(Aegle marmelos). - UMY Repository

Nama Rumpun Ilmu:
Kesehatan (Farmakologi)
LAPORAN
PENELITIAN KEMITRAAN
Judul:
Peranan Sel Epithelial Terhadap Efek Relaksasi Oleh Ekstrak Aegle
marmelos Correa. Pada Otot Polos Trakhea Marmut Terisolasi.
oleh :
Puguh Novi Arsito, M.Sc.,Apt. (173 224)
Arko Jatmiko W, M.Sc.,Apt. (201 248)
Ratih Dwi Amaliah (20120350023)
Aditya Rizqi Abdi Setyo (20120350051)
PROGRAM STUDI ILMU FARMASI
FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN
UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH YOGYAKARTA
2016
1
HALAMAN PENGESAHAN PENELITIAN KEMITRAAN
Judul Penelitian
: Uji Aktivitas Antagonisme Piperin pada Reseptor
beta Adrenergik dan Muskarinik: Studi in vitro dan
in silico
: Farmakologi
Nama Rumpun Ilmu
Ketua Peneliti
a. Nama Lengkap
: Puguh Novi Arsito,M.Sc.,Apt
b. NIDN/NIK
: 0507118601/173224
c. Jabatan Fungsional : d. Program studi
: Ilmu Farmasi
e. Nomor Hp
: +65701384948
f. Alamat e-mail
: [email protected]
Anggota Peneliti (1)
a. Nama Lengkap
: Rima Erviana, M.Sc.,Apt
b. NIDN/NIK
: 0506067803/173240
c. Jabatan Fungsional : d. Program studi
: Ilmu Farmasi
Anggota Peneliti Mahasiswa (Mitra. 1)
a. Nama Lengkap
: Ilham Perdana
b. NIM
: 20130350037
c. Program studi
: Ilmu farmasi
Anggota Peneliti Mahasiswa (Mitra. 2)
a. Nama Lengkap
: julio candra wijaya
b. NIM
: 20130350007
c. Program studi
: Ilmu Farmasi
Biaya penelitian
: - Diusulkan ke UMY
: Rp. 10.000.000,- Diusulkan internal prodi : - Diusulkan institusi lain : -
Mengetahui,
Kaprodi Farmasi FKIK UMY
Yogyakarta, 27 September 2016
Ketua Peneliti
Sabtanti Harimurti, M.Sc.,Ph.D.,Apt.
NIDN: 0523027304
Puguh Novi Arsito,M.Sc.,Apt
NIDN: 0507118601
Mengetahui
Dekan FKIK UMY
Dr. H. Ardi Pramono,Sp.An.,M.Kes
NIDN: 0513126902
2
DAFTAR ISI
Halaman Pengesahan……………………………………………………………….
Daftar Isi……………………………………………………………………………
Ringkasan…………………………………………………………………………..
BAB I. PENDAHULUAN ………………………………………………………...
A. Latar Belakang………………………………………………………………….
B. Rumusan Masalah………………………………………………………………
C. Tujuan Penelitian……………………………………………………………….
D. Luaran Penelitian……………………………………………………………….
E. Keaslian Penelitian……………………………………………………………..
BAB II. TINJAUAN PUSTAKA…………………………………………………
A. Kerangka Konsep………………………………………………………………
B. Hipotesis………………………………………………………………………..
BAB III. METODOLOGI PENELITIAN………………………………………..
A. Rancangan Penelitian…………………………………………………………..
B. Populasi dan Sampel……………………………………………………………
C. Waktu dan Tempat……………………………………………………………..
D. Variabel Penelitian……………………………………………………………..
E. Alat dan Bahan ………………………………………………………………..
F. Prosedur Kerja dan Alur Penelitian……………………………………………
G. Alur Penelitian…………………………………………………………………
BAB IV. HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN………………………..
A. Hasil dan pembahasan …………………………………………………………
B. Kesimpulan …………………………………………………………………….
BAB V. BIAYA DAN JADWAL PENELITIAN………………………………...
Daftar Pustaka…………………………………………………...…………………
Lampiran 1. Justifikasi Biaya Penelitian…………………………………………...
Lampiran 2. Susunan Organisasi Tim Penelitian…………………………………..
Lampiran 3. Biodata Ketua dan Anggota………………………………………….
Lampiran 4. Surat Pernyataan……………………………………………………...
2
3
4
5
5
7
8
8
8
10
10
11
12
12
12
12
12
13
13
17
18
18
25
26
27
30
31
31
34
3
RINGKASAN
Alergi adalah suatu perubahan reaksi atau respon pertahanan tubuh yang
berlebihan terhadap zat – zat yang sebenarnya tidak berbahaya atau yang dikenal
sebagai alergen. Manifestasi klinis umum dari alergi adalah asma. Asma
merupakan suatu sindroma yang sangat kompleks yang melibatkan berbagai sel
inflamasi yang salah satunya adalah eosinofil. Eosinofil akan teraktivasi oleh
mediator kimia yang dihasilkan oleh degranulasi sel mast. Kortek Maja (Aegle
marmelos Correa.) memiliki beberapa kandungan kimia yang berpotensi sebagai
antialergi yaitu diantaranya marmin, aegelin, lupen-ol dan lupen-on. Tujuan
penelitian adalah untuk mengidentifikasi golongan senyawa ekstrak, mempelajari
aspek mekanisme farmakologi dan dosis optimal ekstrak kortek Aegle marmelos
Correa. sebagai antialergi pada tikus terinduksi ovalbumin melalui penghambatan
migrasi eosinofil trakea secara in vivo.
Sebanyak 1250 gram serbuk kortek Aegle marmelos diekstraksi
menggunakan pelarut etanol 96% (1:4), kemudian diidentifikasi menggunakan
metode kromatografi lapis tipis (KLT) dan densitometri. Penelitian ini merupakan
penelitian eksperimental dengan rancangan post test only control group design
menggunakan 25 ekor tikus wistar jantan, dibagi dalam 5 kelompok. Kelompok
K0: tanpa perlakuan. Kelompok K(-): sensitisasi OVA aerosol. Kelompok P1, P2,
P3: sensitisasi OVA aerosol dengan variasi dosis ekstrak. Hari ke-14 dilakukan
pengambilan jaringan trakea untuk pemeriksaan hispatologi. Analisis data
menggunakan uji One-Way ANOVA dan Post Hoc Test.
Rata – rata hitung eosinofil trakea tertinggi terdapat pada kelompok K(-)
(10.6 ± 2.19), diikuti oleh P1, P2, P3 dan K0. Uji One-Way ANOVA menunjukkan
adanya perbedaan bermakna antara K(-) dengan K0, K(-) dengan P2 dan K(-)
dengan P3, sedangkan antara P2 dan P3 tidak ada perbedaan bermakna (p>0.05).
Aegle marmelos terdeteksi memiliki kandungan senyawa kumarin, steroid
dan alkaloid. Pemberian ekstrak Aegle marmelos dosis 250 mg/tikus/hari mampu
menurunkan rerata hitung eosinofil trakea tikus wistar secara signifikan
dibandingkan kelompok asma alergi. Sedangkan ekstrak Aegle marmelos dosis
500 mg/tikus/hari mampu menurunkan rerata hitung eosinofil trakea namun tidak
berbeda signifikan dibandingkan dosis 250 mg/tikus/hari. Sehingga bisa
