TEKNIK PENGGUNAAN MARKA RAPD DENGAN PCR RINGKASAN

Temu Teknis Fungsional Non Peneliti 2001
TEKNIK PENGGUNAAN MARKA RAPD DENGAN
PCR
ZULQOYAH LAYLA
Balai Penelitian Ternak,Po . Box 221 Bogor 16002
RINGKASAN
PCR (Polymerase Chain Reaction) atau reaksi polimerase berantai
adalah teknik amplifikasi DNA yang spesifik dengan cara melakukan proses
pemanjangan nukleotida dari primer yang merupakan pasangan komplemen
dari utas DNA secara simultan . Untuk mengatahui hasil amplifikasi, perlu
dilakukan migrasi produk PCR di dalam gel (elektro-foresis) dan diamati
dengan UVtransiluminator . Hasil visualisasi akan menunjukkan adanya
perbedaan sifat diantara sampel yang diuji berdasarkan pada ukuran DNA yang
terseparasi . Salah satu kegunaan proses PCR adalah untuk kajian keragaman
molekuler seperti RAPD. Teknik RAPD (Random Amplified Polimorphic
DNA) sederhana dalam pengerjaannya, memerlukan sedikit sampel, dan paling
cepat dalam penggunaannya, namun relatif cukup mahal terutama pada enzym
Taq polimerase. Dari masing-masing 5 sampel darah domba bangsa Garut,
Sumatera, StCroix, Merino, dan Ekor Gemuk, telah berhasil diisolasi sebanyak
25 nomor DNA dengan kemumian berkisar antara 1,440-2,330, serta memiliki
konsentrasi antara 87,5ng/ul - 1912,5 ng/ul . Dari hasil separasi produk PCR
dengan primer OPH-03, muncul pita-pita dengan jumlah berfariasi antara 2-4 .
Hal ini menunjukkan bahwa bangsa domba yang diperiksa memiliki sifat
polimorfis .
PENDAHULi1AN
PCR (Polymerase Chain Reaction) atau reaksi polimerase berantai
adalah teknik amplifikasi DNA yang spesifik dengan cara melakukan proses
pemanjangan nukleotida dari primer yang merupakan pasangan komplemen
dari utas DNA secara simultan . Proses pemanjangan nukleotida merupakan
proses polimerase yang dilakukan oleh DNA karena adanya "primer" yang
berkomplemen dengan DNA utas tunggal .(SUHARSONO, 2000).
Pengulangan dari siklus berdasarkan pada perubahan suhu yang terdiri
dari tahap "denaturasi", "annealing " dan "extension" . Tahap "denaturasi"
merupakan tahap awal dimana pada tahap ini DNA yang merupakan rantai utas
panda akan terlepas sehingga membentuk rantai utas tunggal . Tahap
"annealing" merupakan tahap dimana terjadi perlekatan primer pada ikatan
DNA Was tunggal_ Primer yang memiliki sekuens basa tertentu akan mengenali
sekuens basa DNA utas tunggal . Tahap selanjutnya adalah tahap "extension"
atau pemanjangan , dimana pada tahap ini terjadi pemanjangan primer dengan
147
Temu Teknis Fungsional Non Peneliti 200/
bantuan enzym Taq DNA polimerase. Hasil produk ini berfungsi sebagai
template (cetakan) pada siklus berikutnya. PCR sangat sensitive, dapat
mengamplifikasi sampai lebih dari sejuta kali, sehingga dapat menghasilkan
DNA dalam jumlah yang sangat besar. Karena dapat mengamplifikasi demikian
banyak, maka DNA cetakan (template) dibutuhkan dalam jumlah yang
sedikit.(SUHARSONO, 2000) .
Untuk mengetahui hasil amplifikasi maka perlu dilakukan migrasi
produk PCR di dalam gel (elektroforesis) dan diamati dengan UV
transiluminator . Hasil visualisasi akan menunjukkan adanya perbedaan sifat
diantara sampel yang diuji , berdasarkan pada ukuran DNA yang terseparasi.
