi secara intravenus. Setelah
heroin sampai di sirkulasi sistemik, maka heroin
sangat cepat menuju otak. Karena sangat
cepatnya timbulnya efek pada pemakaian
intravenus, maka rute pemakaian ini sangat
digemari oleh para junkis. Namun pemakain ini
sangat berresiko ketimbang pemakaian secara
inhalasi atau merokok, karena sering ditemui
muncul penyakit bawaan lain pada pemakaian
injeksi, seperti infeksi HIV, hepatitis.
kapiler mesenterika menuju vena porta hepatika
menuju hati sebelum ke sirkulasi sistemik, dari
sini akan terdistribusi ke seluruh tubuh.
3.2.2. Distribusi
Setelah tokson mencapai sistem peredahan
darah, bersama darah akan terdistribusi ke
seluruh tubuh. WEISS M. (1990) membagi
distribusi ke dalam konveksi (transpor tokson
bersama peredaran darah) dan difusi (difusi
tokson di dalam sel atau jaringan). Transprot
tokson intra- dan inter organ di dalam tubuh
diprasaranai oleh sistem peredaran darah. Difusi
berperan penting dalam transport suatu tokson
diantara ekstra dan intra selular. Difusi tokson
melalui membran biologi dapat berlangsung
melalui berbagai proses difusi, seperti: difusi
pasif, difusi aktif (melalui sistem transport
tertentu ,”cariier”, melalui finocitose, atau
fagocitose) atau melalui poren. Laju difusi suatu
tokson sangat ditentukan oleh sifat fisikokimanya
(lipofili, ukuran melekul, derajat ionisasi, ikatan
dengan protein plasma).
Transpor
Transport dapat di kelompokkan ke dalam dua
proses utama, yaitu konveksi (transport
xenobiotika bersama aliran darah) dan difusi
(transport xenobiotika melalui membran biologis).
Sirkulasi sistemik sangat memegang peranan
penting dalam transport xenobiotika antar organ
dan jaringan di dalam tubuh. Sehingga laju
peredaran darah di dalam organ atau jaringan
juga akan menentukan kecepatan distribusi
xenobiotika di dalam tubuh.
Pada paparan melalui oral bentuk farmasetik
(tablet, kapsul, dll) akan terdispersi dan melarut
di dalam cairan saluran pencernaan. Bentuk
terlarut melalui pembuluh kapiler pada saluran
pencernaan akan terabsorpsi. Absorpsi ini
sebagaian besar berlangsung di pembuluh
kapiler usus halus, kemudian melalui pembuluh
Tabel 3.2: Laju aliran darah pada berbagai organ pada orang dewasa
Organ
Prosen (%) dari Prosen (%) dari
berat badan
volum jantung per
menit
Aliran darahnya bagus:
Ginjal
0,5
20
Hati
2,8
28
Otak
2,0
12
Paru-paru
1,5
100
Jantung
0,5
4
Lambung dan usus saluran
2,8
24
pencernaan
Aliran darahnya kurang bagus:
Kulit
10
6
Otot-otot
40
23
Aliran darahnya jelek:
Jaringan Lemak
18
5
Fase Kerja Toksik
Laju aliran darah
(ml/min/100g
organ)
400
85
54
400
84
70
5
5
2,1
18
Pada tabel 3.2 menggambarkan perbedaan jalu
aliran darah di berbagai organ tubuh. Organ
tubuh seperti ginjal, hati, otak, paru-paru,
jantung, lambung dan usus, adalah organorgan yang memiliki laju aliran darah (perfusi)
yang baik. Karena laju aliran darah dalam
organ-organ ini sangat baik, maka xenobiotika
akan sangat cepat terdistribusi homogen di
dalam organ tersebut, jika dibandingkan pada
organ-organ yang memiliki laju aliran darah
relatif lambat.
Difusi
Pada pemodelan farmakokinetik, tubuh dibagi
menjadi berbagai ruang difusi (kompartimen).
Pembagian ruang ini hanya didasarkan pada
laju distribusi xenobiotika. Perlu ditegaskan di
sini bahwa, pembagaian kompartimen ini hanya
merupakan
langkah
abstraksi
guna
mempermudah pemahaman ruang distribusi
(difusi) xenobiotika di dalam tubuh. Model yang
paling sederhana untuk memahami jalu difusi
xenobiotika di dalam tubuh adalah model
kompartimen tunggal. Pada model ini tubuh
dipandang seperti satu ember besar, dimana
difusi xenobiotika hanya ditentukan oleh daya
konveksi di dalam ember. Namun pada
kenyataannya,
agar
xenobitika
dapat
ditransportasi dari saluran kapiler pembuluh
darah menuju sel-sel pada jaringan tubuh,
haruslah melewati membran biologis, yaitu
membran yang menyeliputi sel-sel di dalam
tubuh. Secara keseluruhan luas permukaan
kapiler tubuh (orang dewasa) diperkirakan
berkisar antara 6000-8000 m2, dengan panjang
keseluruhan diduga sekitar 95000 km. Di
bagian luar kapileredotel ini diselimuti oleh
membran basal yang sangat halus dan elastis.
Struktur membran basal dapat dibedakan
menjadi:
- kapiler yang sangat tertutup (contoh: barier
sawar darah otak)
- kapiler yang berjendela, pada jendela ini
terjadi pertukaran cairan yang sangat
intensiv, jarak jendela dalam kapiler ini
adalah tidak beraturan (contoh:tubulus
ginjal),
- kapiler yang terbuka, tidak terdapat
hubungan antar sel-sel endotel, sehingga
pada kapiler ini terdapat lubang-lungang
yang besar, yang dapat dilewati oleh plasma
darah (contoh: hati).
Fase Kerja Toksik
Laju penetrasi xenobiotika melewati membran
biologis akan ditentukan oleh struktur
membran basal dan juga sifat lipofilitasnya.
Senyawa-senyawa
lipofil
akan
dapat
menembus membran biologis dengan baik,
sedangkan senyawa yang polar (larut air)
haruslah melewati lubang-lunag di membran
biologis, yang dikenal dengan „poren“. Jumlah
poren dalam membran biologis adalah terbatas,
oleh sebab itu dapatlah dimengerti, bahwa
senyawa lipofil akan terdistribusi lebih cepat
dibandingkan senyawa hidrofil (lihat tabel 3.3).
Difusi xenobiotika melalui membran biologis
dapat berlangsung melalui berbagai proses,
seperti: difusi pasiv, difusi aktiv, melalui poren
dan juga melalui jembatan intraseluler.
Ketika xenobiotika mencapai pembuluh darah,
maka bersama darah melalui sirkulasi sistemik
siap untuk didistribusikan ke reseptor dan ke
seluruh tubuh. Untuk memudahkan memahami
sejauh mana suatu xenobiotika terdistribusi di
dalam tubuh, para ilmuan farmakokinetik
mengumpamakan bahwa xenobitika di dalam
tubuh akan terdistribusi di dalam suatu ruang,
yang memiliki sejumlah volume tertentu. Jadi
kemampuan
suatu
xenobiotika
untuk
terdistribusi di dalam tubuh dinyatakan sebagai
parameter yang disebut dengan volume
distribusi.
Distribusi
Terdapat
banyak
faktor
yang
dapat
mempengaruhi proses distribusi dari suatu
xenobiotika, dimana faktor-faktor tersebut
dapat dikelompokkan menjadi dua, yaitu:
a) faktor biologis:
- laju aliran darah dari organ dan jaringan,
- sifat membran biologis
- perbedaan pH antara plasma dan jaringan
b) faktor sifat molekul xenobiotika
- ukuran molekul
- ikatan antara protein plasma dan protein
jaringan
- kelarutan
- sifat kimia
Senyawa yang larut lemak akan lebih mudah
terdistribusi ke seluruh jaringan tubuh,
sehingga pada umumnya senyawa lipofil akan
mempunyai volume distribusi yang jauh lebih
besar ketimbang senyawa yang hidrofil. TetraHidro-Canabinol (THC) (zat halusinogen dari
tanaman ganja) adalah sangat larut lemak,
19
sehingga THC akan sangat mudah terdistribusi
jaringan lemak, dan ini akan memperlambat laju
ke seluruh jaringan dan akan terdeposisi di
eliminasi THC. Etanol (alkohol), senyawa yang
jaringan lemak, oleh sebab itu THC memiliki
bersifat agak hidrofil, sebagian besar
volume distribusi yang relatif besar (4-14 l/kg).
terdistribusi di dalam cairan intra- dan
Karena kelarutannya yang tinggi, hal itu pun
ekstraseluler tubuh. Volume distribusi (Vd)
menyebabkan THC sangat lama tertambat di
etanol adalah 0,5 l/kg.
Tabel 3.3: Permeabilitas beberapa membran biologis (H Nau, 1994)
Membran lipid
- barier sawar darah otak
darah ( liquor)
darah ( otak )
- lapisan lendir penanjang saluran pencernaan
- lapisan lendir di mulut
- tubulus ginjal
- kulit
hanya xenobiotika lipofil, tidak terionisasi;
xenobitika polar akan terperfusi sangat lambat atau
sama sekali tidak
Membran lipid dengan „Poren“
- darah ( hati )
- hati ( empedu )
- paru-paru
- plasenta
- darah ( kelenjar mamai)
- kapilar-kapiler di kulit dan otot
- lapisan lendir (mata, hidung, kantung kemih)
- glomerulus ginjal (Filtrasi)
xenobiotika lipofil dan hidrofil dapat lewat
3.2.3 Metabolisme dan Ekskresi
Metabolisme dan ekskresi dapat dirangkum ke
dalam eliminasi. Yang dimaksud proses
eliminasi adalah proses hilangnya xenobiotika
dari dalam tubuh organisme. Eliminasi seatu
xenobiotika
dapat
melalui
reaksi
biotransformasi (metabolisme) atau ekskresi
xenobiotika melalui ginjal, empedu, saluran
pencernaan, dan jalur eksresi lainnya (kelenjar
keringan, kelenjar mamai, kelenjar ludah, paruparu). Jalur eliminasi yang paling penting
adalah eliminasi melalui hati (reaksi
metabolisme) dan eksresi melalui ginjal.
Ginjal sangat memegang peranan penting
dalam mengekskresi baik senyawa eksogen
(xenobiotika) maupun seyawa endogen, yang
pada umumnya tidak diperlukan lagi oleh tubuh.
Proses utama ekskresi renal dari xenobiotika
adalah: filtrasi glumerula, sekresi aktiv tubular,
dan resorpsi pasiv tubular. Pada filtrasi
glumerular, ukuran melekul memegang
peranan penting. Molekul-molekul dengan
diameter yang lebih besar dari 4 nm atau
dengan berat lebih besar dari 50 kilo Dalton (k
Da) tidak dapat melewati filtrasi glumerular.
Oleh sebab itu hanya senyawa dengan ukuran
dan berat lebih kecil akan dapat terekskresi.
Fase Kerja Toksik
Xenobiotika yang terikat dengan protein
plasma tentunya tidak dapat terekskresi melalui
ginjal. Resorpsi pasiv tubular ditentukan oleh
gradien konsentrasi xenobitika antara urin dan
plasma di dalam pembuluh tubuli. Berbeda
dengan resorpsi tubular, sekresi tubular
melibatkan proses transport aktiv.
Xenobiotika yang masuk ke dalam tubuh akan
diperlakukan oleh sistem enzim tubuh,
sehingga senyawa tersebut akan mengalami
perubahan struktur kimia dan pada akhirnya
dapat dieksresi dari dalam tubuh. Proses
biokimia yang dialami oleh ”xenobiotika”
dikenal dengan reaksi biotransformasi.
Biotransformasi pada umumnya berlangsung di
hati dan sebagian kecil di organ-organ lain
seperti: ginjal, paru-paru, saluran pencernaan,
kelenjar susu, otot, kulit atau di darah.
Secara umum proses biotransformasi dapat
dibagi menjadi dua fase, yaitu fase I (reaksi
fungsionalisasi) dan fase II (reaksi konjugasi).
Dalam fase pertama ini tokson akan mengalami
pemasukan gugus fungsi baru, pengubahan
gugus fungsi yang ada atau reaksi penguraian
melalui reaksi oksidasi (dehalogenasi,
dealkilasi,
deaminasi,
desulfurisasi,
pembentukan oksida, hidroksilasi, oksidasi
alkohol dan oksidasi aldehida); rekasi reduksi
20
(reduksi azo, reduksi nitro reduksi aldehid atau
keton) dan hidrolisis (hidrolisis dari ester
amida). Pada fase II ini tokson yang telah siap
atau termetabolisme melalui fase I akan
terkopel (membentuk konjugat) atau melalui
proses sintesis dengan senyawa endogen
tubuh, seperti: Konjugasi dengan asam
glukuronida asam amino, asam sulfat, metilasi,
alkilasi, pembentukan asam merkaptofurat.
Enzim-enzim
yang
terlibat
dalam
biotransformasi pada umumnya tidak spesifik
terhadap substrat. Enzim ini (seperti
monooksigenase, glukuronidase) umumnya
terikat pada membran dari retikulum
endoplasmik dan sebagian terlokalisasi juga
pada mitokondria, disamping itu ada bentuk
terikat sebagai enzim terlarut (seperti esterase,
amidase, sulfoterase). Sistem enzim yang
terlibat pada reaksi fase I umumnya terdapat di
dalam retikulum endoplasmik halus, sedangkan
sistem enzim yang terlibat pada reaksi fase II
sebagian besar ditemukan di sitosol.
Disamping memetabolisme xenobiotika, sistem
enzim ini juga terlibat dalam reaksi
biotransformasi senyawa endogen (seperti:
hormon steroid, biliribun, asam urat, dll). Selain
organ-organ tubuh, bakteri flora usus juga
dapat
melakukan
reaksi
metabolisme,
khususnya reaksi reduksi dan hidrolisis.
3.3. Fase Toksodinamik
Setelah tokson didistribusikan ke reseptor
(tempat kerja tokson), maka tokson siap
berinteraksi dengan reseptor. Hasil interaksi ini
diimplementasikan sebagai efek farmakologik
(efek racun yang ditimbulkan, seperti efek
toksik alergi, schok anafilaktik, mutagenesis,
teratogenesis, dan lainnya). Kualitas efek ini
sebanding dengan konsentrasi tokson di
reseptor.
Mekanisme Utama Interaksi tokson-resptor
adalah:
• Interaksi dengan sistem enzim
– Inhibisi enzim tak bolak-balik
• Contoh:
inhibisi
asetilkolenesterase
oleh
organofosfat
– Inhibisi enzim secara reversibel
– Pemutusan reaksi biokimia
– Inhibisi fotosinteses pada tanaman
– Sentesis zat mematikan
Fase Kerja Toksik
–
•
•
•
•
•
Pengambilan ion logam penting untuk
kerja enzim
– Inhibisi penghantaran elektron dalam
rantai pernafasan
Inhibisi pada transport oksigen karena
gangguan pada hemoglobin
Interaksi dengan fungsi umum sel
Gangguan pada sintesa DNA dan RNA
Kerja teratogenik
Reaksi hipersensitif (alergi)
3.4. Pemodelan Farmakokinetik
Dalam mempelajari farmakokinetik suatu
xenobiotika haruslah disadari, bahwa semua
proses farmakokinetik terjadi tidaklah seperti
alur blok yang diskret (satu proses akan diikuti
oleh proses yang lain apabila proses
sebelumnya telah tuntas berakhir), melainkan
lebih merupakan suatu proses kombinasi satu
dengan yang lain. Setelah molekul xenobiotika
diabsorpsi dan menuju sirkulasi sistemik, maka
akan siap di transportasi ke seluruh tubuh,
dalam waktu bersamaan akan ada molekul
xenobiotika yang berikatan dengan reseptor
dan ada terdapat juga molekul yang lain
mengalami reaksi metabolisme, atau ada
molekul yang langsung dieksresi oleh ginjal.
Proses ini yang dimaksud dengan kombinasi
satu dengan yang lain.
Kompartemen model adalah pemodelan klasik,
yang sampai saat ini masih banyak digunakan,
yang digunakan untuk menggambarkan sifat
disposisi (perubahan konsentrasi sebagai
fungsi waktu) xenobiotika di dalam tubuh.
Kompartemen model adalah gambaran kinetik,
yang mengkarakterisasi sifat-sifat absorpsi,
disposisi, dan eliminasi dari suatu xenobiotika
di dalam tubuh. Karena kompartemen
merupakan gambaran sifat kinetik, maka
seharusnya pengertian suatu kompartemen
dilandasi (dibatasi) atas laju dari suatu proses.
Oleh sebab itu kompartemen disini tidak dapat
didefinisikan sebagai suatu ruang, melainkan
suatu poses yang memiliki laju yang sama
(Weis 1990).
Kurva konsentrasi suatu xenobiotika di dalam
cairan tubuh merupakan jumlah dari proses
invasi, distribusi, dan eliminasi. Proses invasi
digambarkan sebagai fungsi input „I(t)“ dan
proses ini menggambarkan bagaimana suatu
xenobiotika mencapai sirkulasi sistemik. Poses
distribusi dan eliminasi dirangkum ke dalam
21
fungsi disposis“fd(t)“. Sehingga kurvakonsentrasi-waktu (konsentrasi profil) suatu
xenobiotika merupakan gabungan dari fungsi
input dan disposisi dari xenobiotika tersebut.
Persamaan matematis dari fungsi ini dapat
ditulis dengan menggunakan operasi konvulasi.
Operasi ini ditandai dengan asterik (*),
sehingga konsentrsi profil suatu xenobiotika
dapat ditulis sebagai:
[C ](t ) = I (t ) * fd (t )
(3.1)
Laju invasi dan disposisi mengikuti hukum
kinetika orde ke pertama artinya laju invasi dan
disposisi berbanding lurus dengan konsentrasi
xenobiotika. Secara umum fungsi diposisi ini
digambarkan
sebagai
jumlah
fungsi
eksponential:
(3.2)
i =1
αi dan λi = parameter diposisi
n
= jumlah fungsi eksponensial
(jumlah dari kompartemen)
t
= waktu
iv
p
i
(3.3)
i =1
Div
km
Ap
n
∑ α i e −λ t
= adalah sama dengan fungsi input I(t)
Dalam
menganalisis
metabolit
kinetik
digunakan istilah senyawa induk (p) dan juga
metabolit primer (mi). Metabolit kinetik adalah
analisa matematis dari profil konsentrasi
senyawa induk dan metabolit yang terbentuk.
Sampai saat ini terdapat beberapa model untuk
menganalisa metabolit kenetik dari suatu
xenobiotika, yaitu: model kompartemen klasik,
model psiologi, dan model komparten terbuka
(Wirasuta, 2004).
n
D
[C ](t ) = D iv
Target analisis toksikologi tidaklah hanya
senyawa induk, melainkan juga metabolitnya.
Memperhatikan
hubungan
konsentrasi
senyawa induk dan metabolit pada setiap
waktu dapat menggambarkan keseluruhan
jaringan proses farmakokinetik. Konstelasi
konsentrasi antara senyawa induk dan
metabolitnya sebagai fungsi waktu merupakan
hal yang penting bagi toksikolog forensik
dalam menginterpretasikan hasil analisis
berkaitan dengan pertanyaan kapan suatu
paparan itu terjadi. Oleh sebab itu disini
dipandang perlu untuk menjelaskan model
metabolit kinetik.
Perubahan konsentrsi dari sebagaian besar
xenobiotika di dalam tubuh, mengikuti hukum
kinetika orde ke pertama, hanya sedikit
xenobiotika mengikuti orde ke nol. Alkohol
adalah salah satu xenobiotika yang perubahan
konsentrasinya di dalam tubuh manusia
mengikuti hukum kinetika orde ke nol, yang
artinya alkohol dieliminasi dari tubuh dengan
kecepatan yang konstan.
fd (t ) = ∑ α i e −λit
Jika suatu xenobiotika diberikan secara
intravenus dan perubahan konsentrasinya
mengikuti hukum kinetika orde ke pertama,
maka fungsi profil konsetrasinya dapat
dinyatakan sebagai berikut:
Am
ke m
ku p
Up
Gambar 3.1: Skema model dari metabolit kinetik
A
U
Div
p
: Jumlah total xenobiotika di dalam tubuh
: Jumlah xenobiotik yang eliminasi melalui ginjal
: Dosis intravenus
: Senyawa induk
Analisis metabolit kinetik berdasarkan model
kompartemen klasik dan psiologi didasarkan
pada pengandaian model terstruktur, dimana
perubahan konsentrasi senyawa induk dan
Fase Kerja Toksik
ke
km
ku
m
: Konstanta laju eliminasi
: Konstanta laju metabolisasi
: Konstantan laju eliminasi melalui urin
: Metabolit
metabolitnya memenuhi hukum kinetika orde
pertama dan eleminasi senyawa induk
berlangsung melalui hati (reaksi metabolisme)
atau melalui ginjal (ekskresi). Dalam model ini
juga diasumsikan bahwa laju distribusi dari
22
senyawa induk dan metabolitnya di dalam
tubuh adalah sangat cepat dibandingkan
dengan laju eleminasinya (Pang 1981,1985,
Pang dan Kwan 1982, Houston 1982). Berikut
ini gambaran skematis model metabolit kinetik
pada model satu kompartemen:
dipecahkan apabila analisa matematisnya
dengan menggunakan model kompartimen
terbuka, dimana persamaan matematis
diselesaikan
dengan
menggunakan
Transformasi Laplace (Weiss 1998, Wirasuta
2004). Konsep dari model ini didasarkan pada
asumsi
bahwa
perubahan
konsentrasi
xenobiotika dan metabolitnya di dalam tubuh
mengikuti hukum kinetik orde pertama,
sehingga profil konsentrasi suatu xenobiotika
dapat digambarkan sebagai jumlah persamaan
eksponential. Jika xenobiotika (senyawa induk
„p“ diberikan secara intravenus maka profil
konsentrasinya seperti yang tertulis dalam
persamaan (3). Tranformasi persamaan
tersebut ke daerah Laplace memberikan
persamaan berikut ini:
np  αi

iv
p

(3.5)
[ p](s ) = D p ∑ 


i =1  s + λi p 
Perubahan jumlah xenobiotika dapat dituliskan
sebagai berikut:
A p (t ) = D ivp e
− ke pt
(3.3)
Dimana profil jumlah metabolit di dalam tubuh
adalah:
Am (t ) =
(k
k m D ivp
em
− ke p
) (e
− ke p t
−e
− ke mt
)
(3.4)
Banyak xenobiotika di dalam tubuh tidak
mengikuti model satu kompartemen, sehingga
dalam melakukan analisis matematik metabolit
kinetik xenobiotika seperti ini akan sangat
komplek. Masalah ini akan lebih mudah
(
)
Menurut persamaan (3.1), maka profil konsentrasi metabolit primer adalah:
[m]( s) = I m ( s) fd m ( s)
(3.8)
 αi p

∑
 s + λi
i =1
p

np
(
10
Fase Eliminasi
1
)
 n m  αi
m
 

∑
+
s
λ
im
 i =1 
Konsentrasi (mg/ml)
Konsentrasi (mg/ml)
[m](s) = F p_m CL p Ψ p_m (s) D ivp
0,1
0,01
(
)