disimpulkan bahwa ekstrak kortek Aegle marmelos dosis 250 mg/tikus adalah
dosis optimal.
Kata kunci : Aegle marmelos Correa., asma alergi, eosinofil
4
BAB I
Pendahuluan
A. Latar Belakang
Alergi adalah suatu perubahan reaksi atau respon pertahanan tubuh
yang menolak dan tidak tahan terhadap zat-zat yang sebenarnya tidak
berbahaya (Candra et al., 2011). Clemens vons Pirquet pada tahun 1906
menggunakan istilah alergi untuk pertama kali sebagai perubahan kemampuan
tubuh dalam merespon substansi asing bila terpajan dengan bahan yang sama
untuk kedua kalinya atau lebih. Reaksi alergi dapat mempengaruhi hampir
semua jaringan atau organ dalam tubuh, dengan manifestasi klinis tergantung
pada organ target. Manifestasi klinis umum dari alergi termasuk asma,
dermatitis atopik, rhinitis alergi, dan urtikaria/angioedema (Paramita, 2011).
Meningkatnya angka kejadian alergi selama 20 tahun terakhir dapat
menimbulkan masalah bagi dunia kesehatan. Alergi ditimbulkan karena
perubahan reaksi tubuh (menjadi rentan) terhadap suatu bahan yang ada
dalam lingkungan hidup kita sehari-hari.
Asma merupakan salah satu gejala alergi berupa suatu sindroma yang
sangat kompleks melibatkan berbagai sel inflamasi, antigen, faktor genetik,
mediator dan sitokin. Subtipe yang terlibat pada asma adalah subtipe T helper
2 (Th2) yang bertugas mensekresi berbagai sitokin yang bertanggung jawab
bagi berkembangnya reaksi tipe lambat atau cell- mediated hypersensitivity
reaction. Sel Th2 merupakan bagian dari sel limfosit T helper (CD4) yang
dibedakan menjadi Th1 dan Th2. Sel Th1 mensekresi interferon y (IFN-y),
tumor necrosis factor-a (TNF-a), granulocytet monocyte colony stimulating
factor atau GMCSF, interleukin-2 (IL-2) dan IL-3. Sedangkan Th2
mensekresi IL-3, IL-4, IL-5, IL-9, IL-13 dan GMCSF. Masuknya alergen
akan ditangkap oleh sel pengenal antigen (Antigen Persenting Cell/APC).
Antigen akan diproses di dalam APC dan dengan bantuan Mayor
histocompatibility (MHC) kelas II antigen diperkenalkan kepada sel limfosit
T. Ciri antigen spesifik akan dibawa oleh limfosit T, teraktivasi dan
5
berdiferensiasi ke profil Th2. Th2 akan merangsang IL-4 dan IL-13, sehingga
memacu sel limfosit B untuk mensintesa IgE. (Ardinata, 2008).
IgE diproduksi oleh sel plasma yang terletak pada lymph node dan
daerah yang mengalami reaksi alergi. IgE berbeda dengan antibodi yang lain
dalam hal lokasinya. IgE sebagian besar menempati jaringan dan berikatan
dengan permukaan sel mast dengan reseptornya yang disebut high affiniting
IgE receptors (FcεRI). Ikatan antigen dengan IgE menyebabkan terjadinya
penggabungan silang antar reseptor yang akan mengaktifkan sel mast yang
menyebabkan degranulasi sel mast dan tersekresinya mediator kimia dari sel
mast (Rifa’I, 2011), seperti histamin, protease, heparin sulfat, prostaglandin,
sistenil leukotrin, chemokine dan sitokin (Holgates, 2000).
Kebocoran
mikrovaskuler
yang terinduksi
mediator
inflamasi
melibatkan eksudasi plasma kedalam saluran nafas. Penyempitan lumen
saluran nafas disebabkan oleh kebocoran plasma protein yang menginduksi
penebalan dan edema dinding saluran nafas, sehingga menyebabkan kontraksi
otot pernafasan dan reaksi ini berlangsung selama 1-2 jam. Reaksi ini disebut
early onset pada asma. Sel-sel inflamasi eosinofil, basofil, neutrofil dan
makrofag akan digerakkan dan diaktifkan oleh degranulasi sel mast beserta
limfosit T subtipe Th2, melalui pembentukan molekul adhesi yang disebabkan
aktivitas sel endotel. Reaksi ini terjadi pada 4-8 jam setelah reaksi pertama
dan disebut sebagai reaksi tipe lambat. Reaksi ini menyebabkan kedatangan
sel-sel radang sehingga meningkatkan pelepasan mediator (Ardinata, 2008).
Terapi yang dapat dilakukan untuk mengatasi gejala alergi pada saluran
pernafasan adalah dengan menggunakan antialergi.
Indonesia sebagai penghasil tumbuhan obat mempunyai sekitar 30.000
jenis flora dihutan tropika Indonesia, sekitar 9.600 spesies merupakan
tumbuhan obat penting bagi industri obat tradisional (Kusuma dan Zaky,
2005). Dari 30.000 jenis tanaman herbal itu baru sedikit yang termanfaatkan.
Padahal permintaan atas obat-obatan herbal kian meningkat dari tahun ke
tahun
(Marimbo,
2007).
Pemanfaatannya
sangat
beragam
meliputi
pemanfaatan sebagai aditif makanan, pengobatan, bahan bangunan, ritual
keagamaan dan sebagainya.
6
Saat ini, penelusuran senyawa obat dari berbagai tanaman terus
dilakukan, salah satunya adalah kandungan senyawa aktif yang berasal dari
Aegle marmelos Correa (Rutaceae). Maja (Aegle marmelos Correa), suku
jeruk-jerukan atau Rutaceae) adalah tumbuhan berbentuk pohon yang tahan
lingkungan keras tetapi mudah luruh daunnya dan berasal dari daerah Asia
tropika dan subtropika. Tanaman ini biasanya dibudidayakan di pekarangan
tanpa perawatan dan dipanen buahnya. Berbagai hasil penelitian mengenai
senyawa aktif pada tumbuhan ini telah dilaporkan, diantaranya senyawa tanin,
skimianin, minyak esensial (sebagian besar kariofilena, sineol, sitral,
sitronelal, D-limonena, dan eugenol), sterol triterpenoid termasuk lupeol, βdan γ-sitosterol, α- dan β- amirin, flavonoid (sebagian besar rutin) dan
kumarin termasuk aegelin, marmesin, umbelliferon, dan golongan steroid
(Saleh, 2009). Kulit batang dan kortek akar tumbuhan Aegle marmelos
mengandung turunan kumarin dan berdasarkan data difraksi sinar-X senyawa
tersebut adalah marmin [7-(6’,7’-dihidroksigeranil-oksi) kumarin] (Gupta et
al., 2006). Senyawa aktif lain yang ditemukan dari kulit batang dan kortek