Proses PCR dapat dipergunakan untuk berbagai keperluan diantaranya
untuk identifikasi suatu gen atau DNA yang spesifik ; untuk identifikasi adanya
suatu patogen penyebab suatu penyakit, seperti HepatitisB, TBC, AIDS, atau
kelainan lainnya ;perbanyakan gen untuk berbagai keperluan ; untuk kajian
keragaman molekuler seperti RAPD(Random Amplified Polimorphic DNA) ;
untuk pengurutan DNA, dll .
RAPD merupakan salah satu teknik yang paling luas dipergunakan
karena kesederhanaannya .. Primer yang digunakan adalah primer
oligonukleotida dimana urutan basanya dibuat secara random (acak) . Dalam
RAPD diperlukan sedikit sampel DNA untuk analisa . Teknik ini merupakan
teknik yang paling cepat dalam penggunaannya, namun relatif cukup mahal,
tenitama untuk enzym Taq DNA polimerase .(WILLIAM at al, 1990).
Tujuan penulisan ini adalah untuk mengemukakan salah satu metode
isolasi DNA, pelaksanaan metode marka RAPD yang digunakan di
laboratorium Genetika Balitnak Bogor terhadap sampel darah domba .
BAHAN DAN METODA
Alat dan bahan yang digunakan
Mikropipet, tips, tabung eppendorf 1500 ul, tabung eppendorf 200 ul,
mikrosentrifus, spektrofotometer double beam UV150-02 Shimadzu, tangki
elektroforesis, cetakan gel + sisir mesin PCR MJ Research, kamera Polaroid.,
UV transiluminator, sarung tangan latex.
Larutan yang digunakan
Penyangga TE, penyangga TBE, NP-40, SDS, alkohol 70 %, alkohol
absolut, NaOAc 3M, Proteinase-K , buffer PCR(Promega), dATP(Promega),
dCTI'(Promega), dGTP(Promega), dTTP(Promega), MgCl z(Promega), DNA
Taq polimerase(Promega), primer OPH-03(Operon), dd HZO. Penanda ukuran
molekuler 1 Kb dan 100 bp.
Temu Teknis Fungsional Non Peneliti 100/
Metode
Isolasi DNA
DNA cetakan diisolasi dari darah domba berdasarkan metode
at al, (1989) yang telah dimodifikasi . Sebanyak 5 ekor dari
masing masing domba bangsa Ekor gemuk, Merino, Garut, StCroix dan
Sumatra diambil darahnya secara aseptis melalui vena jugularis . Pengambilan
darah sebanyak 5 ml dimasukkan ke dalam tabung vacutainer yang telah berisi
anti koagulant EDTA. Sebanyak 350 ul plasma darah dimasukkan ke dalam
tabung eppendorf 1500ul, ditambah sebanyak 70 ul larutan NP40, 350 ul
larutan SDS dan 10 ul Proteinase K . Tabung divortex, kemudian diinkubasi
pada suhu 50°C semalam . Keesokan harinya ditambah 350ul larutan fenol,
disentrifugasi pada 13000 rpm selama 5 menit . Fase atas diambil untuk
dipindahkan ke dalam tabung eppendorf baru, ditambah 1/10 bagian larutan
NaOAc 3M dan 2 bagian larutan alkohol absolut dingin . Tabung digoyang
perlahan ( dasar tabung di jentik jentik ) hingga terbentuk endapan putih
(DNA) . Tabung disimpan pada suhu --20°C semalam . Keesokan harinya
tabung disentrifugasi pada kecepatan 13000 rpm
selama 5 menit . Cairan
yang ada di dalam tabung di buang dengan hati hati hingga yang tersisa
berupa endapan (DNA) berwarna putih . Ke dalam tabung yang berisi DNA
tersebut ditambahkan sebanyak 1 ml larutan alkohol 70 %, campur perlahan,
sentrifugasi pada kecepatan 13000 rpm selama 5 menit. Cairan alkohol
dibuang, tabung diinkubasi pada suhu 50°C selama 1 jam , atau dikering
anginkan hingga terbentuk pelet DNA didasar tabung . Ke dalam tabung yang
berisi pelet DNA diisikan sebanyak 200 ul larutan TE untuk melarutkan
kembali DNA, diinkubasi pada suhu 65°C sampai DNA larut. Ke dalam DNA
ditambahkan 5 ul larutan RNAse, diinkubasi selama 2 jam pada suhu 37°C,
kemudian direbus selama 5 menit untuk menghentikan reaksi. DNA yang
dihasilkan selanjutnya diukur kualitas dan kuantitasnya .