(3.9)
10
Fase Eliminasi
1
0,1
0,01
0,001
0,001
0
60
Fase Distribusi
120
180
240
Waktu (min)
0
120
240
360
480
600
720
Waktu (min)
Gambar 3.2: Kurva konsentrasi-waktu xenobiotika A (kiri) dengan metabolitnya B (kanan) mengikuti
hukum kinetika orde ke pertama.
A setelah intravenus, profil konsentrasinya mengikuti model disposisi dua-kompartemen,
dimana setelah injeksi A sangat cepat terdistribusi (fase distribusi), yang ditandai dengan
penurunan konsentrasi yang sangat cepat, kemudian diikuti dengan fase elminasi, pada saat
ini terjadi kesetimbangan kecepatan trasport antara kedua kompartemen. Waktu paruh (t½)
fase eliminasi biasanya digunakan oleh toksikolog forensik untuk menghitung/meraka kapan
xenobiotika ”drug” pada waktu awal ”initial time” pemakaian.
Reaksi biokimia pembentukan metabolit primer
dan transport metabolit yang terbentuk dari
tempat reaksi metabolisme ke sirkulasi
sistemik membutuhkan waktu. Laju rekasi dan
tranport ini dikenal dengan fungsi waktuFase Kerja Toksik
transit-metabolisme „„Ψp_m (t)“ (Weiss 1998).
Jika metabolisme berlangsung di hati, maka
fungsi ini dikenal dengan fungsi waktu-transitmetabolisme-hepatika, fungsi ini ditulis
sebagai:
23
Ψ p_m ( s ) =
λp
(s + λ p )
(3.6)
λp_m= konstanta waktu dari fungsi-waktutransit-metabolisme
Fungsi input dari biosintesa metabolit primer
„Im(s)“ adalah:
I m ( s ) = F p_m CL p Ψ p _m ( s ) [ p ]( s )
(Weiss
1998)
Fp_m
(3.7)
= Fraksi dari senyawa induk „p“ yang
terbentuk menjadi metabolit primer
= Clearance senyawa induk
CLp
Ψp_m (s) = Fungsi waktu-transit-metabolisme
dari senyawa induk membentuk
metabolit primer
3.5. Parameter Farmakokinetik
Clearance (CL) adalah satuan kemampuan dari
organisme (organ tubuh) untuk mengeliminasi
suatu xenobiotika. Clearence dapat juga
dimengerti dengan jumlah volume dari
xenobiotika yang mampu dieliminasi oleh
organ (organismus) persatuan waktu. Oleh
sebab itu satuan clearance adalah volume
perwaktu (misal, ml/min).
Waktu paruh (t1/2) adalah waktu yang
dibutuhkan oleh xenobiotika tereliminasi
menjadi setengah konsentrasi awalnya. Waktu
paruh pada fase akhir disposisi (fase eliminasi)
dikenal sebagai waktu paruh terminal (t1/2 Z).
Hurup z menandakan fase akhir disposisi. Fase
ini biasanya ditunjukkan oleh proses
farmakokintik yang paling lambat. Waktu paruh
dari
metabolit
yang
diperoleh
dari
penghitungan
secara
logaritma
kurvakonsentrasi-waktu metabolit dari senyawa
induk biasanya disebut dengan waktu paruh
semu ”apparance half life time” (t1/2 app). Waktu
paruh setiap fase disposisi, dimana laju
eliminasinya memenuhi hukum kinetika orde
pertama, dapat dihitung dengan :
t 1 i = ln 2 λ l (3.10)
2
Dari persamaan di atas tampak bahwa untuk
laju eliminasi orde ke pertama, t½ adalah
konstan. Tanpa perlu memperhatikan berapa
jumlah atau konsentrasi xenobiotika pada
keadaan awal, maka waktu yang diperlukan
untuk berkurang menjadi separuhnya adalah
konstan
Volume distribusi (Vd) adalah volume virtual,
dimana kelihatannya suatu xenobiotika
Fase Kerja Toksik
terdistribusi atau di mana dianggap xenobiotika
tersebut terlarut. Volume distribusi menyatakan
suatu faktor yang harus diperhitungkan dalam
memperkirakan jumlah xenobiotika dalam
tubuh dari konsentrasi xenobiotika yang
ditemukan dalam kompartimen cuplikan.
Untuk sebagaian besar xenobiotika dianggap
bahwa xenobiotika bersetimbangan secara
cepat dalam tubuh. Tiap jaringan dapat
mengandung suatu konsentrasi xenobiotika
yang berbeda sehubungan dengan perbedaan
afinitas xenobiotika terhadap jaringan tersebut.
Oleh karena itu volume distribusi tidak
mengandung suatu arti fiosologik yang
sebenarnya dari
Dengan asusmsi, bahwa tubuh manusia dapat
diandaikan sebagai satu ruang distribusi
(model satu kompartemen), maka pada
pemakaian injeksi intravenus ”injeksi bolus”
ratio antara dosis dan konsentrasi awal ([Co])
adalah menunjukkan volume distribusi
xenobiotika tersebut.
V =D
iv
(3.11)
[C ]o
Dalam kinetika kompartemen ganda kita dapat
menganggap secara matematik volume
hipotetik, seperti volume dari kompartimen
sentral (Vc) dan volume kompartemen perifer
atau kompartemen jaringan (Vp). Volume
distribusi, yang dihitung pada keadaan
tunak ”steady state”, dimana laju obat masuk
dan keluar dari dan ke kompartemen perifer
adalah sama, disebut dengan volume distribusi
dalam keadaan tunak. Volume distribusi area
adalah volume hipotetik yang dihitung melalui
persamaan berikut:
V ß = Varea = D
λ z [ AUC ]∞o
(3.12)
Oleh karena clearance total sama dengan
D
[ AUC ]∞o
, maka Vß dapat dinyatakan
dalam clearance dengan tetapan laju eliminasi
pada fase terminal (λz),
V ß = Varea = CL
λz
(3.13)
Volume distribusi area dipengaruhi oleh laju
eliminasi obat pada fase terminal dan clearance
total obat dari dalam tubuh. Perubahan ini
mungkin diakibat oleh perubahan fungsi organ
tubuh (ginjal, hati). Sedangkan volume
24
distribusi pada keadaan tunak
dipengaruhi perubahan eliminasi obat.
tidak
3.6. Biotransformasi (metabolisme)
Senyawa-senyawa lipofil setelah terfiltrasi
glumerular akan direabsorpsi melalui tubili
ginjal menuju sistem peredaran darah. Ekskresi
senyawa ini akan belangsung dengan sangat
lambat. Jika senyawa tersebut tidak mengalami
perubahan
kimia,
kemungkinan
akan
menimbulkan bahaya yang sangat serius.
Senyawa lipofil ini akan tingal dalam waktu
yang cukup di dalam tubuh, yaitu terdeposisi di
jaringan lemak.
Pada prinsipnya senyawa yang hidrofil akan
dengan mudah terekskresi melalui ginjal.
Ekskresi ini adalah jalur utama eliminasi
senyawa asing (xenobiotika) dari dalam tubuh.
Sehingga sebagian besar senyawa-senyawa
lipofil terlebih dahulu oleh tubuh dirubah
menjadi senyawa yang lebih bersifat hidrofil.
Proses perubahan biokimia dari xenobiotika
dikenal
dengan
biotransformasi.
Biotransformasi pada umumnya berlangsung di
hati dan sebagian kecil di organ-organ lain
seperti: ginjal, paru-paru, saluran pencernaan,
kelenjar susu, otot, kulit atau di darah.
Pada
umumnya
biotransformasi
akan
mengakhiri efek farmakologi dari xenobiotika
(detoksifikasi / inaktivasi). Namun ada
beberapa xenobiotika setelah termetabolisme
mengalami
peningkatan
aktivitasnya
(bioaktivasi), seperti bromobenzen melalui
oksidasi membentuk bentuk bromobenzen
epoksid. Bromobenzen epoksid akan terikat
secara kovalen pada makromlekul jaringan hati
dan mengakibatkan nekrosis hati.
Biotransformasi belangsung dalam dua tahap,
yaitu reaksi fase I dan fase II. Rekasi fase I
melibatkan reaksi oksidasi, reduksi dan
hidrolisis. Sedangkan reaksi fase II adalah
pengkopelan hasil reaksi fase I (metabolit fase
I) dengan suatu senyawa endogen. Reaksi fase
II disebut juga reaksi konjugasi. Gambar 1
menggambarkan reaksi-rekasi penting yang
terjadi dalam biotransformasi.
Enzim-enzim
yang
terlibat
dalam
biotransformasi pada umumnya tidak spesifik
terhadap substrat. Enzim ini (seperti
monooksigenase, glukuronidase) umumnya
terikat pada membran dari retikulum
endoplasmik dan sebagian terlokalisasi juga
pada mitokondria, disamping itu ada bentuk
terikat sebagai enzim terlarut (seperti esterase,
amidase, sulfoterase). Sistem enzim yang
terlibat pada reaksi fase I umumnya terdapat di
dalam retikulum endoplasmik halus, sedangkan
sistem enzim yang terlibat pada reaksi fase II
sebagian besar ditemukan di sitosol.
Disamping memetabolisme xenobiotika, sistem
enzim ini juga terlibat dalam reaksi
biotransformasi senyawa endogen (seperti:
hormon steroid, biliribun, asam urat, dll). Selain
organ-organ tubuh, bakteri flora usus juga
dapat
melakukan
reaksi
metabolisme,
khususnya reaksi reduksi dan hidrolisis.
Reaksi Fase I
Reaksi Fase II
Metabolit Fase II
Metabolit Fase I
Xenobiotika
Oksidasi
Reduksi
Hidrolisis
Konjugasi
dengan:
- asam glukoronat
- sulfat
- asetat
l t ti
Gabar 3.3: Proses dan reaksi penting dalam biotransformasi
menghasilkan suatu gugus fungsi, yang
3.6.1. Reaksi Fase I
selanjutnya pada fase ke II akan terkonjugasi
Reaksi fase I ini juga disebut dengan reaksi
a. Reaksi oksidasi
fungsionalisasi, sebab melalui reaksi fase ini
(oksidasi,
reduksi
atau
hidrolisis)
25
Fase Kerja Toksik
Reaksi oksidasi mempunyai peranan penting
pada biotransformasi, khususnya reaksi-reaksi
yang melibatkan sistem enzim oksidase,
monooksigenase dan dioksigenase. Oksidase
mengoksidasi melalui masuknya oksigen
(elektron). Melalui mono-oksigenase akan
dimasukkan satu atom oksigen ke dalam
xenobiotika dan molekul oksigen yang lainnya
akan direduksi menjadi air. Berbeda dengan
dioksigenase, kedua atom oksigen akan
dimasukkan ke dalam xenobiotika. Sistem
enzim yang yang mengkatalisis rekasi
oksigenase ini memerlukan sistem sitokrom P450 dan NADPH-sitokrom P-450 reduktase,
NADPH dan molekul oksigen.
Oksidasi pada sitokrom P-450 sangat
memegang
peranan
penting
dalam
biotransformasi xenobiotika. Sitokrom P-450
adalah hemoprotein dengan suatu kharakter
puncak absorpsi dari bentuk terreduksi COkompleknya pada panjang gelombang 450 nm.
Enzim sitokrom P-450 terletak di retikulum
endoplasmik dari beberapa jaringan. Sistem
enzim yang mengkatalisis reaksi ini dikenal
dengan mikrosomal oksidasi fungsi campur
(microsomal mixed-function oxidase, MFO).
Reaksi oksidase multi level ini digambarkan
secara skematis pada gambar 3.4.
R-OH
Fe3+
Fe3+
.
R
IOI
H2O
RH
R-H
F e 3+
OH
F e 3+
NADPH +
H+
NADPH + H+
RH
Fp
CYP b5
e
e
Fe 2+
RH
+ 2 H*
Fe3+
O22RH
Fe3+
Fe2+
O2-
O2
RH
RH
O2
Gambar 3.4. Sistem Sitokrom P-450
Substrat R-H tertempel pada Sitokrom (CYP),
dengan itu CYP-450 reduktase teraktivasi dan
satu elektron diserahkan pada CYP-450. CYP450 tereduksi dapat menerima satu melekul O2
dan oksigen mendapat satu elektron dari CYP450. Komplek CYP-450, O2 dan R-H akan
terpecah dengan memberikan oksigen pada
Fase Kerja Toksik
substrat (R-H) menjadi R-OH begitu juga
oksidasi CYP-450Fe3+ .
Substrat xenobiotika bereaksi dengan bentuk
teroksidasi CYP-450Fe3+ membentuk komplek
enzim-subtrat. Sitokrom P-450 reduktase
mendapatkan satu elektron dari NADPH, yang
akan mereduksi komplek dari CYP-450Fe3+—
xenobiotika. Bentuk reduksi dari komplek CYP450Fe2+—xenobiotika bereaksi dengan molekul
oksigen dan kemudian mendapatkan elektron
yang ke dua dari NADPH, yang diperoleh dari
flavoprotein reduktase yang sama, membentuk
species oksigen terakivasi. Langkah terakhir
satu atom oksigen terlepas sebagai H2O dan
atom oksigen yang lain ditransfer ke dalam
substrat dan bentuk teroksidasi CYP-450Fe3+
terregenerasi.
Sistem enzim CYP-450 monooksigenase
mengkata-lisis reaksi seperti berikut (I:
inaktivasi efek toksik, A: aktivasi efek toksik) :
1. Hidroksilasi dari rantai karbon dan alkilen:
R-CH2-CH2-CH3 → R-CH2-CH2-CH2-OH atau RCH2-CHOH-CH3
contoh:
I : Butan → Butanol
Etilbenzol → Fentilbenzol
Tetrahidrokanabinol (THC) → 11-OH-THC
A: Hexan → 2,6-Hexandiol (→ Hexandion)
2. Hidroksilasi dari aromatik menjadi fenol
I: Fenitoin → Hidroksifenition
3. Hidroksilasi alkilamin
I: Imipramin → Desimipramin
Diazepam → Nordiazepam
Lidokain → Monoetilglisinsilidid
Cocain → Norcocain
A: Dimetilnitroamin → Metilnitrosoamin
4. Hidroksilasi dari alkileter, alkiltiol
R-CH2O(S)-CH3 → R-CH2(s)OH + HCHO
I : Papaverin → O-Desmetilpapaverin
A: Kodein → Morphin
5. Epoksidasi dari alifatis atau aromatis rantai
ganda
O
RCH=CHR
RHC
CHR
O
I : Karbamazepin → Karbamazepinepoksid
A:Trikloretilen → [Trikloretilenepoksid]
Benzo(a)piren-7,8-dihidridiol
→
Bezo(a)piren-7,8-dihidrodiol-9,10-epoksid
26
6. Oksidatif desaminasi
RCH(CH3)-NH2 → RCHOH(CH3)-NH2 → RCOCH3 + NH3
Tabel 3.4: Bentuk-bentuk
spesifisitas substratnya*
CYP-450
Substrat
7. Oksidatif desulfurasi
(R-O)3P=S → (R-O)3P=O
A: Paration → Paraokson
CYP1A1
CYP1A2
8. Oksidasif dehalogenasi
RCH2X → RCHXOH → RCHO + HX
I: Benzilklorid → Benzaldehid
Lindan → Triklorfenol
9. S-oksidatif membentuk sulfoksida dan
sulfona
R1-CH2-S-CH2-R2 → R1-CH2-SO-CH2-R2 → R1CH2-SO2-CH2-R2
I : Fenotiasin → Solfoksid → Sulfon
A: Temefos → Temefos-S-oksid
10. N-oksidatif membentuk N-oksida atau
Hidroksil-amin
(R)3N → (R)2N-OH
I : Amitriptilin → Amitriptilin-N-oksid
A: Naftilamin → Naftilaminhidroksilamin
11. Alkohol: Oksidatif membentuk aldehid
Sekarang ini telah dilaporkan 4 keluarga gen
dari CYP-450-isoenzim (CYP1, CYP2, CYP3 dan
CYP4), yang terdiri dari 16 subfamili
(SCHMOLD 2003). Sistem standard untuk
mengelompokan keluarga CYP-450 multigen
adalah berdasarkan kesamaan sequensi dari
individual proteinnya. Apabila lebih dari 40%
asam amino yang teridentifikasi memiliki
kesaman sequen maka akan dikelompokkan ke
dalam satu keluarga gen CYP-450. Satu
keluarga gen CYP-450 dibagi pula menjadi
beberapa sub keluarga, apabila dalam satu
famili mempunyai kesamaan lebih dari 55%
sequensi maka akan dikelompokkan ke dalam
satu subfamili. Tabel 1 memberikan kelompok
CYP-450
insoenzim
dan
kespesifisitas
subtratnya.
Aktifitas dari CYP-450-isoenzim ini kadang
dapat dipisahkan, namun terdapat beberapa
famili yang aktivitasnya tumpang tindih.
Perbedaan ini mempunyai pengaruh yang
sangat relevan terhadap kenetik, inaktivasi atau
bioaktivasi dari substrat. Isoenzim CYP2D6
bertanggungjawab pada rekasi N- dan Odealkilasi, telah dilaporkan pada kelompok
populasi tertentu diketemukan ganganguan
dalam polimorfismus dari isoenzim ini.
Sehingga terdapat perbedaan kinetik N- atau Odealkilasi pada sekelompok populasi tersebut.
Fase Kerja Toksik
CYP2A1
CYP2A2
CYP2A6
CYP2B1
CYP2B2
CYP2C
CYP2C9
CYP2D6
CYP2E1
CYP3A
CYP3A4
CYP3A2
CYP4A1
CYP4A2
CYP-450
dan
PAH, arilamin, fenacetin, kafein,
benzo(a)piren, aflatoksin B,
heterisiklik amin
7a-testosteron
15a-testosteron
Dietilnitrosamin
Resorufin
Cocain
Etotoin, heksobarbital, metosuksimid
Naproksen
Debrisoquin, spartain, kodein,
propanolol
Umumnya senyawa bermolekul kecil,
etanol, benzol, stirol, CCl4, dll
Eritromizin, midazolam
Nefedifin, etiletradiol, progesteron,
aflatoksin, dan banyak lagi substrat
yang lain
Fluokinolon
Asam-asam lemak
* dikutip dari SCHMOLD (2003)
Sekitar 5% penduduk asia memiliki kelainan
genetik polimufismus CYP2D6, sehingga pada
kelompok populasi ini kodein terjadi hambatan
dalam N-demetilasi menjadi morfin.
Flavinmonooksigenase. Disamping oksidatif
yang dikatalisis oleh CYP-450 terdapat juga
oksidatif yang tidak tergatung pada CYP-450,
yaitu sistem enzim flavonmonooksigenase.
Sistem enzim ini merubah amin sekunder
menjadi hidroksilamin dan amin tersier menjadi
N-oksida.
Sistem enzim oksidatif lainnya. Sistem enzim
oksidatif selain dua sistim di atas adalah:
- Alkoholdehidrogenase,
khususnya
mendehidrasi etanol menjadi aldehid.
- Aldehid oksidase, merubah aldehid menjadi
asam karboksilat
- Monoaminoksidase, mengoksidasi aminbiogen (seperti: Catekolamin)
b. Reaksi reduksi
Dibandingkan dengan reaksi oksidasi, rekasi
reduksi mempunyai peran minor dalam
biotransformasi. Gugus karbonil melalui
alkoholdehidrogenase atau citoplasmik aldoketo-reduktase direduksi menjadi alkohol.
Pemutusan ikatan azo menjadi amin primer
melalui pembentukan hidrazo melibatkan
27
banyak enzim-enzim, diantaranya: NADPH-CYP450-reduktase.
Reduktif dehalogenasi sangat beperan penting
dalam detoksifikasi dari senyawa-senyawa
alifatis halogen (Cl, Br dan I), seperti: Senyawa
karbon tetraklorida atau halotan.
c. Biohidrolisis
Banyak xenobiotika yang mengandung ikatan
jenis ester dapat dihidrolisis, diantaranya ester,
amid dan fosfat. Reaksi-reaksi biohidrolisis
yang penting adalah:
- Pemutusan ester atau amida menjadi asam
karboksilat dan alkohol (atau amin) melalui
esterase atau amidase.
- Perubahan epoksida menjadi vicinalen diol
melalui enzim epoksidihidratase
- Hidrolisis dari acetylen (glikosida) melalui
enzim glikosidase.
Ester atau amida dihidrolisis oleh enzim yang
sama, namun pemutusan ester jauh lebih cepat
dari pada amida. Enzim-einzim ini berada di
intra- dan juga extra selular, baik dalam
keadaan terikat dengan mikrosomal maupun
terlarut.
Enzim hidrolitik terdapat juga di saluran
pencernaan.
Enzim-einzim
ini
akan
menghidrolisis metabolit fase II (bentuk
konjugat
menjadi
bentuk
bebasnya).
Selanjutnya bentuk bebas ini dapat kembali
terabsorpsi menuju sistem peredaran darah.
Proses ini dikenal dengan siklus enterohepatik.
3.6.2. Reaksi fase II
Reaksi fase II melibatkan beberapa jenis
metabolit endogen yang mungkin membentuk
konjugat
dengan
xenobiotika
atau
metabolitnya.
Pembentukan
konjugat
memerlukan adanya pusat-pusat reaktif dari
substrat, biasanya gugus -OH, -NH2 dan COOH. Reaksi-reaksi penting pada fase II
adalah kunjugasi dengan :
- teraktivasi asam glukuronat,
- teraktivasi sulfat,
- asam amino (khususnya glisin),
- oligopeptida dan ikatan dengan turunan
asam merkapturat,
- teraktivasi asam asetat,
- metilasi.
Hasil reaksi konjugasi bersifat sangat polar,
sehingga sangat cepat tereksresi melalui ginjal
Fase Kerja Toksik
bersama urin dan / atau melalui empedu
menuju saluran cerna. Pada umumnya melalui
reaksi fase II, xenobitika atau metabolit fase I
mengalami deaktivasi. Namun belakangan ini
telah dilaporkan beberapa metabolit fase II
justru mengalami aktivasi, seperti morfin-6glukuronida mempunyai aktivitas antianalgesik
yang lebih poten dari pada morfin.
a. Glukuronidasi.
Glukuronid adalah jenis konjugasi yang paling
umum dan penting. Glukuronidasi dari gugus
alkohol atau fenol adalah reaksi konjugasi yang
paling sering pada reaksi fase II, disamping itu
juga asam-asam karboksilat, senyawa sulfidril
dan senyawa amin. Kosubstrat dari reaksi ini
adalah Asam-uridin-5’-difosfo-α-D-glukuronat
(UDPGA). Enzim yang mengkatalisi reaksi
konjugasi
ini
adalah
UDP-glukuroniltransferase (UGT). Enzim ini terikat di retikulum
endoplasmik dan terdapat sebagian besar di
bagian sisi-luminal dari hati atau organ lainnya.
Enzim ini dikelompokkan ke dalam dua famili,
yaitu UGT1 dan UGT2 (FICHTL 1998).
Glukuronat juga mengkonjugasi senyawa
endogen, seperti bilirubin, konjugasi ini
dikatalis oleh UGT1*1. Enzim UGT dilain hal
agak kurang spesifik, namun ada dari
subfamilinya yang mempunyai spesifisitas
yang tinggi. UGT2B7 adalah enzim yang
mengkalisis konjugasi morfin menuju morfin-3glukuronid dan morfin-6-glukuronid dengan
perbandingan residu yang berbeda (COFFMAN
et al. 1996). UGT2B7 agak kurang spesifik
dibandingkan
dengan
UGT1A1
hanya
mengkatalisis morfin menuju morphin-3glukuronid (COFFMANN et al. 1998).
b. Konjugasi Sulfat.
Reaksi ini dikatalisis oleh sulfotranferase, yang
diketemukan dalam fraksi sitosolik jaringan
hati, ginjal dan usus. Koenzimnya adalah PAPS
(3’-fosfoadenosin-5’-fosfosulfat). Konjugasi ini
adalah untuk gugus fungsional: fenol, alkohol
alifatik dan amin aromatik.
R-OH
R-NH2
PAPS
R-O-SO3H
R-NH-SO3H
Konjugasi sulfat biasanya sebagian besar
terhadap senyawa-senyawa endogen dan
relativ jarang dengan xenobiotika. Jumlah
cadangan koenzim PAPS biasanya terbatas dan
mudah habis, sehingga pada peningkatan
28
jumlah substrat konjugasi sulfat menjadi jalur
reaksi fase II yang kurang menonjol.
c. Konjugasi dengan Asam amino (glisin).
Konjugasi ini dikatalisis oleh konjugat asam
amino dan koenzim-A. Asam karboksilat
karboksilat, asam arilasetat dan asam akrilat
yang mengalami substitusi aril dapat
membentuk konjugat dengan asam amino,
terutama glisin.
d. Ikatan dengan turunan asam merkatofurat
(konjugasi glutation).
Reaksi konjugasi ini berlangsung dalam
beberapa tingkat, sebagian belangsung secara
spontan dan juga dikatalisis oleh glutation-Stransferase. Pada awalnya terbentuk konjugat
glutation-substrat
kemudian
mengalami
pemecahan enzimatik dari kedua asam amino.
Melalui asetilasi dari sistein membentuk produk
akhir berupa turunan N-asetilsistein (asam
merkaptofurat) yang mudah diekskresi.
Glutation dapat berkonjugasi dengan epoksid
yang terbentuk akibat oksidasi dari halogen
aromatik. Epoksida ini bersifat sangat
elektrofilik yang sangat reaktif. Metabolit ini
dapat bereaksi dengan unsur-unsur sel dan
menyebabkan kematian sel atau pembentukan
tomor. Konjugasi glutation akan berikatan
dengan metabolit elektrofilik, dengan demikian
akan mencegah metabolit ini berikatan dengan
sel. Dengan demikian konjugasi glutation
sangat berperanan penting dalam pencegahan
tembentukan tomor (sel kanker).
Selain itu glutation dapat berkonjugasi dengan
senyawa alifatik tak jenuh dan menggantikan
gugus nitro dalam suatu senyawa kimia.
e. Asetilasi.
Xenobiotika yang memiliki gugus amin
aromatik, yang tidak dapat dimetabolisme
secara oksidatif, biasanya akan diasetilisasi
dengan bantuan enzim N-asetil transferase dan
asetil koenzim A. Asetilasi merupakan fransfer
gugus asetil ke amin aromatik primer, hidrazin,
hidrazid, sulfoamid dan gugus amin alifatik
primer tertentu.
Acetil-CoA + RNH2
AT
CH3CONHR + HSCoA
Hasil penelitian menunjukkan bahwa
terdapat dua kelompok isoenzim N-asetil
transferase (NAT1 dan NAT2). Genotif isoenzim
NAT2 memiliki sifat plomorfismus, sehingga
Fase Kerja Toksik
mengakibatkan perbedaan laju asetilasi
(asetilasi cepat dan lambat). Hal ini dapat
memberikan makna toksikologis penting pada
populasi tertentu terhadap laju eliminasi dari
substratnya, seperti: isoniazid, hidralazin, atau
prokainamid.
f. Metilasi.
Di dalam biotransformasi, reaksi metilasi relatif
sangat jarang, karena UDPGA tersidia lebih
luas sehingga lebih mudah terbentuk
glukuronid. Reaksi ini dikatalisis oleh
metiltransferase. Koenzimnya adalah SAM (Sadenosinmetionin).
Contoh
N-metilasi
(noradrenalin, nicotinamid, metadon)
R1 C
R2 C
NH
R1C
R2C
3.6.3 Faktor-faktor yang
metabolisme xenobiotika.
NCH3
mempengaruhi
Genetik, lingkungan dan psiologik adalah
faktor-faktor yang dapat mempengaruhi reaksi
biotransformasi
(metabolisme).
Faktor
terpenting adalah genetik yang menentukan
polimorfisme dalam oksidasi dan konjugasi
dari xenobiotika, penggunaan dengan obatobatan secara bersamaan, paparan polutan
atau bahan kimia lain dari lingkungan, kondisi
kesehatan dan umur. Faktor-faktor ini diduga
bertanggungjawab
terhadap
penurunan
efisiensi biotransformasi, perpanjangan efek
farmakologi dan peningkatan toksisitas.
Induksi enzim, banyak xenobitika dapat
meningkatkan
sintesa
sistem
enzim
metabolisme (induksi), induksi sistem enzim
tertentu
dapat
meningkatkan
laju
biotransformasi senyawa tertentu. Contoh
xenobiotika yang bersifat inkduksi enzim
adalah fenobarbital. Fenobarbital dapat
meningkatkan jumlah CYP450 dan NADPHsitokrom c reduktase.
Inhibisi enzim, penghabantan sistem enzim
biotransformasi
akan
mengakibatkan
perpanjangan
efek
farmakologi
dan
meningkatnya efek toksik. Inhibisi sistem
enzim CYP2D6 oleh quinidin, secara nyata
dapat
menekan
metabolime
spartain,
debrisoquin atau kodein.
Faktor Genetik, Telah dikenal dari hasil
penelitian pengembangan dan penemuan obat
baru, bahwa variabilitas genetik berperan
penting pada reaksi metabolisme. Perbedaan
29
variabilitas ini dapat disebabkan oleh Genotipe
dari masing-masing sel, sehingga dapat
mengakibatkan kekurangan atau kelebihan
suatu sistem enzim. Pada kenyataanya
perbedaan aktivitas metabolisme ditentukan
oleh fenotipe, yang tergantung pada genotipe
dan satuan dari ekspresinya. Perbedaan
fenotipe ini mengantarkan peneliti untuk
mengelompokkan individu ke dalam populasi
pematabolit cepat ”extensive metabolizer” dan
pemetabolit lambat ”poor metabolizer”. Dalam
berbagai kasus penekanan metabolisme
melalui pengontrolan laju polimorfisasi dari
enzim dapat mengakibatkan peningkatnya efek
samping (efek toksik) pada pemetabolit lambat.
Sebagai contoh faktor genetik adalah cacat
pada
system
enzim
glukuse-6-fosfatdihidrogenase, hal ini diakibatkan oleh
kerusakan genetik dari X-kromosomal. Contoh
lainnya adalah polimorfismus dari sistem enzim
CYP2D6 yang lebih dikenal dengan
polimorfismus spartain atau debrisoquin,
polimorfismus sistem enzim CYP2C19
(polimorfismus mefenitoin dan polimorfismus
N-asetil-transferase. Hampir 10% dari orang
eropah
memiliki
gangguan
dalam
polimorfismus sistem enzim CYP2D6, yang
mengakibatkan lambatnya metabolisme dari
spartain, debrisoquin, kodein.
Penyakit, Hati adalah organ utama yang
bertanggungjawab
pada
reaksi
biotransfromasi. Penyakit hepatitis akut atau
kronis, sirosis hati dan nekrosis hati secara
signifikan dapat menurunkan laju metabolisme
xenobiotika. Pada sakit hati terjadi penurunan
sintesa sistem enzim dan penurunan laju aliran
darah melalui hati. Senyawa yang memiliki
clearance hati (eliminasi persatuan volume)
yang tinggi, penurunan laju aliran darah di hati
secara signifikan akan menurunkan laju
metabolismenya. Dilain hal senyawa-senyawa
dengan clearan hati rendah, penurunan laju
metabolisme pada kasus ini lebih ditentukan
oleh penurunan aktivitas enzim metabolisme.
Umur, pada bayi telah dikenal, kalau sistem
einzim biotranformasi belum sempurna
terbentuk. Pada bayi yang baru lahir (fetus)
sistem enzim-enzim, yang terpenting (seperti:
CYP-450, glukoronil-trensferase dan Acetiltransferase) belum berkembang dengan
sempurna. Pada tahun pertama sistem enzim
ini berkembang lebih sempurna, dan pada
Fase Kerja Toksik
tahun ke lima fungsi sistem enzim
biotransformasi telah mendekati sempurna
seperti pada orang dewasa. Namun pada orang
lanjut usia terjadi degradasi fungsi organ, hal
ini juga mengakibatkan penurunan laju
metabolisme.
Faktor lingkungan. Pengaruh faktor fisik dan
faktor sosial dalam biotransformasi masih
sanga sedikit diketemukan di literatur. Namun
faktor-faktor ini sering didiskusikan sebagai
salah satu faktor, yang dapat berpengaruh
pada laju metabolisme.
Bahan Bacaan:
1. BENET, L.Z., KROETZ D.L. and SHEINER
L.B., (1996), “Pharmacokinetics The
dynamics of drug absorption, distribution,
and elimination”, in HARDMAN J.G.,
GOODMAN GILMAN A.., LIMBIRD L.E.,
“Goodman & Gilman’s The Pharmacological
Basis of Therapeutics”, 9th edn, McGrawHill, New York p. 3-27.
2. COFFMAN, B.L., KING, C.D., RIOS, G.R. und
TEPHLY, T.R. (1998),”The Glucuronidation
of opioids, other xenobiotics and androgens
by human UGT2B7Y (268) and UGT2B7H
(268)”, Drug Metab. Dispos., 26: 73-77
3. COFFMAN, B.L., RIOS, G.R. und TEPHLY
T.R. (1996),” Purification and properties of
two rat liver phenobarbital-inducible UDPglucuronosyltransferases that catalyze the
glucuronidation of opioids”, Drug Metab.
Dispos., 24: 329-333
4. FICHTL B et al. , Allgemeine Pharmakologie
und Toxikologie, in FORTH W et al. (Ed)
Allgemeine und Spezielle Pharmakologie
und Toxikologie 7. ed, Spektrum
Akademiker Verlag, Berlin 1998, S. 3- 102.
5. LU, F.C. (1995), “Toksikologi dasar, asas,
organ sasaran, dan penilaian resiko”, UIPress, Jakarta.
6. MUTSCHLER E. Und SCHÄFER-KORTING M.
(1997) “Arzneimittel-Wirkungen Lehrbuch
der Pharmakologie und Toksikologie”
Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft mbH,
Stuttgart.
7. SCHMOLD A. (2003), “Wirkungsbedingunen
von Giften“, in MADEA, B. und BRINKMANN
B., “Handbuch gerichtliche Medizin, Band
2.“, Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, New
York. S. 14-30
30
BAB IV
ANALISIS TOKSIKOLOGI FORENSIK
4.1. Pendahuluan
Toksikologi forensik adalah salah satu dari
cabang ilmu forensik. Menurut Saferstein yang
dimaksud dengan Forensic Science adalah ”the
application of science to low”, maka secara
umum ilmu forensik (forensik sain) dapat
dimengerti sebagai aplikasi atau pemanfaatan
ilmu pengetahuan tertentu untuk penegakan
hukum dan peradilan.
Guna lebih memahami pengertian dan ruang
lingkup kerja toksikologi forensik, maka akan
lebih baik sebelumnya jika lebih mengenal apa
itu bidang ilmu toksikologi. Ilmu toksikologi
adalah ilmu yang menelaah tentang kerja dan
efek berbahaya zat kimia atau racun terhadap
mekanisme biologis suatu organisme. Racun
adalah senyawa yang berpotensi memberikan
efek yang berbahaya terhadap organisme. Sifat
racun dari suatu senyawa ditentukan oleh:
dosis, konsentrasi racun di reseptor, sifat fisiko
kimis toksikan tersebut, kondisi bioorganisme
atau sistem bioorganisme, paparan terhadap
organisme dan bentuk efek yang ditimbulkan.
Tosikologi forensik menekunkan diri pada
aplikasi atau pemanfaatan ilmu toksikologi
untuk kepentingan peradilan. Kerja utama dari
toksikologi forensik adalah melakukan analisis
kualitatif maupun kuantitatif dari racun dari
bukti fisik dan menerjemahkan temuan
analisisnya ke dalam ungkapan apakah ada
atau tidaknya racun yang terlibat dalam tindak
kriminal, yang dituduhkan, sebagai bukti dalam
tindak kriminal (forensik) di pengadilan. Hasil
analisis dan interpretasi temuan analisisnya ini
akan dimuat ke dalam suatu laporan yang
sesuai dengan hukum dan perundanganundangan. Menurut Hukum Acara Pidana
(KUHAP), laporan ini dapat disebut dengan
Surat Keterangan Ahli atau Surat Keterangan.
Jadi toksikologi forensik dapat dimengerti
sebagai pemanfaatan ilmu tosikologi untuk
keperluan penegakan hukum dan peradilan.
Toksikologi forensik merupakan ilmu terapan
yang dalam praktisnya sangat didukung oleh
berbagai bidang ilmu dasar lainnya, seperti
kimia analisis, biokimia, kimia instrumentasi,
farmakologi-toksikologi,
farmakokinetik,
biotransformasi.
Analisis Toksikologi Forensik
Secara umum tugas toksikolog forensik adalah
membantu penegak hukum khususnya dalam
melakukan analisis racun baik kualitatif
maupun
kuantitatif
dan
kemudian
menerjemahkan hasil analisis ke dalam suatu
laporan (surat, surat keterangan ahli atau saksi
ahli), sebagai bukti dalam tindak kriminal
(forensik) di pengadilan. Lebih jelasnya
toksikologi forensik mencangkup terapan ilmu
alam dalam analisis racun sebagi bukti dalam
tindak kriminal, dengan tujuan mendeteksi dan
mengidentifikasi konsentrasi dari zat racun dan
metabolitnya dari cairan biologis dan akhirnya
menginterpretasikan temuan analisis dalam
suatu
argumentasi
tentang
penyebab
keracunan dari suatu kasus. Menurut
masyarakat toksikologi forensik amerika
“society of forensic toxicologist, inc. SOFT”
bidang kerja toksikologi forensik meliputi:
- analisis dan mengevaluasi racun penyebab
kematian,
- analisis ada/tidaknya alkohol, obat terlarang
di dalam cairan tubuh atau napas, yang dapat
mengakibatkan
perubahan
prilaku
(menurunnya kemampuan mengendarai
kendaraan bermotor di jalan raya, tindak
kekerasan dan kejahatan, penggunaan
dooping),
- analisis obat terlarang di darah dan urin pada
kasus
penyalahgunaan
narkotika,
psikotropika dan obat terlarang lainnya.
Tujuan lain dari analisis toksikologi forensik
adalah membuat suatu rekaan rekostruksi
suatu peristiwa yang terjadi, sampai sejauh
mana obat atau racun tersebut dapat
mengakibatkan
perubahan
prilaku
(menurunnya kemampuan mengendarai, yang
dapat mengakibatkan kecelakaan yang fatal,
atau tindak kekerasan dan kejahatan).
4.2 Bilamana
toksikologik
memerlukan
pemeriksaan
Dalam tabel berikut ini digambarkan kasuskasus yang umumnya di negara maju
memerlukan pemeriksaan toksikologi forensik.
Kasus-kasus tersebut dapat dikelompokkan ke
dalam tiga kelompok besar yaitu:
a) kematian akibat keracunan, yang meliputi:
kematian mendadak, kematian di penjara,
kematian pada kebakaran, dan kematian
31
medis yang disebabkan oleh efek samping
obat atau kesalahan penanganan medis,
b) kecelakaan fatal maupun tidak fatal, yang
dapat mengancam keselamatan nyawa
sendiri ataupun orang lain, yang umumnya
diakibatkan oleh pengaruh obat-obatan,
alkohol, atau pun narkoba,
c) penyalahgunaan narkoba dan kasus-kasus
keracunan yang terkait dengan akibat
