xii ABSTRACT Development Method of Detection

ABSTRACT
Development Method of Detection Contaminant Bacterial Pathogen
Escherichia coli in Milk with Real-Time Polymerase Chain Reaction (RTiPCR)
By
Amalia Masturotul M
09/283370/PA/12532
Detection contaminant bacterial pathogen Escherichia coli in milk with
Real-Time Polymerase Chain Reaction (RTi-PCR) have been done. The research
aimed to develop detection method of E. coli contamination in milk rapidly.
The prosedure of research was begun with development method which
was consisted of E. coli culture enrichment, DNA isolation, analysis of DNA
concentration, and RTi-PCR analysis that was combined with Melting Curve
Analysis (MCA). Then, the research was continued by validation method which
was consisted of specificity test to compare between positive control and negative
control, precision test or repeatability method in 10 positive control, cut off
detection determining, and the last was method application in commercial milk
sample.
The Results from this research showed that RTi-PCR method used
TEco1553 and TecoI754 primer was right method to detect E. coli contamination
in milk with typical melting peak point at 84,50 °C. Specificity test showed that
this method was specific in detecting E. coli in milk. In precision test, all of
positive control resulted melting peak with melting peak point between 84,00 °C –
84,50 °C. This RTi-PCR method could detected contamination of E. coli in milk
with cut off detection until 1,6 CFU/mL. Five commercial milk samples that were
analysed in application method showed a result that commercial milk samples
which sold in traditional market and stall dairy was positive contaminated E. coli.
Key word: Escherichia coli, milk contamination, Real-Time PCR.
xii
BAB I
PENDAHULUAN
I.1 Latar Belakang
Susu merupakan bahan pangan yang kaya akan gizi dan nutrisi yang
dibutuhkan oleh tubuh. Berbagai macam vitamin, mineral, protein, dan lemak
yang terkandung di dalam susu dapat memberikan manfaat yang beragam pada
tubuh, seperti membantu pertumbuhan tulang serta menetralisir racun dalam
tubuh. Adanya kandungan nutrisi yang tinggi dalam susu dapat menyebabkan
banyaknya bakteri termasuk bakteri yang merugikan dan bersifat patogen dapat
tumbuh dan berkembang di dalam susu tersebut. Mikroorganisme yang tumbuh
dalam susu tersebut dapat berasal langsung dari sapi perah itu sendiri maupun
dari lingkungan pemerahan susu sapi tersebut, meliputi sumber air yang
digunakan serta peralatan yang digunakan untuk menyimpan dan mengangkut
susu sapi tersebut (Bali et al., 2013).
Secara alami, susu yang berasal dari sapi yang sehat mengandung
mikroorganisme kurang dari 5 × 103 CFU per mL jika diperah dengan cara yang
benar (Suwito, 2010). Namun adanya kontaminasi dari bakteri patogen pada susu
segar dapat menyebabkan kasus keracunan makanan yang dapat beresiko fatal.
Terdapat banyak bakteri patogen yang dapat mencemari susu, salah satunya yaitu
bakteri Escherichia coli.
Beberapa tahun terakhir, E. coli telah dilaporkan sebagai penyebab utama
terjadinya kasus keracunan makanan oleh mikroba atau lebih dikenal dengan
foodborne disease yang terjadi di beberapa negara seperti Inggris, Jepang,
Amerika, dan juga Indonesia (Daly et al., 2001). Strain tertentu dari E. coli telah
diakui sebagai patogen manusia sejak tahun 1940 dan dikaitkan dengan kasus
keracunan makanan yang sering terjadi. E. coli dapat masuk ke dalam tubuh
manusia terutama melalui konsumsi pangan yang tercemar, misalnya daging
mentah, daging yang dimasak setengah matang, susu mentah, dan cemaran feses
pada air dan pangan. Terdapat lima kelompok E. coli yang bersifat patogen yaitu
enteropatogenik E. coli (EPEC), enteroagregatif E. coli (EAEC), enterotoksigenik
1
2
E. coli (ETEC), enteroinvasif E. coli (EIEC), dan verositotoksin atau shigatoksin
E. coli (VTEC/STEC) (Kagkli et al., 2012). E. coli penghasil verotoksin (VTEC)
umumnya mengakibatkan diare berdarah dan dapat menyebabkan uremia
hemolitik, yang ditandai dengan trombositopenia, anemia hemolitik, dan gagal
ginjal akut terutama pada anak- anak, sehingga E. coli jenis ini lebih dikenal
dengan enterohemoragik E. coli (EHEC). Saat ini, E. coli dengan strain EHEC ini
sedang menjadi pusat penelitian dunia karena dinilai strain E. coli yang paling
berbahaya dan paling sering mencemari makanan sehingga menimbulkan berbagai
masalah keracunan yang dapat mengakibatkan kematian (Djafaar dan Rahayu,
2007).