Kuantitas DNA dapat dilihat dengan UVspektrofotometer pada
panjang gelombang 260 nm dan 280 nm. Adapun prosedurnya yaitu
memasukkan sebanyak 5 ul DNA ke dalam tabung cuvet ditambah 2495 ul TE
sebagai pengencer, dilihat (dibaca) nilai optikal densitinya pada
UVspektrofotometer dengan panjang gelombang 260nm dan 280 nm. Sebagai
larutan standar dipakai larutan penyangga TE. Dari hasil pengecekkan tersebut
didapat data kemurnian DNA yang dapat dihitung dengan melihat
perbandingan bacaan pada spektrofotometer dengan panjang gelombang 260
nm dan 280 nm. Selanjutnya dari hasil pengukuran tersebut dapat ditentukan
jumlah DNA sampel yang diperoleh dengan rumus : Jumlah DNA = [ 260 x
2500/5 x 50 ]/1000. Informasi kuantitas ini dapat digunakan untuk menentukan
perhitungan dalam pengenceran DNA agar dapat diketahui secara tepat
konsentrasi DNA diinginkan.
Uji kualitas DNA dapat dilakukan dengan elektroforesis . DNA basil
isolasi diambil sebanyak 3 ul dan dicampur dengan larutan blue juice
(pemberat/penanda migrasi), lalu diisikan ke dalam sumuran gel yang
SAMBROOK
149
Temu Teknis Fungsionnl Non Peneliti 2001
mengandung 1 % agarose . Pada sumuran lain, diisi penanda DNA berukuran
1Kb . Gel dielektroforesis dengan tegangan 90 volt selama 1,5 jam, kemudian
direndam dalam larutan Ethidium Bromida selama 10 menit, dibilas dengan
merendam gel di dalam air suling, diamati dengan bantuan UV transiluminator,
bila perlu selanjutnya difoto dengan kamera Polaroid .
Metode RAPD dengan PCR
1.
2.
Sampel DNA yang akan diuji
masing-masing diencerkan dengan
konsentrasi 5 ng/ul .dalam larutan penyangga TE. Untuk setiap bangsa
dibuat larutan gabungan (bulk) 10 ul DNA 5ng/ul setiap individu dijadikan
satu.
Membuat larutan campuran(cocktail) untuk tiap sampel bulk DNA ke
dalam tabung eppendorf isi 200 ul dengan komposisi :
Buffer PCR [ Promega]
dATP [Gibco]
dCTP [ Gibco]
dGTP [ Gibco]
dTTP [ Gibco]
MgC1 2 [ Promega]
Primer [Operon] H-03
Taq DNA Polimerase [Promega]
ddH Z0
Templat DNA 5ng/ul
Total volume
2,5 ul
0,5 ul
0,5 ul
0,5 ul
0,5 ul
1,5 ul
1,25 ul
1,2 ul
7,5 ul
10 ul
25 ul
"Cocktail "yang sudah dibuat, kemudian disentrifugasi dengan
kecepatan 6000 rpm agar bahan- bahan dalam "cocktail" dapat tercampur
sempurna.
Untuk menghindari terjadinya penguapan pada saat proses
amplifikasi berlangsung, diatas permukaan larutan "cocktail "dilapisi minyak
mineral sebanyak 25 ul .