pemakaian obat, makanan, kosmetika, alat
kesehatan, dan bahan berbahaya lainnya,
yang tidak memenuhi standar kesehatan
(kasus-kasus forensik farmasi).
Dari sekian contoh kasus-kasus yang perlu
dilakukan pemeriksaan toksikologik, lalu timbul
pertanyaan: Siapa yang memutuskan untuk
melakukan pemeriksaan tersebut dan siapa yang
berkompeten untuk melakukan pemeriksaan
tersebut? Sudah barang tentu yang memutuskan
untuk melakukan adalah tim penyidik dan yang
melakukan adalah seorang yang berkompeten
yaitu “toksikolog forensik”. Lalu dimana lembaga
toksikolog forensik tersebut di negara kita?
Tabel 4.1. Kasus-kasus toksikologi forensik yang melibatkan
Jenis Kasus
Pertanyaan yang muncul
Kematian yang tidak wajar
(mendadak)
Apakah ada keterlibatan obat atau
racun sebagai penyebab kematiannya?
Kematian di penjara
Kecelakaan, pembunuhan yang
melibatkan racun atau obat terlarang?
Kematian pada kebakaran
Apakah ada unsur penghilangan jejak
pembunuhan?
Apa penyebab kematian: CO, racun,
kecelakaan, atau pembunuhan?
Berapa konsentrasi dari obat dan
metabolitnya?
Apakah ada interaksi obat?
Apakah pengobatannya tepat?
Kesalahan terapi?
Kematian atau timbulnya efek
samping obat berbahaya
akibat salah pengobatan
Kematian yang tidak wajar di
rumah sakit
Kecelakaan yang fatal di
tempat kerja, sakit akibat
tempat kerja, pemecatan
Apakah ada keterlibatan racun, alkohol,
atau obat-obatan?
Apakah kematian akibat ”human eror”?
Apakah sakit tsb diakibatkan oleh
senyawa kimia di tempat
kerja?Pemecatan akibat terlibat
penyalahgunaan Narkoba?
Meyebabkan kematian?
Adakah keterlibatan alkohol, obatobatan atau Narkoba?
Kecelakaan, atau pembunuhan?
Apakah kesalahan pengemudi?
Mengemudi dibawah pengaruh obatobatan atau Narkoba?
Kecelakan fatal dalam
menyemudi
Kecelakaan tidak fatal atau
mengemudi dibawah
pengaruh obat-obatan
Penyalahgunaan Narkoba
Penyalahgunaan atau pasient yang
sedang mengalami terapi rehabilitasi
narkoba
Identifikasi bentuk sediaan, kandungan
sediaan obat, penggunaan obat palsu.
Litigasi
Kriminal: Pembunuhan
Sipil: klaim tanggungan asuransi,
tuntunan kepada fabrik farmasi atau kimia
Kriminal: pembunuhan
Sipil: gugatan tanggungan dan
konpensasi terhadap pemerintah
Kriminal: pembunuhan
Sipil: klaim tanggungan asuransi
Malpraktek kedokteran, gugatan terhadap
fabrik farmasi
Klaim Malpraktek, tindak kriminal,
pemeriksaan oleh komite ikatan profesi
kedokteran (”IDI”)
Gugatan terhadap ”employer”,
Memperkerjakan kembali
Kriminal: Pembunuhan, kecelakaan
bermotor
Sipil: klaim gugatan asuransi
Kriminal: Larangan Mengemudi dibawah
pengaruh Obat-obatan atau Narkona
Sipil: gugatan pencabutan atau
pengangguhan SIM
Kriminal:
Sipil: rehabilitasi
Farmaseutikal dan Obat
Kriminal: pengedaran obat ilegal.
palsu, atau tidak memenuhi
Sipil: tuntutan penggunan obat palsu
syarat standar ”Forensik
terhadap dokter atau yang terkait
Farmasi”
Sumber: Finkle, B.S., (1982), Progress in Forensic Toxicology: Beyond Analytical Chemistry, J. Anal. Tox. (6):
57-61
4.3.
Langkah-langkah
forensik
analisis
Analisis Toksikologi Forensik
toksikologi
Secara umum tugas analisis toksikolog
forensik (klinik) dalam melakukan analisis
32
dapat dikelompokkan ke dalam tiga tahap yaitu:
1) penyiapan sampel “sample preparation”, 2)
analisis meliputi uji penapisan “screening test”
atau dikenal juga dengan “general unknown
test” dan uji konfirmasi yang meliputi uji
identifikasi dan kuantifikasi, 3) langkah terakhir
adalah interpretasi temuan analisis dan
penulisan laporan analisis.
Berbeda dengan kimia analisis lainnya (seperti:
analisis senyawa obat dan makanan, analisis
kimia klinis) pada analisis toksikologi forensik
pada umumnya analit (racun) yang menjadi
target analisis, tidak diketahui dengan pasti
sebelum dilakukan analisis. Tidak sering hal ini
menjadi hambatan dalam penyelenggaraan
analisis toksikologi forensik, karena seperti
diketahui saat ini terdapat ribuan atau bahkan
jutaan senyawa kimia yang mungkin menjadi
target analisis. Untuk mempersempit peluang
dari target analisis, biasanya target dapat digali
dari informasi penyebab kasus forensik
(keracunan, kematian tidak wajar akibat
keracunan,
tindak
kekerasan
dibawah
pengaruh obat-obatan), yang dapat diperoleh
dari laporan pemeriksaan di tempat kejadian
perkara (TKP), atau dari berita acara penyidikan
oleh polisi penyidik.
Sangat sering dalam analisis toksikologi
forensik tidak diketemukan senyawa induk,
melainkan metabolitnya. Sehingga dalam
melakukan analisis toksikologi forensik,
senyawa matabolit juga merupakan target
analisis.
Sampel dari toksikologi forensik pada
umumnya adalah spesimen biologi seperti:
cairan biologis (darah, urin, air ludah), jaringan
biologis atau organ tubuh. Preparasi sampel
adalah salah satu faktor penentu keberhasilan
analisis toksikologi forensik disamping
kehadalan penguasaan metode analisis
instrumentasi. Berbeda dengan analisis kimia
lainnya, hasil indentifikasi dan kuantifikasi dari
analit bukan merupakan tujuan akhir dari
analisis
toksikologi
forensik.
Seorang
toksikolog forensik dituntut harus mampu
menerjemahkan apakah analit (toksikan) yang
diketemukan dengan kadar tertentu dapat
dikatakan sebagai penyebab keracunan (pada
kasus kematian).
4.3.1. Penyiapan Sampel
Analisis Toksikologi Forensik
Spesimen untuk analisis toksikologi forensik
biasanya diterok oleh dokter, misalnya pada
kasus kematian tidak wajar spesimen
dikumpulkan oleh dokter forensik pada saat
melakukan otopsi. Spesimen dapat berupa
cairan biologis, jaringan, organ tubuh. Dalam
pengumpulan spesimen dokter forensik
memberikan label pada masing-masing
bungkus/wadah dan menyegelnya. Label
seharusnya dilengkapi dengan informasi:
nomer indentitas, nama korban, tanggal/waktu
otopsi, nama spesimen beserta jumlahnya.
Pengiriman dan penyerahan spesimen harus
dilengkapi dengan surat berita acara menyeran
spesimen, yang ditandatangani oleh dokter
forensik. Toksikolog forensik yang menerima
spesimen kemudian memberikan dokter
forensik surat tanda terima, kemudian
menyimpan sampel/spesimen dalam lemari
pendingin “freezer” dan menguncinya sampai
analisis dilakukan. Prosedur ini dilakukan
bertujuan
untuk
memberikan
rantai
perlindungan/pengamanan spesimen (chain of
custody).
Beberapa hal yang perlu diperhitungkan dalam
tahapan penyiapan sampel adalah: jenis dan
sifat biologis spesimen, fisikokimia dari
spesimen, serta tujuan analisis. Dengan
demikian akan dapat merancang atau memilih
metode penanganan sampel, jumlah sampel
yang akan digunakan, serta memilih metode
analisis yang tepat. Penanganan sampel perlu
mendapat perhatian khusus, karena sebagian
besar sampel adalah materi biologis, sehingga
sedapat mungkin mencegah terjadinya
penguraian dari analit.
Pemilihan metode ekstraksi ditentukan juga
oleh analisis yang akan dilakukan, misal pada
uji penapisan sering dilakukan ekstraksi satu
tahap, dimana pada tahap ini diharapkan
semua analit dapat terekstraksi. Bahkan pada
uji
penapisan
menggunakan
teknik
“immunoassay” sampel tidak perlu diekstraksi
dengan pelarut tertentu.
Sampel urin pada umumnya dapat langsung
dilakukan uji penapisan dengan menggunakan
teknik immunoassay. Namun tidak jarang harus
mendapatkan
perlakuan
awal,
seperti
pengaturan pH dan sentrifuga, guna
menghilangkan kekeruhan. Pemisahan sel
darah dan serum sangat diperlukan pada
persiapan sebelum dilakukan uji penapisan
33
pada darah. Serum pada umumnya dapat
langsung
dilakukan
uji
penapisan
menggunakan teknik immunoassay. Tidak
jarang sampel darah, yang diterima sudah
mengalami hemolisis atau menggupal, dalam
hal ini darah dilarutkan dengan metanol, dan
kemudian disentrifuga, sepernatannya dapat
langsung
dilakukan
uji
penapisan
menggunakan teknik immunoassay.
Ekstraksi satu tahap sangat diperlukan apabila
uji penapisan tidak menggunakan teknik
immunoassay,
misal
menggunakan
kromatografi lapis tipis dengan reaksi
penampak bercak tertentu. Atau juga ekstraksi
bertingkat “metode Stas-Otto-Gang” untuk
melalukan pemisahan analit berdasarkan sifat
asam-basanya.
Metode ekstraksi dapat berupa ekstraksi caircair, menggunakan dua pelarut yang terpisah,
atau ekstraksi cair-padat. Prinsip dasar dari
pemisahan ekstraksi cair-cair berdasarkan
koefisien partisi dari analit pada kedua pelarut
atau berdasarkan kelarutan analit pada kedua
pelarut tersebut. Pada ekstraksi cair-padat
analit dilewatkan pada kolom yang berisi
adsorben fase padat (SPE, Si-Gel C-18,
Extrelut®, Bund Elut Certify®, dll), kemudian
dielusi dengan pelarut tertentu, biasanya diikuti
dengan modifikasi pH pelarut.
Penyiapan sampel yang baik sangat diperlukan
pada uji pemastian “identifikasi dan
kuantifikasi”,
terutama
pada
teknik
kromatografi. Karena pada umumnya materi
biologik merupakan materik yang komplek,
yang terdiri dari berbagai campuran baik
senyawa endogen maupun senyawa eksogen
“xenobiotika”. Penyiapan sampel umumnya
meliputi hidrolisis, ekstraski, dan pemurnian
analit. Prosedur ini haruslah mempunyai
efesiensi dan selektifitas yang tinggi.
Perolehan kembali yang tinggi pada ekstraksi
adalah sangat penting untuk menyari semua
analit, sedangkan selektifitas yang tinggi
diperlukan untuk menjamin pengotor atau
senyawa penggangu terpisahkan dari analit.
Pada analisis menggunakan GC/MS, penyiapan
sampel termasuk derivatisasi analit secara
kimia, seperi salilisasi, metilisasi, dll.
Derivatisasi ini pada umumnya bertujuan untuk
meningkatkan
volatilitas
analit
atau
meningkatkan kepekaan analisis.
Analisis Toksikologi Forensik
4.3.2. Uji Penapisan “Screening test”
Uji penapisan untuk menapis dan mengenali
golongan senyawa (analit) dalam sampel. Disini
analit digolongkan berdasarkan baik sifat
fisikokimia, sifat kimia maupun efek
farmakologi yang ditimbulkan. Obat narkotika
dan psikotropika secara umum dalam uji
penapisan dikelompokkan menjadi golongan
opiat, kokain, kannabinoid, turunan amfetamin,
turunan benzodiazepin, golongan senyawa anti
dipresan tri-siklik, turunan asam barbiturat,
turunan
metadon.
Pengelompokan
ini
berdasarkan struktur inti molekulnya. Sebagai
contoh, disini diambil senyawa golongan opiat,
dimana senyawa ini memiliki struktur dasar
morfin, beberapa senyawa yang memiliki
struktur dasar morfin seperti, heroin, monoasetil morfin, morfin, morfin-3-glukuronida,
morfin-6-glukuronida, asetilkodein, kodein,
kodein-6-glukuronida, dihidrokodein serta
metabolitnya, serta senyawa turunan opiat
lainnya yang mempunyai inti morfin.
Uji
penapisan
seharusnya
dapat
mengidentifikasi golongan analit dengan
derajat reabilitas dan sensitifitas yang tinggi,
relatif murah dan pelaksanaannya relatif cepat.
Terdapat teknik uji penapisan yaitu: a)
kromatografi
lapis
tipis
(KLT)
yang
dikombinasikan dengan reaksi warna, b) teknik
immunoassay. Teknik immunoassay umumnya
memiliki sifat reabilitas dan sensitifitas yang
tinggi, serta dalam pengerjaannya memerlukan
waktu yang relatif singkat, namun alat dan
bahan dari teknik ini semuanya harus diimpor,
sehingga teknik ini menjadi relatif tidak murah.
Dibandingkan dengan immunoassay,
KLT
relatif
lebih
murah,
namun
dalam
pengerjaannya memerlukan waktu yang relatif
lebih lama.
a) teknik immunoassay
Teknik immunoassay adalah teknik yang
sangat umum digunakan dalam analisis obat
terlarang dalam materi biologi. Teknik ini
menggunakan “anti-drug antibody” untuk
mengidentifikasi obat dan metabolitnya di
dalam sampel (materi biologik). Jika di dalam
matrik terdapat obat dan metabolitnya (antigentarget) maka dia akan berikatan dengan “antidrug antibody”, namun jika tidak ada antigentarget maka “anti-drug antibody” akan
berikatan dengan “antigen-penanda”. Terdapat
berbagai metode / teknik untuk mendeteksi
34
ikatan antigen-antibodi ini, seperti “enzyme
linked immunoassay” (ELISA), enzyme
multiplied immunoassay technique (EMIT),
fluorescence polarization immunoassay (FPIA),
cloned enzyme-donor immunoassay (CEDIA),
dan radio immunoassay (RIA).
Pemilihan teknik ini sangat tergantung pada
beban kerja (jumlah sampel per-hari) yang
ditangani oleh laboratorium toksikologi. Misal
dipasaran teknik ELISA atau EMIT terdapat
dalam bentuk single test maupun multi test.
Untuk laboratorium toksikologi dengan beban
kerja yang kecil pemilihan teknik single test
immunoassay akan lebih tepat ketimbang
teknik multi test, namun biaya analisa akan
menjadi lebih mahal.
Hasil dari immunoassay test ini dapat dijadikan
sebagai bahan pertimbangan, bukan untuk
menarik kesimpulan, karena kemungkinan
antibodi yang digunakan dapat bereaksi
dengan berbagai senyawa yang memiliki baik
bentuk struktur molekul maupun bangun yang
hampir sama. Reaksi silang ini tentunya
memberikan hasil positif palsu. Obat batuk
yang mengandung pseudoefedrin akan
memberi reaksi positif palsu terhadap test
immunoassay dari anti bodi- metamfetamin.
Oleh sebab itu hasil reaksi immunoassay
(screening test) harus dilakukan uji pemastian
(confirmatori test).
b) kromatografi lapis tipis (KLT)
KLT adalah metode analitik yang relatif murah
dan mudah pengerjaannya, namun KLT kurang
sensitif jika dibandungkan dengan teknik
immunoassay. Untuk meningkatkan sensitifitas
KLT sangat disarankan dalam analisis
toksikologi forensik, uji penapisan dengan KLT
dilakukan paling sedikit lebih dari satu sistem
pengembang dengan penampak noda yang
berbeda.
Dengan
menggunakan
spektrofotodensitometri analit yang telah
terpisah dengan KLT dapat dideteksi
spektrumnya (UV atau fluoresensi). Kombinasi
ini tentunya akan meningkatkan derajat
sensitifitas dan spesifisitas dari uji penapisan
dengan metode KLT. Secara simultan
kombinasi ini dapat digunakan untuk uji
pemastian.
4.3.3. Uji pemastian “confirmatory test”
Analisis Toksikologi Forensik
Uji ini bertujuan untuk memastikan identitas
analit dan menetapkan kadarnya. Konfirmatori
test paling sedikit sesensitif dengan uji
penapisan, namun harus lebih spesifik.
Umumnya uji pemastian menggunakan teknik
kromatografi yang dikombinasi dengan teknik
detektor lainnya, seperti: kromatografi gas spektrofotometri massa (GC-MS), kromatografi
cair kenerja tinggi (HPLC) dengan diode-array
detektor, kromatografi cair - spektrofotometri
massa (LC-MS), KLT-Spektrofotodensitometri,
dan teknik lainnya. Meningkatnya derajat
spesifisitas pada uji ini akan sangat
memungkinkan mengenali identitas analit,
sehingga dapat menentukan secara spesifik
toksikan yang ada.
Prinsip dasar uji konfirmasi dengan
menggunakan teknik CG-MS adalah analit
dipisahkan menggunakan gas kromatografi
kemudian selanjutnya dipastikan identitasnya
menggunakan teknik spektrfotometrimassa.
Sebelumnya analit diisolasi dari matrik
biologik, kemudian jika perlu diderivatisasi.
Isolat akan dilewatkan ke kolom CG, dengan
perbedaan sifat fisikokima toksikan dan
metabolitnya, maka dengan GC akan terjadi
pemisahan
toksikan
dari
senyawa
segolongannya atau metabolitnya. Pada
prisipnya pemisahan menggunakan GC, indeks
retensi dari analit yang terpisah adalah sangat
spesifik untuk senyawa tersebut, namun hal ini
belum cukup untuk tujuan analisis toksikologi
forensik. Analit yang terpisah akan memasuki
spektrofotometri massa (MS), di sini
bergantung dari metode fragmentasi pada MS,
analit akan terfragmentasi menghasilkan pola
spektrum massa yang sangat kharakteristik
untuk setiap senyawa. Pola fragmentasi
(spetrum massa) ini merupakan sidik jari
molekular dari suatu senyawa. Dengan
memadukan data indeks retensi dan spektrum
massanya, maka identitas dari analit dapat
dikenali dan dipastikan.
Dengan teknik kombinasi HPLC-diode array
detektor akan memungkinkan secara simultan
mengukur spektrum UV-Vis dari analit yang
telah dipisahkan oleh kolom HPLC. Seperti
pada metode GC-MS, dengan memadukan data
indeks retensi dan spektrum UV-Vis analit,
maka dapat mengenali identitas analit.
Disamping
melakukan
uji
indentifikasi
potensial positif analit (hasil uji penapisan),
35
pada uji ini juga dilakukan penetapan kadar
dari analit. Data analisis kuantitatif analit akan
sangat berguna bagi toksikolog forensik dalam
menginterpretasikan hasil analisis, dengan
kaitannya dalam menjawab pertanyaanpertanyaan yang muncul baik dari penyidik
maupun hakim sehubungan dengan kasus
yang terkait. Misal analisis toksikologi forensik
ditegakkan bertujuan untuk memastikan
dugaan kasus kematian akibat keracunan atau
diracuni, pertanyaan-pertanyaan yang mungkin
muncul pada kasus ini adalah:
- senyawa racun apa yang terlibat?
- berapa besar dosis yang digunakan?
- kapan paparan tersebut terjadi (kapan racun
tersebut mulai kontak dengan korban)?
- melalui jalur apa paparan tersebut terjadi
(jalur oral, injeksi, inhalasi)?
Dalam praktis analisis menggunakan teknik
GC-MS, LC-MS, atau HPLC-Diode array detektor
memerlukan biaya analisis yang relatif mahal
ketimbang
KLT-Spektrofotodensitometri.
Sehingga disarankan dalam perencanaan
pengadaan /pemilihan peralatan suatu
laboratorium
toksikologi
seharusnya
mempertimbangkan
biaya
operasional
penanganan sampel. Hal ini pada kenyataannya
sering menjadi faktor penghambat dalam
penyelenggaraan laboratorium toksikologi.
Karena pada kenyataanya telah diatur dalam
KUHAP, bahwa biaya yang ditimbulkan akibat
pemeriksaan atau penyidikan dibebankan pada
negara, namun pada kenyataanya sampai saat
negara belum mampu memikul beban tersebut.
4.4. Interpretasi temuan analisis
Temuan analisis sendiri tidak mempunyai
makna yang berarti jika tidak dijelaskan makna
dari temuan tersebut. Seorang toksikolog
forensik berkewajiban menerjemahkan temuan
tersebut berdasarkan kepakarannya ke dalam
suatu kalimat atau laporan, yang dapat
menjelaskan
atau
mampu
menjawab
pertanyaan yang muncul berkaitan dengan
permasalahan/kasus yang dituduhkan.
Berkaitan dengan analisis penyalahgunaan
obat-obatan terlarang, mengacu pada hukum
yang berlaku di Indonesia (UU no 5 th 1997
tentang spikotropika dan UU no 22 th 1997
tentang Narkotika), interpretasi temuan analisis
oleh seorang toksikolog forensik adalah
merupakan suatu keharusan (Wirasuta, 2005).
Analisis Toksikologi Forensik
Heroin menurut UU no 22 tahun 1997 termasuk
narkotika golongan I, namun metabolitnya
(morfin) masuk ke dalam narkotika golongan II.
Dilain hal kodein (narkotika golongan III) di
dalam tubuh akan sebagian termetabolisme
menjadi morfin. Namun pada kenyataannya
heroin illegal juga mengandung acetilkodein,
yang merupakan hasil asetilasi dari kodein,
sehingga dalam analisis toksikologi forensik
pada pembuktian kasus penyalahgunaan
heroin ilegal akan mungkin diketemukan morfin
dan kodein. Menurut UU narkotika ini (pasal 84
dan 85), menyatakan bahwa penyalahgunaan
narkotika golongan I, II, dan III memiliki
konsekuensi hukum yang berbeda, sehingga
interpretasi temuan analisis toksikologi
forensik, khususnya dalam kaitan menjawab
pertanyaan narkotika apa yang telah
dikonsumsi, adalah sangat mutlak dalam
penegakan hukum.
Terdapat beberapa pertanyaan yang harus
dijawab oleh toksikolog forensik dalam
melakukan analisis:
a. Senyawa apa yang terlibat dalam tindak
kriminal tersebut (senyawa apa yang
menyebabkan keracunan, menurunnya
kemampuan mengendarai kendaraan dalam
berlalulintas, atau narkoba apa yang telah
disalah gunakan)?
b. Berapa besar dosisnya?
c. Efek apa yang ditimbulkan?
d. Kapan tubuh korban terpapar oleh senyawa
tersebut?
e. Pertanyaan-pertanyaan tersebut dapat
terungkap dari hasil analisis toksikologi dan
didukung oleh penguasaan ilmu pendukung
lainnya seperti farmakologi dan toksikologi,
biotransformasi, dan farmakokinetik.
Data temuan hasil uji penapisan dapat
dijadikan petunjuk bukan untuk menarik
kesimpulan bahwa seseorang telah terpapar
atau menggunakan obat terlarang. Sedangkan
hasil uji pemastian (confirmatory test) dapat
dijadikan dasar untuk memastikan atau
menarik kesimpulan apakah sesorang telah
menggunakan obat terlarang yang dituduhkan.
Pernyataan ini terdengar sangatlah mudah,
namun pada praktisnya banyak faktor yang
mempengaruhi.
Untuk lebih jelasnya disini akan diberikan
suatu perumpamaan kasus, misal dari hasil uji
penapisan menggunakan teknik immunoassay
36
diperoleh dalam sampel darah dan urin
tertuduh memberikan reaksi positif terhadap
golongan opiat. Hasil ini tidak cukup untuk
membuktikan (menuduh) terdakwa telah
mengkonsumsi obat terlarang narkotika
golongan
opiat,
karena
obat
batuk
dekstrometrofan mungkin memberikan reaksi
positif. Dilain hal senyawa golongan opiat
terdistribusi ke dalam golongan narkotika I
sampai III, dimana menurut UU Narkotika,
penyalahgunaan golongan tersebut memiliki
konsekuen hukum yang berbeda. Metabolit
glukuronida dari morfin dan kodein tidak
dimasukkan ke dalam senyawa narkotika.
Kenyataan ini akan membuat interpretasi
toksikologi forensik, yang hanya berdasarkan
data hasil analisis uji penapisan, menjadi lebih
komplek.
Dilain hal banyak senyawa obat, dimana
metabolitnya memungkinkan memberi reaksi
positif (reaksi silang) terhadap test antiamfetamin-antibodi. Senyawa obat tersebut
antara lain: a) golongan obat bebas yang
digunakan sebagai dekongestan dan anoreksia,
seperti:
efedrin,
pseudoefedrin
dan
fenilpropanolamin; b) golongan keras (dengan
resep):
benzofetamin,
fenfluramine,
mefentermin, fenmeterzine, dan fentermine; c)
obat / senyawa obat, dimana amfetamin atau
metamfetamin sebagai metabolitnya, seperti:
etilamfetamin,
clobenzorex,
mefenorex,
dimetilamfetamin, dll (United Nation, 1995).
Pada interpretasi hasil analisis pada kasus
kematian, seorang toksikolog forensik dituntut
mampu menjawab pertanyaan spesifik seperti:
rute pemakaian toksikan, apakah konsentrasi
toksikan yang ditetapkan cukup sebagai
menyebabkan kematian atau penyebab
keracunan. Penetapan rute pemakaian
biasanya diperoleh dari analisis berbagai
spesimen, dimana pada umumnya konsentrasi
toksikan yang lebih tinggi ditemukan di daerah
rute pemakaian. Jika ditemukan toksikan dalam
jumlah besar di saluran pencernaan dan hati,
maka dapat ditarik kesimpulan bahwa paparan
melalui jalur oral. Demikian juga apabila
konsentrasi yang tinggi ditemukan di paru-paru
atau
pada
organ
viseral
lainnya
mengindikasikan paparan melalui inhalasi.
Bekas suntikan yang baru pada permukaan
tubuh (seperti telapak tangan, lengan, dll), yang
ditemukan pada kasus kematian akibat
Analisis Toksikologi Forensik
penyalahgunaan narkotika, merupakan petujuk
paparan melalui injeksi.
Ditemukannya toksikan dalam konsentrasi
yang cukup tinggi baik di saluran pencernaan
maupun di darah, dapat dijadikan cukup bukti
untuk menyatakan toksikan tersebut sebagai
penyebab kematian. Seorang toksikolog
forensik dituntut juga dapat menerangkan
absorpsi toksikan dan transportasi/distribusi
melalui sirkulasi sistemik menuju organjaringan sampai dapat menimbulkan efek yang
fatal. Interpretasi ini diturunkan dari data
konsentrasi toksikan baik di darah maupun di
jaringan-jaringan.
Hasil analisis urin biasanya kurang berarti
dalam menentukan efek toksik/psikologi dari
suatu toksikan. Secara umum hasil analisis
urin menyatakan adanya paparan toksikan
sebelum kematian. Dari jumlah volume urin dan
konstelasi jumlah toksikan dan metabolitnya di
dalam kantung kemih, dengan berdasarkan
data laju eksresi toksikan dan metabolitnya,
maka dimungkinkan untuk menurunkan
informasi lamanya waktu paparan telah terjadi
sebelum kematian (Wirasuta 2004).
Kebanyakan
efek
farmakologik/psikologi
xenobiotika berhubungan dengan tingkat
konsentrasinya di darah dan tempat kerjanya
(reseptor). Oleh sebab itu tingkat konsentrasi di
darah adalah sebagai indikator penting dalam
mencari faktor penyebab kematian/keracunan.
Dalam menginterpretasikan tingkat konsentrasi
di dalam darah dan jaringan sebaiknya
memperhatikan tingkat efek spikologis yang
sebenarnya dan semua faktor yang
berpengaruh dari setiap tingkat konsentrasi
yang diperoleh dari spesimen. Interpretasi
tingkat konsentrasi dalam darah dan jaringan
dapat dibagi menjadi tiga katagori: normal atau
terapeutik, toksik, dan lethal. Tingkat
konsentrasi normal dinyatakan sebagai
keadaan, dimana tidak menimbulkan efek
toksik pada organisme. Tingkat konsentrasi
toksik
berhubungan
dengan
gejala
membahayankan nyawa, seperti: koma, kejangkejang, kerusakan hati atau ginjal. Tingkat
konsentrasi kematian dinyatakan sebagai
konsentrasi
yang
dapat
menyebabkan
kematian. Contoh: sianida pada konsentrasi
yang tinggi (0,17-2,22 mg/l, diketemukan pada
kematian akibat keracunan sianida), dinyatakan
sebagai penyebab keracunan. Sedangkan pada
37
konsentrasi yang sangat kecil (0,004 mg/l pada
orang sehat dan 0,006 mg/l pada perokok),
sianida berperan dalam pembentukan vitamin
B12. Dalam jumlah kecil sianida juga
diabsorpsi dan dibangkitkan selama merokok.
Oleh sebab itu mendeteksi sianida di darah
pada tingkat dibawah konsentrasi toksik, masih
dapat ditolerir sebagai tanpa efek toksik.
Beberapa logam berat, seperti arsen, timbal,
dan merkuri tidak diperlukan untuk fungsi
normal tubuh. Keberadaan logam tersebut
dibawah
tingkat
konsentrasi
toksik
mengindikasikan bahwa korban telah terpapar
logam berat akibat polusi lingkungan.
Faktor-faktor yang mempengaruhi respon
individu terhadap tingkat konsentrasi toksik
(seperti: usia, jenis kelamin/status hormonal,
berat badan, status nutrisi, genetik, status
immunologi, kelainan patologik dan penyakit
bawaan, kelainan fungsi organ, sifat
farmakokinetik dari toksikan) seharusnya juga
dipertimbangkan dalam menginterpretasikan
hasil analisis, yang bertujuan mencari faktor
penyebab keracunan. Faktor lain yang juga
harus mendapat perhatian adalah fenomena
farmakologi seperti toleransi. Toleransi adalah
suatu keadaan menurunnya respon tubuh
terhadap toksikan sebagai hasil paparan yang
berulang sebelumnya, biasanya dalam waktu
yang lama. Penurunan respon dapat
diakibatkan oleh adaptasi selular pada suatu
konsentrasi toksikan, yang dapat berakibat
pada penekanan efek farmakologis yang
diinginkan. Hal ini sering dijumpai pada kasus
kematian akibat menyalahgunaan heroin,
dimanakan ditemukan tumpang tindih rentang
konsentrasi morfin di darah pada kasus “lethal
related heroine (0,010 - 2,200 µg/ml, rataan:
0,277 µg/ml)” dan “non-lethal related heroine
(0,010 -0,275 µg/ml, rataan: 0,046 µg/ml)”
(Wirasuta 2004). Konsetrasi morfin yang tinggi
mungkin tidak mengakibatkan efek toksik pada
junkis yang telah berulang memakai heroin,
sedangkan pada konsentrasi yang sama
mungkin menimbulkan efek kematian pada
orang yang baru menggunkan. Bahaya
kematian sering dijumpai pada pemakaian
dosis tinggi oleh pencadu, yang memulai
kembali menggunakan heroin setelah lama
berhenti menggunakannya, dimana dosisnya
didasarkan pengalaman pribadi saat efek
tolerasi masih timbul.
Analisis Toksikologi Forensik
Melalui pengamatan ulang riwayat kasus,
memperhatikan semua faktor toksokinetik,
toksodinamik, dan dengan membandingkan
hasil analisis dengan laporan kasus yang sama
dari beberapa pustaka atau pengalaman
sendiri, seorang ahli toksikologi membuat
interpretasi akhir dari suatu kasus.
Contoh-contoh di atas dengan jelas
memaparkan, bahwa hasil reaksi positif dengan
teknik immunoassay belum cukup bukti untuk
memastikan/menuduh
seseorang
telah
mengkonsumsi obat terlarang. Lebih lanjut
berikut ini diberikan ilustrasi kasus dan
interpretasi dari hasil analisis toksikologi
forensik yang lengkap:
Contoh: Ilustrasi kasus toksikologi forensik
(data dikutif dari kasus yang masuk ke Institut
of Legal Medicine of Goerg August University,
Göttingen, Germany):
Berdasarkan Berita Acara Pemeriksaan dari
penyidik dilaporkan telah diketemukan mayat di
kamar mandi sebuah cafe. Dilengan kanannya
masih tertancap jarum suntik. Hasil otopsi
melaporkan terdapat baik bekas suntikan yang
masih baru maupun yang sudah menua
dilengan kanan dan kiri, telapak tangan, kaki.
Terdapat udema paru-paru, dan bau aromatis
dari organ tubuh seperti saluran cerna. Dokter
spesialis Forensik menyimpulkan kematian
diduga diakibatkan oleh keracunan obatobatan.
Hasil analisis toksikologi forensik:
Uji skrining menggunakan teknin immonoassay
test (EMIT) terdeteksi positif golongan opiat
dan benzodiazepin. Dari penetapan kadar
alkohol di darah dan urin terdapat alkohol 0,1
promil dan 0,1 promil.
Pada uji konfirmasi dengan menggunakan alat
GC-MS diperoleh hasil:
- darah sebelum di hidrolisis: - morfin: 0,200
µg/ml, - kodein: 0,026 µg/ml
- darah setelah hidrolisis: - morfin: 0,665 µg/ml,
- kodein: 0,044 µg/ml
- urin sebelum hidrolisis: - 6-asetilmorfin: 0,060
µg/ml, - morfin: 0,170 µg/ml, - kodein: 0,040
µgml
- urin setelah hidrolisis : - morfin: 0,800 µg/ml, kodein: 0,170 µg/ml
Golongan benzodiazepin yang terdeteksi di
darah adalah: diazepam: 1,400 µg/ml;
nordazepam: 0,086 µg/ml; oxazepam: 0,730
µg/ml; temazepam: 0,460 µg/ml
38
Dalam menginterpretasikan hasil temuannya
seorang toksikolog forensik harus mengulas
kembali efek toksik dan farmakologi yang
ditimbulkan oleh analit, baik efek tunggal dari
opiate dan benzodiazepin maupun efek
kombinasi yang ditimbulkan dalam pemakaian
bersama antara opiat dan benzodiazepin.
Menyacu informasi konsentrasi toksik (“lethal
concentration”) dapat diduga penyebab
kematian dari korban.
Efek toksik yang ditimbulkan oleh pemakaian
heroin adalah dipresi saluran pernafasan.
Keracunan oleh heroin ditandai dengan adanya
udema paru-paru. Sedangkan pemakaian
diazepam
secara
bersamaan
akan
meningkatkan efek heroin dalam penekanan
sistem pernafasan. Hal ini akan mempercepat
kematian.
Guna mengetahui obat apa yang telah
dikonsumsi oleh korban, berdasarkan hasil
analisis dan alur metabolisme dari suatu
senyawa obat, seorang toksikolog forensik
akan merunut balik apa yang telah dikonsumsi
korban.
Di darah dan urin terdapat morfin dan kodein
baik dalam bentuk bebas maupun terikat
dengan glukuronidnya namun di urin terdeteksi
juga 6-asetilmorfin. Heroin di dalam tubuh
dalam waktu yang sangat singkat akan
termetabilisme menjadi 6-asetilmorfin, dan
kemudian membentuk morfin. Morfin akan
terkonjugasi menjadi morfin-glukuronidanya.
Dari hasil analisis seorang toksikolog forensik
sudah dapat menyimpulkan bahwa korban
telah mengkonsumsi heroin.
Di dalam tubuh diazepam akan termetabolisme
melalui
N-demitelasi
membentuk
desmitldiazepam (nordazepam) dan kemudian
akan terhidrolisis membentuk oksazepam,
sebagaian
kecil
akan
termetabolisme
membentuk temazepam. Sehingga dari temuan
analisis dapat disimpulkan korban juga telah
mengkonsumsi diazepam.
Berdasarkan data farmakokinetik dari heroin
serta metabolitnya dan juga konstelasi dari
konsentrasi morfin bebas dan terikatnya dapat
diambil duga kematian terjadi lebih kurang dari
satu sampai dua jam setelah pemakaian heroin
(perkiraan ini didasarkan atas model
farmakokinetik dari Wirasuta 2004).
Semua temuan dan hasil interpretasi ini dibuat
dalam suatu laporan (berita acara pemeriksaan)
yang akan diserahkan kembali ke polisi
Analisis Toksikologi Forensik
penyidik. Berkas berita acara pemeriksaan ini
dikenal dengan keterangan ahli.
Interpretasi akan menjadi bernar secara ilmiah
apabila didasarkan pada data analisis yang
valid, dan harus didukung oleh pemahaman
ilmu toksikologi-farmakologi, farmakokinetik,
biotransformasi yang baik. Untuk mendapatkan
data analisis yang valid/sahih, harus dilakukan