akar tanaman ini diantaranya aegelin, lupen-ol, lupen-on, epoksiaurapten,
triterpen hopana dan aurapten (Riyanto, 2003)
Nugroho, et al (2013) berpendapat bahwa ekstrak organik dari daun
Aegle marmelos Correa. memiliki aktivitas sebagai anti inflamasi akut dan
subakut. Ekstrak metanolik dan ekstrak air dari biji Aegle marmelos Correa.
menunjukkan aktivitas anti inflamasi yang cukup baik terhadap inflamasi akut
dan kronis. Ekstrak air dari kulit batang akar Aegle marmelos Correa juga
menunjukkan aktivitas sebagai anti inflamasi terhadap inflamasi akut dan
kronis yang cukup baik (Benni et al., 2011). Mekanisme senyawa-senyawa
dalam Aegle marmelos Correa sebagai anti inflamasi diduga berhubungan
dengan interaksi senyawa tersebut dengan enzim siklooksigenase (COX) yang
berperan dalam membentuk asam arakidonat menjadi prostaglandin (Nugroho
et al., 2013). Prostaglandin merupakan mediator inflamasi yang menyebabkan
timbulnya rasa perih, panas maupun edema (pembengkakan), yang nantinya
mengakibatkan terjadinya perekrutan mediator inflamasi lain atau migrasi
eosinofil pada tempat peradangan. Bila mediator inflamasi terbentuk
7
berlebihan, maka timbullah reaksi hipersensitivitas dan alergi (Tjay dan
Rahardja, 2002). Penelitian ini mencoba untuk menelusuri lebih lanjut tentang
aktivitas golongan senyawa pada Aegle marmelos sebagai antialergi. Selain
itu, penelitian ini juga mencoba untuk menentukan pendekatan terapi yang
didasarkan pada peranan sel mast dalam menstimulasi proses pembentukan
dan perekrutan eosinofil.
B. Rumusan Masalah
1. Apakah ekstrak kortek Aegle marmelos Correa. dapat menghambat migrasi
eosinofil trakea secara in vivo ?
2. Berapakah dosis optimal ekstrak kortek Aegle marmelos Correa. yang
dapat digunakan untuk penghambatan migrasi eosinofil trakea secara in
vivo ?
3. Apakah golongan senyawa yang terkandung dalam ekstrak kortek Aegle
marmelos yang diduga berpotensi sebagai antialergi dengan melalui
analisis kromatografi lapis tipis (KLT) densitometri ?
C. Tujuan
Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi golongan senyawa
ekstrak, mempelajari aspek mekanisme farmakologi dan dosis optimal ekstrak
kortek Aegle marmelos Correa. sebagai antialergi pada tikus terinduksi
ovalbumin melalui penghambatan migrasi eosinofil trakea secara in vivo.
D. Luaran Penelitian
Hasil penelitian ini dapat menjadi dasar ilmiah pada penelitian
aktivitas Aegle marmelos tahap selanjutnya. Selain itu, Hasil penelitian ini
diharapkan dapat memberikan kontribusi dalam pengembangan Aegle
marmelos sebagai antialergi yang berasal dari bahan alam.
E. Keaslian penelitian
Sejauh ini belum pernah dilakukan penelitian tentang aktivitas
antialergi golongan senyawa yang berasal dari Aegle marmelos melalui
inhibisi migrasi eosinofil trakea. Beberapa penelitian lain yang terkait dengan
judul penelitian ini adalah hubungan pemberian ekstrak patikan kebo
8
(Euphorbia hirta L.) dengan variabel ekstrak patikan kebo dan sel mast
(Hermawan, 2009). Penelitian lainnya yaitu interaksi antara senyawa aktif
dari Aegle marmelos Correa. sebagai agen anti inflamasi dengan reseptor
COX-1 dan COX-2 (Nugroho et al., 2013) dan efek pemaparan Ovalbumin
aerosol terhadap Eosinofilia Bronkus pada mencit Balb/C (Diding, 2007),
serta hubungan pemberian ekstrak patikan kebo terhadap hitung Eosinofil
darah tepi (Prihandhi, 2010).
9
BAB II
Tinjauan Pustaka
A. Kerangka konsep
Bila suatu protein asing (antigen) berulang kali masuk ke dalam tubuh
seorang yang berbakat hipersensitif, maka limfosit B akan membentuk
antibodi dari tipe IgE. IgE atau disebut juga regain, akan terikat pada
membran sel mast tanpa menimbulkan gejala. Apabila kemudian antigen
(alergen) yang sama rumus bangunnya memasuki tubuh lagi, maka IgE akan
mengenali dan mengikat padanya. Akibatnya membran sel mast akan pecah
(degranulasi sel mast).
Hasilnya adalah suatu reaksi alergi karena sejumlah zat perantara
(mediator) dilepaskan, yakni histamin, serotonin, bradikinin dan asam
arachidonat, yang kemudian diubah menjadi prostaglandin dan leukotrien.
Zat-zat itu akan menarik makrofag dan eosinofil ke tempat infeksi untuk
memusnahkan penyerbu. Mediator tersebut secara langsung atau melalui saraf
otonom menimbulkan bermacam-macam penyakit seperti asma, rhinitis alergi
dan eksim. Gejala seperti bronkokontriksi, vasodilatasi dan pembengkakan
jaringan akan timbul sebagai reaksi terhadap masuknya antigen (Tjay dan
Rahardja, 2002).
Marmin dilaporkan mampu menghambat pelepasan histamin dari
kultur sel RBL-2H3 melalui penghambatan Ca2+ uptake secara in vitro.
Marmin mampu menghambat influks Ca2+ ekstraseluler ke dalam kultur sel
RBL-2H3,
sehingga
pelepasan
histamin
>
70%
mampu
dihambat
dibandingkan kontrol pada kultur sel RBL-2H3 yang diinduksi oleh
thapsigargin dan calcium ionophore. Marmin dengan konsentrasi 100µM
mampu menekan pelepasan histamin dari kultur sel RBL-2H3 (yang diinduksi
secara immunologik dengan DNP24-BSA) dengan efek penghambatan > 60%
dibandingkan dengan kontrol. Selain itu, marmin juga mampu menghambat
pelepasan histamin dari kultur sel RPMCs dengan efek penghambatan sebesar
10
40% dibandingkan kontrol (Nugroho et al., 2011). Dibandingkan kontrol dari
kultur sel RBL-2H3, aegelin yang merupakan turunan senyawa alkaloid
dengan konsentrasi 100 µM mampu melakukan penekanan pada pelepasan
histamine hingga 40% yang diinduksi DNP24-BSA dan lebih dari 50% yang
diinduksi oleh thapsigargin dan ionomycin (Nugroho et al., 2010).