"Cocktail" dibuat dengan tujuan untuk memudahkan cara kerja. Buffer
PCR berfungsi sebagai larutan penyangga pada proses amplifikasi . Sedangkan
dATP dCTP dGTP, dTTP, digunakan untuk pemanjangan primer dalam
membentuk utas DNA baru. Primer yang digunakan adalah OPH-03 buatan
Operon yang mempunyai urutan basa 5'-AGACGTCCAC-3' . Enzim Taq
DNA polimerase berfungsi untuk memanjangkan primer pada tahap
"elongasi/extension (BUDIARTI.P,1993).
Amplifikasi DNA dengan PCR
Setelah "cocktail" selesai dibuat maka tahap selanjutnya adalah
mengamplifikasi DNA sample dengan mesin PCR (MJ Research Inc ).
150
Temu Teknis Fungsional Non Peneliti 200/
Amplifikasi dilakukan sebanyak 45 siklus. Setiap siklus terdiri dari
tiga tahap yaitu tahap "denaturasi" dengan suhu 94°C selama 1 menit, tahap
"annealing" dengan suhu 36°C selama 1 menit dan tahap "elongasi" dengan
suhu 72°C selama 2 menit . Setelah siklus selesai, selanjutnya PCR akan
melakukan proses inkubasi pada suhu 72°C selama 5 menit. Waktu inkubasi ini
dimaksudkan untuk memastikan bahwa DNA yang diamplifikasi telah
mengalami renaturasi . Setelah proses amplifikasi selesai selanjutnya tabung
eppendorf disimpan pada suhu 0°C sampai saatnya untuk melakukan separasi
dalam gel agarose .
Mengetahui hasil amplifkasi [separasil
Hasil amplifikasi dapat dilihat dalam gel agarose yang diamati dengan
UVtransiluminator. Tahapannya adalah sebagai berikut :
1 . Membuat larutan agarose 1,2% dalam larutan penyangga 0,5x TBE
dengan cara memanaskannya hingga larut, menuangkannya ke dalam
cetakan husus dengan sisir terpasang, biarkan sampai beku. Sisir
selanjutnya dilepas .
2 . Cetakan yang berisi gel beku dimasukkan ke dalam tangki elektroforesis
yang sudah diisi larutan penyangga 0,5xTBE hingga terendam.
3 . Sebanyak 3ul sampel DNA hasil amplifikasi dicampur dengan 2ul larutan
pemberat , diaduk hingga homogen . Tujuan pemberian larutan pemberat
adalah sebagai indikator warna dan juga sebagai pemberat sehingga ketika
sampel DNA dimasukkan ke dalam sumuran gel, dapat turun kedasar
sumuran. Sumuran paling kanan diisi penanda ukuran molekuler 100 by
buatan Promega dengan isi yang sama. .
4. Proses separasi (elektroforesis) dilakukan pada tegangan 90 volt selama
sekitar 2jam.
5 . Separasi dihentikan
apabila
sampel DNA telah bergerak hampir
mendekati akliir gel .
Visualisasi fragmen DNA dalam gel
Setelah proses separasi selesai, selanjutnya gel direndam dalam larutan
Ethidium Bromida dengan konsentrasi 0,5 ul /ml selama 10 menit. Tujuan
perendaman ini diharapkan Ethidium Bromida dapat menyisip pada DNA,
sehingga pita- pita DNA yang terseparasi dapat terlihat dengan bantuan sinar
UV dart UV transiluminator .
Selanjutnya gel direndam dalam dH,O selama 10 menit, untuk
menghilangkan senyawa Ethidium Bromida yang terikat secara lion spesifik
pada bagian gel yang tidak ada DNAnya . Bila tidak dilakukan perendaman,
maka pita-pita DNA akan tampak pucat karena pendaran latar belakang gel
yang mengikat Ethidium Bromida.
Gel dikeluarkan dart rendaman air suling dan diletakkan diatas
pennukaan UVtransiluminator untuk diarnati ada tidaknya pita-pita DNA, dan
bisa dilanjutkan pemotretan dengan menggunakan kamera Polaroid.
Temu Teknis Fungsional Non Peneliti 2001
HASIL DAN PEMBAHASAN
LIsolasi DNA
Dari sebanyak masing-masing lima nomor darah yang berasal dari
domba Garut, St.Croix, Merino, Sumatera, dan Ekor Gemuk, dengan
menggunakan metode Sambrook yang telah disempurnakan, telah diisolasi
sebanyak 25 nomor DNA .