Kasus keracunan makanan akibat kontaminasi E. coli telah dilaporkan
terjadi di beberapa daerah di Indonesia. Seperti yang telah terjadi di Kediri, Jawa
Timur, sebanyak 7 pelajar sekolah dasar keracunan susu pemberian pemerintah
yang dibagikan secara gratis di sekolah pada Oktober 2011. Kasus serupa juga
terjadi pada 15 Juni 2012, belasan santri sebuah pesantren di Sukabumi, Jawa
Barat mengalami mual-mual, muntah bahkan diare setelah mengkonsumsi susu
kemasan. Pada September 2013, tiga balita di Tasikmalaya, Jawa Barat juga
mengalami keracunan susu. Gejala yang ditimbulkan pada beberapa kasus
tersebut memiliki kesamaan dengan gejala keracunan yang diakibatkan oleh E.
coli yaitu nyeri perut, mual, dan diare.
Metode deteksi E. coli dalam makanan menjadi suatu hal yang amat
penting dan dibutuhkan yang berguna untuk mengidentifikasi penyebab utama
kasus keracunan yang sedang terjadi serta untuk menjamin kesehatan masyarakat.
Berbagai macam metode telah dikembangkan untuk mendeteksi adanya
kontaminasi E. coli di dalam makanan (Fode et al., 2003). Uji mikrobiologis
untuk mendeteksi bakteri Escherichia coli dalam air umumnya dilakukan melalui
pendekatan konvensional, yaitu cara kultur dan uji sifat biokimia. Namun
demikian metode konvensional ini pada umumnya memerlukan waktu 5-7 hari
untuk mendapatkan hasil yang positif.
Seiring dengan perkembangan ilmu dan teknologi, metode analisis
berbasis kultur tersebut mulai ditinggalkan karena metode berbasis kultur tersebut
3
dinilai memiliki kelemahan dalam hal tingkat kecepatan analisis. Hal ini dapat
berpengaruh pada melambatnya upaya pencegahan dan penanganan kontaminasi
E. coli dalam makanan khususnya dalam susu segar (Heijnen dan Medema, 2009).
Oleh karena itu, beberapa upaya pengembangan untuk mendeteksi E. coli dalam
makanan telah dilakukan.
Metode lain yang telah dikembangkan untuk mendeteksi adanya
kontaminasi E. coli dalam susu segar berbasis molekuler yaitu melalui uji PCR
(Polymerase Chain Reaction). Reaksi polimerase berantai atau dikenal sebagai
polymerase chain reaction (PCR) merupakan suatu proses sintesis enzimatik
untuk mengamplifikasi nukleotida secara in vitro. PCR merupakan reaksi
berulang yang meliputi tahap denaturasi templat, annealing (penempelan)
pasangan primer pada untai tunggal DNA target dan extension (pemanjangan atau
polimerisasi) sehingga diperoleh amplifikasi DNA antara 105-109 kali (Abdullah
dan Retnoningrum, 2003). Penelitian mengenai deteksi kontaminasi E. coli
dengan PCR telah dilakukan sebelumnya oleh Tsen et al. (1998) dengan
menggunakan primer 16E1/16E2/16E3 dalam sampel air dan juga susu skim.