validasi terhadap semua prosedur analisis dan
mengevalusai sumber-sumber yang mungkin
memberikan
kesalahan
analisis.
Mengevaluasi/menganalisis validasi dari hasil
analisis dapat ditinjau dari tiga tingkat faktor
utama yang menentukan hasil analisis (DFG,
1990, 1995), yaitu:
1) Tataran teknis analisis yang menghasilkan
data analisis. Dalam tataran ini kesalahan
dapat diakibatkan oleh faktor metode
analisis. Untuk mendapatkan data analisis
yang valid, perlu dilakukan validasi
prosedur analisis, sesuai dengan kentuan
yang diatur secara international (misal
mengikuti ketentuan validasi prosedur
analisis yang dimuat dalam Farmakope
International, USP, AOAC, dll).
2) Tataran biologis, variansi matrik biologis
dari
sampel
memungkinkan
ikut
memberikan
sumbangan
kesalahan
terhadap hasil analisis. Terdapat tiga
langkah yang dapat dilakukan dalam
mengevaluasi data analisis dari sudut
pandang tataran biologis, yaitu: kontrol
plausibilitas, evaluasi longitudinal dan
transversal.
Kontrol plausibilitas mencangkup:
- Kontrol data ekstrim, data ini dikontrol
berdasarkan data medikal misalnya data
analisis tidak sesuai dengan data yang
telah diperoleh dari populasi manusia
atau sangat jauh menyimpang secara
statistik.
- Kontrol konstelasi yaitu membandingkan
dari berbagai data analisis, yang
diperoleh dari matrik biologis yang
berbeda tetapi seri data tersebut masih
memiliki
parameter
yang
saling
bergantungan. Misal membandingkan
data analisis toksikan dan metabolitnya
di darah dan di urin, konstelasi data
yang ditimbulkan dikontrol berdasarkan
sifat farmakokinetik dari toksikan dan
metabolitnya.
39
- Kontrol trend data: data analisis yang
diperoleh dari satu pasien (korban)
dievalusi terhadap perubahan waktu, hal
ini bertujuan untuk mengetahui sifat
perubahan biologis (misal: laju eliminasi)
yang terjadi pada pasien tersebut.
Tujuan dari krontrol plausibilitas adalah
untuk mencari kesalahan analisis, dimana
dari tataran teknik analitik tidak
teridentifikasi,
sehingga
diharapkan
diperolehnya data analsis yang sahih.
evaluasi
ini
Analisis
tongitodinal,
didasarkan terhadap sifat farmakokinetik
(toksokinetik) dan reaksi biotransformasi
dari toksikan dan metabolitnya. Data
analisis (toksikan dan metabolitnya) dari
pasien yang sama, yang diperoleh dari
selang waktu pengambilan sampel
(penerokan) yang berbeda dibandingkan
satu
sama
lainnya.
Dari
hasil
pembandingan data analisis tersebut,
dengan didasarkan sifat farmakokinetik,
maka dapat dijadikan dasar untuk
menduga/mengontrol konsentrasi aktuel
(waktu terjadinya keracunan). Lebih lanjut
data ini dapat dijadikan dasar untuk
memperkirakan waktu terjadinya eksposisi.
Analisis transversal, data analisis yang
diperoleh dari satu pasien dibandingkan
dengan kelompok kontrol. Data dari
kelompok kontrol mungkin dapat berupa
data konsentrsi toksikan/obat, yang
diambil dari interval waktu tertentu, seperti
interval waktu konsentrasi efek terapeutik,
interval konstrasi toksik atau “lethal
dosis”.
3) Tataran nosologi (ilmu pengelompokan
penyakit), kesalahan dapat ditimbulkan
akibat kesalahan dalam mendiagnose
keracunan atau mungkin muncul akibat
kesalahan menginterpretasikan temuan
patologis atau psiologis pasient (korban).
Kesalahan ini mungkin muncul karena
keracunan dapat menampakkan kelainan
patoligis.
4.5. Kesimpulan
Toksikologi forensik mencangkup terapan ilmu
alam dalam analisis racun sebagi bukti dalam
tindak kriminal, dengan tujuan mendeteksi dan
mengidentifikasi konsentrasi dari zat racun dan
bentuk metabolitnya dari dalam cairan biologi
dan akhirnya menginterpretasikan temuan
Analisis Toksikologi Forensik
analisis dalam suatu argumentasi tentang
penyebab keracunan dari suatu kasus.
Analisis toksikolog forensik (klinik) dapat
dikelompokkan ke dalam tiga tahap yaitu: 1)
penyiapan sampel, 2) Analisis meliputi uji
penapisan dan uji konfirmasi yang meliputi uji
identifikasi dan kuantifikasi, dan 3) interpretasi
temuan analisis dan penulisan laporan analisis.
Data temuan hasil uji penapisan dapat
dijadikan petunjuk bukan untuk menarik
kesimpulan bahwa seseorang telah terpapar
atau menggunakan obat terlarang. Sedangkan
hasil uji pemastian (confirmatory test) dapat
dijadikan dasar untuk memastikan atau
menarik kesimpulan apakah sesorang telah
menggunakan obat terlarang yang dituduhkan
Bahan Bacaan
1. DFG (Deutsche Forschungsgemeinschaft),
(1990),
Orientierende
Angaben
zu
therapeutischen
und
toxischen
Konzentrationen von Arzneimitteln und
Gifften in Blut, Serum, oder Urin, VCH
Verlag, Weinheim.
2. DFG (Deutsche Forschungsgemeinschaft),
(1995),
Einfache
toxikologische
Laboratoriums-untersuchungen bei akuten
Vergiftunen, VCH Verlag, Weinheim.
3. Eckert, W.G., 1980, Introduction to Forensic
sciences, The C.V. Mosby Company, St.
Louis, Missori
4. Kerrigan, S, (2004), Drug Toxicology for
Prosecutors Targeting Hardcore Impaired
Drivers, New Mexico Department of Health
Scientific Laboratory Division Toxicology
Bureau, New Mexico.
5. Madea, B. und Brinkmann B., Handbuch
gerichtliche Medizin, Band 2,, SpringerVerlag, Berlin, Heidelberg, New York
6. Moffat, Ac., Jackson, J.V., Moss, M.S. and
Widdop, B., 1986, Clark’s isolation and
indentification of drugs in pharmaceuticals,
body fluids, and post-mortem material, 2nd
Ed. The Pharmaceutical Press, London
7. Mueller B., 1975, Gerichtliche Medizin,
Springer-Verlag, Berlin
8. Saferstein R:, 1995, Criminalistics, an
Introduction to Forensic Science, 5th Ed., A
Simon & Schuster Co., Englewood Cliffs,
New Jersey.
40
9. SOFT (Society of Forensic Toxicologist,
Inc.) and AAFS (the American Academy of
Forensic Sciences, Toxicology Section),
(2002), Forensic Toxicology Laboratory
Guidelines, SOFT / AAFS.
10. United Nations, (1995) Recommended
methods for the detection and assay of
heroin,
cannabinoids,
cocaine,
amphetamine
and
ring-substituted
amphetamine derivates in biological
specimens manual for use by national
laboratories, United Nation International
Drug Control Programme, New York
11. Wirasuta I M.A.G. (2004), Untersuchung zur
Metabolisierung und Ausscheidung von
Heroin im menschlichen Körper. Ein
Beitrag
zur
Verbesserung
der
Analisis Toksikologi Forensik
Opiatbefundinterpretation, Cuvillier Verlag,
Göttingen.
12. Wirasuta, I M.A.G., (2005), Hambatan dalam
pengegakan Undang-Undang No 22 th 1997
tentang Narkotika, khususnya pada
penyalahgunaan narkotika golongan opiat
ditinjau dari sifat farmakokinetiknya, dalam
Wirasuta, I M.A.G., et al. (Ed.) (2005), Peran
kedokteran forensik dalam penegakan
hukum di Indonesia. Tantangan dan tuntuan
di masa depan, Penerbit Udayana, Denpasar
13. Wirasuta, I M.A.G., (2005), Peran Toksikologi
forensik
dalam
penegakan
hukum
kesehatan di Indonesia, dalam Wirasuta, I
M.A.G., et al. (Ed.) (2005), Peran kedokteran
forensik dalam penegakan hukum di
Indonesia. Tantangan dan tuntuan di masa
depan, Penerbit Udayana, Denpasar
41
BAB V
CAIRAN BIOLOGI
Cairan biologi (darah, urin, saliva, sisa
muntahan, organ) adalah merupakan
sebagian besar sample dari analisis
toksikologi. Materi biologi adalah campuran
komplek, yang terdiri dari berbagai
komponen. Dari sekian banyak materi
biologi, darah, plasma (serum) dan urine
sample murupakan sampel yang memiliki
frekuensi yang paling tinggi dalam toksikologi
analisis forensik.
Beberapa metode analisis tertentu cukup
spesifik
untuk
digunakan
langsung
menetapkan obat dalam cairan biologik,
tetapi pada umumnya masalah yang akan
timbul pertama-tama adalah bagaimana
cara pemisahan obat dari materi endogen
yang ada. Kemudahan suatu sampel dianalisis
akan bergantung pada derajat fluiditas. Untuk
memperbesar fluiditas, sampel padat atau
semi-solid dihancurkan terlebih dahulu
dengan prosedur mekanik.
5.1. Sifat Beberapa Cairan Biologik Tertentu
a) Darah
Darah merupakan cairan biologik yang paling
kompleks. Darah manusia atau hewan terdiri
dari cairan jernih yang terdapar yang
mengandung protein tersolubilisasi, lemak dan
garam terlarut, dan sel-sel yang tersuspensi.
Konstituen utama sel darah merah (eritrosit),
dapat terpisah dari cairan jernih (plasma)
dengan sentrifugasi sederhana. Tetapi jika
darah tidak diperlakukan dengan hati-hati,
sel-sel ini akan pecah dan metodelogi
pemisahan akan semakin sulit. Sel darah
merah ini dapat pecah oleh pemanasan,
oleh pembekuan, atau perlakuan mekanik
seperti misalnya penyadukan, tetapi
penyebab yang paling umum adalah
perubahan dalam kekuatan ion dari cairan
sekitarnya misalnya dengan penambahan air;
osmosis yang dihasilkan menyebabkan sel
menggelembung dan pecah. Oleh karena itu,
setiap manipulasi yang melibatkan perubahan
volume harus dilakukan dengan salin (larutan
NaCl fisiologik) isotonik.
Cairan Biologik
Jika darah dibiarkan tanpa penambahan agen
anti koagulan, maka sel darah merah akan
menggumpal (clotting) dan cairan diatasnya
yaitu serum dapat dienap tuangkan. Serum
dalam banyak hal sama dengan plasma
terkecuali tidak mengandung faktor pelarutan
yang mengakibatkan terjadinya penggumpalan.
Sebaliknya jika ditambahkan anti-koagulan dan
dibuat plasma, maka faktor ini tetap tinggal
yang memberikan sedikit perbedaan jika
plasma dan serum dianalisis. Pada umumnya
darah tidak langsung diekstraksi, tetapi plasma
atau serum dibuat terlebih dahulu. Jika darah
diekstraksi langsung, harus ditangani dengan
hati-hati untuk mengurangi pecahnya sel darah
merah.
b) Serum dan Plasma
Sifat umum serum dan plasma adalah
mengandung protein dalam jumlah besar.
Protein sangat berbeda secara fisikokimia
dengan molekul obat yang bermolekul kecil.
Tetapi sering kali ada afinitas yang sangat kuat
antara protein dengan obat, dan penghilangan
langsung protein dengan ultrafiltrasi atau
dialisis dapat juga menghilangkan obatnya.
Selain itu setiap pengukuran langsung obat
dapat menghilangkan obat total yang ada, dan
hanya mengukur obat yang bebas. Walaupun
obat bebas merupakan satuan yang penting
secara psiologik, karena sebagian besar obat
terikat pada protein, maka konsentrasi obat
bebas adalah sangat rendah, hingga biasanya
yang diukur adalah obat total dalam plasma
atau serum. Masalahnya adalah merusak ikatan
obat-protein dan kemudian obat total
diekstraksi dan dianalisis. Juga harus diketahui
bahwa karena ikatan protein-obat merupakan
prosentase yang tetap dari jumlah pada
rentang konsentrasi yang lebar, maka
penentuan obat total hanya menggunakan
suatu faktor amptifikasi, maka kesimpulan
keseluruhan masih tetap berlaku.
Tahap pertama penyiapan sampel serum atau
plasma untuk analisis adalah mendapatkan
larutan dalam air yang bebas protein yang
sesuai untuk diekstraksi dengan pelarut
organik. Metode yang paling sederhana dan
42
paling tua adalah mengendapkan proteinnya,
dan mengisolasi filtrat yang terjadi. Protein
terdenaturasi oleh pengendapan, dan ikatan
obat-protein dirusak dan diharapkan obat tetap
dalam larutan. Pereaksi asam yang populer
untuk pengendapan protein adalah asam
triklorasetat, asam perklorat, dan asam
tungstat. Akan tetapi pereaksi yang merupakan
asam kuat ini dapat mempunyai efek merugikan
pada obat yang hendak diekstraksi dan
penggunaannya harus diuji terlebih dahulu
dengan senyawa murni/standard, dan jangan
digunakan langsung sebagai pereaksi umum.
Selain itu dapat juga digunakan aluminium
klorida atau amonium sulfat. Aluminium klorida
merupakan pereaksi yang paling aman untuk
mengendapkan protein dalam darah total.
Penemuan kembali yang rendah disebabkan
baik oleh mengendapnya obat dengan protein
atau oleh degradasi.
Ketidak stabilan obat pada pH rendah di atas
dengan penggunaan pelarut organik untuk
denaturasi dan mengendapkan protein. Dapat
digunakan metanol atau etanol dan paling tidak
dua volume etanol untuk mengendapkan
semua protein yang ada dalam plasma. Akhirakhir ini banyak digunakan asetonittril, yang
dapat digunakan untuk analisis obat
antikuvulsan dan analgetik, pada mana plasma
dicampur dengan volume sama asetonitril,
larutan dijenuhkan natrium bisulfat-natrium
klorida, kemudian larutan sebelah atasnya
dapat digunakan untuk analisis.
Protein juga dapat didenaturasi menggunakan
enzim proteolitik. Walaupun enzim seperti ini
sering digunakan pada penyimpanan jaringan
untuk analisis, enzim substilisin telah berhasil
digunakan untuk merusak protein plasma.
Penemuan kembali sejumlah obat seperti
benzodiazepin, fenitoin dan asam salisilat dari
plasma lebih efisien jika digunakan enzim ini,
dibandingkan dengan prosedur ekstraksi
langsung. Hidrolisis menggunakan enzim
adalah sangat berguna untuk prosedur skrining
umum
jika
tidak
mungkin
untuk
mengoptimasikan prosedur ekstraski yang
biasa untuk obat tertentu. Sejumlah enzim lain
yang juga dapat digunakan dapat dilihat pada
tabel berikut
Tabel 5.1. Enzim proteolitik yang dapat digunakan pada penyiapan sampel biologik untuk analisis obat
Obat yang hedak dianalisis
Enzim
Amitriptilin
Subtilisin, tripsin, proteinase
Klorpormazine
Substilisin, papain, ketodase, tripsin, protease
Diazepam
Tripsin, proteinase, substilisin, ketodase
Difenhidramin
Substilisin, ketodase, papain
Fenobarbaital
Tripsin, protease
Fenitoins
Substilisin, tripsin, proteinase
Walaupun plasma merupakan cairan yang amat
kompleks, komposisinya sangat stabil, bahkan
juga dalam pasien, pH plasma jarang terletak
diluar 7,3 - 7,5 dan protein total serta
konsentrasi garamnya dapat dikontrol.
Sebaliknya kandungan lemaknya dapat
bervariasi, yang seringkali dipengaruhi waktu
dan sifat makanan. Lemak ini dapat
mempengaruhi analisis dan terutama untuk
sampel yang berlemak, memerlukan tahap
partisi spesifik untuk menghilangkan lipida.
Yang harus juga, diketahui adalah bahwa
perubahan dalam konstituen plasma dapat
memberi impact pada level obat dalam plasma,
dan berbeda dengan faktor yang menggangu
analisis.
Ekstraksi juga dapat dilakukan tanpa
mendenaturasi protien terlebih dahulu.
Walaupun obat terikat kuat dengan plasma
Cairan Biologik
protein, ikatannya adalah reversibel. Oleh
karena itu pada pH yang tepat, sampel dapat
langsung diekstraksi dengan pelarut organik.
Jika partisi bentuk yang tak terinonisasi ke
dalam pelarut organik cukup tinggi, maka
kesetimbangan
ikatan
dapat
digeser
sedemikian hingga memberikan ekstraksi yang
efesien ke dalam pelarut organik. Caranya
adalah dengan menambahkan dapar yang
sesuai dengan volume sama, kemudian
diekstraksi dengan 2-3 kali volume pelarut
organik. Keuntungan dari cara ini adalah bahwa
tidak diperlukannya tahap filtrasi atau
dekantasi dan dapat digunakan sebagai
prosedur rutin untuk sejumlah besar sampel.
Pemecahan ikatan protein-obat ini dapat juga
dengan kolom adsorben untuk memekatkan
obatnya yang kemudian dielusi dengan pelarut
organik. Adsorben yang digunakan harus
cukup kuat untuk merebut obat dari proteinnya
43
serta cukup lemah untuk melepaskan obat
pada waktu dielusi. Sebagai adsorben dapat
digunakan arang aktif, beberapa jenis resin
seperti XAD-2 dan S-X3.
Yang perlu juga diperhatikan pada plasma atau
serum adalah kemungkinan adanya enzim yang
dapat melanjutkan degradasi obat, terutama
esterase yang dapat menguraikan ester
menjadi asam bebas dan alkohol. Sifat dan
aktivitas estrase ini dapat tergantung dari
pasiennya.
c) Urine
Urine, tidak seperti plasma, bebas dari protein
dan lipida, karena itu umumnya dapat langsung
diekstraksi
dengan
pelarut
organik.
Dibandingkan dengan plasma atau serum,
komposisinya bervariasi cukup besar yang
dapat dilihat dari warna gelap urine malam
dibandingkan dengan warna yang pucat dari
urine yang dikumpulkan pada siang hari.
Komposisi urine keseluruhan tergantung pada
diet yang memang menyebabkan warna yang
berbeda.
Keuntungannya adalah bahwa jenis senyawa
yang umum terdapat dalam urine adalah larut
air, sedangkan sebagian besar obat adalah
larut lemak, hingga dapat diekstrasi dengan
pelarut yang sesuai. Yang menjadi kesukaran
adalah bahwa adanya perbedaan yang besar
dari volumen urine yang dihasilkan pada satu
tenggang waktu.
tidak boleh dikocok melainkan tabung dibolakbalik secara pelahan-lahan.
Pemilihan tabung, harus hati-hati dan cocok
untuk fraksi darah yang diperiksa agar
senyawa obat terjamin kemantapanya untuk
dianalisa. Untuk analisa plasma dan serum
diperhatikan zat tambahan yang digunakan
sehingga gangguan pada tahap analisis dapat
ditekan sekecil mungkin. Seperti contoh Tris(2butoksi-etil)fosfat (TBEP), suatu pengental
yang terdapat pada tutup tabung pengental,
ternyata dapat mendesak beberapa ikatan obat
dengan protein, menyebabkan obat masuk ke
dalam eristrosit. Sehingga memberi kesalahan
dalam penentuan obat dalam plasma.
Jika darah atau serum yang hendak dianalisis
perlu segera dipisahkan eritrositnya karena
kadar obat menjadi menurun yang disebabkan
oleh beberapa faktor seperti metabolisme obat
oleh eritrosit dan penyerapan obat ke dalam sel
darah. Jadi makin lama obat bersentuhan
dengan sel menyebabkan makin besar
penurunan kadar obat tersebut. Perlu
diperhatikan adsorpsi obat oleh dinding wadah
karena kadar obat sangat kecil. Untuk
mengatasi hal ini biasanya ditambahkan amilalkohol. Setelah disentrifuga hati-hati dalam
pemisahan, agar sel darah tidak terikut dipipet.
Urine dapat mempunyai rentang pH yang lebar,
terutama tergantung dari diet atau pengobatan.
Misalnya antasida, jika diabsorpsi akan
menyebabkan urine basa.
Wadah vial seharusnya inert, tertutup rapat dan
tahan terhadap kondisi penyimpanan. Pada
wadah ditandai dengan: tanda pengenal subjek,
nama kajian, tenggang waktu perlakuaan
/pengobatan, macam contoh (serum, plasma,
darah total), jam pengambilan sampel, tanggal,
nomer klas untuk setiap sampel, volume
sampel.
5.2. Pengambilan Sampel
b. Sampel urine
Analisis
toksikologi
forensik
biasanya
menerima sampel dari kedokteran patologi
forensik yang dilengkapi dengan Berita Acara
Pengiriman Sampel.
Yang perlu diperhatikan dalam sampling urine
adalah: 1) selang waktu pengambilan akan
berpengahur terhadap volume yang ditampung,
dihindari hilangnya urine (tumpah selama
pengambilan sampel); 2) untuk mencegah
tumbuhnya bakteri dalam sampel sebaiknya
didinginkan dalam lemari pendingin, dalam
beberapa hal biasanya ditambahkan pengawet
seperti: timol, toluen, formaldehid, borat, dan
kloroform. Penyawetan bertujuan untuk
mencegah obat tidak terurai oleh bakteri.
a) Darah.
Darah diambil dari pembuluh vena dengan
menggunakan: jarum dan spuit; jarum dan
tabung pengambil darah hampa; kateter vena
yang dipasang tetap pada infus. Dalam
pengambilan darah harus diperhatikan agar sel
darah merah tidak terhemolisis baik pada saat
pengambilan dalam vena harus pelan-pelan.
Penambahan antikoagulan (heparin) tabung
Cairan Biologik
Sebelum analisa urine perlu dikocok agar
homogen, dan perlu pengukuran volum urine
(volum urin total), analisis biasanya
44
memerlukan 10 - 15 mL urine. Penandaan pada
wadah dilakukan seperti pada sampel darah
tetapi perlu dicatat volume urine total.
5.3. Faktor-Faktor yang harus diperhatikan
dalam Analisis obat dalam cairan biologi.
A. Penyimpanan Sampel
Dalam penyimpanan ini yang harus
diperhatikan adalah adanya enzim esterase
serum. Oleh karena itu sebagai anti koagulan
digunakan natrium forida dengan kadar 5
mg/ml karena dapat menginhibisi kerja enzim.
Cara yang paling banyak digunakan untuk
penyimpanan adalah pendinginan di dalam
freezer. Kerugian dari cara ini adalah terjadi
efek apple jack yaitu obat akan terkonsentrasi
dalam tetes pertama yang membeku hingga
akan tinggal dipermukaan dan akan lebih
mudah teroksidasi. Setelah beku obat belum
tentu tetap stabil seperti misalnya apomorfin,
sebagian besar senyawa katekol ternyata tetap
akan teroksidasi menjadi senyawa koinon
walaupun disimpan pada suhu -15 °C,
terkecuali jika ditambahkan vitamin C sehagai
anti oksidan. Indometasin juga tidak stabil jika
dibekukan. Selain itu bekuan cairan/materi
biologi dapat mengakibatkan protein yang ada
rusak yang natinya dapat menggangu analisis
obatnya.
Karena pada waktu pencairan sampel sebelum
dianalisis dapat terjadi efek konsentrasi
terlokalisasi, sampel dikocok homogen
sebelum dilakukan analisis. Sampel yang
sudah mencair harus segera dianalisis untuk
menghambat kerja enzim. Pencairan sebaiknya
jangan dilakukan dengan pemanasan yang
tinggi karena mungkin dapat menguraikan
obatnya.
B. Ekstraksi
Cara yang paling umum yang sering digunakan
untuk pemurnian parsial obat adalah metode
ekstraksi dengan pelarut organik. Agar obat
dapat terekstraksi dalam pelarut organik, harus
dalam bentuk tidak terionisasi. Oleh karena itu
pH fase air harus dioptimasi untuk masingmasing obat agar diperoleh bentuk tak
terionisasi dengan sempurna.
Pada tahap ekstraksi, densitas pelarut
pengekstraksi juga harus diperhitungkan. Jika
hendak mengunakan corong pisah maka
pelarut pengekstraksi sebaiknya lebih berat
Cairan Biologik
dari air. Jika ekstraksi dilakukan dalam tabung
sentrifuga terlebih-lebih jika sejumlah banyak
sampel yang harus dianalisis, maka sebaiknya
pelarut pengekstraksi lebih ringan dari air.
Pemilihan ini tentunya disesuaikan dengan
apakah fase air atau fase organiknya yang
hendak digunakan selanjutnya.
Selain pada densitas, pemilihan pelarut ini juga
dapat
didasarkan
pada
kemudahan
menguapnya. Untuk ini paling banyak
digunakan adalah eter walaupun akan
memberikan masalah pada waktu sentrifugasi.
Sifat kimia pelarut pengekstraksi juga dapat
menimbulkan efek yang tidak dikehendaki.
Misalnya amin primer seperti etilamin akan
bereaksi dengan keton dan aldehida
membentuk basa Schiff. Sebaliknya metil butil
keton sebagai pelarut dapat bereaksi dengan
amin primer. Dalam beberapa hal reaksi dapat
terjadi tanpa diketahui dan obat dapat
ditentukan tanpa kesalahan besar. Etil asetat
akan terurai pada pH lebih dari 9,0 membentuk
etanol dan asetat. Kloroform dan diklormetan
jika terkena udara akan terbentuk fosgen yang
sangat rekatif. Oleh karena kloroform /
diklormetan
mengandung
pengawet
/
antioksidan seperti etanol yang dapat
mengakibatkan
adanya
/
terjadinya
etilkloformat yang selanjutnya merupakan alat
pada perubahan norkodein menjadi norkodein
karbonat. Terjadinya turunan karbonat ini juga
ditunjukkan
jika
antidepresan
trisiklik
diekstraksi dengan kloroform yang tidak
mengandung etanol sebagai pengawet. Fosgen
dapat dihilangkan dari kloroform dengan
mencuci dengan air, dan etanol dengan
kromatografi kolom alumina.
Untuk memperbesar partisi senyawa ionik ke
dalam fase organik, fase air dapat dijenuhkan
dengan garam seperti ammonium sulfat yang
dapat juga memperkecil
kecendrungan
terbentuknya emulsi, untuk memisahkan dua
lapisan cairan yang bercampur atau untuk
merubah fase organik yang lebih berat dari air
menjadi lebih ringan seperti halnya campuran
eter-kloroform.
C. Pemisahan Fase/Lapisan.
Untuk pemisahan obat dalam cairan biologik
secara ekstraksi cair-cair jarang digunakan
corong pisah, karena volume sampel umumnya
45
kecil. Biasanya pemisahan dilakukan dengan
tabung sentrifus.
dibandingkan menggunakan natirium sulfat
anhidrat.
Kerusakan yang paling umum adalah yang
disebabkan oleh pembentukan emulsi yang
bertahan akibat pengocokan kuat. Pada
pengocokan kuat akan terjadi gelembung
gelembung kecil dari satu fase masuk ke
campuran dua fase, dan jika tegangan
permukaannya rendah, maka gelembung ini
akan bertahan. Emulsi yang bertahan ini akan
terbentuk jika dilakukan pengocokan kuat
dengan adanya protein, sabun atau detergen.
Untuk memecahkan emulsi ini dapat dengan
sentrifugasi, pembekuan kemudian diikuti
pencairan, filtrasi, diaduk dengan batang
pengaduk gelas, penjenuhan fase air dengan
garam atau penambahan sejumlah sedikit
alkohol. Penambahan alkohol sebaiknya tidak
dilakukan jika dikehendaki reprodusibilitas
ekstraksi yang baik.
E. Penguapan Sampai Kerring
D. Pengeringan Fase Organik
Setelah dipisahkan dari fase air, fase organik
harus betul-betul bebas air, karena jika fase
organik hendak diuapkan sampai kering, maka
tetes terakhir air dapat menyebabkan
diperlukannya kondisi yang labih kuat
dibandingkan dengan kondisi yang dibutuhkan
pelarut sendiri, yang mungkin justru dapat
menguraikan obatnya. Untuk mempercepat
penguapan dapat ditambahkan beberapa tetes
etanol, walaupun hal ini dapat menimbulkan
terjadinya esterifikasi asam organik yang tidak
dikehendaki atau pembentukan ketal dengan
gugus okso. Residu penguapan dapat
mengandung asam atau basa mineral. Adanya
air dalam fase organik dapat merubah
komposisi fase gerak pada HPLC. Pada GC
penyuntikan garam atau protein yang larut air
yang dikandung fase organik dapat
menyebabkan terbentuknya tumpukan zat
padat pada awal kolom atau airnya sendiri
dapat menarik fase diam kolom.
Sesepora air dapat dihilangkan dari fase
organik dengan penambahan sedikit natrium
sulfat anhidrat, larutan yang sudah bebas air
dituangkan dengan meninggalkan garam yang
terhidrasi sebagai bongkahan kecil di dalam
tabung. Jika jumlah airnya hanya sesepora
untuk menghilangkan air ini cukup dengan
menyaring melalui kertas saring kering dengan
kehilangan akan obat yang lebih kecil
Cairan Biologik
Pada tahap penguapan sampai kering ini sering
kehilangan akan obat, akibat terutama oleh
bumping (muncrat), adsorpsi oleh wadah gelas
dan menguapnya obat, seperti yang dialami
oleh anti depresan trisiklik. Jika hal ini terjadi
dapat diatasi dengan mengselanisasi alat gelas
yang digunakan, pelarut diuapkan pada 40 °C
memindahkan residu obat segera dan
menggunakan standard internal. Penguapan
sampai kering dapat dilakukan dengan
evaporator.
F. Sumber Pencemaran
Cemaran adalah senyawa yang tidak
dikehendaki yang masuk ke dalam sampel
selama proses pembuatan (cemaran endogen)
yang sebenarnya merupakan sebagian masalah
analisis. Adanya cemaran yang sebenarnya
berasal dari proses analisis. Yang juga harus
diketahui adalah bahwa cemaran suatu
prosedur tertentu belum tentu merupakan
cemaran pada prosedur yang lain. Jadi pelarut
yang diperuntukkan untuk spektroskopi
misalnya dapar saja mengandung senyawa
yang tidak mengabsorpsi yang memungkinkan
mempengaruhi sifat kromatografi.
Masuknya cemaran dapat terjadi dari mulai
tabung pengumpul spesimen, senyawa kimia
yang, sengaja ditambahkan ke dalam sampel
misalnya antikoagulan pada sampel darah
dapat merupakan cemaran pada analisa
menggunakan HPLC.
Staf laboratorium dapat juga merupakan
sumber cemaran. Cemaran lain dapat berupa
serat dan tisu atau jas Lab. Cemaran juga dapat
berasal dari alat lab yang tidak bersih.
KEPUSTAKAAN
1. Chamberliain, J.. (1985), Analysis of Drugs
in Biological Fluids, CRC Press, Inc., Boca
Raton.
2. Moffat, C.A., et al., (1986), Clarke's Isolation
and Identification of Drugs, 2nd ed. The
Pharmaceutical Press, London.
3. Sriewoelan, S. (1988), .Analisis Obat Dalam
Cairan Biologi, Jakarta
46
BAB VI
REAKSI WARNA
Reaksi warna adalah prosedur kimia dalam
pengujian senyawa dengan menggunakan
pereaksi dengan mengamati warna yang
terbentuk atau perubahan warna yang terjadi.
Banyak senyawa kimia dapat memberikan
warna tertentu jika berkontak dengan pereaksi
tertentu. Warna yang dihasilkan oleh pereaksi
tersebut mungkin spesifik untuk senyawa
tersebut, atau juga tidak. Reaksi warna tidak
dapat dijadikan dasar untuk mengidentifikasi
satu senyawa obat, tetapi warna yang terbentuk
mungkin positif terhadap sekelompok senyawa
atau positif terhadap gugus fungsi tertentu,
sehingga reaksi warna berhubungan dengan
aspek gugus fungsi dari struktur senyawa obat
tersebut.
yang sama. Warna yang dihasilkan harus
dicatat apakah dihasilkan oleh bentuk asam
atau bentuk basanya, sebab dalam hal tertentu
bentuk asam dan basanya memberikan warna
yang berbeda pada pH yang berbeda. Seperti
contoh senyawa obat dalam bentuk garam
hidroklorida biasanya memberi warna merah
dengan uji Mendelin's dan memberi warna biru
oleh reagen Koppayi-Zwikker (sebelum
ditambahkan pirolidin). Fenomena ini jika
diterapkan pada materi biologi tidak
menimbulkan masalah, tetapi akan muncul
masalah jika diterapkan pada sediaan
farmaseutika.
Yang paling penting dari reaksi warna adalah
skrining
cepat
dari
sampel
urine
memungkinkan analisa tanpa ekstraksi lebih
dahulu. Toksikolog harus memperhatikan
keterbatasan reaksi warna dan sumber-sumber
yang memungkinkan reaksi positif palsu.
Pemilihan pereksi warna yang tepat untuk
senyawa obat yang diduga terdapat dalam
sampel didasarkan atas rumus bangun dari
senyawa obat tersebut. Jika dikenal
strukturnya maka dapat diketahui gugus fungsi
(golongan) yang terdapat didalamnya, sehingga
pemilihan pereaksi dapat berdasarkan reaksi
positif terhadap gugus fungsi tersebut.
Ataupun pemilihan pereaksi warna dapat
didasarkan pada pereksi yang memang spesifik
untuk senyawa bersangkutan.
6.1. Interpretasi reaksi warna.
Rentang warna yang dihasilkan oleh rekasi
warna tidak mungkin mengatakan dalam
derajat, karena sangat terbuka untuk
memberikan deskripsi yang subjektif. Lebih
jauh rentang warna tersebut mungkin sangat
luas atau sempit, rentang warna tersebut
sangat tergantung pada kondisi percobaan,
jumlah analit yang terdapat dalam sampel, dan
terdapatnya senyawa lain dalam sampel yang
mungkin menimbulkan reaksi positif atau
negatif palsu.
Warna yang ditunjukan dibagi menjadi warna
dasar seperti: merah, oranye, kuning, hijau,
biru, ungu, dan ping, coklat, abu-abu, hitam.
Biru yang bervariasi mungkin dihasilkan dua
warna seperti merah - coklat, oleh karena itu
perlu dijelaskan perubahan warna yang
terbentuk selama melakukan uji, atau dicatat
warna yang dominan muncul merah - coklat
atau terjadi perubahan warna merah → coklat.
Kesimpulan akhir dari reaksi warna harus
disertai reaksi pembandingan, dengan
mereaksikan baku pembanding pada kondisi
Reaksi Warna
6.2. Faktor Teknis
Rekasi warna dapat diterapkan langung pada
sampel baik berupa sediaan atau dari spesimen
cairan biologi. Reaksi warna juga digunakan
sebagai penampak noda pada plat KLT atau
sebagai uji skrining maupun konfirmasi
menggunakan KLT.
6.3. Beberapa Reaksi Warna
6.3.1. Reaksi golongan
a. Sifat khas senyawa nitrogen
Nitrogen dalam bentuk nitrat dan nitrit; sebagai
senyawa nitro dalam ikatan dengan senyawa
karbon; sebagai amin primer, sekunder, atau
tersier yang bersifat basa; sebagai amonium
kuarterner; golongan amin aromatik; asam
amida netral; garam ion zwitter seperti asam
amino: dan dalam bentuk lain.
Pemeriksaan nitrat
47
Semua nitrat larut dalam air. Dengan
menambahkan FeSO4 dan H2SO4 pekat
terbentuk cincin berwarna coklat.
Pemeriksaan senyawa nitro aromatik
Sejumlah 50 mg zat dilarutkan dalam 3 ml
etanol. Sesudah pemberian 3 ml HCl encer, 4
ml air, dan 200 mg Zn, campuran dipanaskan di
penangas air selama 10 menit. Lalu 2 ml
filtratnya direaksikan dengan 2 tetes pereaksi
Diazo I. Selanjutnya larutan dituangkan ke
dalam 2 ml pereaksi Diazo II; terbentuk warna
jingga atau endapan, misalnya pada nitrazepam
dan klorazepam.
Pereaksi Diazo I: 10 g NaN02 dalam 100 ml
aquades
Pereaksi Diazo II : 0,25; g 2-naftol dalam 100 ml
3N NaOH.
Pemeriksaan senyawa basa amin
Dengan pereaksi Mayer senyawa basa amin
membentuk endapan kekuning-kuningan.
Caranya: ke dalam larutan zat yang jernih, yang
bersifat asam lemah akibat penambahan asam
sulfat, ditambahkan beberapa tetes pereaksi.
Reaksi tidak sama untuk semua senyawa basa