2Xualifikasi DNA
Kualitas DNA yang dihasilkan dapat diamati pada gambar 1 .
Gambar l . Isolasi DNA
Keterangan
I So'a= 108
2 .Sumatera I I I
3. Sumtera 119
4. Sumatera 120
5. Sumatera 128
6 Ekor Gemuk M1
7. Ekor Gemuk 111
8. Ekor gemuk Sus 4
9. Ekor Gemuk Sus2
10 Fkor Gemuk Isa 2
11 .
12 .
13 .
14 .
15 .
Merino 1003
Merino 1023
Merino 1249
Merino1036
Merino 1109
16 .
17 .
18 .
19 .
20.
Garut
Garut
Garut
Garut
Garut
3579
3613
9062
1094
9105
21 .
22 .
23 .
2425 .
St Croix 40015
St Croix32257
St .Croix 20113
St . Croix 519
St.Croix 603
Kemurnian DNA berdasarkan basil bagi nilai absorbensi pada panjang
gelombang 260 terhadap nilai absorbensi pada panjang gelombang 280 dari
sampel DNA bangsa Ekor Gemuk, Sumatera, Garut, St.Croix dan Merino,
berada antara 1,440-2,330 . Menurut standard yang ditetapka kemurnian DNA
sebaiknya berada pada kisaran 1,8 (SAMBROO at al, 1989). Karena untuk
pengerjaan RAPD sifatnya adalah random (acak), maka DNA dengan kisaran
trilai 1,44-2,33 masih dapat digunakan .
Temu Teknis Fungsional Non Peneliti 2001
3. Kuantifikasi DNA
Dari hasil kuantifikasi DNA dengan spektrofotometer, didapat
konsentrasi DNA seperti terdapat pada tabel 1 . Konsentrasi DNA total yang
dihasilkan berkisar antara 87,5 ng/ul - 1912,5 ng/ul .
Tabel 1 .
Kuantifikasi DNA Domba pada panjang gelombang 260 nm
No.
Spesimen
X11 C7
1
2
3
4
EG Ml
H1
Sus4
SUS2
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
ISA2
Mer 1003
1023
1249
1036
1109
Smt 108
120
119
111
128
Grt 3579
3613
9062
1094
9105
StCr40015
32257
20113
519
603
0,018
0,020
0,034
0,036
0,013
0,013
0,040
0,008
0,007
0,014
0,040
0,062
0,113
0,026
0,067
0,031
0,013
0,043
0,020
0,016
0,047
0,036
0,015
0,053
0,055
18
19
20
21
22
23
24
25
XE 0
0,011
0,012
0,019
0,019
0,007
0,006
0,022
0,004
0,003
0,006
0,025
0,0036
0,063
0,018
0,038
0,017
0,007
0,025
0,012
0,008
0,029
0,022
0,008
0,027
0,029
Konsentrasi
DNA ng/ul
225
250
430
450
163
162,5
500
100
87,5
175
500
775
1912,5
325
837,5
387,5
162,5
537,5
250
200
587,5
450
187,5
662,5
687,5
Kemumian
1,640
1,670
1,800
1,890
1,860
2,170
1,820
2,000
2,330
2,330
1,600
1,720
1,800
1,440
1,760
1,820
1,860
1,720
1,670
2,000
1,620
1,640
1,880
1,960
1,900
4. Visualisasi produk PCR
Hasil visualisasi yang dapat dilihat pada gambar 2, menunjukkan
bahwa pita-pita DNA terlihat jelas untuk setiap bangsa domba dengan jumlah
153
Temu Teknis Fungsional Non Peneliti 2001
pita yang muncul berkisar antara 2-4 pita. Jumlah pita yang muncul bervariasi,
yaitu 4 dari domba bangsa StCroix, Sumatera, dan Garut dan 2 buah pada
domba bangsa Merino dan Ekor Gemuk.