Metode deteksi kontaminasi E. coli dalam produk pangan dengan PCR
konvensional masih memiliki kekurangan. Hal ini dikarenakan analisis pemisahan
produk hasil PCR dilakukan melalui proses elektroforesis sehingga dinilai kurang
efisien.
Pengembangan metode untuk mengatasi kekurangan pada metode PCR
konvensional tersebut yaitu melalui teknik Real-Time PCR (RTi-PCR) yang dapat
mengamplifikasi gen tuf pada E. coli. Gen tuf merupakan gen pengkode faktor
elongasi (elongation factor thermo unstable/ EF-Tu) pada proses translasi protein
sel prokariot. Metode RTi-PCR memiliki beberapa kelebihan dibandingkan
dengan metode PCR konvensional. Analisis produk amplifikasi pada RTi-PCR
tersebut dapat diamati secara langsung dengan menggunakan pewarna ikatan
DNA (DNA binding dye) seperti SYBR green atau melalui penggunaan fluorescent
probe dalam waktu yang singkat serta memiliki tingkat sensitivitas yang tinggi.
Selain itu, resiko kontaminasi pada metode RTi-PCR ini dapat dikurangi karena
4
pada saat proses analisis produk amplifikasi, tidak perlu membuka tube untuk
analisis lain setelah proses PCR (Jothikumar dan Griffiths, 2002).
Penelitian yang dilakukan saat ini difokuskan pada sistem deteksi yang
efektif dan cepat untuk mengetahui adanya kontaminasi E. coli dalam susu. Maka
dari itu, perlu dilakukan pengembangan metode deteksi E. coli dengan
menggunakan teknik RTi-PCR yang dikombinasikan dengan Melting Curve
Analysis (MCA). Uji sepesifisitas, uji presisi serta penentuan cut off deteksi dari
pengembangan metode ini perlu dilakukan untuk mengetahui keakuratan dan
ketepatan metode dalam mendeteksi adanya kontaminasi E. coli dalam susu.
Dengan demikian, diharapkan pengembangan metode ini dapat diaplikasikan pada
analisis kontaminasi E. coli dalam sampel susu yang beredar di masyarakat.
1.2 Rumusan Masalah
Penelitian ini akan menerapkan metode deteksi kontaminasi E. coli dengan
RTi-PCR dengan rumusan masalah:
1.
Apakah primer TEco1553 dan Teco1754 dengan gen target tuf mampu
mendeteksi kontaminasi E. coli secara spesifik dengan RTi-PCR?
2.
Bagaimana tingkat spesifisitas, presisi, dan cut off deteksi metode RTi-PCR
dalam mendeteksi kontaminasi bakteri E. coli pada susu?
3.
Bagaimana hasil aplikasi metode RTi-PCR terhadap sampel susu yang
beredar di masyarakat?
I.3 Tujuan Penelitian
Adapun tujuan dari penelitian yang dilakukan yaitu:
1.
Mengetahui apakah primer TEco1553 dan Teco1754 dengan gen target tuf
mampu mendeteksi kontaminasi E. coli secara spesifik dengan RTi-PCR.
2.
Melakukan uji spesifisitas, uji presisi, serta penentuan cut off detection pada
metode RTi-PCR untuk deteksi kontaminasi E. coli pada susu.
3.
Mempelajari penggunaan dan pengaplikasian metode RTi-PCR untuk deteksi
E. coli pada susu.
5
I.4 Manfaat Penelitian
Manfaat yang dapat diperoleh dari penelitian ini adalah:
1.
Metode RTi-PCR dapat digunakan untuk pengujian kontaminasi E. coli pada
makanan sehingga diperoleh informasi yang cepat dan tepat.
2.
Memberikan kontribusi dalam pengembangan metode identifikasi E. coli
pada makanan dengan pendekatan molekular DNA yang dapat dijadikan
alternatif selain dengan metode konvensional yang selama ini telah dilakukan.