amin. Morfin dan efedrin hanya memberikan
sedikit endapan atau sama sekali tidak.
Pereaksi Mayer: 1,35 g HgCl2 dalam 100 ml
larutan KI 5%
Pemeriksaan amin alifatik primer ( reaksi
Senfol)
Larutan amin dalam etanol dituangi
karbondisulfida sama banyak, dipanaskan
sampai
karbondisulfida
yang
berlebih
menguap. Pada sisa larutan ditambahkan
beberapa tetes larutan raksa (II) klorida 5 %;
tercium bau khas `mustard' jika ada amin
alifatik primer.
Pemeriksaan amin aromatik primer ( reaksi
Diazo)
Sejumlah 50 mg zat dilarutkan dalam 1 ml 3N
HCl. Larutan direaksikan dengan 2 tetes
pereaksi Diazo I, dan kemudian dituangkan ke
dalam 2 ml perekasi Diazo II; terbentuk warna
merah jingga atau endapan. Reaksi positif
untuk benzokain, etrakridin, PAS, prokain, dan
sulfonamida. Etakridin sudah berwarna merah
ketika ditambahkan Diazo I, sedangkan
imipramin berwarna biru. Rekasi dapat juga
positif jika zat dipasakan dulu dengan 3N HCl
selama 3-15 menit dan kemudian didinginkan,
misalnya untuk klordiazepoksida, furosemida,
oksazepam, fenasetin.
Reaksi Warna
Pemeriksaan amin sekunder
Zat dilarutkan dalam 2 ml 3N HCl, didinginkan
pada 5°C, kemudian dengan 2 ml larutan NaNO2
1%. Lima menit kemudian larutan diencerkan
dengan 5 ml air dan dikocok dua kali, setiap
kali dengan 5 ml eter. Larutan eter dicuci, dan
akhirnya diuapkan sampai kering. Kepada sisa
penguapan ditambahkan 50 mg fenol,
dipanaskan sebentar, didinginkan, direaksikan
dengan 1 ml H2SO4 : terbentuk warna biru-hijau
pekat yang bila hasil rekasi dituangkan ke
dalam air berubah menjadi merah. Jika
dibasakan warna hijau-biru semula timbul
kembali
(percobaan
nitrosamin
dan
Liebermann)
Pemeriksaan amin alifatik primer dan amin
aromatik ( rekasi Isonitril)
Sedikit zat dilarutkan dalam etanol, direkasikan
dengan beberapa tetes kloroform dan basa
alkali dalam etanol, kemudian dipanaskan
dengan api kecil. Tercium bau khas isonitril
Pemeriksaan asam amino ( rekasi Ninhidrin)
Kedalam 1 ml larutan zat yang netral
ditambahkan 2 tetes larutan ninhidrin 1 %
dalam air, kemudian dipanaskan, sampai
mendidih. Terbentuk warna kemerah-merahan,
ungu, atau biru. Rekasi positif antara lain untuk
: efedrin (merah), tolbutamid (ungu), asam
askorbat (merah tua).
Pemeriksaan golongan guanidin (reaksi
Sakaguchi)
Ke dalam larutan 1 mg zat dalam 5 ml air
ditambahkan 1 ml larutan NaOH 10 % dan 1 ml
larutan 1-naftol 0,05 % dalam etanol. Campuran
didinginkan pada ± 15 °C lalu ditambahkan 3
tetes larutan natrium hipobromit ( 2 g NaOH
dalam 7,5 ml air + 0,5 ml Brom, ditambahkan air
sampai 10 ml). Terbentuk warna merah-ungu
(streptomisin).
Pemeriksaan turunan piridin
Pada pemanasan 100 mg zat dengan 100
mg natrium karbonat kering bau piridin
tercium. Hal itu terjadi pada sebagian besar
turunan piridin.
ii. Sejumlah 5 mg zat dicampur atau digerus
dengan 10 mg 1-klor-2,4dinitrobenzol, lalu
dilumerkan sebentar. Lumeran yang sudah
dingin dilarutkan dalam 2 ml 0,5N KOHetanol. Terbentuk warna merah tua
(nikotinamida)
i.
48
b. Pemeriksaan senyawa pereduksi
Reaksi Fehling
Ke dalam 1 ml campuran pereaksi Fehling I
dan II sama banyak ditambahkan 20 mg
zat, lalu dipanaskan di penangas air. Bila
ada reduksi terbentuk endapan tembaga (I)
oksida berwarna merah-biru bata.
Positif pada suhu kamar : asam askorbat.
Positif pada pemanasan : isoniasida, gula
pereduksi, hidrokortison, sorbitol yang
sebelumnya dioksidasi dengan KMnO4,
sukrosa setelah dihidrolisis dengan asam.
Perekasi Fehling I: larutan CuS04.5H20 7 %.
Pereaksi Fehling II: 35 g KNa-tartrat + 10 g
NaOH + air sampai 100 ml.
Rekasi adisi dengan brom
Sejumlah 50 mg zat dilarutkan dalam 2 ml
asam asetat, lalu ditambahkan tetes demi
tetes air brom (1,0 g Br2 atau 0,3 ml Br2 /
100 ml asam asetat). Apabila ada ikatan tak
jenuh warna brom akan hilang.
c. Pemeriksaan aldehid
Zat dilarutkan atau disupensikan dalam air,
diasamkan dengan 3 N HCl sampai pH
mencapai kurang dari 3, lalu ditambahkan
perekasi Schif yang tak berwarna dengan
volum sama banyak. Setelah beberapa waktu
terbentuk warna, merah sampai ungu. Rekasi
blanko terhadap perekasi perlu dilakukan.
6.3.2. Reaksi khusus Test asam amalic
a. Tets asam amalic
Metode : Tambahakan ke dalam sampel
beberapa tetes 10 M HLCl, diikuti beberapa
kristal KCl, kemudian uapkan sampai kering.
Amati warna yang terbentuk pada residu,
tambahkan 2-3 tetes 2 M NH4OH, amati kembali
rawna yang terbentuk
Indikasi :Residu berwarna merah, ping, orange,
atau kuning berubah menjadi ping, merah atau
violet
setelah
ditambahkam
amoniumhidroksida.
Mengindikasikan
terdapatnya senyawa berinti xantin.
b. Perak Ammoniumnitrat
Pereaksi: Ke dalam 20 ml peraknitrat 0,1 M
ditambahkan larutan ammonium pekat
secukupnya untuk melarutkan peraknitrat yang
tidak melarut.
Reaksi Warna
Metode : Larutkan sampel ke dalam sesedikit
air, dengan tambahan etanol bila perlu,
tambahkan pereaksi sejumlah volum yang
sama, catat warna yang terjadi, kemudian
panaskan di dalam tangas air pada 100°C
selama 30 detik.
Indikasi : Merah, kuning, coklat, atau hitam
(pada suhu kamar) menunjukkan adanya
senyawa pereduksi. Ini terjadi jika atom karbon
pada cincin terikat gugus hidroksil, gugus
hidroksil pada posisi meta tidak memberi
respon, sedangkan pada posisi para
menunjukkan respon. Beberapa pereduksi juga
positif adalah ikatan etinil, tetapi bukan ikatan
etilenik.
c. Antimoni Pentaklorida
Pereaksi: Keringkan sejumlah antimoni
triklorida pada fosfor penta oksida, lelehkan
bahan yang telah dikeringkan ( titik leleh 73°C),
dan lewatkan gas klorin kering ke dalam
lelehan sampai terbentuk cairan berwarna
kuning. Tambahkan kloroform 10 kali volum
cairan kuning, saring larutan ke dalam botol
berwarna gelap dan simpan di dalam desikator.
Metode : Tempatkan satu tetes larutan etanol
dari sampel pada kertas saring, tambahkan
pereaksi, dan segera keringkan di atas uap air.
Indikasi : Berbagai variasi warna terbentuk oleh
glikosida jantung dan warna tertentu oleh
estrogen dan kortikosteroid.
d. Aromatik
Metode 1: Tempatkan sejumlah sampel masingmasing ke dalam dua tabung reaksi, salah satu
tabung tambahkan NaOH padat. Panaskan
tabung dengan hati-hati hingga semua uap
keluar, tambahkan pereaksi Marquis dan amati
warna yang terjadi.
:Warna
merah
dan
orange
Indikasi
mengindikasikan bahwa sampel mengandung
aromatik alam. Warna mungkin diberikan oleh
sesepora hidrokarbon aromatik. Jika warna
diberikan setelah pemanasan dengan NaOH
menunjukan adanya asam aromatik, tetapi jika
tanpa NaOH menunjukkan adanya fenol, asam
fenolat, mengandung aldehid dengan gugus
hidroksil lebih dari satu. Reaksi negatif tidak
berarti sampel bukan non-aromatik.
Metode 2: Tambahkan 2- 3 tetes asam nitrat ke
dalam sampel panaskan pada tangas air 100°C
49
selama 1 menit, dinginkan tambahkan air 2-3
kali volum, buat larutan menjadi basa dengan
menambahkan NaOH 40%.
Indikasi : Perubahan warna dari tidak berwarna
atau warna kekuningan dalam larutan asam
menjadi warna gelap; seperti contoh orange
atau orange-merah setelah penambahan NaOH
menunjukkan terdapat cincin benzen di dalam
molekul, mungkin dihasilkkan oleh nitrofenol
atau senyawa nitro lainnya. Seyawa tertentu
(contoh : diazepam, metaqualon) memberi hasil
yang negatif. Warna orange dapat diberikan
oleh senyawa kortikosteroid non-aromatik
tertentu ( Kortison).
e. Reaksi Mureksid
Sejumlah 10 mg zat ditambahkan 1,5 ml
hidrogen pereksida dan 5 tetes asam sulfat
pekat, kemudian dipanaskan di penangas air
samapi kering. Sisa diberikan beberapa tetes
6N NH3. Bila ada senyawa purin ( teofilin,
kofein, teobromin) terbentuk warna merah
ungu. Sewaktu menguap, warna sudah
terbentuk, yang kemudian diperkuat oleh
oksidasi.
f. Reaksi Zwikker
Ke pada 10 mg zat dipelat tetes ditambahkan 10
tetes pereksi Zwikker I. Penambahan 2 tetes
pereaksi Zwikker II menimbulkan warna ungu
jika reaksi positif. Isoniasida dan beberapa zat
lain menggangu rekasi hingga lebih baik jika
zat dipisahkan dulu dengan ekstraksi. Reaksi
Zwikker positif untuk barbiturat, glutetimida,
hidantoin, beberapa sulfonamida, dan purin.
Basa hidroksida atau basa fosfat membentuk
warna biru-hijau yang setelah ditambahkan
pereaksi Zwikker II berubah menjadi biru tua
atau ungu. Reaksi ini terutama positif untuk
furosemida (biru kuat), mefrosida (biru-kelabu),
nipagin M, hidroklortiazida, dan sakarin Na
(berwarna biru hanya dengan perekasi Zwikker
I).
Pereksi Zwikker I: kobal (II) nitrat dalam
metanol Peraksi Zwikher II : piridin 10 % dalam
metanol.p-Dimetilaminobenzaldehid
Tambahkan ke dalam sampel di dalam tabung
reaksi, bila perlu dipanaskan, amati warna yang
terbentuk, kemudian tambahkan air dengan
hati-hati. Warna ungu diberikan oleh alkaloid
ergot, kanabinoid dan beberapa cincin indol
memberikan warna merah yang berubah
Reaksi Warna
menjadi ungu jika diencerkan, beberapa fenol
juga memberikan warna seperti
kanabinoid.
Pereaksi
:
Larutkan
0.5
g
pdimetilaminobenzaldehid
dalam
50
ml
campuran larutan (60 volume etanol dan 40
volume asam sulfat). Peraksi harus dibuat
segar.
h. Pereaksi Dragendruff
Larutkan sampel ke dalam 3 tetes 2M HCl,
tambahkan 2-3 ml perekasi, encerkan dengan 2
ml air, amati warna yang terjadi; warna orange,
merah-orange, coklat-orange diberikan oleh
alkaloid. Amin primer, skunder, tersier, dan
kuartener juga memberi reaksi positif.
Pereaksi: Larutkan 1 g bismut subnitrat dalam
3 ml 10 M HCl untuk tujuan pemanasan.
Encerkan dengan 20 ml air, larutkan 1 g KI ke
dalam campuran tersebut. Jika Bismut hitam
dengan tri-iodida terpisah tambahkan asam HCl
2M dan sedikit KI.
i. Pereksi Duquinois
Sejumlah sampel atau ekstrak eter simplisia, di
dalam tabung reaksi, uapkan ekstrak
tambahkan 0,5 ml pereaksi dan sejumlah
volume yang sama 10 M HCl, panaskan
perlahan-lahan amati warna yang terjadi,
tambahkan klorform kemudian dikocok, amati
wama yang terekstraksi. Perubahan warna dari
abu-abu - hijau- biru- violet- biru diduga
diberikan oleh kanabis, tetapi perlu dilakukan
pembandingan dengan kopi yang disangrai,
dan minyak patcholi yang juga memberi rekasi
positif. Hanya kanabis memberikan warna ungu
yang terekstraksi ke dalam kloroform.
Perekasi :Larutkan 2 g vanilin dan 0,3 ml
asetaldehid dalam 100 ml etanol. Peraksi harus
disimpan dalam lempat yang gelap.
j. Formaldehid - asam sulfat
Campurkan sampel dengan pereaksi panaskan
pada 100 oC selama satu menit. Senyawa
benzodiazepin umumnya memberikan warna
orange kecuali bromazepam dan klozapin
(kuning), dan lurazepam (pink). Senyawa lain
juga berreaksi, positif adalah fenotiasin,
tioxanten, tryplamin tertrasiklin, dan zomepirak.
Pereaksi ke dalam 4 volume H2S04 tambahkan 6
volume
larutan
formaldehid,
aduk
50
manggunakan pipet, larutan akan panas lebih
dari 1 jam, apabila memberikan warna buram
panaskan dalam, penangas air 100 °C selama 1
menit. Catatan pereaksi ini tidak sama dengan
pereaksi Marquis.
Pereaksi : 2 ml Natriumplatina 5% dan 5 g KI
ditambahkan air 98 ml kocok hingga larut.
k. Pereaksi lodoplatinat
1. Kovar. A, 1987, Identifikasi Obat,Penerbit
ITB, Bandung.
Larutkan sampel dalam 2 tetes 2 M HCl,
tambahkan 2-3 ml pereaksi, encerkan dengan
10 ml air. Reaksi positif diberikan oleh alkaloid
base membentuk warna ungu, biru-ungu,
coklat-ungu, abu-abu-ungu.
Reaksi Warna
Kepustakaan.
2. Stevens, HM., 1986, Color Test, Moffat, C.A.
et.al., Clarke `s Isolation and Identification
of Drugs, 2 nd ed., 128 - 176 The
Pharmaceutical Press, London.
51
BAB VII
KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS
Kromatograti lapis tipis (KLT) adalah suatu
salah satu komponen dari campuran
metode pemisahan campuran analit dengan
diadsorpsi lebih kuat dari komponen yang
mengelusinya melalui fase diam yang datar
lainnya.
Karena
adsorpsi
merupakan
pada plat penyangga. KLT termasuk
fenomena
permukaan,
maka
derajat
kromatografi adsorpsi, walaupun sebenarnya
pemisahan dipengaruhi oleh luas permukaan
mekanisme yang terjadi adalah kombinasi
yang ada atau secara tidak langsung
adsorpsi dan partisi. Dalam kromatografi
dipengaruhi oleh ukuran partikel fase diam
adsorpsi fase diam berupa padatan seperti
(adsorpben).
Walaupun
begitu
yang
silika gel atau alumina sedangkan fase gerak
merupakan faktor kunci setiap bentuk
berupa cairan atau gas. Dalam KLT fase gerak
kromatografi adalah koefisien distribusi/partisi
ini berupa cairan. Pemisahan akan terjadi jika
senyawa antara ke dua fase dalam sistem.
Koefisien distribusi" partisi" (K) =
Jumlah senyawa per satuan fase diam
Jumlah senyawa per satuan fase gerak
Dalam kromatografi adsorpsi harga “K” ini
dipengaruhi oleh suhu dan konsentrasi
senyawa. Pada suatu suhu tertentu hubungan
antara jumlah senyawa pada fase diam dan
jumlah senyawa yang ada pada fase gerak
dapat dinyatakan secara grafik sebagai
isoterem distribusi. Kelandaian isoterm linier
berbanding langsung dengan koefisien
distribusi/partisi, hingga kondisi untuk
mendapatkan pemisahan yang optimum
adalah kondisi pada mana harga koefisien
distribusi ini adalah sama dengan satu.
Efisiensi pemisahan pada kromatografi dapat
dinyatakan sebagai jumlah plat teoritis.
Jumlah plat teoritis (N) berhubungan dengan
panjang plat KLT (L) atau panjang kolom pada
kromatografi kolom dan H adalah tinggi plat
teoritis (Height equivalent a theoretical plat)
N=L
H
(7.2)
Untuk menghitung kinerja KLT perlu
mengidentifikasi parameter yang mungkin
menurunkan harga H. Empat parameter yang
terpenting pada KLT adalah viskositas,
temperatur, laju linier dari fase gerak dan
ukuran dari fase diam. Efisensi dari
kromatografi cair dapat digambarkan seperti
pada persarnaan Van Deemter
H=B
µ + Cs µ + Cm µ
(7.3)
Dimana µ = laju linier fase gerak, Cs dan Cm
adalah konsentrasi analit pada fase diam dan
fase gerak. Proses difusi longitudinal
dinyatakan sebagai B dan berhubungan
dengan kecenderungan dari molekul analit
Kromatografi Lapis Tipis
(7.1)
untuk bermigrasi dari konsentrasi tinggi di
tengah-tengah noda pada KLT menuju zone
konsentrasi yang lebih rendah di pinggiran
noda. Hal ini akan menimbulkan pelebaran
noda yang akan membuat pemisahan tidak
efisien.
KLT dengan fase diam yang berukuran sangat
kecil (3 - 5 µm) dikenal dengan KLT kinerja
tinggi (HPTLC = High Performance Thin-Layer
Chromatography). HPTLC memerlukan waktu
elusi yang singkat, jarak elusi yang lebih
pendek dan jumlah elusi analit yang lebih
sedikit dibandingkan dengan KLT.
Parameter migrasi analitik pada KLT dinyatakan
dengan Rf.
Rf = D A
(7.4)
DM
dimana DA jarak titik awal ke pusat zone A
setelah elusi dan DM adalah jarak dari titik awal ke
tepi muka pelarut. Faktor kapasitas relatif dari
dua komponen merupakan ukuran kemampuan
kolom/plat untuk memisahkan keduanya. Hal ini
dinyatakan sehagai:
K ' = (1 − Rf )
(7.5)
Rf
Kemampuan sistem KLT untuk memisahkan dua
komponen A dan B dapat dinyatakan sebagai
resolusi (Rs):
(
)
Rs = 2 D A − D B
(W A + WB )
(7.6)
dimana DA dan DB adalah jarak yang ditempuh
noda A dan B, sedangkan WA dan WB adalah
lebar noda/bercak A dan B. Jika Rs ≥ 1 pemisahan
52
yang terjadi adalah sempurna. Faktor selektivitas
(S) juga diukur sebagai daya resolusi
S=
k ' B D A (DM − D B )
=
K ' A D B (DM − D D )
(7.7)
Batas Pengembangan
WA
WB
DM
DA
Eluent
DB
Awal Penotolan
Gambar 7.1. Diagram alat kromatografi lapis tipis
7. 1. Fase Diam
Sebagai fase diam pada KLT digunakan
adsorpben dengan partikel halus yang
dilapiskan pada lempeng penyangga kaca,
logam atau plastik. Adsorpben yang dapat
digunakan diklasifikasi berdasarkan sifat kimia
atau daya ikatanya. Adsorpben pada KLT
adalah analog dengan yang digunakan pada
kromatografi kolom, hanya berbeda ukuran
partikelnya,
1) Silika gel (asam silikat), yang paling
banyak digunakan dan bersifat asam
lemah. Sering ditambahkan CaSO4,
hemihidrat sebagai pengikat agar melekat
kuat pada pengangga dan mempercepat
mengeringnya
plat.
Juga
dapat
ditambahkan indikator fluoresensi yang
akan berfluoresensi di bawah sinar UV
pada 254 nm, hingga bercak yang
mengabsorpsi
pada
frekuensi
ini
berfluoresensi hijau kuning.
2) Alunima, bersifat basa lemah. Tidak sebaik
silika gel lebih reaktif secara kimia
senyawa yang sensitif dapat terdegradasi.
Juga dapat ditambahkan CaSO4 dan
indikator fluoresensi.
3) Kieselguhr (tanah diatome), merupakan
adsorpben netral dengan aktivitas rendah.
Daya resolusinya juga kecil. Dapat
ditambahkan sebagai campuran pada silika
Kromatografi Lapis Tipis
gel yang akan memberikan adsorpben
campur yang kurang aktif. Juga dapat
ditambahkan CaSO4.
4) Selulosa, sebagai adsorpben pada
kromatografi lapis tipis memberikan lapis
tipis yang sitatnya analog dengan
kromatograti kertas dan memberikan lapis
tipis yang cukup baik tanpa pengikat.
Dapat ditambah indikator fluoresensi atau
kalsium
asetat.
Digunakan
untuk
pemisahan senyawa hidrofil. Kerugiannya
ialah tidak dapat digunakan pereaksi yang
korosif seperti asam sulfat atau pereaksi
destruksi lainnya.
5) Poliamida, merupakan magnesium silikat.
Daya melekatnya tidak sebaik adsorben
lainya. Biasanya ditambah pengikat seperti
selulosa atau amilum. Mempunyai
kapasitas yang besar dan banyak
digunakan untuk pemisahan senyawa
fenol.
6) Fase diam cair terikat secara kimia,
pengikatan fase diam secara kimia pada
penyangga menyangkut reaksi silika
dengan dimetilklorsilan tersubstitusi.
Proses reaksi pengikatan meliputi
pengaktipan permukaan silika dengan HCl
sehingga
terbentuk
silanol
pada
permukaan silika. Silanol yang terbentuk
53
direaksikan
tersubstitusi
dengan
dimetilklorsilan
▓-Si -OH + Cl-Si(CH3)-R →Si-OSi(CH3)3R + HCl
Untuk membuat berbagai macam fase
terikat dilakukan dengan menganti-ganti
gugus fungsi R yang terikat pada pereaksi
sililasi.
▓-Si -OH + ROH → ▓Si-OR + H2O
▓-Si -OH + SOCl2 → ▓Si-Cl + SiO2 + HCl
↓ RMgBr (Gridnard)
Metode lain: untuk esterifikasi dari gugus
silanol permukaan dengan alkohol atau
konversi
gugus
silanol
ke
SiCl
mengnunakan ionilklorida diikuti dengan
senyawa organometalik. Reaksi esterifikasi
:
Fase diam ini umum digunakan pada HPLC
namun sekarang telah banyak dijumpai pada
KLT. Sistem ini lebih dikenal kromatografi fase
balik.
▓-Si -R (gugus Si-C yang sangat
stabil)
7.2. Penotolan sampel
Titik penotolan harus ditandai terlebih dahulu,
dapat di lakukan dengan pinsil atau dengan
jarum, 1, 5 - 2 cm dari tepi bawah plat. Sampel
dan pembanding jika mungkin dilarutkan dalam
pelarut organik yang non-polar dengan titik
didih rendah agar mudah menguap setelah
larutan ditotolkan. Penotolan dapat dilakukan
dengan pipet mikro atau pipet lamda atau jarum
suntik mikro sebanyak 1- 5 µL dari larutan 1%.
Diameter penotolan hendaknya sekecil
mungkin (5 mm) umumnya lebih kecil.
7.3. Sistem pelarut
Yang menjadi permasalahan adalah bagaimana
memperoleh suatu sistem pelarut yang sesuai
karena melibatkan berbagai jenis fase diam
yang berbeda dan sifat dari gaya yang terlibat
dalam prosedur kromatografi. Yang sering
digunakan adalah sistem bukan air seperti
metanol, asam asetat, etanol, aseton, etil
asetat, eter, kloroform, benzen, sikloheksan,
dan petrolium eter, kloroform. Sistem pelarut
ini dapat berupa pelarut tunggal atau campuran
beberapa pelarut. Hanya hendaknya sistem
multikomponen dihindari karena komposisinya
dapat berubah dan akan terbentuk suatu
gradien fase gerak dalam lapis tipis yang dapat
menyebabkan reprodusibilitasnya berkurang.
Untuk fase diam yang polar dapat digunakan
fase gerak dari nonpolar (n-heksana) sampai
paling polar. Untuk fase diam non-polar (sistem
fase balik) biasanya digunakan fase gerak
larutan berair, metanol, asetonitril dan
isopropanol.
Kromatografi Lapis Tipis
Pemilihan fase gerak sangat tergantung pada
jenis pemisahan yang hendak dicapai. Secara
umum pemilihan fase gerak harus dihindari
menggunakan pelarut berbahaya atau beracun.
Beberapa hal yang dipertimbangkan dalam
pemilihan pelarut adalah:
- pelarut harus tidak toksik menyebabkan
masalah kesehatan baik jangka
- pendek maupun jangka panjang,
- tidak mudah meledak pada kondisi normal,
- tidak reaktif atau bereaksi secara kimia
dengan analit atau fase diam,
- tidak
memberikan
masalah
pada
pembuangan (ramah lingkungan).
Kloroform, metilenklorida, benzen dan 1-4
dioksan adalah pelarut yang bersifat
karsinogen. Kloroform adalah pelarut yang
sukar didegradasi dilingkungan.
Dalam beberapa sistem pelarut organik dan
silika, sering ditambahkan amonia yang
bertujuan untuk menangani masalah bercak
berekor. Etilasetat - amonia adalah campuran
pelarut yang sangat berguna, tetapi asetat
dapat bereaksi dengan amonia menghasilkan
sistem pelarut yang lemah. Cember seharusnya
diisi dengan pelarut segar sekurang-kurangnya
setiap hari.
7.4. Pengembangan
Teknik pengembangan kromatografi lapis tipis
sama dengan kromaografi kertas. Pemilihan
tipe bejana tergantung dari tujuan analisisnya.
Fase gerak diisikan ke dalam bejana paling
kurang satu jam sebelum digunakan. Dinding
bejana dapat dilapisi dengan kertas saring
tebal yang dibasahi pelarut pengembang untuk
54
mendapatkan atmosfer jenuh akan uap pelarut
dalam bejana. Diketahui beberapa macam
pengembangan yaitu:
1) Pengembangan
menaik.
Teknik
pengembangan ini yang paling umum dalam
KLT.
2) Pengembangan ganda. Pengembangan
ganda ini biasanya dilakukan jika pemisahan
terjadi
belum
sempurna
dengan
pengambangan tunggal. Dalam hal ini
lempeng dikeluarkan dari bejana setelah
pengembangan pertama selesai, dikeringkan
di udara, kemudian dikembangkan kembali
dengan pelarut yang sama. Cara ini dapat
digunakan untuk senyawa yang bergerak
lambat.
3) Pengembangan horizontal. Fase gerak
dialirkan dengan pertolongan tekanan.
4) Pengembangan bertahap. Jika suatu
campuran senyawa mengandung komponenkomponen yang polaritasnya sangat
berbeda,
maka
untuk
mendapatkan
pemisahan yang sempurna, dapat dilakukan
migrasi
secara
progresif
dengan
menggunakan pelarut pengembang yang
berbeda. Pelarut pengembang pertama dapat
berupa pelarut polar misalnya metanol untuk
memisahkan komponen polar. Kemudian
pengembangan dilanjutkan dengan pelarut
non-polar misalnya sikloheksan sampai
selesai. Dengan cara ini dapat dipisahkan
senyawa non-polar yang bermigrasi dengan
muka perat pertama. Teknik ini disebut
leknik elusi gradien.
5) Pengembangan
lewat.
Teknik
pengembangan ini pada kromatografi lapis
tipis jarang digunakan karena sukar
melakukannya dan membutuhkan suatu
peralatan yang khusus. Dalam hal ini
pengembangan dilakukan sampai tepi atau
lapis tipis dan selanjutnya pelarut
pengembangnya dihilangkan dengan jalan
penguapan.
6) Pengembang dua demensi. Dengan
pengembangan cara ini sampel ditotolkan
pada satu sisi, dikembangkan dan
dikeringkan. Kemudian dikembangkan dalam
sistem pelarut pengembang yang lain
dari/terhadap
dengan
posisi
90°
pengembangan pertama.
7.5 Deteksi noda
Kromatografi Lapis Tipis
Cara deteksi noda tergatung dari adsorben dan
bahan pengangga yang digunakan. Untuk
deteksi secara fisika atau kimia, adsorpben
yang baik adalah adsorben anorganik, bewarna
putih dan bahan penyangga dari kaca.
Sebaiknya adsorben juga tidak mengandung
bahan pengikat.
1) Metode deteksi secara fisika. Dapat
menggunakan sinar UV 254 nm dan 366 nm
Dapat menggunakan lapis tipis yang
mengandung indikator fluoresensi untuk
mendeteksi senyawa yang memadamkan
fluorosensi dalam sinar UV atau senyawa
yang tidak memadamkan fluoresensi sinar
UV gelombang pendek.
Cara fisika lainnya adalah dengan
menggunakan deteksi ionisasi nyala. Dalam
hal ini pemisahan kromatograti dilakukan
pada batang pengaduk yang dilapisi dengan
adsorben. Setelah pengembangan, batang
pengaduk dilewatkan dengan cepat melalui
nyala detektor ionisasi nyala.
2) Metode deteksi secara kimia. Deteksi secara
kimia ini tergantung dari reaksi senyawa
yang bersangkutan. Reaksi dilakukan
dengan
meyemprot,
mencelup
atau
melewatkan kromarogram melalui larutan
pereaksi/larutan penampak bercak. Jika
kromatogram dicelup pelarut penampak
bercak yang digunakan, hendaknya larutan
ini tidak melarutkan senyawa bersangkutan.
Setalah
penyemprotan
kromatogram
dikeringkan. Sering kali setelah direkasikan
dengan pelarut penampak noda, perlu
dilakukan pengeringan/pemanasan dalam
oven selama beberapa saat.
Pereaksi yang digunakan sebagai penampak
noda ini dapat berupa pereaksi umum,
selektif atau spesifik. Bila mengalisa suatu
senyawa yang tidak diketahui maka
digunakan pereaksi umum terlebih dahulu,
kemudian untuk memastikan baru digunakan
pereaksi selektif atau spesifik.
Sebagai peraksi umum dapat digunakan:
a) Asam sulfat pekat, akan memberikan
bercak yang berwarna setelah atau tanpa
pemasan. Pemanasan dapat merubah
warna tertentu atau memperbesar
intensitas warna. Hanya saja harus
dilakukan dengan hati-hati, sebab jika
tidak bercak akan mengarang hingga tidak
55
spesifik lagi karena pengarangan ini akan
diberikan oleh semua senyawa organik.
Data juga digunakan asam sulafat 50 %
dalam air. Tetapi karena larutan air tidak
berpenetrasi ke dalam adsorben dapat
memberikan penyemprotan yang tidak
merata. Akan memberikan hasil yang lebih
baik jika digunakan pelarut organik.
Sebagai pengganti asam sulfat dapat
digunakan campuran amonium sulfat dan
amonium
hidroksida
dengan
perbandingan 1:1.
b) Uap iodium, akan memberikan noda
berwarna coklat, karena terbentuknya
kompleks adisi lemah dengan beberapa
senyawa. Caranya dapat dengan
penyemprotan dengan larutan iodium 1%
dalam
metanol
atau
meletakkan
kromatogram di atas wadah yang
mengandung uap iodium. Perlu diketahui
bahwa iodium yang sudah terikat akan
terlepas kembali setelah beberapa waktu
lamanya
atau
jika
kromatogram
dipanaskan dan warna coklat yang terjadi
akan hilang. Tetapi ada beberapa
senyawa yang bereaksi secara iriversibel
dengan iodium yaitu beberapa steroid
aromatik yang mengandung cincin A.
c) Asam lainya, seperti asam perklorat 2%,
asam ortofosfat 50% yang akan
memberikan noda yang berfluorosensi.
Asam fosfomolibdat 10% memberikan
noda yang berwarna. Asam-asam ini
digunakan sebagai larutan dalam
metanol.
d) Campuran asam sulfat dengan oksidator
kuat
seperti
serisulfat,
kalium
permanganat, kalium bikroomat dan asam
nitrat memberikan noda yang mengarang
setelah pemanasan.
e) Halida logam seperti antimon triklorida,
antimon pentaklorida, seng klorida dan
besi(III)klorida dalam pelarut organik
memberikan noda berfluorosensi dengan
senyawa.
Sebagai pereaksi selektif dapat digunakan :
a) Ninhidrin untuk gugus amin primer.
b) Klorinasi, kalium ionida dan amilum untuk
gugus amina sekunder.
Kromatografi Lapis Tipis
c) Pereaksi Dragendorff atau iodoplatinat
untuk gugus amin tersier dan amonium
kuarterner.
d) Indikator asam-basa, misalnya biru
bromfenol untuk gugus asam atau basa.
e) Para-dimetil-amonium-benzaldehida untuk
gugus amina aromatik atau cincin indol.
f) Assay sulfanilat yang terdisosiasi untuk
gugus fenol.
g) 2,4-dinitrofenilhidrazin untuk senyawa
oso.
3) Metode deteksi secara enzimatik dan
biologik. Metode enzim digunakan untuk
mendeteksi enzim atau mendeteksi substrat,
misalnya untuk amilase. Dalam hal ini lapis
tipis disemprot dengan larutan amilum,
dinkubasi untuk beberapa saat lamanya,
kemudian disemprot dengan larutan iodium.
Amilase akan terlilhat sebagai bercak tak
berwarna dengan latar belakang biru.
7.6 Faktor-faktor yang perlu diperhatikan
pada KLT
1) KLT seperti metode kromatografi lainnya
adalah metode pembandingan. Untuk
identifikasi suatu senyawa haruslah
digunakan senyawa pembanding dan tidak
dapat digunakan harga Rf yang ada dalam
pustaka.
2) Jika suatu sampel yang tidak diketahui
memberikan
satu
noda
setelah
pengembangan dengan sistem pelarut
tertentu, belum berarti bahwa sampel hanya
mengandung
satu
senyawa.
Untuk
memastikan harus dilakukan pengembangan
dengan sistem pelarut yang lainnya atau
digunakan metode pengembang lainnya.
3) Jika suatu senyawa yang tidak diketahui
menunjukkan harga Rf yang sama dengan
senyawa pembanding, belum berati bahwa
kedua zat tersebut adalah identik. Untuk
memastikan maka harus dikembangkan
dengan sistem pengembangan yang lain.
Kepustakaan
1. Chamberlain, J., 1985, Analysis of Drugs in
Biological Fluid, CRC Press Inc. Boca
Raton.
2. Ho.K.I., Loh,H.H.. Leong Way,E.. Mini Thinlayer Chromatography in The Detection of
Narcotics in Urine from Subjects on A
56
3.
4.
5.
6.
7.
Methadone Maintenance Program., J.
Chrorrtatogr., 65., 1972, hal. 577-579.
Johnsan. E.L., Stevenson,R., 1991, Dasar
Kromatografi Cair, Penerbit ITB, Bandung.
Kovar. A, 1987, Identifikasi Obat,Penerbit
ITB, Bandung.
Loh, H.H., et al., Mini Thin-layer
Chromatography III: A Rapid and Sensitive
Methode
for
The
Estimation
of
Amphetamine and Methamphetamine, J.
Chromatogr., 65 1972, 189-293.
Moffat, A.C., et al. (Ed), 1986,Clark's
Isolation and Identification of Drugs in
Pharmaceuticals, Body Fluids, and Post
mortem Material, Second ed., The
Pharmaceutical Press, London.
Roberson, J.C., 1991, The Use of Thin-layer
Chromatography in the Analysis of Drugs
of Abuse, Gough, T, The Analysis of Drugs
Kromatografi Lapis Tipis
of Abuse, 3-22, Jhon Wiley& Sons,
Chichester.
8. Skoog; D.A., Leary, J.J., 1992, Princiles of
lnstrumental Analysis, 4th Ed., Harcourt
Brace Publisher, New York.
9. Sriewoelan, S. 1988, Analisis Obat Dalam
Cairan Biologik, ITB, Bandung
10.Unated Nation, 1995, Recommended
Methods for The Detection and Assay of
Heroin,
Cannabinoids,
Cocaine,
Amphetamine Methamphetamine and RingSubstituted Amphetamine Derivaties in
Biological Specimens Manual for Use by
National Laboratories, United Nations
International Drug Control Programme, New
York.
11.Willard. H.H., et all 1989, Instrumental
Methods of Analysis, Wadsbuorth Publising
Company, California.
57
BAB VII I
PENGGUNAAN KROMATOGRAFI GAS
DALAM ANALISIS TOKSIKOLOGI
Jika dalam suatu sistem kromatografi sebagai
fase gerak digunakan gas, maka tekniknya
disebut kromatografi gas. Ada dua jenis
kromatografi gas yaitu kromatografi gascair
jika fase diamnya berupa cairan dan
kromatografi gas-padat jika fase diamnya
berupa padatan. Kromatografi gas-cair
merupakan kromatografi partisi, sedangkan
gas padat merupakan kromatografi adsorpsi.
Proses pemisahan pada kromatografi gas
didasarkan atas prinsip yang sama seperti
pemisahan kormtografi jenis lainnya.
Kromatografi sering digunakan untuk analisis
obat, baik untuk analisis toksikologi maupun
analisis
senyawa
obat
itu
sendiri.
Keunggulan kromatografi gas adalah dapat
memisahkan senyawa dan secara langsung
dapat melakukan analisis kualitatif dan
kuantitatif memiliki reprodusibilitas yang tinggi
pada penggunaan rutin. Seperti metode analisis
lainnya kromatografi gas juga memiliki
keterbatasan.
Bentuk obat yang disalahgunakan adalah
komplek tidak homogen, dengan variasi yang
luas pada volatilitas, polaritas. dan
reaktivitasnya.
Sehingga
diperlukan
pertimbangan yang mendasar jika hanya
menggunakan kromatografi gas sebagai salah
satu alat metode analisis.
8.1. Parameter Retensi
Waktu retensi tR adalah waktu yang
dibutuhkan untuk mengelusi maksimum
zone dihitung dari waktu menyuntikan
sampel. Laju aliran Fa adalah laju aliran fase
gerak (dalam ml / menit), diukur pada outlet
kolom pada suhu kamar. Laju aliran dalam
kolom Fc , akan berbeda dengan Fa jika suhu
kolom Tc, berbeda dengan suhu lingkungan Ta.
H ubungan antara besaran-besaran ini adalah:
T