Lupen-ol dan lupen-on yang merupakan turunan senyawa steroid ini
berpotensi
untuk
dikembangkan
sebagai
agen
antialergi
karena
kemampuannya dalam menghambat pelepasan mediator dari kultur sel mast.
Pelepasan enzim β-heksosaminidase dari kultur sel RBL-2H3 yang diinduksi
secara immunologis dengan antigen DNP24-BSA sebesar 35,69% dan 39,19%,
dengan nilai IC50 sebesar 59,40 µM (lupenol) dan 72,51 µM (lupenon)
mampu dihambat kedua senyawa ini dengan konsentrasi 100 µM (Nugroho, et
al., 2010).
Melalui mekanisme aksi efek penghambatan degranulasi sel mast
melalui kultur sel RBL-2H3 diduga berpengaruh pada terhambatnya migrasi
sel-sel inflamasi, seperti eosinofil. Adanya mekanisme antialergi yang
prospektif ini sangat memungkinkan untuk mengembangkan Aegle marmelos
pada uji in vivo.
B. Hipotesis
Berdasarkan landasan teori diatas, dibuat suatu hipotesis, yaitu ekstrak
kortek dari Aegle marmelos Correa. memiliki kandungan senyawa seperti
kumarin, alkaloid dan steroid, yang dengan dosis optimalnya memiliki
aktivitas sebagai antialergi dengan melalui aksi menghambat migrasi eosinofil
trakea secara in vivo.
11
BAB III
Metodologi Penelitian
A. Rancangan Penelitian
Penelitian ini menggunakan desain penelitian eksperimental laboratorium
dengan tema Farmakologi molekuler.
B. Populasi dan Sampel
Subjek penelitian ini berupa 25 ekor tikus wistar jantan dengan berat
badan ± 150 gram, dan berumur 10 minggu. Dalam penelitian ini subjek
dibagi menjadi 5 kelompok. Pengambilan sampel dilakukan secara incidental
sampling. Jumlah sampel ditentukan berdasarkan rumus Federer, yaitu :
(k-1) (n-1) ≥ 15
Keterangan :
k : jumlah kelompok
n : jumlah sampel dalam tiap kelompok (Purawisastra, 2001)
Dalam penelitian ini subjek dibagi menjadi 5 kelompok, sehingga
berdasarkan rumus Federer didapatkan jumlah subjek masing-masing
kelompok sebagai berikut:
(k-1) (n-1) ≥ 15
(5-1) (n-1) ≥ 15
4 (n-1) ≥ 15
(n-1) ≥ 15/4
n ≥ 4,75  n ≥ 5
Dalam penelitian ini tiap kelompok terdiri dari 5 ekor tikus.
C. Waktu & Tempat
1. Laboratorium Farmakologi dan Toksikologi Fakultas Farmasi UGM
2. Laboratorium Fitomedisin Fakultas Kedokteran dan Ilmu kesehatan UMY
D. Variabel Penelitian
12
1. Variabel Bebas
Dosis ekstrak Aegle marmelos yang diberikan
2. Variabel Perancu
a. Dapat dikendalikan : galur, berat badan, makanan, umur, dan jenis
kelamin.
b. Tidak dapat dikendalikan : Variasi kepekaan tikus terhadap suatu zat.
3. Variabel Tergantung
Jumlah total eosinofil trakea
E. Alat & Bahan
1. Alat
Kandang tikus, Suntikkan injeksi dengan jarum panjang 0,5 – 1,0 cm dan
ukuran 24 gauge, Tabung ukur 10 ml dan 50 ml, Becker glass 100 ml,
Mikroskop cahaya (Olympus®), Timbangan elektrik (Mettler Toledo®),
Gelas objek, Deck glass, Mortir, Pengaduk magnet termostat tipe 1419 (B.
Brawn®, W. Germany), vortex (CAT. M. Zippear Gmbh. Etzenbach®, W.
Germany), pipet volume mikro 100,0
µL, 1000 µL dan 5000,0 µL
(Gilson®, model 15415, France), kotak sinar UV 254 dan 366, plat KLT
silica gel, cawan porcelain, tabung reaksi, evaporator, waterbath
2. Bahan
Tikus jantan ± 150 mg, Ekstrak kortek Aegle marmelos,
Ovalbumin (Sigma Aldrich®), Akuades (Bratachem). Pakan tikus
(AD2®), Formalin buffer 10%, Phosphate buffered saline, Blok parafin,
Pewarna Hematoksilin Eosin (HE), Pereaksi Vanillin sulfat, Heksana
(merck®, p.a grade), Pereaksi Dragendorf, HCl, H2SO4 pekat, NH4OH,
CHCl3 (merck®, p.a grade)
F. Prosedur Kerja
1. Penyiapan Seri Konsentrasi Ovalbumin
Larutan inhalasi ovalbumin mengandung 0,1 g serbuk ovalbumin
dalam 10 ml larutan phosphate buffered saline (PBS). Larutan PBS dibuat
dengan menimbang KCl 0,1 g, KH2PO4 0,1 g, NaCl 4 g, dan
Na2HPO4.H2O 1,08 g yang dilarutkan dalam 250 ml aquadest. Larutan
13
yang digunakan untuk sensitisasi 1 kelompok perlakuan dibuat dengan
mengambil 10 ml larutan ovalbumin dalam PBS pada pH 7,4.
2. Pembuatan Fraksi Heksana dan Fraksi Kloroform
Ekstrak kental 30 mg diencerkan terlebih dahulu ke dalam cawan
porcelain dengan sedikit etanol 96%, kemudian ditambahkan dengan
heksan secukupnya. Sisihkan sedikit untuk penotolan fraksi heksan 1
(fh1). Setelah itu diuapkan hingga mendapat kekentalan yang optimal.
Kemudian tambahkan HCl 2N sebanyak 4 - 6 ml, lalu tambahkan heksan
beberapa ml dan lakukan penggojokan didalam tabung reaksi. Kemudian
pisahkan antara larutan asam (berwarna putih bening) dan larutan heksan
(berwarna hijau muda). Larutan heksan ini digunakan untuk penotolan
fraksi heksan 2 (fh2).
Larutan asam pada proses fraksinasi heksan diletakkan ke dalam
cawan
porcelain
kemudian
ditambahkan
NH4OH,
diaduk
lalu
ditambahkan kloroform (CHCl3) dan lakukan pengadukan kembali.
Setelah itu masukkan ke dalam tabung reaksi dan kemudian lakukan
penggojokan. Larutan di dalam tabung reaksi akan terpisah menjadi
larutan ampas (berwarna kuning) dan larutan kloroform (berwarna putih
bening). Larutan kloroform ini digunakan untuk penotolan fraksi
kloroform (fk).
4. Pembuatan Tikus Model Asma Alergi dan Perlakuan
Untuk membuat tikus model asma alergi dilakukan sensitisasi awal
pada tikus dengan inhalasi 1% ovalbumin dalam PBS tiap 1 kelompok
perlakuan. Sensitisasi ulangan dilakukan secara inhalasi 7 dan 14 hari
berikutnya.
5. Pembuatan perlakuan dosis ekstrak maja
Kelompok perlakuan 1
= 125 mg/1000 g* = 18,75 mg/150 g
Kelompok perlakuan 2
= 250 mg/1000 g =
37,50 mg/150 g
Kelompok perlakuan 3
= 500 mg/1000 g =
75 mg/150 g
*nb : ekstrak maja (mg)/berat badan tikus (gram)
Dengan asumsi kapasitas volume maksimal lambung tikus yaitu 5 ml,
maka;
14