Dengan terbentuknya pita DNA dengan primer OPH-03, maka primer
ini dapat digunakan untuk analisis keragaman bangsa-bangsa domba. Pada hasil
visualisasi menunjukkan sifat polimorfis, artinya antar bangsa memiliki ukuran
DNA yang berbeda berdasarkan ukuran pasangan basa . Hal ini menunjukkan
adanya perbedaan sifat diantara bangsa domba yang diamati yang dapat dilihat
dari ukuran DNA yang terseparasi. Sifat polimorfis inilah yang diharapkan
muncul dari analisa RAPD ini.
Tabel 2..
Larutan untuk proses persiapan sampel
Nama larutan
1 M TrisCl . pH 8,5
1 M TrisCl . pH 7,5
5M Nacl
TBE buffer 5x
TE buffer
NaOAc 3M
Penyangga NP-40
SDS
Blue juice
70 % alkohol
Proteinase K
Komposisi
6,06 gr(40 ml air bebas ion +
1ml HCI pekat)
6,06 gr(40 ml air bebas ion +
2ml HCI pekat
14,61 gr Nacl
tris base 54 gr
boric acid 27,5 gr
0,5 M EDTA pH 8,0 20 ml
1M Tris Hcl pH 8,0 10 ml
0,5 M EDTA pH 8,2 ml
62,52 gr NaOAc anhydrous
102,02 gr NaOAc 3H20
pH 5,2 (acetat glasial)
5M Nacl 2,80 ml
1M MgC12 0,15 ml
lM Tris Hcl pH 8,5 10 ml
10% SDS 6ml
0,5M EDTA 1,2m1
5M Nacl 1,2 ml
0,125 gr blue juice +
20 gr sucrose
70 ml alkohol absolut
1M TrisCI pH 7,5 50u1
Proteinase K 100mg(18 unit/mg)
glyserol 100% 5 ml
Pelarut/volume akhir
air bebas ion/50 ml
air bebas ion/50 ml
air bebas ion/50 ml
air bebas ion/1000 ml
air bebas ion/ 1000 ml
air bebas ion/ 150 ml
air bebas ion/ 100 ml
air bebas ion/50 ml
air bebas ion/50 ml
air bebas ion/100 ml
air bebas ion/ 10 ml
Temu Teknis Fungsional Non Peneliti 1001
Ekor Gemul
Garut
Merino
Surnatera
St. Croix
100 by
Gambar 2. Hasil separasi amplifikasi dengan primer 01H-03
KESIMPi1LAN
Dari hasil amplifikasi DNA yang dihasilkan dengan teknik RAPD
menggunakan mesin PCR memperlihatkar_ bahwa munculnya pita-pita dengan
jutnlah yang bervariasi yaitu antara 2-4 . Ini menunjukkan bahwa primer OPH
03 dapat mengenali DNA domba, sehingga primer ini dapat melakukan
pembentukan komplemen sekuen DNA. Perbedaan ukuran pasangan basa antar
bangsa domba yang terlihat pada gambar, menunjukkan sifat polimorfis dari
bangsa domba yang diperiksa .
DAFTAR BACAAN
BUDIARTI S . 1993 . Tehnik PCR dan aplikasinya, Kursus Singkat Biologi
Molekuler PAU . Bioteknologi IPB.
SAMBROOK J.E .F, FRITISCH AND T.MANIATIS . 1989. Molecular Cloning . A
2nd
Laboratory manual
Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press .
Analysis and Cloning of Eukaryotic Genomic DNA,9.19 .
SUHARSONO S. 2000. Prinsip Amplifikasi DNA dengan PCR . Pelatihan
Peningkatan Pengetahuan dan Ketrampilan Teknisi Tentang Teknik
Laboratonum Biologi Molekuler .PAU . IPB .
WILLIAM J.G.K, A.R .KUBELIC, K.J. LIVAK J.A. RAFALSKI AND S.V. TINGEY,
1990. DNA Polymorphis Amplified by Arbitary Primer are usefull as
Genetic Marker, Nucleic Acid-Res. 18 :6531-6535 .