F c = F a  C

T
a 

(8.1)
dimana suhunya adalah suhu absolut. Volume
retensi eksperimantal VR adalah:
Penggunaan GC Dalam Analisis Toksikologi
T
V R = Fa  C 
 Ta 
(8.2)
Dengan cara yang sama volume fase gerak
kolom VM diberikan oleh persamaan:
(8.3)
VM = Fc t M
dimana tM adalah waktu retensi suatu senyawa
yang tidak ditambat oleh kolom. VM seringkali
disebut volume mati dan merupakan volume
minimum gas pembawa yang harus
dipindahkan sebelum suatu puncak dielusi. Di
dalam kolom dapat terjadi penurunan tekanan
dengan tiba-tiba yang akan menyebabkan
variasi laju aliran gas sepanjang kolom. Oleh
karena itu volume retensi harus dikoreksi
terhadap efek ini dengan faktor koreksi
penurunan tekanan tiba-tiba j:


j = 2


3
( )
( )
Pi
Pi
2
Po
3
Po
− 1 

− 1 
(8.4)
dimana Pi dan Po adalah tekanan inlet dan
outlet. Dalam hal ini, volume retensi yang
dikoreksi V°R adalah :
V Ro = jV R
(8.5)
VRo ini banyak digunakan untuk mengukur
retensi senyawa dan karena mempunyai
hubungan dengan koefisien partisi senyawa
dapat digunakan untuk identifikasi senyawa.
Selain itu dikenal juga volume retensi yang
disesuaikan V R' :
V R' = V R − VM = t R FC − t ud FC
(8.6)
dimana tud adalah waktu retensi udara. Dalam
kromatografi gas, fase gerak dapat ditekan.
Karena gas bergerak lebih lambat dekat inlet
dari pada di outlet kolom, maka harus
dilakukan koreksi gradien tekanan atau koreksi
dengan faktor kompresibilitas j terhadap
volume retensi yang disesuaikan memberikan
volume retensi bersih (netto ) VN
V N = jV R'
(8.7)
8.2. Peralatan
58
Skema alat kromatografi gas terlihat pada
gambar (8.1). Sampel disuntikkan ke dalam
aliran gas pada pintu sampel. Setelah dari
kolom aliran efluen melewati detektor yang
akan memberikan sinyal listrik yang
proposional pada beda antara kandungan eluat
dan efluen. Pintu sampel, kolom dan detektor
berada dalam oven yang suhunya dikontrol.
Gas pembawa biasanya adalah nitrogen atau
helium. Kolom terbuat dari gelas/kaca atau
logam berdiameter ⅛ atau 1/4 inci dengan
panjangnya berkisar 30 meter. Fase diam harus
tidak mudah mengurai pada suhu yang
digunakan untuk pemisahan dan harus
mempunyai selektivitas yang mencukupi untuk
campuran yang hendak dipisahkan. Selektivitas
dapat pemisahan dapat diprediksi dari
perbedaan harga koefisien partisi komponenkomponen yang hendak dipisahkan.
Gambar 7.1. Skema alat kromatografi gas.
Sampel biasanya disuntikkan sebagai larutan
sebanyak 1 - 50 µL ke dalam aliran gas. Ukuran
sampel sebaiknya sekecil mungkin dan
disuntikkan sebagai zone yang sempit untuk
mengurangi lebar puncak yang terelusi. Pintu
sampel dipanaskan agar sampel yang
disuntikkan segera menguap dan dibawa oleh
gas pembawa ke dalam kolom.
Terdapat beberapa jenis detektor yang
digunakan pada kromatografi gas:
i) Detektor konduktivitas termal (thermal
condacctnIty
detector,
TCD)
yang
didasarkan atas prinsip bahwa panas akan
hilang dari kawat panas yang diletakkan di
dalam gas dengan laju yang dipengaruhi
oleh sifat dari gas. Dengan mengukur
tahanan listrik kawat, konduktivitas termal
gas dapat diukur.
ii) Detektor ionisasi nyala (flame ionisation
detector, FID). Dalam hal ini efluen dialirkan
ke nyala hidrogen. Senyawa dalam efluen
akan
terbakar
dalam
nyala
dan
menghasilkan ion. Nyala ditempatkan
diantara dua elektroda yang diberi
potensial. Arus yang dibawa di antara
elektroda ini oleh nyala, adalah
proporsional
terhadap
konsentrasi
Penggunaan GC Dalam Analisis Toksikologi
senyawa di dalam efluen, sinyal listrik yang
terjadi diamplifikasi dan direkam.
iii) Detektor penangkap elektron (electron
capture detector. ECD), didasarkan juga
pada proses ionisasi gas, tetapi dalam hal
ini gas pembawa yang terionisasi, bukan
senyawanya. Jika suatu molekul senyawa
mengandung atom elektronegatif kuat
masuk kearah efluat, elektron akan
ditangkap oleh senyawa yang akan
mengakibatkan berkurangnya arus latar
belakang. Perubahan dalam arus ini yang
memberikan sinyal pada kromatogram.
Detektor ini sangat resposif terhadap
molekul yang mengandung halogen dan
senyawa elektronegatif lainnya, oleh karena
itu banyak digunakan dalam analisis
pestisida,
iv) Nitrogen fosfor detektor (NPD)
Dari
keempat
detektor
ini
detektor
konduktivitas termal adalah universal dan
memberikan respon terhadap semua senyawa;
detekrtor ionisasi nyala memberikan respon
terhadap semua senyawa organik, sedangkan
detektor
penangkap
elektron
hanya
memberikan respon terhadap molekul atau
atom elektronegatif. Detektor konduktivitas
59
termal memberikan respon dalam jumlah
mikrogram, detektor ionisasi nyala terhadap
jumlah nanogram dan detektor penangkap
elektron terhadap jumlah pikogram.
Fase diam, terdapat banyak pilihan fase diam,
pada suatu katalog 1986 terdapat 440 pilihan.
Di dalam literatur menunjukkan bahwa SE
30/OV-1 dan OV-17 adalah fase diam yang
sangat luas digunakan untuk analisis obat.
Pada fase polar beberapa obat tidak dapat
dipisahkan menggunakan kolom SE 30.
Frekuensi distribusi obat pada fase diam SE-30
dan OV-17 hampir mendekati rectangular,
dimana ini berarti memiliki daya diskriminasi
yang optimum. Sehingga fase diam ini sangat
luas digunakan dan telah terkumpul data
kepustakaan waktu retensi obat-obatan. Data
ini sangat penting untuk uji skrining.
8.3. Analisis Kualitatif
Terdapat dua pendekatan untuk melakukan
analisis kualitatif:
i) Pada khasus dimana terdapat indikasi kuat
untuk mengidentifikasi senyawa yang
diduga, kromatografi gas digunakan sebagai
tahap untuk pembuktian senyawa kimia
tersebut.
ii) Indikasi suatu senyawa tidak diketahui,
kromatografi gas sebagai metode untuk
mereduksi sejumlah jumlah kemungkinan
dengan
mengkunjugasikan
dengan
spektrofotometer atau teknik lainnya.
8.3.1. Pembandingan waktu tambat.
Analisa dari suatu senyawa dapat dilakukan
dengan membandingkan waktu tambat
senyawa yang diduga dengan baku
pembanding. Untuk menghindari pergeseran
waktu tambat akibat pengaruh konsentrasi
(khususnya pada kolom polimer yang poros
akibat pengepakan yang tidak sempurna) dapat
diatasi dengan menggunakan konsentrasi yang
sama.
Variasi waktu tambat antara senyawa dan baku
pembanding disebabkan oleh variasi dari
radas-radas pada alat kromatograti gas,
pengaruh waktu, pengaruh cara penyuntikan
dan juga faktor keterulangan antara operator
yang berbeda. Contoh reprodusibilitas waktu
tambat untuk menggunakan penyuntikan
otomatis sebaiknya lebih kecil dari 0,03 %.
Penggunaan GC Dalam Analisis Toksikologi
8.3.2.Waktu tambat relatif
Dari beberapa khasus telaah senyawa yang
belum diketahui dengan menggunakan
kramatografi gas dapat diperkecil dugaannya
dengan membandingkan waktu tambatnya
terhadap sejumlah senyawa pembanding.
Biasanya data waktu tambat pembanding
bukan merupakan data absolut, tetapi
menunjukan variasi yang besar yang
disebabkan oleh jenis gas dan kecepatan laju
elusi, temperatur dan konsentrasi. Untuk
mengurangi variasi ini data dikelompokan ke
dalam sistem / variabel yang hampir
berdekatan.
Langkah pertama, waktu tambat dinyatakan
sebagai hasil bagi / nisbah dari waktu tambat
senyawa pembanding (waktu tambat relatif =
RRf) pada kondisi yang sama. Pemilihan
senyawa pembanding sebaiknya dipilih
senyawa yang telah sering digunakan untuk
analisis pada laboratorium tersebut dan
memberikan kinerja kromatografi yang baik.
Kelemahan metode ini adalah setiap
lababoratorium
menggunakan
senyawa
pembanding yang berbeda, sesuai dengan
analit yang ditetapkan, kadang juga
lababoratorium yang sama menggunakan
pembanding yang berbeda untuk senyawa
yang berbeda.
8.3.3. Indek Waktu Tambat
Metode berikutnya adalah metode Kovats atau
indeks waktu tambat yang menggunakan nalkana sebagai standard. Pada kondisi
isotermal, logaritmik waktu tambat dari alkana
adalah sebanding dengan jumlah atom C-nya.
Keuntungan dari metode ini adalah relativ tidak
bergantung pada laju aliran gas, persen fase
diam dan panjang kolom.
8.3.4. Indek respon
Faktor tambahan yang digunakan untuk
menentuan identifikasi dari suatu senyawa
adalah dengan membandingkan respon relatif
senyawa tersebut pada dua detektor yang
berbeda. Untuk mendapatkan reabilitas yang
tinggi perlu digunakan internal standard. Beker
menggunakan kolom OV-17 yang diujungnya
terdapat pemisah dan detektor FID/NPD kofein
sebagai internal standard. Data dinyatakan
sebagai:
57
Indeks respon =
U NPD
S NPD
U FID
(8.8)
S FID
dimana U respon detektor terhadap analit dan S
adalah serpon terhadap standard.
8.4. Analisis Kuantitatif
Kromatografi gas terutama digunakan untuk
analisis kualititatif campuran senyawa, tetapi
kromatogram
yang
dihasilkan
juga
mengandung informasi yang memungkinkan
untuk melakukan analisis kuntitatif. Hal ini
disebabkan kenyataan bahwa luas area
dibawah kurva pada kromatogram adalah
proporsional dengan jumlah senyawa yang
terkandung oleh zone yang terelusi. Analisis
kuantitatif meliputi pengukuran area/luas dan
menentukan proporsionalitasnya.
Apabila radas kromatogram tidak dilengkapi
dengan
integrator,
secara
sederhana
pengukuran puncak dapat dilakukan dengan
mengasumsikan
kromatogram
sebagai
segitiga,
dengan
menerapkan
prinsip
pengukuran luas segitiga, maka luas
kromatogram dapat dihitung. Belakangan ini
hampir semua peralatan analisis dikontrol oleh
komputer, sehingga sistem kromatografi
otomatis luas ini dapat ditentukan dengan
komputer.
Kuantitas yang didapat selanjutnya harus
dikonversikan ke dalam jumlah atau persentase
komponen yang terdapat dalam sampel. Ada
tiga cara yang berbeda untuk melakukan hal
ini:
i) Kalibrasi dengan standard eksternal, cara
ini sebenarnya adalah analog dengan cara
menggunakan kurva kerja/kurva standar
dalam spektroskopi. Satu seri sampel yang
mengandung jumlah senyawa yang hedak
dianalisis dalam jumlah yang berbeda
dikromatografi pada kondisi yang sama.
Kurva dari tinggi puncak / luas puncak
versus ukuran konsentrasi sampel akan
memberikan kurva kalibrasi linier. Suatu
sampel yang tidak diketahui dapat
dianalisis dengan mengkromatografinya
pada kondisi yang sama, dan membaca
jumlah
komponen konsenirasi yang
bersangkutan pada kurva kalibrasi.
Kelemahan metode ini adalah bahwa
Penggunaan GC Dalam Analisis Toksikologi
diperlukan kondisi yang sama untuk
standar dan sampel
ii) Kalibrasi dengan sandard internal,
kelemahan pada metode di atas dapat
diatasi dengan standard internal, yang
merupakan
suatu
senyawa
yang
ditambahkan pada sampel. Standard
internal ini harus terpisah sempurna dari
semua komponen yang terdapat dalam
sampel, harus mempunyai waktu tambat
mendekati waktu tambat senyawa yang
hendak ditentukan. Cara ini dilakukan
dengan menyiapkan kurva standard melalui
kromatografi ratio bobot tertentu dari
standard dan komponen sampel.
Kurva dibuat dari ratio As/Ais versus Ws/Wis,
dimana A adalah luas puncak dan W adalah
bobot, s = standard, dan is = standard
internal. Dengan menambahkan jumlah
standard internal yang sama ke dalam
suatu rentang konsentrasi standard, kurva
linier akan diperoleh dari As/Ais versus
Ws/Wis karena Ais dan Wis adalah konstan
pada rentang konsentrasi standard. Sampel
yang tidak diketahui cheat ditentukan
dengan menambahkan suatu bobot internal
standard yang sama seperti pada
pembuatan kurva kalibrasi kepada sampel,
campuran dikromatografi ratio luas puncak
diukur, dan ratio bobot dibaca pada kurva.
Karena semua kuantitas merupakan ratio,
metode standard internal ini akan
mengkonpensasi perubahan dalam kondisi
kromatografi selama perubahan ini akan
mempengaruhi baik standarard ataupun
komponen sampel dengan cara yang sama.
iii) Normalisasi luas puncak, misalkan suatu
sampel mengandung komponen x, y, dan z
dan bahwa respons kromatograti gas
adalah sama untuk semua komponen
dengan basis molar. Maka persentase
komponen x dalam sampel adalah sama
dengan persentase luas total pada
kromatogram untuk x:
(8.9)
100 (luas x )
%X =
(luas x + luas y + luas z )
Jika faktor respons adalah berbeda untuk
berbagai komponen, harus dilakukan
koreksi.
8.5. Derivatisasi Pada Kromatograti Gas Cair
58
Banyak senyawa dapat ditentukan dengan
kromatografi gas, senyawa yang mudah
menguap dapat ditentukan dengan mudah.
Masalah akan muncul apabila menganalisa
senyawa dengan titik didih yang tinggi atau
senyawa tidak stabil pada suhu analisa.
Sehingga untuk dapat menganalisa senyawa
seperti itu, dibuat derivat yang mudah
menguap. Derivat ini biasanya akan
mempertinggi stabilitas dalam kromatografi
berlangsung, mempertinggi volatilitas untuk
analisis, memperkecil adsorpsi, identifikasi
yang lebih positif, memperbaiki pemisahan dan
spesifisitas
terhadap
gangguan
atau
"background", dari mempertinggi sensitfitas
respons detektor.
Seringkali
senyawa
yang
labil
jika
dikromatografi akan mengalami dekomposisi
termal dan/ atau penguraian katalitik seperti
misalnya steroida. Hal ini dapat menyebabkan
puncak yang terdistorsi, puncak yang sangat
lebar dan respons non-linier. Mengurangi suhu
kolom dan penggunaan sistem all-glass dapat
mengurangi sebagian masalah ini, tetapi
seringkali tidak berhasil. Dengan membuat
derivat/turunan yang sesuai, stabilitas senyawa
mungkin dapat dipertingi dan seringkali
derivatisasi dapat mempertinggi volatilitas
hingga analisis dapat dilakukan pada suhu
yang lebih rendah. Derivatisasi ini juga dapat
diterapkan untuk senyawa yang karena bobot
molekulnya dan tekanan uapnya tidak dapat
dikromatografi pada kondisi yang umum.
Melalui pembentukan derivat/turunan pada
mana gugus interaksi polarnya dilindungi
(masking) oleh bagian non-polar dapat
mengatasi interaksi adsorpsi. Sebagai contoh
morfin dan narkotik kerabatnya yang
penentuan kadarnya mengalami kesukaran
terlebih-lebih dalam jumlah sub-mikrogram. Hal
ini disebabkan oleh puncak yang berekor dan
respon tergantung pada jenis kolornnya selain
pada jumlah sampel yang disutikan.
Manisfestasi ini dapat diatasi dengan membuat
Penggunaan GC Dalam Analisis Toksikologi
derivat/turunan eter trimetilsilil yang akan
memberikan puncak yang cukup simetris dan
respons yang tidak saja linier tapi lebih baik
dibandingkan
dengan
basa
bebasnya.
Derivatisasi ini juga berguna jika menghadapi
kerusakan yang terdiri dari gangguan blangko
biologik dan latar belakang.
Kepustakaan
1. Huizer, H., (1991), The use of gas
chhromatography for the detection and
quantitation of abused drugs, Gogh, T., A.,
The Analysis of Drugs Abuse, John Wiley &
Sons, Chichester, 23- 92.
2. Sriewoelan, S. (1988), Analisis Obat Dalam
Cairan Biologik, ITB, Bandung.
3. Moffat, A.C., et.al,, (Ed), (1986), Clark's
Isolation and Identification of Drugs in
Pharmaceuticals, Body Fluids, and PostMoterm Material, Second ed., The
Pharmaceutical Press, London.
4. Johnsan, E.L., Stevenson,R., (1991), Dasar
Kromatografi Cair, Penerbit ITB, Bandung.
5. Skoog, D.A., Leary, J.J., (1992), Principles
of Instruniental Analysis, 4th Ed., Harcourt
Brace Publisher., New York.
6. Willard, HH.; et al., (1989), Instrumental
Methods of Analysis, Wadsbuorth Publising
Company. California.
7. Chamberlain, J., (1985), Analysis of Drugs
in Biological Fluid, CRC Press Inc, Boca
Raton.
8. United Nations, (1995) Recommended
methods for the detection and assay of
heroin,
cannabinoids,
cocaine,
amphetamine
and
ring-substituted
amphetamine derivates in biological
specimens manual for use by national
laboratories, United Nation International
Drug Control Programme, New York
59
BAB IX
PENGGUNAAN KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI
”High Performance Liquid Chromatography (HPLC)”
DALAM ANALISIS TOKSIKOLOGI
Metode analisis obat pada penyalahgunaan
obat-obatan seharusnya sederhana dan
spesifik untuk obat-obatan tertentu atau untuk
kelompok obat tertentu, dan seharusnya
memberikan ketepatan dan ketelitian analisis
yang tinggi. HPLC adalah salah teknik analisis
yang tepat untuk kriteria tersebut di atas.
Khususnya dalam menganalisis senyawa yang
termolabil seperti analog gugus asam
karboksilat dari kanabinoid yang sangat susah
dianalisis menggunakan kromatografi gas.
HPLC juga lebih fleksible dibandingkan
kromatografi gas, karena dapat memilih berbagai
fase gerak atau fase diam yang akan digunakan
untuk keperluan analisis.
pengoperasiannya pada temperatur rendah
sehingga dapat meminimalkan terjadinya
dekomposisi termal; dapat digunakan untuk
menganalisa senyawa non-volatile atau
senyawa polar; kemampuannya dalam
memisahkan senyawa dengan perbedaan
rentang polaritas yang luas; HPLC fase batik
menggunakan fase gerak (pelarut) larut air.
Potensialitas HPLC sangat berguna untuk
pemisahan, identifikasi, dan penetapan kadar
senyawa obat dan metabolitnya, walaupun
waktu dan uhasa yang keras akan menentukan
apakah metode dapat diterapkan dosentilitas,
kesederhanaan, dan sarana yang diinginkan.
HPLC memiliki beberapa keunggulan seperti:
Gambar 9.1: Skema peralatan HPLC
Peralatan HPLC terdiri dari empat bagian utama: 1) pompa untuk menyuplai fase gerak. 2) sistem
penyuntikan sampel, 3) kolom, dan 4) detektor
diperdadangan dengan nama dagang SepPak
9.1. Pemilihan Sistem HPLC
atau Bond-Elut atau merek lainnya. Fase padat
atau kolom tersebut dapat berupa silika terikat
9.1.1. Pra-kolom dan ekstraksi fase padat
dengan derivat etil, oktil; pertukaran ion; nonPada analisis toksikologi forensik sebelum
ionik polisterin-divinil benzen-co polimer XADsampel diinjeksikan ke dalam kolom terlebih
2. Penggunaan pra kolom dan ekstraksi fase
dahulu dapat dilewatkan pada pra-kolom yang
padat ini memungkinkan menginjeksikan
memungkinkan terjadi ekstraksi obat pada fase
materi yang relatif murni ke dalam kolom HPLC.
padat dari materi biologi atau dari ekstrak
Sehingga akan dapat mem-perpanjang umur
kasar, seperti cannabis, opium, atau
kolom. Untuk memperpanjang umur kolom
amfetamin.
Pada
tahap
ini
obat
pada HPLC biasanya dilengkapi Guard colum
dipekatkan/terkonsentrasi pada fase padat dan
yang berfungsi menahan partikel - partikel kecil
kemudian dielusi dengan pelarut yang tepat,
yang terbawa dalam sampel, sehingga tidak
sehingga diperoleh fraksi analit.
akan menyumbat kolom.
Pra-kolom dikemas ke dalam kolom yang
berukuran kecil yang banyak tersedia
Penggunaan HPLC Dalam Analisis Toksikologi
9.1.2. Sistem injeksi
60
Cuplikan harus dimasukkan ke dalam pangkal
kolom (kepala kolom), diusahakan agar sedikit
mungkin terjadi gangguan pada kemasan
kolom. Analit yang diinjeksikan harus tidak,
mengandung partikel yang tersuspensi
sehingga diperlukan mikrofilter sebelum
diinjeksikan ke dalam kolom.
Metode yang paling luas digunakan untuk
menginjeksikan sampel adalah sistem katup
kitar "sampling pool" alat ini menyatu dengan
HPLC, dan dapat mamasukkan sampel antara
5-500 µL. Mikro sampling injkesi dapat
menginjeksikan volum 0,5 - 5 µL. Perlu juga
diperhatikan jika menginjeksikan pelarut dapar
(dapar fosfat) sebab dapar tersebut dapat
mengkristal jika tercampur dengan pelarut
organik (fase gerak).
Sistem injeksi automatis banyak dijumpai pada
sistem HPLC, dengan kerja injeksi pneumatik,
dibawah kontrol komputer. Sistem ini biasa
digunakan pada analisis rutin dengan jumlah
sampel yang banyak.
9.1.3. Sistem Pompa
Terdapat dua jenis pompa yang digunakan
untuk memompakan fase gerak melalui kolom
yaitu tekanan tetap dan pendesakan tekanan.
Pompa pendesakan tetap dapat dibagi menjadi
pompa torak dan pompa semprit. Pompa torak
mengasilkan aliran berdenyut, jadi memerlukan
peredam denyut atau peredam elektronik untuk
menghasilkan garis alas detektor yang, stabil
jika detektor peka terhadap aliran. Kelebihan
utamanya ialah tandonnya yang tidak terbatas.
Pompa semprit menghasilkan aliran yang tak
berdenyut, tetapi tandonya terbatas.
9.1.4. Kolom
Kolom merupakan jantung kromatografi
keberhasilan
atau
kegagalan
analitis
tergantung pada pemilihan kolom dan kondisi
kerja. Kolom dapat dikelompokkan menjadi dua
kelompok :
i) Kolom analitik: garis tengah dalam 2 - 6 mm.
Panjang bergantung pada jenis kemasan,
untuk kemasan pelikel biasanya panjang
kolom 50 - 100 cm, untuk kemasan mikro
pelikel 10 -30 cm. Untuk analisis obat
volume sampel yang diinjeksikan antara 20 50 µL, mengandung 20-50 µg obat. Untuk
mengelusi analit diperlukan tekanan 1000 2500 psi dan volume elusi 50 ml.
Penggunaan HPLC Dalam Analisis Toksikologi
ii) Kolom preparatif ; umumnya bergaris
tengah 6 mm atau Iebih besar dan
panjangnya 25 - 100 cm.
Terdapat berbagai variasi kolom yang
digunakan untuk analisis obat, seperti fase
normal, silika, kromatografi fase balik;
oktadesil yang terikat dengan silika atau fase
terikat rantai hidrokarbon yang lainnya
Untuk analisis obat secara rutin pada periode
waktu yang lama dan data waktu tambat
digunakan sebagai uji skrining dan konfirmasi.
Sangat direkomendasikan untuk membeli
kolom dengan nomer batch yang sama, sebab
nomer batch yang berbeda memberikan data
indeks retensi yang berbeda.
9.1.5. Fase Gerak
Pada kromatografi cair susunan pelarut atau
fase gerak merupakan salah satu variabel
(peubah) yang mempengaruhi pemisahan.
Berbagai macam pelarut dipakai dalam semua
ragam HPLC, tetapi ada beberapa sifat yang
diinginkan berlaku umum. Fase gerak harus:
murni, tanpa cemaran; tidak bereaksi dengan
kemasan; sesuai dengan detektor; dapat
melarutkan
sampel/analit;
mempunyai
tokskositas
rendah;
memungkinkan
memperoleh kembali analit/sampel dengan
mudah jika diperlukan; harganya wajar. Dari
semua persyaratan empat yang, pertama yang
paling penting.
Elusi isokratik adalah metode pengelusi
dimana komposisi fase gerak mulai sampel di
injeksikan ke dalam kolom sampai semua
sampel terelusi adalah tetap. Elusi isokratik
untuk pemisahan sampel dengan rentang harga
k' (koefisien partisi) yang luar biasanya
memberikan resolusi yang tidak baik, sangat
susah untuk mendeteksi akhir dari suatu
puncak (puncak yang dihasilkan berekor), dan
memerlukan waktu analisis yang sangat lama.
Untuk memisahkan sampel dengan rentang
harga k' yang luas biasanya digunakan elusi
terprogram. Elusi terprogram, analog dengan
pemrograman suhu pada GC. Elusi terprogram
juga disebut elusi gradien, yang melihatkan
perubahan komposisi fase gerak secara
bertahap atau secara continu selama proses
elusi. Biasanya semua sampel pada awal/ saat
diinjeksikan tertahan pada kepala kolom.
Setelah elusi gradien dimulai kekuatan
pengelusi akan meningkat. Sampel dengan
61
harga k' yang, kecil akan terelusi terlebih
dahulu, diikuti oleh senyawa lain sesuai
dengan peningkatan harga k' dan kekuatan
pengelusi.
Persamaan dasar untuk elusi gradien dapat
menggunakan persamaan k' diganti dengan k
rata-rata selama elusi gradien berlangsung.
Persamaan tersebut adalah :
Waktu tambat: t g = t M k log(2,3 k o / k ) (9.1)
 N (α − 1)  k 

 k + 1  (9.2)