Kelompok perlakuan 1
= 18,75 mg/0,75 ml
Kelompok perlakuan 2
= 37,5 mg/1,5 ml
Kelompok perlakuan 3
= 75 mg/3 ml
Pemberian ekstrak maja selama 14 hari
Kelompok P 1
= 0,75 ml x 5* = 3,75 ml
Kelompok P 2
= 1,5 ml x 5
= 7,50 ml
Kelompok P 3
= 3 ml x 5
= 15 ml
Total/hari
= 26,25 ml  30 ml
*nb : jumlah tikus per kelompok perlakuan
Dalam 14 hari
= 14 hari x 30 ml = 420  500 ml
= 75 mg/3 ml = X (mg)/500 ml
X (ekstrak maja) = 12.500 mg
Dalam 7 hari
= 12.500 mg/500 ml = X (mg)/250 ml
X (ekstrak maja) = 6.250 mg

Pembuatan CMC-Na 2%
2 g/100 ml
= X (g)/500 ml
X (jumlah CMC-Na)
= 10 gram/14 hari  5 gram/7 hari
6. Pengecatan/Staining
Cat yang umum dipakai dalam hispatologi adalah Hematoxylin-Eosin
(HE) disamping cat khusus/histokimia seperti : PAS, Gomori, Ziel Nelson,
Malory dan lain – lain dan juga cat lebih khusus yaitu Immunohistokimia
seperti : ER, PR, CD20, LMP dan lain – lain.
Pengecatan menggunakan HE diawali dengan melakukan deparafinisasi
dengan memasukkan preparat ke xylol I, II, III masing – masing selama 3
menit. Deparafinisasi berfungsi untuk melarutkan/melepaskan paraffin yang
ada pada preparat. Setelah itu dilap dengan kain kassa di sekitar jaringan.
Lalu dilanjutkan dengan melakukan rehidrasi yaitu preparat masuk ke alcohol
100%, 95%, 80%, dan 70% masing – masing selama 2 menit. Rehidrasi
berfungsi untuk melarutkan/melepaskan xylol yang terbawa oleh preparat dan
memasukkan kadar air ke dalam jaringan dengan cara bertahap mulai alcohol
100% sampai 70%. Preparat dicuci pada air mengalir selama 3 menit untuk
melepaskan sisa cat/cairan yang terbawa sebelumnya
15
Pengecatan inti dilakukan dengan cara memasukkan preparat ke dalam
larutan Mayer Hematoksilin selama 7 menit. Pengecatan ini dilakukan untuk
memberikan warna biru pada inti sel. Preparat masuk ke air mengalir selama
7 menit. Kemudian dilakukan Counter stain dengan memasukkan preparat ke
larutan eosin selama ± 0,5 menit. Hal ini dilakukan untuk memberikan warna
merah pada sitoplasma, jaringan ikat, dan lainnya. Cat ini juga disebut
Counter stain atau penyeimbang. Preparat masuk ke air wadah I, II, III
masing – masing 3 celup.
Langkah selanjutnya yaitu lakukan dehidrasi dengan memasukkan
preparat ke alkoohol 70%, 80%, 95% dan 100% masing – masing 3 celup.
Dehidrasi berfungsi melepaskan/mengeluarkan air yang terbawa oleh
preparat mulai dari alcohol 70% sampai 100%. Setelah itu dilap dengan kain
kassa di sekitar jaringan. Kemudian dilakukan clearing preparat dengan
memasukannya ke dalam xylol I dan II masing – masing selama 2 menit.
Clearing berfungsi melarutkan/melepaskan sisa alcohol yang terbawa oleh
preparat dan juga memberikan warna yang bening terhadap jaringan.
Langkah terakhir pengecatan HE yaitu lakukan mounting dengan
meneteskan 1 tetes Entelan dan Dek Glass pada preparat. Mounting berfungsi
memberikan warna yang cerah (tidak kusam) dan sebagai pelindung /
pengawet jaringan dari mikroba/bakteri. Mounting bersifat permanen seperti
Entelan, Canada balsam, Hipermount, EZ-mount dan lainnya.
16
3. Alur penelitian
17
BAB IV
Hasil Penelitian dan Pembahasan
Preparat trakea tikus wistar yang telah diolah dan telah dilakukan
pengecatan HE masing-masing kelompok diamati menggunakan mikroskop
cahaya dengan perbesaran 10 x 40 dalam 3 lapang pandang dan dihitung
jumlah eosinofil trakea tikus wistar.
Hasil pengamatan preparat diperlihatkan pada gambar berikut :
Gambar 16. Penampang melintang trakea (perbesaran 400x) tiap
kelompok
Keterangan :
K0 : Kelompok Kontrol nol
K(-) : Kelompok OVA
P1
: Kelompok Ekstrak Aegle marmelos 125 mg/tikus/hari
P2
: Kelompok Ekstrak Aegle marmelos 250 mg/tikus/hari
18
P3
: Kelompok Ekstrak Aegle marmelos 500 mg/tikus/hari
Setelah dilakukan penelitian hitung eosinofil trakea pada tikus wistar
didapatkan peningkatan rata – rata hitung eosinofil pada kelompok OVA.
Pemberian kelompok ekstrak kortek Aegle marmelos menurunkan hitung eosinofil
trakea. Data jumlah eosinofil trakea disajikan pada tabel 4.
Tabel 4. Rata – rata hitung eosinofil trakea (sel/3 LP) pada tikus
wistar
Kelompok
n
Rata – rata ± SD
K0
5
1.93 ± 0.60
K(-)
5
10.6 ± 2.19
P1
5
9.27 ± 2.09
P2
5
5.27 ± 0.89
P3
5
3.80 ± 1.10
Histogram rata – rata hitung eosinofil trakea tikus wistar pada tiap
kelompok perlakuan.
Gambar 17. Histogram hitung eosinofil tiap kelompok perlakuan
Keterangan :

Data disajikan dengan 5x replikasi (3 lapang pandang pada tiap replikasi)

Mean : X ± SD
K0 : Kelompok Kontrol nol
K(-) : Kelompok OVA
P1 : Kelompok Ekstrak Aegle marmelos 125 mg/tikus/hari
P2 : Kelompok Ekstrak Aegle marmelos 250 mg/tikus/hari
19
P3 : Kelompok Ekstrak Aegle marmelos 500 mg/tikus/hari
Analisis Statistik
Data yang diperoleh kemudian diuji menggunakan software program SPSS
for Windows Release 16.0. Perhitungan menggunakan uji One way ANOVA untuk
mengetahui ada tidaknya perbedaan rerata lebih dari dua kelompok. Sebelum
menggunakan uji ANOVA, dilakukan uji kenormalan distribusi data terlebih
dahulu.
Macam alat uji kenormalan distribusi data yang digunakan adalah ShapiroWilk. Shapiro Wilk adalah metode analitik yang digunakan untuk sampel yang
sedikit (< 50). Data Sig. (Lampiran 6.1) menunjukkan tingkat signifikansi atau
nilai probabilitas di atas 0.05, maka dapat dikatakan distribusi eosinofil/LPB pada
masing – masing kelompok adalah normal.
Setelah diketahui bahwa data terdistribusi normal, maka dilanjutkan
dengan melakukan uji ANOVA. Data (Lampiran 6.2) menggambarkan ringkasan
statistik dari 5 kelompok.

Pada K0, rerata jumlah eosinofil trakea adalah 1.93, dengan jumlah
minimum 1.33 dan maksimum 2.67, dengan tingkat kepercayaan 95%
atau signifikansi 5% rerata jumlah eosinofil trakea ada pada range 1.18
sampai 2.67.

Pada K(-), rerata jumlah eosinofil trakea adalah 10.6, dengan jumlah
minimum 8.67 dan maksimum 14, dengan tingkat kepercayaan 95%
atau signifikansi 5% rerata jumlah eosinofil trakea ada pada range 7.88
sampai 13.32.

Pada P1, rerata jumlah eosinofil trakea adalah 9.26, dengan jumlah
minimum 7.33 dan maksimum 12.67, dengan tingkat kepercayaan 95%
atau signifikansi 5% rerata jumlah eosinofil trakea ada pada range 6.67
sampai 11.86.

Pada P2, rerata jumlah eosinofil trakea adalah 5.26, dengan jumlah
minimum 4.33 dan maksimum 6.67, dengan tingkat kepercayaan 95%
atau signifikansi 5% rerata jumlah eosinofil trakea ada pada range 4.15
sampai 6.37.
20

Pada P3, rerata jumlah eosinofil trakea adalah 3.79, dengan jumlah
minimum 2.33 dan maksimum 5, dengan tingkat kepercayaan 95%
atau signifikansi 5% rerata jumlah eosinofil trakea ada pada range 2.43
sampai 5.15.
Analisis ini (Lampiran 6.3) bertujuan untuk menguji berlaku tidaknya
asumsi untuk ANOVA, yaitu apakah kelima sampel mempunyai varians yang sama
Hipotesis :
H0 = Kelima varians populasi adalah identik
H1 = Kelima varians populasi adalah tidak identik
Pengambilan keputusan

Jika probabilitas > 0.05, maka H0 diterima

Jika probabilitas < 0.05, maka H0 ditolak
Terlihat bahwa Levene T hitung (Lampiran 6.3) adalah 1.616 dengan nilai
probabilitas 0.209. oleh karena probabilitas > 0.05, maka H0 diterima atau berarti
kelima varians adalah sama. Dengan demikian, asumsi kesamaan varians untuk uji
ANOVA sudah terpenuhi.
Data (Lampiran 6.4) digunakan untuk menguji apakah dari kelima sampel
mempunyai rata – rata yang sama.
Hipotesis :
H0 = Kelima rata –rata populasi adalah identik
H1 = Kelima rata – rata populasi adalah tidak identik
Pengambilan keputusan