4


Resulusi: Rs = 
Pelebaran pita: σ g =
VM (1 + k ) N
2
(9.3)
dimana ko adalah harga k' pada saat elusi
gradien dimulai, t waktu tambat pada elusi
gradien, dan σg lebar pita gradien (satu kali
standard deviasi).
Harga k pada saat elusi dari solut seharusnya
berada antara 1 < k < 10, seperti pada elusi
isokratik. Pada saat pita meninggalkan kolom ,
k masing-masing sangat kecil ( ∞ 1). Harga k,
yang kecil pada waktu dari akan memberikan
pita yang sempit. Lebar pita sempit berarti
meningkatkan sensitititas (detektor).
Interaksi antara solute dengan gugus siloksil
bebas dari silika dan isoterm adsorpsi nonlinier
adalah alasan utama yang menyebabkan noda
berekor pada kromatografi fase normal.
Masalah ini dapat diatasi jika molekul solut
dapat berinteraksi dengan pelarut lebih polar.
Dengan secara konstan merubah komposisi
fase gerak pada periode analisis, sehingga
daya elusi dapat ditingkatkan. Dengan metode
elusi gradien dimulai dengan pelarut non-polar
hingga pelarut polar. Laju pencampuran pelarut
dapat secara linier atau eksponensial. Pada
HPLC sudah dilengkapi radar (device) untuk
mengatur pencampuran pelarut ini. Metode
elusi gradien ini tidak hanya dapat mengatasi
puncak berekor tetapi juga akan memberikan
resolusi yang lebih baik. Yang lebih penting
dapat menurunkan waktu analisis campuran
komplek, yang memiliki harga k' berbeda.
Sistem ini memberikan analisis yang sangat
selektif karena memberikan puncak yang lebih
tajam. HPLC modern menyediakan radas elusi
gradien sampai menggunakan empat campuran
pelarut yang berbeda.
Penggunaan HPLC Dalam Analisis Toksikologi
Pemilihan sistem pengelusi untuk kromatografi
partisi fase normal, daya elusi pelarut
mengikuti derajat eluotropik. Pada rangkaian
pelarut ini meningkat daya eluotropiknya:
heksana < toluen < dietileter < kloroform <
etilasetat < etanol < metanol < pirirdin < asam
asetat. Pelarut yang umum digunakan pada
HPLC fase balik adalah air (atau larutan dapar),
asetonitril metanol, dan tetrahidrofuran. Pelarut
ini paling sering digunakan dalam analisis obat.
Kromatografi pasangan ion telah digunakan
untuk analisis obat khususnya pada sistem
kromatografi fase balik. Prosedur ini tergatung
pada kemampuan obat membentuk ion pada
larutan dapar yang sesuai. Ion lawan yang
sesuai larut dalam pengelusi, biasanya
konsentrasi ion lawan dalam 5 mM. Pasangan
ion obat dan ion lawan dielusi sebagai satu
kesatuan pada sistem kromatograti fase balik,
dan akan tertahan lebih lama pada fase diam
yang lifofilik. Beberapa contoh ion lawan
adalah garam-garam asam heptan sulfonat, dan
nitrium
lauril
sulfat,
tetraetil
atau
tetreapenilamonium halida untuk untuk obatobatan yang mengandung gugus karbonil
aatau fenate
9.1.6. Detektor
Detektor yang sering digunakan untuk analisis
obat adalah UV detektor. Detektor ini
dikelompokkan menjadi tiga kelompok:
detektor panjang gelombang tatap, detektor
panjang gelombang variabel atau panjang
gelombang tersebar, detektor diode-array.
Detektor
panjang
gelombang
tetap
menggunakan panjang gelombang tertentu
pada satu panjang gelombang, biasanya
dihasilkkan oleh lampu merkuri (254 nm),
kadang-kadang juga oleh Iampu cadmium
(225nm) dan zink (212 nm). Panjang gelombang
yang diemisikan oleh lampu ini tidaklah
monokromatis tetapi intensitas radiasi panjang
gelombang yang lainnya sangat rendah. Untuk
menghilangkan radiasi ini ditambahkan filter
antara sumber radiasi dan sel detektor.
Tidak semua obat mempunyai panjang
gelombang maksimum pada 254 nm, sebagai
konsekuensinya tidak semua senyawa obat
dapat dideteksi menggunakan detektor ini.
Masalahnya yang timbul juga tidak semua obat
dapat dideteksi pada serapan maksimumnya.
62
Tabel 8.1. Sifat dari pelarut yang digunakan untuk kromatografi cair (1)
Pelarut
UVa
RIb
BP (oC)c
ηd
ρe
εf
δg
kelompok
Isooktana
197
1.389
99
0.47
0.1
0.01
1.94
n-heksana
190
1.372
69
0.30
0.1
0.01
1.88
Sikloheksana
200
1.423
81
0.90
-0.2
0.04
2.02
Siklopentana
200
1.404
49
.42
-0.2
0.05
1.97
Karbon disulfide
380
1.624
46
0.34
0.3
0.15
2.64
Karbontetraklorida
265
1.457
77
0.90
1.6
0.18
2.24
Trietilamin
1.398
89
0.36
1.9
0.54
2.4
I
Isopropil eter
220
1.36
68
038
2.4
0.28
3.9
I
Dietil eter
218
1.350
35
0.24
2.8
0.38
4.3
I
Benzen
280
1.498
80
0.6
2.7
0.32
2.3
VII
Diklormetan
233
1.421
40
0.41
3.1
0.42
8.9
V
1-2 Dikloroetan
1.442
83
0.78
3.5
0.44
10.4
V
ter- bulanol
1.385
82
3.60
4.1
0.70
12.5
II
Butanol
210
1.397
118
2.60
3.9
0.70
17.5
II
Propanol
240
1.385
97
1.90
4.0
0.82
20.3
III
Tetrahidrofuran
212
1.405
66
0.46
4.0
0.57
7.6
III
Etil asetat
256
1.370
77
0.43
4.4
0.58
6.0
Via
Isopropanol
205
1.384
82
1.90
3.9
0.82
20.3
II
Kloroform
245
1.443
61
0.53
4.1
0.40
4.8
VIII
Etil metil keton
1.376
80
0.38
4.7
18.5
VIa
0.51
Aseton
330
1.356
56
0.30
5.1
0.56
VIa
Etanol
210
1.359
78
1.08
4.3
0.85
24.6
II
Asam Asetat
1.370
1118
1.10
6.0
6.2
IV
Asetonitril
190
1.341
82
0.34
5.8
0.65
37.5
VIb
Metanol
205
1.326
65
0.54
5.1
0.95
32.7
II
Air
1.333
100
0.89
10.2
80.2
VIII
a pelarut tidak dapat digunakan untuk deteksi pada panjang gelombang tersebut b indeks
Keterangan:
refraksi pada 25 oC; c Titik didih dalam oC; d Viskositas pada 25 oC, e Parameter polaritas
pelarut; g konstanta dielektri pada 20oC; h kelompok selektivitas pelarut.
susunan diode, masing celah diode merekam
Untuk memecahkan masalah ini digunakan
satu panjang gelombang. Sehingga masingdetektor panjang gelombang variabel atau
masing celah tersebut dapat digunakan untuk
diode array detektor. Sumber radiasi detektor
mengukur serapan pada λmak analit yang
panjang gelombang variabel menggunakan
melewati sel detektor, atau semua diode
lampu deuterium dan yang memberikan radiasi
merekam radian power (intensitas) yang
pada daerah UV. Antara sumber radiasi dan sel
dielusi. Detektor ini dapat juga digunakan
detektor ditempatkan monokromator, radiasi
untuk menentukan kemurnian analit yang
monokromatis yang melewati sel detektor akan
dipisahkan dengan cara mengukur sepektrum
ditangkap oleh photocell. Oleh photo sel
dari waktu ke waktu selama puncak tersebut
intensitas radiasi dirubah menjadi sinyal listrik
dielusi. Apabila spektra puncak tersebut
kemudian dimanipulasi sehingga dapat terbaca
berubah
selama
pengukuran
tersebut
sebagai data adsorban atau transmitan.
menunjukan puncak terelusi adalah tidak
Untuk HPLC yang menggunakan penghenti
tunggal. Kebanyakan diode array detektor
aliran, serapan spektra senyawa yang dideteksi
dilengkapi dengan pengukuran rasio absorban
dapat diukur. Berbeda dengan diode array
pada dua panjang gelombang yang berbeda,
detektor
tidak
melewatkan
radiasi
seperti yang digunakan untuk penetapan
monokrimatis ke dalam sel detektor. Radiasi
barbiturat.
polikromatis yang dilewatkan ke sel detektor
Detektor fluoresensi. Walaupun sangat sedikit
dilewatkan menuju monokromatis halokisi yang
digunakan untuk analisis obat detektor
mendispersikan radiasi polikromatis menuju
fluoresensi memiliki keuntungan dalam
Penggunaan HPLC Dalam Analisis Toksikologi
63
sensitivitas dibandingkan dengan detektor UV.
kususnya dalam batas deteksinya. Tidak semua
obat berfluoresensi, tetapi banyak dapat dibuat
manjadi turunan berfluoresensi dengan
pereaksi fluoresen yang sesuai, seperti asam
amino dapat dibuat menjadi turunan
berfluoresensi dengan menggunakan reagent
o-ftalaldehid atau fluorescamin. Morfin dapat
dibuat berfluoresensi dengan pereaksi
ferisianida membentuk apomorfin dengan
intensitas fluoresensi yang kuat.
Detektor elektrokimia adalah representatif
untuk monitoring penyalahgunaan obat.
Detektor ini sangat sensitive dan menunjukan
selektivitas yang tinggi. Hanya saja detektor ini
hanya dapat digunakan untuk menetukan obat
yang dapat dioksidasi atau direduksi. Respon
dari detektor ini muncul dari aliran elekro yang
dihasilkan oleh reaksi redok pada permukaan
elektroda.
Detektor indek refraksi, detektor ini mengukur
perubahan indeks refraksi eluen yang
disebabkan oleh adanya senyawa yang pada
waktu keluar dari kolom. Detektor ini tidak
dapat digunakan secara sefektif dengan elusi
gradien karena adanya perubahan pada
baseline (perubahan indeks refraksi pelarut jika
gradien berubah) atau jika pelarut mempunyai
indek refraksi mendekati indeks refraksi zat
terlarut. Selain itu detektor ini sensitif terhadap
perubahan suhu.
Dengan diketemukan Fourier transform infrared
(FTIR)
spektrofotometer
dimungkinkan
digunakan sebagai detektor pada HPLC
detektor ini akan sangat berguna untuk
memonitoring penyalahgunaan obat-obatan
karena dapat melakukan identifikasi absolut
dari obat yang dianalisa. Spcetrum IR yang
direkam digunakan sebagai dasar untuk uji
konfirmasi.
9.2. Analisis Obat
Tidak semua analisis obat dapat dilakukan
dengan menggunakan HPLC, peryataan ini
dikemukan oleh Gough dan Beker(2.3) yang
melaporkan penggunaan kromatografi untuk
mendeteksi
penyalahgunaan obat-obatan
sampai tahun 1983.
Analisis obat-obatan pada penyalahgunaan
obat harus mengikuti prototkol yang baku, dari
penyumpulan sampel sampai pada penanganan
Penggunaan HPLC Dalam Analisis Toksikologi
data analisis, sehingga data yang berhubungan
dengan sampel obat harus dicatat. khususnya
penampilan
mikroskopi
maupun
makroskopiknya seperti, pembungkus sampel,
dan penandaaan yang terdapat pada
sampel/pembungkus. Semua historis data ini
sebagai bukti di pengadilan.
Penggunaan HPLC didalhului oleh uji skrining,
menggunakan reaksi warna atau reaksi
skrining lainnya. Analisis obat menggunakan
HPLC biasanya didahului oleh praperlakuan,
seperti ekstraksi analit dari sampel. Metode
ekstraksi tergantung pada jenis sampel dan
sifat fisikokimia dari analit. Setelah sampel
diekstraksi dapat langsung diinjeksikan ke
dalam kolom melalui mikrofilter (biasanya
berdiameter 2µm) atau sebelum diinjeksikan
ekstrak kering kemudian dilarutkan ke dalam
fase gerak. Perlu diperhatikan sifat mikrofilter
yang kadang terlarut dengang pelarut organilk
tertentu.
K e p u st a k a a n .
1 . Caddy, B., 1991, The use of high
performance liquid chromatography for
the detection and quanitation of abussed
drugs, Goglt, T., A., The Analysis of Drugs of
Abuse, John Wiley & Sons, Chichester, 1 2 1
- 174.
2. Sriewoelan, S. 1988, Analisis Obat Dalam
Cairan Biologik, ITB, Bandung.
3. Moffat, A.C., et.all., (Ed), 1986,Clark's
Isolation and Identification of Drugs in
Pharmaceuticals, Body Fluids, and PostMortenz Material, Second ed., The
Pharmaceutical Press,London.
4. Johnsan, E.L., Stevenson,R., 1991, Dasar
Kromatografr Cair, Penerbit ITB, Bandung.
5. Skoog, D.A., Leary, J.J., 1992, Principles of
Instrumental Analysis, 4"' Ed., Harcourt
Brace Publisher, New York.
6. Willard, H.H., et all.. 1989, Instrumental
Methods of Analysis, Wadsbuorth
Publising Company, California.
7. Chamberlain, J., 1985, Analysis ofDrugs in
Biological Fluid, CRC Press Inc, Boca
Raton.
8. United Nations, (1995) Recommended
methods for the detection and assay of
heroin,
cannabinoids,
cocaine,
64
amphetamine
and
ring-substituted
amphetamine derivates in biological
specimens manual for use by national
laboratories, United Nation International
Drug Control Programme, New York
9. Lawry, W.T., Gsrriott, J,C., 1979, Forensic
Toxicology Controlled Substances and
Dangerous Drugs, Plenum Press, New York,
103-346.
10. Ferrara, S.D., e all, , 1992, Solid-Phase
Extraction and HPLC-UV Confirmation of
Drugs of Abuse in Urine J. An. Toxicology,
16, 217-222.
11. Ziegler, H.W., Beasly, T.H., Smit, D.W., 1975,
Simultaneous Assay for Six Alkaloids in
Opium, Using High-Perfomence Liquid
Penggunaan HPLC Dalam Analisis Toksikologi
Chromatograpy, J. ofAOAC, 58 (5), 888897.
12. Hyds, P.M., 1985, Evaluation of Drug
Extraction Procedures from Urine, J. of
Toxic olo gy , 9 (Nov/Des), 265-272.
13. Lurie Ira, 1977, Application of Reverse
Phase lon-Pair Partition Chromatography
to Drugs of Forensic Intere-t, JJ ofAOAC,
60 (5), 1035-1040
14. Chao, M.K.C., Albert,K.S., Fusari,S.A., 1977,
Phenobarbital, in Florey,K. (Ed), Analytical
Profiles ofDrug Substances, 7, Academic
Prees, New York, 359-395.
15. Macdonald,A., Michatlis, A.F., Senkauski,
1977, Uiarcpam, in in FIor'cy,K. (V d), Analitical
of Profiles Drugs Substances, 7 Academic
Prees, New York, 79-101.
65
BAB X
APLIKASI SPEKTROMETRI MASSA
DALAM ANALISIS PENYALAHGUNAAN OBAT
10. 1. Pendahuluan
Dalam bab ini akan dibahas identifikasi dan
kuantisasi obat menggunakan spektrometri
massa. Spektrometri massa merupakan teknik
analisis yang sangat handal yang dapat
memberikan bukti/data terdapatnya suatu obat
yang diduga, MS utamanya telah digunakan
untuk memastikan identitas suatu obat, yang
telah di skrining atau diduga sementara
menggunakan teknik lain (R-X warna, TLC, dll).
MS menghasilkan partikel bermuatan yang
terdiri dari susunan ion dan pecahan (fragmen)
ion dari molekul asalnya dan urutan susunan
ion ini sesuai dengan rasio massa/muatan
ionnya. Spektrum massa dari asal senyawa
adalah karakteristik oleh senyawa tersebut.
Apabila spektrum massa dari suatu senyawa
dilengkapi dengan data spektronik lainnya
seperti IR, UV-Vis, NMR, dapat dianalisis
struktur molekul senyawa tersebut.
Keuntungan utama MS dibandingkan metode
instrumental analitik lainnya adalah mempunyai
sensitivitas dan spesivitas yang paling tinggi
untuk
mengidentifikasi
atau
mengkonfirmasikan suatu senyawa yang telah
diduga. Spesivitas yang sangat tinggi
dihasilkan
karakteristik
pola
pemecahan/fragmentasi,
yang
dapat
memberikan informasi tentang berat molekul
dan struktur molekul.
Dengan berkembangnya teknologi sekarang
banyak dijumpai MS yang digabungkan dengan
instrumen lain seperti HPLC, GC, dan atau
digabungkan dengan suatu analizer MS
(tendem MS/ MS-MS).
10.2. Aliran Analit/Sampel dalam MS
Fungsionalitas dari MS secara prinsip dapat
dibagi menjadi 3 bagian fungsi utama: 1)
menciptakan fragmen ion dalam bentuk gas
dari sampel, 2) mengion/ion-ion tersebut sesuai
dengan
massanya
(tepatnya
rasio
massa/muatan), 3) mengeluarkan massa relatif
dari fragmen ion-ion dari setiap massa.
Diagram balok komponen dari MS dapat dilihat
pada gambar 10.1. Bagian-bagian yang
terpenting adalah: 1. Sampel inlet sistem, 2.
Sumber ion, 3. Percepatan ion atau analizer
massa (ion), 4. Sistem pengumpul ion, 5.
Sistem pengolah data, 6. Sistem vakum.
Sampel
Inlet
sistem
Sumber
ion
Sistem Vakum
Analizer
Massa
Detektor
Sistem Pengolahan Data
Gambar 10.1. Diagram balok komponen dari MS
Tujuan dari inlet sistem adalah memungkinkan
untuk memasukkan sampel ke dalam sumber ion
dengan kehilangan vakum yang sangat kecil.
Pada MS ada 3 jenis inlet sistem: batch inlet,
direct probe inlet, kromatografi inlet.
MS yang digabungkan sistem kromatografi
gas/HPLC memungkinkan melakukan pemisahan
dan mengidentifikasi secara langsung senyawa
Spektroskopi Massa
tersebut. Penggabungan kromatografi dengan MS
memerlukan sistem inlet yang khusus.
10.3. Sistem
Pengumpulan
Data
dan
Penampilannya
Sekarang ini spektrometer terhubung dengan
berbagai bentuk sistem data sangat bergantung
dari tujuan analisis. Sistem data yang modern
akan mengontrol operasional MS, pengumpulan
66
data dan memproses data termasuk pencarian
dalam data kepustakaan. Metode yang lama
spektra direkam di atas kertas yang sensitif
dengan UV dan massa ditentukan secara manual
dari masing-masing puncak spektra. Cara ini akan
sangat lama pengerjaannya, dan jumlah senyawa
yang dapat dianalisis akan sangat terbatas.
Sistem data tidak hanya dapat menangani operasi
pengumpulan data spektra penetapan massa dari
puncak tetapi juga dapat memanipulasi data
sesuai dengan kebutuhan. Sistem data juga dapat
secara simultan mengoperasikan data dari
berbagai data Spektrofotometer (UV, IR, NMR).
Sistem data dapat dibeli terpisah atau telah
disatukan dengan spektrometer.
Secara umum operasional data sistem adalah
merekam massa dan intensitas ion pada saat
spektrometer
melakukan
scaning.
Perfluorokerosene adalah senyawa kimia yang
biasa digunakan untuk mengkalibrasi skala
massa dari MS. Pada analisis forensik toksikologi
(senyawa obat) diperlukan MS beresolusi tinggi,
sebab MS dengan resolusi rendah sering tidak
berhasil dalam pencarian data dengan sistem
data pustaka, karena memerlukan data massa
yang akurat, dan daftar formula empiris sangat
berhubungan dengan semua data ion yang
terfragmentasi. Informasi spektra MS biasanya
dipadukan dengan data spektra IR, NMR untuk
dapat digunakan dalam identifikasi obat yang
tidak diketahui/obat baru.
Total ion current atau jumlah total muatan ion
adalah penjumlahan semua intensitas muatan ion
terfragmen pada saat melakukan scaning. Jika
MS secara berulang melakukan scaning dari
sumber (inlet) GC rekonstruksi jumlah total
muatan ion dari suatu analit dapat dilakukan. Data
sistem akan mensubstrak spektra dengan yang
lainnya (spektra latar belakang) sehingga spektra
analit bebas dari spektra latar belakang
pengganggu.
Sistem data spektra juga dapat merata-ratakan
semua spektra dari puncak GC dengan
membandingkan spektra dari puncak GC
sebelumnya atau sesudahnya, komponen yang
tidak terdeteksi dapat dihindari sehingga
diperoleh semua spektra dari masing-masing
komponen.
Sistem data juga dapat memplot/merajah variasi
intensitas masing-masing dari ion terhadap
waktu, metode ini dikenal dengan “single-ion
Spektroskopi Massa
chromatogram” (kromatogram ion tunggal).
Kromatogram ion tunggal sangat berguna dalam
mendeteksi obat tertentu dalam suatu campuran.
Juga berguna dalam mendeteksi obat-obat yang
berbeda setelah semua spektra terekam, tetapi
metode ini tidak sensitive. Jika ingin mendeteksi
obat tertentu yang diduga ada beberapa teknik
analitik yang digunakan yaitu monitoring ion
selektif / “selektif ion monitoring”/SIM yang juga
dikenal sebagai monitoring puncak ganda / “multi
peak monitoring”/MPM, atau deteksi ion ganda
/”multiple-ion detection”/MID. Mode operasi dari
teknik ini tidak merekam keseluruhan spektra,
tetapi hanya merekam sinyal karakteristik dari
ion-ion tersebut untuk mengidentifikasi obat yang
diinginkan. Khususnya terdapat tiga ion yang
berbeda yang akan direkam yaitu termasuk ion
molekuler yang utama dan dua ion yang lainnya
sebagai ion diagnostik. Intensitas absolut dari
ion-ion direkam dan intensitas relatif yang
mewakili ion molekuler dicek untuk memastikan
memang pada rasio yang benar, apabila
dibandingkan spektra massa normal. Intensitas
absolut memungkinkan menentukan konsentrasi
suatu obat dengan membandingkan dengan
intensitas baku pembanding. Keuntungan dari
teknik ini adalah lebih sensitive dibandingkan
merekam keseluruhan spektra, memerlukan
waktu yang lebih sedikit untuk memonitor
masing-masing ion.
10.4. Kepustakaan Spektrum Massa
Identifikasi obat yang positif diketahui
memerlukan pembandingan terhadap spektrum
massa yang ada pada data kepustakaan. Pada
sistem data yang modern biasanya dilengkapi
dengan fasilitas pencarian data spektrum
pembanding pada data pustaka, prosedur ini
dikerjakan secara automatis. Secara komersial
terdapat banyak data kepustakaan tersimpan
dalam disket-disket pencarian pembandingan
data kepustakaan dapat dilakukan melalui
internet di mana “home page” tertentu
menyediakan jasa ini. Secara komersial seperti
contoh
“Environmental
protection
Ajency/National Institutes of Health Main Spectral
Database”. Sistem ini jauh lebih menguntungkan
daripada analisis mengumpulkan data spektra
massa manual. Jika analisis melakukan pencarian
pembanding spektra secara manual dan
menghabiskan banyak waktu dan sering muncul
penafsiran yang subyektif dan memerlukan
67
pengalaman yang panjang dalam pekerjaan
mencocokkan spektra.
Untuk
menghindari
penyimpangan
atau
kesalahan pembandingan spektrum yang tidak
diketahui hasil dari pencarian data pustaka
biasanya ditunjukkan beberapa spektrum yang
hampir mendekati. Faktor ketepatan biasanya
dengan skala 0-1000 adalah menampilkan
spektrum yang tepat/cocok dan
mengukur
kedekatan antara spektrum senyawa yang tidak
diketahui dengan spektrum data pustaka.
Penghitungan didasarkan atas perbedaan
intensitas antara ion-ion yang tepat/cocok dalam
spektra yang sesuai. Beberapa sistem ini juga
menampilkan faktor kemurnian. Faktor ini
dihitung dari puncak spektrum senyawa yang
tidak diketahui, tidak terdapat dalam spektrum
pembanding dan dapat menunjukkan adanya
pengotor atau pengganggu. Pada kasus ini faktor
ketepatan yang bagus dengan faktor kemurnian
rendah menunjukkan ketidak tepatan atau ketidak
benaran.
10.5. Analisis Beberapa Kelompok Obat
(‘drugs”/obat ilegal) baik dalam bentuk sediaan
atau bahan baku maupun yang terdapat dalam
cairan biologi berada dalam konsentrasi yang
sangat kecil dan dalam matriks yang sangat
kompleks. Oleh karena itu perlu prosedur “cleanup” atau pemurnian sebelum analisis MS.
Pemurnian
dapat
menggunakan
teknik
kromatografi atau membuat derivatnya sebelum
dikromatografi untuk meningkatkan kinerja
kromatografi. Seperti contoh asam dapat dirubah
menjadi bentuk metil esternya dan barbiturat
dalam bentuk metil-barbiturat.
Untuk analisis kuantitatif sebaiknya digunakan
internal standard yang sesuai, seharusnya
mempunyai sifat kimia yang sama dengan analit
hal ini sangat penting jika dilakukan derivatisasi.
Internal standard yang ideal adalah isotop
berlabel
yang
analog
dengan
analit,
bagaimanapun juga sebelum pemilihan isotop
analog yang spesifik beberapa faktor harus
dipertimbangkan seperti: massanya berbeda,
kemurnian isotop, dan karakteristik fragmentasi
spektrum massanya.
Pada sub bab ini dikhususkan pada pembahasan
analisis obat-obat yang sering disalahgunakan
Tabel 10. 1. Spektrum massa kanabis yang karakteristik
Senyawa
Model ionisasi
CBN
CBD
∆9-THC
Kanabinoid (umum)
THC-COOH, metilasi
THC-COOH, metilasi, deuterasi, IS
THC-COOH trimetilsilil
THC-COOH trimetilsilil, deuterasi, IS
THC-trifluoroasetil
THC-trifluoroasetil, deuterasi, IS
THC-COOH trifluoroasetil
THC-COOH trifluoroasetil, deuterasi, IS
THC-OH, trifluoroasetil, IS
THC-OH, trifluoroasetil, deuterasi, IS
THC
THC, deuterasi, IS
EI =“elektron impact”(tumbukan elektron),
“(baku dalam) Dikutif dari: Huizer, H., (1991)
A. Kanabis
EI
310, 295, 238
EI
314, 299, 258, 246, 231
EI
314, 299, 258, 246, 231, 193
EI
314, 299, 271, 258, 246, 243, 231
EI
372, 357, 313
EI
375, 316
EI
488, 473, 371
EI
491, 374
CI negatif (hidrogen/metana)
410
CI negatif (hidrogen/metana)
413
CI negatif (hidrogen/metana)
454
CI negatif (hidrogen/metana)
457
CI negatif hidrogen metana)
409
CI negatif (hidrogen/metana)
412
EI
314,2
EI
317,2
CI=“Chemical ionization” (ionisasi kimia), IS=“internal standard
Pada analisis kanabis dari produk ilegal dalam
bentuk simplisia, hasis, dll, dapat dilakukan
secara langsung. Beberapa mg produk langsung
dimasukkan ke dalam inlet probe kemudian
diperoleh spektrum total. Ion-ion yang
karakteristik dapat diperoleh dengan melakukan
Spektroskopi Massa
ion-ion yang diamati (m/z)
scaning berulang. Dengan cara ini semua
komponen dari kanabis dapat diamati dalam tabel
10.1. Analisis statistikal dapat dilakukan dengan
mengadakan intensitas ion-ion terpilih. Apabila
ingin mendeteksi adanya campuran kanabinoid
dapat dilakukan dengan membandingkan
spektrum sampel dengan spektrum kontrol
kanabinoid. Cara ini digunakan atau konfirmasi
68
adanya daun, resin atau cairan dari kanabis dan
pembandingan sampel berlainan didasarkan atas
perbedaan konsentrasi.
Untuk memperoleh data spektrum dari masingmasing kanabinoid sebelum injek ke inlet MS
sebaiknya dilakukan proses pemurnian baik
menggunakan GC atau HPLC. Pada analisis
menggunakan GC kanabinoid terlebih dahulu
dibuat sebagai turunannya dengan sililasi.
Beberapa kanabinoid sangat tidak stabil pada
GC sehingga harus segera dianalisis GC
setelah sililasi dan memerlukan penanganan
khusus. Pemurnian menggunakan HPLC
seperti mengatasi masalah termolabil dari
kanabinod
sehingga
dapat
langsung
menganalisis kanabinoid.
Kanabis pada rokok dapat langsung dianalisis
dari kondensat asapnya menggunkan GC-MS.
Kanabinoid (CBD), ∆9 THC dan CBN dapat
dideteksi langsung sebagai turunan trimetilsilil.
Penetapan kanabinoid dalam cairan biologi
ditentukan sebagai metabolit kanabinoid. Di
dalam urine ditentukan sebagai metabolit
utama dari THC yaitu asam 11-nor-∆9-THC-9
karboksilat
(THC-COOH).
Metabolit
ini
diekskresi sebagai bentuk bebasnya atau
terkonyugasi dengan asam glukoronat. Analisis
THC-COOH sebagai metabolit primer dari
kanabinoid menggunakan MS diperlukan
pemurnian sebelum dianalisa. Berbagai metode
ekstraksi dapat diterapkan seperti ekstraksi
menggunakan
pelarut
organik
karena
dikeringkan, atau menggunakan ekstraksi fase
padat. Sebelum dimasukkan ke inlet MS
metabolit
tersebut
dipisahkan
dengan
kromatografi
(GC/HPLC).
Analisis
menggunakan GC-MS, THC-COOH dibuat dalam
berbagai derivatnya seperti derivat metil ester
menggunakan iodometan dan tetrametil
hidroksida; derivat trimetilsilil menggunakan
N,O, bis-(trimetilsilil) trifluoroasetat (BSTFA)
ditambah 1% trimetilklorosilan (TMCS).
Analisis kuantitatif internal standard seperti
oksigen butana, isotop deuterium dari THCCOOH. Pada analisis GC-MS dengan
menganalisa THC-COOH sebagai derivat metil
ester
dengan
metan-kimia
ionisasi,
menunjukkan spektrum MS prominan ion
molekuler terprotonisasi pada m/z 378. Sebagai
derivat trimetilsilil menggunakan BSTFA
diperoleh ion metastabil m/z 371 sesuai dengan
M+ Æ (MCH3)+ dalam spektrum derivat THC.
B. Opiat
Analisis opiat menggunakan MS senyawanya seperti dilihat pada tabel 10.2.
Tabel 10. 2. Spektrum massa opiat yang karakteristik
Senyawa
model ionisasi
Diamorfin
EI
Diamorfin
CI (Isobutana)
Asetilkodein
CI (Isobutana)
kofein
CI (Isobutana)
Diamorfin
CI (Nitrogen/10% oksida nitrat)
6-asetilmorfin, pentafluoropropionil
EI
6-asetilmorfin, propionil
EI
6-asetilmorfin, propionil, deuterasi, IS
EI
Asetilkodein
EI
Morfin, trifluoroasetil
CI (Asetonitril)
6-asetilmorfin, trifluoroasetil
CI (Asetonitril)
Kodein, pentafluoropropionil
EI
Nalorfin, penta-fluoropropionil, IS
EI
Morfin, trifluorosetil
EI
Kodein, trifluorosetil
EI
Nalorfin, trifluoroasetil, IS
EI
Morfin, pentafluoropropionil
EI
6-asetilmorfin, pentafluoropropionil
EI
Morfin
EI
ion-ion yang diamati (m/z)
369 (M+), 327. 310, 268
370 (MH+), 310, 268
342, 282
195
370 (MH+), 327, 310, 268,
473
384, 383, 324
389, 333
341, 282
478, 364
424, 364
445, 282
603, 440
477, 364
395, 282
503, 390
577,414, 361
473, 414
268, 256, 242, 228, 215
EI =“elektron impact”(tumbukan elektron), CI=“Chemical ionization” (ionisasi kimia), IS=“internal standard
“(baku dalam) Dikutif dari: Huizer, H., (1991).
Aplikasi spektrosfotometri massa dalam analisis Toksikologi
69
C. Kokain
Spektrum massa elektron impact dari kokain
sangat karakteristik sehingga memungkinkan
untuk identifikasi dengan membandingkan
terhadap spektra standard. Analisis kuantitatif
dilakukan dengan memonitor intensitas ion
molekuler pada m/z 303 yang dibandingkan
terhadap standard.
Kokain ilegal biasanya dikotori dengan
ekogenin, metil ekogenin dan benzoil ekogenin,
seperti diperlukan pemisahan sebelum analisis.
Analisis menggunakan GC-MS terhadap kokain
ilegal perlu diperhatikan pengotor metil
ekgonin yang dapat membentuk artefak di
muka injektor dari GC pada temperatur tinggi
(>250oC).
Benzoilekgonin dan ekgonin adalah metabolit
utama dari kokain sehingga pada analisis
kokain dalam materi biologi kedua metabolit
tersebut dianalisa.
Tabel 10. 3. Spektrum massa kokain yang karakteristik
Senyawa
model ionisasi
ion-ion yang diamati (m/z)
Ekgonin, metilester
EI
82
Fenklikidin
EI
200
Kokain
EI
303, 182, 82
Kokain, deuterasi, IS
EI
306, 185, 85
Benzoilekgonin ester
EI
361, 240, 82
Benzoilekgonin ester, deuterasi, IS
EI
364, 243, 85
Kokain
EI
303
Kokain, deuterasi, IS
EI
308
p-Fluorokokain
EI
321
p-Fluorokokain, deuterasi, IS
EI
324
n-propilkokain
EI
331
n-propilkokain, deuterasi IS
EI
334
Kokain
EI
303
Kokain, deuterasi, IS
EI
306
Norkokain, trifluoroasetil
EI
263
Norkokain, trifluoroasetil, deuterasi, IS
EI
266
Kokain
CI (Isobutana)
304, 182
Benzoilekgonin
CI (Isobutana)
290, 186, 168, 124
EI =“elektron impact”(tumbukan elektron), CI=“Chemical ionization” (ionisasi kimia), IS=“internal standard
“(baku dalam) Dikutif dari: Huizer, H., (1991).
D. LSD dan Halusinogen lainnya
Halusinogen
yang
paling
sering
disalahgunakan adalah LSD dan analognya,
psilosin,
psilosibin,
2,5-dimetoksi-4-metil
amfetamin, meskalin, ergotamine Analisis LSD
sangat sulit karena dosis yang sangat poten
dari LSD sehingga dalam urine atau materi
biologi hanya berada pada konsentrasi yang
sangat kecil, piko-nano gram/mL. Dalam cairan
biologi LSD dianalisa sebagai bentuk tak
termetabolisme LSD.
Tabel 10. 4. Spektrum massa LSD dan halusinogen lainnya yang karakteristik
Senyawa
model ionisasi
ion-ion yang diamati (m/z)
LSD, trimetilsilil
EI
395, 293, 279, 268, 253, 73
LSD
EI
323 (M+)
Psilokin
EI
204 (M+), 159, 146, 130, 117
STP
EI
166
LSD, trimetilsilil
EI
395 (M+), 293, 268
LSD, trimetilsilil, deuterasi, IS
EI
398 (M+)
LSD, N-trifluoroasetil
CI negatif (metana)
419
LSD, N-trifluoroasetil, deuterasi, IS
CI negatif (metana)
429
N-Dimetil-LSD, trifluoroasetil
CI negatif (metana)
501
EI =“elektron impact”(tumbukan elektron), CI=“Chemical ionzation” (ionisasi kimia), IS=“internal standard
“(baku dalam) Dikutif dari: Huizer, H., (1991).
Aplikasi spektrosfotometri massa dalam analisis Toksikologi
124
E. Turunan Amfetamin
Spektrum
massa
turunan
amfetamin
menggunakan teknik fragmentasi elektron
impact atau tumbukan elektron sangat tidak
memuaskan untuk digunakan sebagai dasar
identifikasi, karena ion-ion molekuler dari
turunan amfetamin muncul sangat lemah
bahkan sering tidak tampak. Umumnya
senyawa turunan amfetamin mempunyai
puncak dasar yang sama pada m/z 58. Untuk
mengatasi hal ini biasanya digunakan teknik
ionisasi yang lain seperti ionisasi secara kimia
atau merubah menjadi bentuk derivatnya yang
akan memberikan spektrum massa yang
bermakna untuk identifikasi.
Metode yang tepat untuk menganalisis
amfetamin dan metabolitnya (amfetamin, phidroksi
metamfetamin
dan
p-hidroksi
amfetamin) didahului dengan hidrolisis
kemudian ekstraksi dan merubah menjadi
turunan heptafluorobutiril dengan menggunakan fentermin sebagai standard internal (2).
Tabel 10. 5. Spektrum massa amfetamin yang karakteristik
Senyawa
Model ionisasi
DOB
Amfetamin, trikloroasetil
Metamfetamin, trikloroasetil
2-metilfenetilamin, trikloroasetil, IS
Amfetamin, 4-karbetoksiheksa-fluorobutiramida
Amfetamin, 4-karbetoksiheksa-fluorobutiramida, deuterasi,
IS
Metamfetamin, 4-karbetoksiheksa-fluorobutiramida
Metamfetamin, 4-karbetoksiheksa-fluorobutiramida,
deuterasi, IS
Amfetamin, heptafluorobutirat
Metamfetamin, heptafluorobutirat
N-Propilamfetamin, heptafluorobutirat, IS
Turunan d- and l-amfetamin
Turunan d- and l-amfetamin, deuterasi, IS
Amfetamin, trifluoroasetat
CI (amonia)
EI
EI
EI
EI
EI
Ion-ion yang diamati
(m/z)
274 (MH+), 186
188, 118, 91
202, 118, 91
118, 105
294, 266, 248
298, 270
EI
EI
308, 280, 262
315, 287
EI
EI
EI
CI (metana)
CI (metana)
EI
240
254
282
427
429
140
EI =“elektron impact”(tumbukan elektron), CI=“Chemical ionization” (ionisasi kimia), IS=“internal standard
“(baku dalam) Dikutif dari: Huizer, H., (1991).
Aplikasi spektrosfotometri massa dalam analisis Toksikologi
70
F. Pencilidin
Pola fragmentasi dari pencilidin yang
karakteristik muncul spektra ion molekuler
yang kuat pada m/z 243. Spektrum karakteristik
pencilidin seperti dilihat pada tabel 10.6.
Tabel 10. 6. Spektrum massa pencilidin yang karakteristik
Senyawa
model ionisasi ion-ion yang diamati (m/z)
EI
249 (M+)
1-{1-(2-tienil)sikloheksil}piperidin
EI
251 (M+)
1-{1-(2-tienil)sikloheksil}morfolin
EI
235 (M+)
1-{1-(2-tienil)sikloheksil}pirolidin
EI
245 (M+)
1-{1-fenilsikloheksil}morfolin
EI
229 (M+)
1-{1-fenilsikloheksil}pirolidin
PCE
EI
203 (M+)
PCC
CI (metana)
193 (MH+), 192, 191, 166
PCP, deuterasi, IS
CI (metana)
243, 159
PCP, heptafluorobutirat; 4-fenil 4- piperidino
CI (metana)
248, 164
242
Sikloheksanol, heptafluorobutirat; dan 1-{1-fenilsikloheksil}- CI (metana)
4-hidroksi piperidin, heptafluorobutirat
CI (metana)
245
1-(1-fenilsikloheksil}morfolin, heptafluorobutirat, IS
EI
304
5-{N-(1’fenilsikloheksil) amino} asam pentanoat, trimetilsilil
293
5-{N-(1’fenilsikloheksil) amino} asam pentanoat, trimetilsilil, EI
deuterasi, IS
EI
289, 246, 159
5-{N-(1’fenilsikloheksil) amino} asam pentanoat, metilester
EI
294, 254, 164
5-{N-(1’fenilsikloheksil) amino} asam pentanoat, metilester,
deuterasi, IS
EI =“elektron impact”(tumbukan elektron), CI=“Chemical ionization” (ionisasi kimia), IS=“internal standard