Jika probabilitas > 0.05, maka H0 diterima

Jika probabilitas < 0.05, maka H0 ditolak
Melihat bahwa F hitung adalah 29.106 dengan probabilitas 0.000 < 0.05,
maka H0 ditolak, yang artinya rata – rata jumlah eosinofil trakea dari masing –
masing kelompok tersebut berbeda.
Untuk mengetahui di antara kelima kelompok, mana saja kelompok yang
berbeda dan mana saja yang tidak berbeda, hal ini akan dibahas pada analisis
Tukey dalam Post Hoc Test.
Uji signifikansi perbedaan, berdasarkan nilai probabilitas

Jika probabilitas > 0.05, maka H0 diterima
21

Jika probabilitas < 0.05, maka H0 ditolak
Post Hoc (Lampiran 6.5) menunjukkan probabilitas dari sebagian besar
kelompok < 0.05, maka H0 ditolak, berarti perbedaan mean diantara sebagian
kelompok tersebut benar – benar nyata (hubungan antar variable). Hal tersebut
juga dapat dilihat dengan adanya tanda (*) di belakang angka Mean Difference.
Untuk mencari kelompok sampel mana saja yang mempunyai perbedaan
rata – rata yang tidak berbeda secara signifikan maka dapat dilihat pada lampiran
6.6.
Data ini (Lampiran 6.6) menunjukkan nilai rata – rata yang terletak dalam
satu kolom subsets yang sama tidak memiliki perbedaan yang nyata. Dapat dilihat
bahwa antara kelompok K(-) dan P1, P2 dan P3 serta P3 dan K0 menunjukkan
tidak ada perbedaan yang signifikan.
Asma merupakan kondisi inflamasi kronis di saluran pernafasan yang
ditandai dengan terjadinya kesulitan bernafas. Asma memiliki gejala seperti sesak
nafas, dada terasa berat dan batuk (Purbaningrum, 2010). Proses inflamasi yang
terjadi menimbulkan munculnya sel inflamasi seperti eosinofil. Eosinofil sering
dijumpai di sekitar tempat terjadinya reaksi imun yang diperantarai IgE, yang
berhubungan dengan alergi (Purbaningrum, 2010). Alergi umumnya disebabkan
oleh benda asing yang biasa disebut alergen. Pada penelitian ini alergen yang
digunakan berupa ovalbumin (OVA) yang dipaparkan secara inhalasi. Sel penyaji
antigen (APC) akan mengenali alergen untuk selanjutnya mengekspresikan pada
sel limfosit T secara langsung atau melalui sitokin.
Pada penelitian ini didapatkan peningkatan jumlah eosinofil trakea pada
kelompok OVA (Gambar 15). Secara statistik didapatkan perbedaan yang
bermakna antara kelompok K0 dan K(-) (p = 0.000) (Lampiran 6.5). Hal ini
menandakan pemaparan OVA terhadap tikus wistar berhasil menimbulkan reaksi
imun yang diperantarai IgE, sehingga terjadi proses alergi yang menyebabkan
munculnya sel inflamasi seperti eosinofil.
Ovalbumin memiliki prevalensi hingga 100% dalam menimbulkan alergi.
Ovalbumin yang dipaparkan akan dikenali oleh APCs dan akan didegradasi
menjadi
peptida-peptida
yang
kemudian
bersama
molekul
HLA
akan
dipresentasikan pada sel limfosit T (CD4+) yang selanjutnya mendorong limfo-B
22
untuk memproduksi antibodi (IgE), mengaktivasi sel-sel sitotoksis, juga
menstimulasi makrofag untuk membentuk sitokinnya (Diding, 2007). Sitokin
adalah protein yang berperan utama pada komunikasi antara berbagai bagian dari
sistem imun. Terutama dibentuk oleh monosit, makrofag, tetapi juga dapat
dibentuk oleh limfosit, granulosit, hepatosit, keratinosit, fibroblast dan sel-sel
epitel. Bila sitokin sudah mencapai tujuannya, akan timbul efek biologis tertentu
seperti aktivasi, pembiakan dan pemindahan ke tempat lain (Tjay dan Rahardja,
2002), dalam hal ini adalah migrasi eosinofil ke trakea.
Eosinofil diproduksi oleh sumsum tulang, kemudian setelah 2 – 6 hari
eosinofil yang matang akan meninggalkan sumsum tulang dan berada di sirkulasi
darah tepi selama 6 – 12 jam, kemudian akan menuju jaringan selama beberapa
hari (Ardinata, 2008). Gambar 16, menunjukkan adanya eosinofil yang menempel
pada jaringan trakea. Eosinofil tersebut akan aktif kembali apabila terjadi
pemaparan berulang.
Kortek Maja (Aegle marmelos Correa.) berpotensi untuk dikembangkan
sebagai alergi jika ditinjau dari kandungan senyawa yang terdapat di dalamnya,
diantaranya seperti aegelin, skimianin, marmesin, lupenol, lupeol, dan marmin.
Hasil penelitian memperlihatkan ekstrak Aegle marmelos dosis 125 mg/tikus (P1)
dapat menurunkan jumlah eosinofil trakea (Tabel 4) tapi penurunan ini tidak
bermakna secara statistik (Lampiran 6.5) (p = 0.641) dibandingkan kelompok
asma.
Sedangkan
ekstrak
Aegle
marmelos
dosis
250
mg/tikus
(P2)
memperlihatkan penurunan jumlah eosinofil trakea (Tabel 4) dan penurunan ini
bermakna secara statistik (Lampiran 6.5) (0.000) dibandingkan kelompok asma.
Penurunan jumlah eosinofil tersebut dimungkinkan akibat adanya
kandungan yang dimiliki oleh kortek Aegle marmelos seperti kumarin, yang
menurut Nugroho (2011) memiliki fungsi sebagai antialergi. Efek antialergi ini
mampu menghambat degranulasi sel mast, sehingga pelepasan sitokin dan
mediator inflamasi seperti histamin, leukotrien dan prostaglandin terhambat yang