“(baku dalam) Dikutif dari: Huizer, H., (1991).
G. Senyawa lainnya
Spektrum
beberapa
massa yang karakteristik dari
senyawa, seperti metaqualon,
pentobarbital, fentanil, aprazolam, trizolam,
bromazepam adalah senyawa yang juga sering
disalahgunakan dapat dilihat pada tabel 10.7.
Tabel 10. 7. Spektrum massa yang karakteristik dari metaqualon, pentobarbital, fentanil, dan
benzodiazepin
Senyawa
model ionisasi
ion-ion yang diamati (m/z)
Metaqualon
EI
250 (M+)
Metaqualon
CI (isobutana)
251 (MH+, 100%), 235 (20%)
Metaqualon
CI (metana atau isobutana) 251 (MH+)
Pentobarbiton
EI
156
Pentobarbiton, deuterasi, IS
EI
161
Fentanil
CI (metana)
337 (MH+)
Fentanil, deuterasi, IS
CI (metana)
340 (MH+)
Fentanil
EI
245, 189, 146
Alfentanil, IS
EI
373, 282, 236
Alprazolam
CI negatif (metana)
308
Triazolam, IS
CI negatif (metana)
306
Triazolam
CI negatif (metana)
306 (M+)
triazolam, deuterasi, IS
CI negatif (metana)
312 (M+)
Bromazepam
CI (amonia)
318 (MH+, isotop 81Br), 316
EI =“elektron impact”(tumbukan elektron), CI=“Chemical ionisation” (ionisasi kimia), IS=“internal
standard “(baku dalam) Dikutif dari: Huizer, H., (1991).
Kepustakaan:
Aplikasi spektrosfotometri massa dalam analisis Toksikologi
124
1. Chamberlain, J., 1985, Analysis of Drugs in
Biological Fluid, CRC Press Inc, Boca
Raton
2. Chapman, J.R., 1985, Practical Organic
Mass Spectrometry, John Wiley & Sons.
3. Huizer, H., 1991, The use of mass
spectrometry for the detection and
quantitation of abused drugs, Gogh, T., A.,
The Analysis of Drugs of Abuse, John
Wiley & Sons, Chichester.
4. Moffat, A.C., et all., (Ed), 1986, Clark’s
Isolation and Identification of Drugs in
Pharmaceuticals, Body Fluids, and PostMortem Material, Second Ed., The
Pharmaceutical Press, London.
5. Skoog, D.A., Leary, J.J., 1992, Principles of
Instrumental Analysis, 4 th Ed., Harcourt
Brace Publisher, New York.
6. Willard, H.H., et all., 1989, Instrumental
Methods
of
Analysis,
Wadsbuorth
Publishing Company, California
Aplikasi spektrosfotometri massa dalam analisis Toksikologi
124
BAB XI
APLIKASI SPEKTROSFOTOMETRI INFRA MERAH
DALAM ANALISIS TOKSIKOLOGI
11. 1. Pendahuluan
Rentang panjang gelombang spektrum
elektromagnetik inframerah (IR) adalah dari 0,8
sampai 500 µm (12.500-20 cm-1). Spektrum IR
dapat dibagi menjadi 3 daerah: IR dekat
(12.500-4000 cm-1); IR tengah (4000-400 cm1),dan IR jauh (400-20 Cm-1).
Kebanyakan instrumen spektrometri IR
beroperasi pada daerah IR tengah. Semua
senyawa organik mengabsorpsi radiasi IR, dan
absorpsi dari senyawa tersebut adalah
karakteristik terhadap gugus fungsi dan
struktur dari senyawa tersebut. Spektroskopi IR
adalah salah satu instrumen yang sangat
berguna bagi kimia suatu langkah awal dalam
mengelusidasi struktur suatu molekul.
Identifikasi kimia dapat diperoleh dari vibrasi
gugus fungsi/pita absorpsi gugus fungsi yang
spesifik dari senyawa tersebut. Dari spektrum
IR dapat melakukan analisis kualitatif dan
kuantitatif terhadap suatu molekul.
Pada suhu biasa (tertentu) molekul-molekul
organik dalam keadaan vibrasi yang tetap,
setiap
ikatan
mempunyai
frekuensi
rentangan/stretching dan binding yang
karakteristik dan dapat menyerap energi radiasi
pada frekwensi tersebut.
Penyerapan radiasi IR oleh molekul akan
menyebabkan eksitasi vibrasional yang akan
mengakibatkan perubahan momen dipol pada
molekul tersebut. Momen dipol pada molekul
hanya diberikanoleh vibrasi yang asimetrik
ditimbulkan oleh eksitasi vibrasional. Intensitas
penyerapan vibrasi IR adalah sebanding
dnegan momen dipolnya.
11. 2. Hubungan spektra IR dengan struktur
molekul
Untuk analisis kualitatif salah satu yang paling
berarti pada spektrum IR dari suatu senyawa
adalah posisi pita-pita absopsi gugus fungsi
spesifik, absopsi atau lemah-kuanya absopsi
pada frekwensi yang spesifik sesuai dengan
vibrasional dari gugus fungsi yang terikat pada
molekul tersebut. Sehingga interpretasi dari
suatu spektrum IR adalah mungkin untuk
menentukan ada atau tidaknya gugus fungsi
tertentu yang terikat pada molekul tersebut.Dari
suatu data spektrum IR dapat mengestimasikan
dugaan senyawa/gugus fungsi yang dapat
melakukan identifikasi dengan membandingkan
dengan data pustaka. Karena pada kuliah
penetapan struktur molekul telah secara jelas
dibahas sehingga pada bab ini dibahas secara
umum.
Daerah IR tengah adalah dasar yang sangat
berguna dan sering digunakan untuk analisis
kualitatif suatu molekul. Daerah ini dibagi
menjadi dua bagian besar yaitu daerah gugus
fungsi (4000-1300 cm-1) (2,50-7,69 µm) dan
daerah sidik jari, 1300-650 cm-1 (7,69-15,38 µm)
pada daerah gugus fungsi. Absorpsi/serapan
diberikan oleh vibrasi dua atom dari molekul
tersebut, bilangan gelombang serapan
tergantung pada gugus fungsi yang
memberikan absopsi dan telah diperiksa oelh
keseluruhan molekul. Daerah gugus fungsi
dapat dibagi lagi dengan interval 4000-2500 cm1 (2,50-4,00 µm), absorpsi diberikan oleh vibrasi
stretching hidrogen dari gugus fungsi yang
karakteristik, dengan unsur bermassa atom 19
atau kurang. Frekwensi stretching dari -C-H
sangat berguna untuk menetapkan jenis
senyawa yang terdapat dalam sampel; seperti
contoh C= C-H muncul sekitar 3300 cm-1 (3,03
µm) C-H aromatik dan ikatan tak jenuh muncul
pada 3000-3100 cm-1 (3,33-3,23 µm), dan alifatik
pada 3000-3800 cm-1 (3,33-3,57 µm).
Rentang frekwensi intermediet 2500-1540 cm-1
(4,00-6,44 µm), biasanya disebut dengan
daerah tak jenuh. Ikatan rangkap tiga muncul
dari 2500-2000 cm-1 (4,00-5,00 µm). Frekwensi
ikatan rangkap dua muncul antara 2000-1540
cm-1 (5,00-6,49 µm). Dengan pengalaman yang
tinggi dan berbagai data empirik dapat
membedakan pita antara C=O, C=C, C=N, N=O,
dan S=O.
Daerah sidik jari (1300-650 cm-1) (7,69-15.38 µm)
diberikan oleh frekwensi stretching ikatan
tunggal dan vibrasi-vibrasi ikatan yang
melibatkan gerakan ikatan gugus fungsi pada
Aplikasi spektrosfotometri IR dalam analisis Toksikologi
73
molekulnya. Multiplisitas dari spektrum sangat
penting untuk meyakinkan identifikasi dari
masing-masing pita, tetapi secara kolektif pitapita serapan digunakan untuk identifikasi suatu
material atau bahan senyawa.
11. 3. Instrumen
IR instrumen dibagi menjadi 2 kelompok:
dispersive dan non dispersive. Instrumen
dispersive menggunakan prisma atau kisi
untuk mendispersikan radiasi polikromatis.
Spektrometer non dispersive menggunakan
filter interferensi, sumber lampu laser “tunable
laser” atau interferometer yang sangat populer
dalam spektrometri fourier transfer inframerah
(FTIR)
a. Spektrometer Inframerah Dispersive
Disebut spektrometer dispersive karena
spektrometer ini mendispersikan radiasi
elektromagnetik inframerah menjadi berbagai
frekwensi menggunakan alat pendifraksi
seperti prisma, kisi. Pada keseluruhan alat
spektrometer dispersive terdapat 5 bagian:
sumber radiasi, ruang sample, fotometer, kisi
atau monokromator, dan detektor.
Gambar 11.1.Skematik sistem optik spektrometer IR dispersive double beam
Masalah-masalah di atas telah dipecahkan oleh
Terdapat beberapa kendala yang berhubungan
FTIR modern.
dengan spektrometer IR dispersive, seperti
kecepatan skening, sensitivitas, dan ketepatan
yang rendah. Dalam spektrometer ini terdapat
banyak alat yang bergerak-gerak, sehingga
b. Spektrometer FTIR
kegagalan sering diakibatkan oleh kegagalan
mekanik. Lamanya waktu skening sekitar 15
Spektrometer FTIR menggunkan interferometer
menit atau lebih untuk mendapatkan spektrum
yang menganalisa informasi frekwensi dan
resolusi yang tinggi, karena spektrometer IR
intensitas dengan merubah frekwensi IR
menggunakan
celah
“slits”
untuk
menjadi auto frekwensi. Interferometer
meningkatkan resolusinya, intensitas dengan
Mickelson sangat banyak digunakan yang
menurunkan sensitivitas. Tidak adanya
terdiri dari cermin permanen dan bergerak dan
reference internal. Untuk mengkalibrasi
pembagi sinar “beam spliter”. Cara kerja
ketepatan frekwensi dan selalu dibutuhkan
interferometer Mickelson digambarkan sebagai
kalibrasi dengan spektrum reference. Spektrum
berikut. Dalam gambar 11.2. radiasi dari
polistirene
biasa
digunakan
untuk
sumber radiasi IR (A), diteruskan menuju
mengkalibrasi spektrum IR. Pada spektrometer
interferometer.
Pada
saat
menuju
dispersive kemungkinan terjadadi efek panas
interferometer, sinar cahaya IR berkontak
pada sampel karena penempatan sampel yang
dengan pembagi sinar (B), yang membagi
berdekatan dengan sumber radiasi, hal ini
berkas sinar dengan energi yang sama. Sekitar
terkadang menimbulkan masalah karena
50% cahaya dari pembagi cahaya diteruskan
detektor merekam emisi radiasi IR dari sampel
menuju cermin permanen (C) dan 50% yang
sering terjadi kesalahan pembacaan serapan
dipentulkan dari pembagi cahaya diteruskan
oelh detektor yang diakibatkan oleh hamburan
menuju cermin bergerak (D). Berkas cahaya
radiasi yang dihasilkan oleh sistem optik.
tersebut akan dipantulkan oleh cermin-cermin
tersebut dan akan digabungkan oleh pembagi
74
Aplikasi spektrosfotometri IR dalam analisis Toksikologi
cahaya. Total interferensi yang terjadi
tergantung dari posisi relatif cermin bergerak
terhadap cincin permanen. Akhirnya berkas
cahaya hasil interferensi ini diterukan menuju
sampel sehingga akan terjadi absorpsi selektif
oleh sampel, berkas cahaya akan diteruskan
menuju detektor. Detektor mengukur frekwensi
dan intensitas dalam kawasan audio.
Gambar 11.2. Skematik diagram spektrometer FTIR
Tabel 11.1. Rangkuman perbedaan IR dispersive dengan FTIR
Dispesive IR
FTIR
- Banyak yang bergerak
- Secara mekanik sederhana (hanya satu bagian
yang bergerak
- Kecepatan scaning rendah
- Kecepatan scaning tinggi
- Sensitivitas rendah
- Sensitivitas tinggi
- Tidak terdapat referen internal
- He-Ne-laser digunakan sebagai reference
internal
- Diperlukan kalibrasi dengan suatu reference
- Tidak membutuhkan kalibrasi
- Sampel dekat dengan sumber cahaya IR
- Sampel jauh dengan sumber cahaya IR
- Digunakan berkas cahaya yang sedikit
- Diperlukan berkas cahaya yang tinggi
- Mungkin terjadi hamburan cahaya
- Hamburan cahaya tidak menggunakan detektor
- Emisi radiasi sampel akan terukur oleh detektor
- Emisi radiasi oleh sampel tidak termodulasi
sehingga tidak terukur oleh detektor
- Terjadi perubahan resolusi dengan berubahnya - Resolusi konstan dari semua rentang spektra.
rentang spektra.
11. 4. Teknik Sampling pda IR
Pada penggunaan spektra IR, senyawa yang
diidentifikasi harus relatif murni dan jumlahnya
harus cukup untuk menyerap radiasi dan
mendeteksi radiasi yang diserap. Di dalam
prakteknya sampel-sampel yang datang di
Laboratorium Forensik umumnya dalam bentuk
campuran dan tidak murni sehingga diperlukan
pemurnian, sebelum dilakukan analisis. Teknik
pemurnian atau pemisahan yang tepat
tergantung pada jenis sampel, konsentrasi
analit dan demikian juga jenis pengotor yang
terdapat.
Senyawa yang hendak dianalisa sedikitnya
memiliki tingkat kemurnian 95% untuk
meminimalkan spektra pengganggu dari
pengotor. Dispersive IR membutuhkan sampel
1 mg sedangkan FTIR dapat mendeteksi hingga
nanogram. Cara-cara penanganan sampel
73
Aplikasi spektrosfotometri IR dalam analisis Toksikologi
tergantung daripada jenis sampel yaitu apakah
terbentuk gas, cairan atau padatan. Gaya-gaya
intermolekul sangat berbeda antara gas, cairan
atau padatan, dan spektrum IR biasanya akan
menunjukkan efek dari perbedaan-perbedaan
ini dalam bentuk pergeseran frekwensi atau
pita-pita tambahan dan sebagainya. Oleh sebab
itu penting mencatat spektrum dengan caracara penanganan yang sesuai.
11.4.1. Teknik sampling tradisional
a. Gas
Untuk menangani cuplikan berbentuk gas,
maka cuplikan harus dimasukkan dalam sel
gas; sel ini menghadap langsung pada berkas
sinar. Dalam bentuk yang dimodifikasi, cermin
internal yang digunakan dapat memantulkan
berkas sinar berulang kali melalui cuplikan
untuk menaikkan sensitivitas. Sejumlah kecil
senyawa-senyawa organik dapat ditentukan
dalam bentuk gas, bahkan dalam sel-sel yang
dipanaskan.
b. Cairan
Cara yang paling mudah dalam penanganan
cuplikan bentuk cairan adalah menempatkan
cuplikan tersebut sebagai film yang tipis di
antara dua lapis NaCl yang transparan terhadap
inframerah. Karena digunakan NaCl maka
setelah selesai segera dibersihkan dengan
mencuci menggunkan pelarut-pelarut seperti
toluena, kloroform, dan sebagainya. NaCl harus
dijaga tetap kering dan selalu dipegang pada
ujung-ujungnya. Untuk spektra di bawah 250
cm-1, maka digunkan CSl, untuk cuplikan yang
mengandung air dapat digunkan CaF2. Cuplikan
cairan dapat juga ditentukan dalam larutan.
c. Padatan
Wujud cuplikan padat dapat bermacam-macam
di antaranya, kristal, amorf, serbuk, gel, dan
lain-lain. Bermacam-macam metoda telah
dikembangkan untuk penyediaan cuplikan
padat hingga dapat langsung diukur. Ada tiga
cara yang umum untuk mencatat spektra
bentuk padatan: pelet KBr, mull, dan bentuk
film / lapisan tipis. Padatan juga dapat
ditentukan dalam larutan tetapi spektra
larutanmngkin memberikan kenampakan yang
ebrbeda dari spektra bentuk padat, karena
gaya-gaya intermolekul akan berubah.
Pelet KBr dibuat dengan menumbuk cuplikan
(0,1-2,0% berat) dengan KBr kemudian ditekan
hingga diperoleh pelet. KBr harus kering dan
akan baik bila penumbukan dilakukan di bawah
lampu inframerah untuk mencegah terjadinya
kondensasi uap dari atmosfer yang akan
memberikan serapan lebar pada 3500cm-1.
Mull, atau pasta, dibuat dengan mencampur
cuplikan dengan setetes minyak; pasta
kemudian dilapiskan di antara dua keping NaCl
yang transparan. Bahan pasta harus transparan
terhadap inframerah, tetapi hal ini tidak pernah
ada dan struktur yang dihasilkan selalu
menunjukkan serapan yang berasal dari bahan
pasta yang super impos dengan cuplikan yang
sering digunakan sebagai bahan pasta adalah
parafin cair (nujol).
Lapisan tipis padatan dapat dilapiskan pada
kepingan NaCl dengan cara meneteskan
larutan dalam pelarut yang mudah menguap
pada permukaan kepingan NaCl dan dibiarkan
hingga pelarut menguap. Plimer-polimer
berbagai lilin atau behan-bahan lemak sering
memberikan hasil yang baik, tetapi ada juga
yang membentuk kristal yang tajam hingga
tidak memberikan serapan.
Larutan, Cuplikan dapat dilarutkan dalam
pelarut seperti karbontetraklorida, karbon
disulfida atau kloroform, dan spektrum dari
larutan ini dicatat. Larutan (biasanya 1-5%)
ditempatkan dalam sel larutan yang terdiri dari
bahan transaparan. Sel yang kedua berisi
pelarut murni ditempatkan pada berkas sinar
referensi, sehingga serapan dari pelarut dapat
dikensel dan spektrum yang dicatat merupakan
senyawanya sendiri. Meskipun demikian untuk
meyakinkan bahwa serapan dari pelarut tidak
mengganggu spektrum dari cuplikan, maka
sebaiknya perlu dibuat spektrum dari pelarut
yang digunkan untuk mengetahui serapanserapan yang diberikan.
11.4.2. Teknik sampling yang lain
Dalam beberapa tahun terakhir telah
berkembang teknik sampling yang lain,
beberapa dari teknik tersebut telah diterapkan
dalam kimia forensik. Metode ini termasuk
spekular reflektan, diffusi reflektan, total
attenuasi reflektan, dan fotoaqoustik detektion.
Beberapa teknik ini adalah sangat baru tetapi
telah banyak dikenal dikalangan analisis
forensik.
a. Spekular reflektan (pemantulan spekular)
Aplikasi spektrosfotometri IR dalam analisis Toksikologi
76
Spekular reflektan adalan suatu teknik di mana
spketrum diperoleh dari pemantulan radiasi IR
pada permukaan sampel. Radiasi dikumpulkan
pada sudut yang sama dengan sudut datang.
Secara komersial terdapat aksesoris dengan
sudut pantul yang tetap atau ebrubah-ubah.
Aksesoris
ini
dapat
digunkan
pada
spekrometer dispersive atau FT-IR. Puncakpuncak serapan pemantulan spekular mungkin
memberikan geseran menuju frekwensi yang
lebih tinggi daripada spektrum absorpsi. Teknik
ini diterapkan untuk merekam spektrum IR dari
suatu senyawa terdeposisi pada cermin.
b. Difusi reflektan
Difusi reflektan dan spektrometri FTIR difusi
reflektan hampir mirif dengan spekular
reflektan tetapi difusi reflektan memantulkan
radiasi yang berpenetrasi ke dalam sampel.
Radiasi yang dipantulkan dikumpulkan oleh
cermin kolimator. Diagram aksesoris difusi
reflektan dari “spectra-tech” dapat dilihat pada
gambar 11.1 dan 11.2
Keuntungan
utama
difusi
reflektan
dibandingkan dengan spekular reflektan adalah
spektrum yang diperoleh analog dengan
spektrum IR secara tradisional. Sampel
dianalisis secara langsung atau dengan
mendispersikan pada bahan tan-erap (nonabsorbing).
Telah dilaporkan jumlah sampel minimum yang
dapat dianalisis adalah 20 µg masih
memberikan spektr yang bagus. Prosedur
penyerapan sampel adalah sampel dicampur
dengan logam alkali halida kemudian
ditempatkan pada cawan sampel. Cawan
sampel ditempatkan dalam aksesories atau
sampel dipekatkan pada bubuk kalium bromida
dengan melarutkan sampel dalam kloroform
kemudian dicampur dengan KBr, kemuidan
kloroform diuapkan sehingga hampir semua
sampel teradsorpsi pada permukaan bubuk
KBr.
c. “Attenuated Total Reflectance”
Teknik “attenuated total reflectance” (ATR)
sama seperti spekular reflektan dan difusi
reflektan. Teknik ini biasa digunakan untuk
merekam spektrum IR dengan bahan yang tidak
transparan. Teknik ini sangat jarang digunkan
pada kimia forensik kimia obat karena
memerlukan jumlah sampel yang besar.
d. Spektroskopi fotoacoustik
Dasar kerja dari spektrokopi fotoacoustik
adalah penyearpan cahaya IR yang termodulasi
dalam sampel. Panas terlokalisasi dihasilkan
oelh penyerapan radiasi oleh sampel ditransfer
dari permukaan sampel menuju atmosfer gas di
atas permukaan sampel. Perpindahan panas
dari gas diukur melalui variasi tekanan yang
dideteksi sebagai suara oleh mikroption
bersensitivitaas tinggi. Suatu interferogram
dibangkitkan yang ditransformasikan dan
dirasiokan terhadap panas jenuh suatu bahan
(karbon hitam). Hasilnya adalah spektrum
fotoacoustik dari sampel.
Keuntungan dari metode ini adalah sangat
sedikit atau tanpa pra perlakuan seperti
penyerapan sampel pelarutan. Kelemahan
utamanya adalah waktu yang lama diperlukan
untuk
menghasilkan
spektrum
dan
aksesorisnya sangat mahal.
11. 5. Berbagai Teknik Yang Dikombinasikan
Dengan Spektroskopi IR
Dalam beberapa tahun terakhir ini banyak
instrumen
lain
digabungkan
dengan
spektroskopi IR seperi GC, HPLC, dan KLT.
Sekarang ini,
juga kromatografi cair
superkritis. GC-FTIR juga dikombinasikan
dengan
MS.
Diameter
dari
semua
penggabungan ini spektroskopi IR berfungsi
sebagai detektor. Diameter spektroskopi FT-IRanalisis termografimetrik (TGA-FTIR) dan FT-IR
mikrospektroskopi juga digunakan untuk
analisis obat.
a. GC-FTIR
Pemisahan sampel untuk kromatografi gas
memungkinkan mendapatkan senyawa murni.
Untuk spektroskopi IR berbagai sistem
kombinasi telah dikembangkan. Pada awalnya
teknik adalah aliran terperangkap dalam suatu
kopolimer tembus sinar IR. Teknik ini sangat
sukar untuk memilih puncak-puncak analit
yang telah dipisahkan oleh GC. Perkembangan
berikutnya sinar IR dilewatkan langsung pada
kolom kapiler tembus sinar. Sehingga sinar IR
langsung melewati aliran efluen. Sinar IR dapat
langsung menganalisa puncak-puncak analit
yang terpisahkan oleh GC.
Pada tahun terakhir ini, dikatakan kimia
forensik telah mengenal kombinasi GC-FTIRMS. Sistem “cryolect” dari Mattsun dan sistem
77
Aplikasi spektrosfotometri IR dalam analisis Toksikologi
tracer dari bijilab dapat mengkombinasikan GCFTIR dengan MS akhirnya. Dengan sistem ini
memungkin-kan mendapat informasi yang
akurat dalam uji skrining dan konfirmasi karena
dari IR dan MS dapat melakukan elusidasi
struktur suatu senyawa atau dengan
perbandingan dengan data “Library”.
b. Kromatografi cair -FTIR
Salah satu keuntungan HPLC dan GC adalah
sistem tidak terjadi perusakan / destruksi analit
dalam efluen. Lebih banyak sampel dapat
dianalisis oelh HPLC. Secara umum kapasitas
kolom HPLC lebih besar dari GC, sehingga
lebih banyak sampel dapat dianalisis oleh IR
spektroskopi. Deteksi IR dari eluen
kromatografi cair dilengkapi dengan alat yang
dapat menguapkan pelarut sebelum deteksi IR
atau deteksi langsung pada lairan kolom.
Teknik penguapan eluen sebelum dianalisis
adalah paling baik, namun akan memerlukan
lebih banyak waktu dan susah untuk
diautomisasi. Deteksi langsung pada aliran
menggunkan “flow-cell detection” HPLC-FTIR
sering menimbulkan 2 masalah adalah
gangguan absorpsi oelh pelarut dan terjadi
interaksi antara analit (solut) dengan pelarut
sehingga
mengakibatkan
geseran
pita
absorpsi. Metode absorpsi lainnya adalah
deteksi “flow-cell” aliran terjadi yaitu aliran
ditentukan pada saat scaning IR.
c. Kromatografi lapis tipis-FTIR
Teknik ini adalah “chromalect TLC-FTIR”
sistem ini dikembangkan oleh Anabect. Awal
dari instrumen ini, spektrum IR dari suatu
senyawa diukur pada pelat KLT yang telah
terpisah atau secara manual dikerok kemudian
diukur transmitan atau difusi reflektornya.
Sistem “chromalect” adalah sampel yang telah
terpisahkan oelh KLT, sampel dipindahkan ke
serbuk IR-transparan kemudian diukur
spektrum IRnya. Pemisahan pada KLT
dilakukan secara konvensional. Plat KLT
kemudian dikeringkan atau diikatkan dengan
alat untuk memindahkan sampel ke dalam
suatu cawan difusi reflektan yang mengandung
bubuk khusus untuk pengukuran IR. Alat ini
dilengkapi pemutar plat 90o dan menggunakan
sumbu stenslesstill, seperti kromatogram dua
dimensi. Analit pada alat KLT dipisahkan dari
plat melalui aliran pengembang pada sumbu
stenless sampai analit terkonsentrasi pada
serbuk IR transparan dalam cawan difusi
reflektan. Serbuk IR transparan berasal dari
gelas - germanium - antimony - selenium. Pada
prosedur ini pelarut dihilangkan dengan
memanaskan
cawan
sehingga
pelarut
menyerap sempurna.
Metode pemindahan ini dapat meminimalkan
kehilangan, dekomposis sampel atau terjadi
kontaminasi oelh senyawa pengotor selama
proses pemisahan. Alat ini bekerja secara
otomatis. Setelah analit terkonsentrasi pada
cawan difusi reflektan, diukur spektrum IRnya.
d. Spektroskopi mikrospektroskopi FTIR
Teknik
mikrospektroskopi
FTIR
dapat
digunakan untuk identifikasi obat, serat, dan
cat. Sinar IR difokuskan pada sampel untuk
memperoleh spektrum IRnya. Serbuk obat
dapat diukur dengan mudah di bawah
mikroskop. Di bawah sinar-sinar mikroskop
berbagai komponen kristal di dalam sampel
dapat dapat dipisahkan melalui bentuk kristal,
tekstur dan morfologinya. Sinar IR kemudian
difokuskan pada satu kristal tersebut. Jika
kristal tersebut terlalu tebal maka spektrum IR
yang diperoleh sangat kasar/ ditutupi oleh pitapita yang lebar. Masalah ini dapat diatasi
dengan memindahkan fokus sinar IR pada
ujung atau bagian tertipis dari kristal tersebut.
Melalui mikroskop ini pemisahan / pemilihan
kristal dapat dilakukan. Permasalahan timbul
banyak kristal obat mengalami polimorfisme
seperti senyawa-senyawa barbiturat dan
amfetamin.
11.6. Penerjemahan Spektrum IR
Terdapat dua prinsip dasar untuk menentukan
identitas suatu senyawa dengan spektroskopi
IR adalah melakukan analisis gugus fungsi dan
secara langsung membandingkan dengan
spektrum senyawa yang sudah diketahui.
Analisis gugus fungsi didasarkan atas pita-pita
serapan yang muncul pada daerah gugus
fungsi dan sidik jari. Dari pita-pita tersebut
dapat diperoleh informasi gugus fungsi yang
mungkin terdapat pada spektrum tersebut.
Penafsiran gugus fungsi secara umum telah
dijelaskan sebelumnya.
Setelah gugus fungsi suatu spektrum / analit
dapat
dikenali
langkah
berikutnya
membandingkan dengan spektrum senyawa
yang sudah diketahui. Beberapa perbedaan /
geseran pita-pita pada spektrum dari suatu
78
Aplikasi spektrosfotometri IR dalam analisis Toksikologi
senyawa dapat diakibatkan oleh alat yang
berbeda atau metode penyiapan sampel yang
berbeda. Perbedaan atau geseran pita-pita oleh
suatu alat diakibatkan oleh resolusi, noise,
respon, gain, dan berbagai faktor yang lain.
Untuk mengatasi dapat dilakukan pengukuran
pembanding dengan alat resolusi yang sama.
11. 7. Spektrum IR obat-obatan yang sering
disalahgunakan
Pada tabel 11.2. terdapat ringkasan puncak
pita-pita dari senyawa obat yang sering
disalahgunakan dan sering dianalisis oleh
Laboratorium Kimia forensik.
Seperti pada MS kebanyakan instrumen FTIR
dilengkapi dengan program manipulasi
database yang dapat membantu dalam analisis
atau penerjemahan spektrum suatu analit.
Database spektra IR juga dilengkapi data
kepustakaan yang memuat semua informasi
spektrum IR.
Tabel 11.2. Ringkasan spektra utama beberapa obat yang umum
Senyawa
Narkotika :
Bilangan gelombang (cm-1)
Kokain
1728. 1264, 1104, 729
Kodein
1499, 1443, 1267, 1069
Diamorfin-HCl
1753, 1732, 1365, 1230
Hidromorfon
1717, 1443, 1027, 964
Hlusinogen: MDA
1485, 1435, 1253, 1034
MDMA
sama dengan MDA
Fensiklidin
1442, 963, 759, 702 (beberapa amfetamin yang karakteristik)
Depresan: Amilobarbiton
1428, 842, 498, 406
fenobarbiton
1350, 1308, 561, 504 (beberapa barbiturat yang serupa)
Diazepan
1681, 1484, 885, 709
Alprazolam
1611, 1484, 822, 695
Stimulan: Amfetamin
1512, 1393, 737, 702
Metamfetamin
1491, 1456, 752, 702
Fenmetrazin
1491, 1449, 759, 702
Fendimetrazin
1449, 1111, 752, 702
Keterangan: MDA = 3,4- Metilendioksiamfetamin, MDMA = 3,4- Metilendioksimetilamfetamin
Kepustakaan
1. Chamberlain, J., 1985, Analysis of Drugs in
Biological Fluid, CRC Press Inc, Boca Raton
2. Hardjono
Sastrohamidjojo,
1992,
Spektroskopi
Inframerah,
Liberty,
Yogyakarta.
3. Mills, III. And G.J. Fontis. 1991. “Aplications
of infrared spectroscopy in drug analysis”,
Goush, T.A. “The Analysis of Drug of
Abuse, John Wileys sons Ltd, Chiehester,
226-281.
4. Moffat, A.C., et all., (Ed), 1986, Clark’s
Isolation and Identification of Drugs in
Pharmaceuticals, Body Fluids, and PostMortem Material, Second Ed., The
Pharmaceutical Press, London.
5. Skoog, D.A., Leary, J.J., 1992, Principles of
Instrumental Analysis, 4 th Ed., Harcourt
Brace Publisher, New York.
6. Sriewoelan, S., 1988, Analisis Obat Dalam
Cairan Biologi, ITB, Bandung.
7. Willard, H.H., et all., 1989, Instrumental
Methods
of
Analysis,
Wadsbuorth
Publishing Company, California
Aplikasi spektrosfotometri IR dalam analisis Toksikologi
79
Bibliografi Penulis
Nama
: Dr.rer.nat. I Made Agus Gelgel Wirasita, M.Si.,
Apoteker
Kantor : - Institute of Forensic Sciences and Criminology –
Udayana University – Denpasar – Bali,
Indonesian
- Department of Pharmacy – Faculty
Mathematic and Basic Sciences
Udayana University
Email : [email protected]
Telp : 0361-7952455
081337742733
Residence : Jl Udayana Lodge, Blok E-52, Pasraman
Udayana, Jimbaran – Bali
Riwayat Pendidikan:
1987 - 1992
: Sarjana Farmasi di Jurusan Farmasi Institut Teknologi Bandung
1992 - 1993
: Apoteker di Jurusan Farmasi Institut Teknologi Bandung
1995 - 1997
: Magister Program di Jurusan Farmasi Institut Teknologi Bandung
2000 - 2004
: Doktor Program di Institute Farmasi-Universitas Hamburg -German
dan di Institute Kedokteran Forensik – Universitas Georg-August Goettingen - German
Pengalaman Kerja:
1994 - 2005
: Staf Dosen Jurusan Kimia-FMIPA Universitas Udayana, pada
Bidang Ilmu Kimia Forensik
1997 - 1999
: Kepala Laboratorium Kimia Forensik-Jurusan Kimia FMIPA
Universitas Udayana
2000 – 2004
: Staf Peneliti di Laboratorium Toksikologi – Forensik - Institut
Kedokteran Forensik -Universitas Georg-August, Gettingen,
German
2005 – sekarang
: Staf Dosen Jurusan Farmasi-FMIPA-Universitas Udayana
2005 – sekarang
: Ketua Pelakasana Harian Lembaga Forensik Sains dan Kriminologi
Universitas Udayana
2005 – sekarang
: Staf peneliti Bidang Toksikologi Forensik, Bidang-Kajian Ilmu
Toksikologi Forensik – Lembaga Forensik Sains dan Kriminologi
Universitas Udayana
2008 – sekarang
: Ketua Jurusan Farmasi – FMIPA-Universitas Udayana
Presentasion:
1. Die Entwicklung der Drogenproblematik in Indonesien und Deutschland am Beispiel
der BTM-Befunde der forensischen Institute in Denpasar und Göttingen.
“Möglichkeiten und Grenzen der Befundinterpretation“, Poster presentation 80th
International Conference of
German Legal Medicine Society in Interlaken,
Switzerland, 2001
2. Möglichkeiten und Grenzen der rechnerischen Simulation der Pharmakokinetik des
Heroins im menschlichen Körper“, Oral Presentation in 81th International Conference
of German Legal Medicine Society in Rostock, Germany, 2002
3. “Rechnerische Simulation der Pharmakokinetik der Opiate im menschlichen Körper zur
Unterscheidung einer Codeinaufnahme von einem Straßenheroinkonsum” Oral
Presentation in 82th International Conference of German Legal Medicine Society in
Münster, Germany, 2003
4.
Aplikasi spektrosfotometri IR dalam analisis Toksikologi
73
5. “Rekonstruktion der individuellen Pharmakokinetik des Morphins, Codeins, und deren
Glucuronide nach Strassenheroinkonsum”, Oral Presentation in 83th International
Conference of German Legal Medicine Society in Göttingen, Germany, 2004
6. “Study of the morphine’s and codeine’s pharmacokinetics after illicit heroin
consumption”, Poster presentation in 3rd Indonesian Biotechnology Conference, 2004
7. Clinical toxicological analysis: New Challenge for Indonesian pharmacist, oral
presenter by Regional Conference of Pharmaceutical and Biomedical Analysis,
Bandung, Indonesia, 15 - 16 Sep. 2005
8. Pharmacokinetic simulation of the time course of the ratio morphine glucuronides to
morphine after i.v. administration of heroin, oral presenter, by the 14th Congers of
Indonesian Pharmacists Association, Kuta, Indonesia, Juni 16-19th, 2005
9. “Hambatan-hambatan dalam penegakan hukum (undang-undang no 22 th 1997
tentang narkotika ) bagi penyalahgunaan golongan opiat berdasarkan sifat-sifat
farmakokinetiknya” , oral presentation, by Kongres ilmiah XIV Ikatan Sarjana Farmasi
Indonesia, Kuta, 16-19 Juni 2005 2004
10. Analitical Forensic toxicology and Interpretation of analytical Result, Oral Presenter, at
National Workshop on Forensic Toxicology, BPOM, Jakarta December, 17-18th, 2005
11. Drugs profiling as tool for identify the origin of drugs, Oral Presenter, on Second
National Workshop on forensic Toxicology, BPOM, Jakarta, May, 22-24th, 2007
12. Pemanfaatan
TLC
dalam
Drugs
Screening
Tinjauan keungguan dan kelemahan dibandingkan dengan teknik immonoassay, Oral
Presenter, on Second National Workshop on forensic Toxicology, BPOM, Jakarta,
May, 22-24th, 2007
13. Aspek-aspek teknis yang perlu diperhatikan dalam pemeriksaan skringing dan
konfirmasi NAPZA dalam rangka peningkatan mutu pemeriksaan NAPZA, dalam
Rapat Konsultasi Pemantapan Mutu Eksternal Laboratorium Kesehatan 2008 di
Denpasar oleh Direktorat Jendral Bina Pelayanan Penunjang Medik, Denpasar, July,
31st – August, 2nd, 2008
14. Pemaknaan Hasil Analisis Laboratorium Pemeriksaan Narkoba Dalam Rangka Proses
Penegakan Hukum, Lokakarya Peran Laboratorium Pemeriksaan Narkoba dalam
Proses Penegakan Hukum, BNN, Jakarta, 24-25 Mei 2008
15. Dasar-dasar kromatografi lapis tipis dan pemilihan eluen dalam uji skrining dan
Konfirmasi, Pelatihan Peningkatan Kemampuan Teknis Pemeriksaan NAPZA di
Surabaya, oleh oleh Direktorat Jendral Bina Pelayanan Penunjang Medik, Denpasar,
August, 25-29th, 2008
Publication
1. Wirasuta, I M.A.G., (2004) “Untersuchung zur Metabolisierung und Ausscheidung von
Heroin im menschlichen Körper. Einbeitrag zur
Verbesserung der
Opiatbefundinterpretation“, Cuvillier Verlag, Göttingen
2. Wirasuta, I M.A.G., (2005) “Peran Toksikologi forensik dalam penegakan hukum
kesehatan di Indonesia” dalam Wirasuta, I M.A.G., et al. (Ed.) (2005), “Peran
kedokteran forensik dalam penegakan hukum di Indonesia. Tantangan dan tuntuan di
masa depan”, Penerbit Udayana, Denpasar
3. Wirasuta, I M.A.G. (2008), Analisis Toksikologi Forensik Dan Interpretasi Temuan
Analisis, Indonesian Journal of Legal and Forensic Sciences 2008; 1(1):47-55
4. Wirasuta, I M.A.G. dan K Suardemana (2007), Analisis Toksikologi Klinik: Tantangan
Baru Bagi Farmasis Indonesia Acta Pharmaceutica Indonesia, Vol 32, No: 2, 2007, 5962
Aplikasi spektrosfotometri IR dalam analisis Toksikologi
74
Research on going
1. Pemanfaatan Teknik High Performace Thin Layer Chromatography (HPTLC)Spektrofotodensitometri Untuk Analisis Kharakteristik Kimia „Drugs Profiling“ Narkoba,
didanai oleh HIBAH UDAYANA 2008
2. Analisis Kharakteristik Kandungan Kannabinoida Daun Ganja Yang Tumbuh Di
Indonesia, DANA DIPA UDAYANA
3. Analisis Opiat dalam Urin dan Darah dengan TLC/HPTLC-Densitometrik
Jimbaran, Juli 2008
Hormat Penelitia
Dr.rer.nat. I Made Agus Gelgel Wirasuta, M.Si., Apotheker
Aplikasi spektrosfotometri IR dalam analisis Toksikologi
75