selanjutnya akan dapat menurunkan jumlah eosinofil trakea. Selain itu di dalam
kortek Aegle marmelos terdapat lupen-on dan lupen-ol yang mampu menghambat
pelepasan mediator kimia dari kultur sel mast. Aegelin yang merupakan turunan
23
senyawa alkaloid yang terkandung di dalamnya juga diketahui mempunyai efek
antialergi (Nugroho, 2010).
Struktur kumarin yaitu atom O yang terikat pada C nomor 7 memiliki
peranan dalam menghambat pelepasan berbagai mediator (histamin, enzim βheksosaminidiase, sitokin dan mediator lainnya) pada kultur sel mast rat
basophilic leukemia (RBL-2H3). Senyawa turunan kumarin, 7-metoksi kumarin
dan 7-hidroksi kumarin konsentrasi 1,0 x 10-4 M juga mempunyai kemampuan
yang sangat kuat dalam menghambat pelepasan histamin yang diinduksi oleh IgE
pada kultur sel RBL-2H3 dengan persentase efek penghambatan berturut-turut
adalah sebesar 98,4% dan 91,7% (Watanabe et al., 2005). Perlu ditekankan bahwa
pada penelitian Watanabe (2005), Nugroho (2011) dan Nugroho (2010) baru pada
taraf in vitro, sehingga tidak terjadi duplikasi dengan data pada penelitian ini.
Efek antialergi oleh senyawa kumarin juga telah dibuktikan dari hasil uji
klinik oleh Husori (2011), bahwa pemberian senyawa turunan kumarin (3,4dimetil-7-[4-(p-klorobenzil)-piperazin-1-il]-propoksikumarin.dihidroklorida)
dosis tunggal 20 mg mampu melindungi penyumbatan bronkus pada manusia, 60
menit setelah paparan alergen. Senyawa ini mampu menghambat pelepasan dan
re-uptake histamin oleh sel leukosit manusia, yang berlangsung dengan pola
tergantung dosis (Assem dan Chong, 1976).
Penelitian lainnya menyebutkan, ekstrak Aegle marmelos memiliki
aktivitas anti inflamasi yang sangat signifikan. Hal ini dikarenakan adanya lupeol
dan skimmianin karena kedua senyawa telah menunjukkan potensi yang sama
dalam bentuk murni (Geetha dan Varalakshmi, 2001). Lupeol dan Citral dalam
ekstrak Aegle marmelos juga menunjukkan penghambatan aktivitas reseptor H1
dengan melihat efek positif pada relaksasi jaringan ileum dan trakea marmut
terisolasi (Arul et al., 2004), karena sebagian besar mekanisme anti inflamasi dan
antialergi bertindak melalui penghambatan mediasi sinyal oleh histamin (Maity et
al., 2009).
Pada hasil penelitian ini, kelompok kortek Aegle marmelos dosis 250
mg/tikus dengan dosis 500 mg/tikus tidak didapatkan perbedaan bermakna dalam
menurunkan hitung eosinofil (p = 0.557) (Lampiran 6.5). Hasil ini menunjukkan
ekstrak kortek Aegle marmelos dosis 250 mg/tikus memiliki kemampuan yang
24
tidak jauh berbeda dengan ekstrak kortek Aegle marmelos dosis 500 mg/tikus
dalam menurunkan jumlah eosinofil. Namun jumlah eosinofil pada kelompok
asma alergi dengan ekstrak kortek Aegle marmelos dosis 500 mg/mencit lebih
rendah jika dibandingkan jumlah eosinofil pada kelompok asma alergi dengan
ekstrak kortek Aegle marmelos dosis 250 mg/tikus (Gambar 17).
Mengingat bahwa ekstrak kortek Aegle marmelos dosis 500 mg/tikus
memiliki dosis yang sudah bisa dikatakan besar sedangkan penurunan jumlah
eosinofil trakeanya tidak berbeda signifikan dibandingkan ekstrak kortek Aegle
marmelos dosis 250 mg/tikus, maka bisa dikatakan bahwa ekstrak kortek Aegle
marmelos dosis 250 mg/tikus tersebut adalah dosis optimal dalam menurunkan
jumlah eosinofil trakea pada asma alergi model akut. Disamping itu perlu
dipertimbangkan adanya keterbatasan dan kelemahan dalam cara perhitungan
eosinofil yang dilakukan secara manual dan hanya menggunakan 3 lapang
pandang saja.
KESIMPULAN
1. Ekstrak kortek Aegle marmelos Correa. dapat menghambat migrasi eosinofil
trakea secara in vivo hal ini dapat terlihat pada penurunan jumlah eosinofil
trakea pada kelompok perlakuan P1, P2 dan P3 (Gambar 15).
2. Ekstrak kortek Aegle marmelos Correa. dengan dosis optimal 250 mg/tikus
dapat menurunkan jumlah eosinofil trakea pada tikus wistar model asma alergi
(p < 0.05).
3. Ekstrak kortek Aegle marmelos Correa. terdeteksi memiliki kandungan
senyawa kumarin, steroid dan alkaloid yang diduga berpotensi sebagai
antialergi melalui analisis kromatografi lapis tipis.
25
BAB IV
Biaya dan Jadwal Penelitian
A. Biaya Penelitian
Jenis Anggaran
Jumlah
Honorarium
Rp.
Belanja bahan habis pakai
Rp. 3.600.000,- (60%)
Perjalanan
Rp.
600.000,- (10%)
Lain lain (Publikasi dan laporan)
Rp.
900.000,- (15%)
900.000,- (15%)
Rp. 6.000.000,-
B. Jadwal Penelitian
No
Kegiatan
Mar
1
2
3
Tahap Persiapan
a. Persiapan bahan penelitian
Tahap Pelaksanaan
a. Ekstraksi
b. Pengujian peranan sel epithelial
terhadap efek relaksasi oleh
ekstrak Aegle marmelos pada otot
polos trachea.
c. Pembacaan hasil preparat
Tahap Penyelesaian
a. Pengumpulan data penelitian
b. Pengolahan data
c. Analisis data
d. Penyusunan laporan akhir
e. Pengumpulan laporan akhir
Bulan
Apr
Mei
Jun
Jul
√
√
√
√
√
√
√
√
√
√
√
√
26
DAFTAR PUSTAKA
Anderson, G.P., 2006, Current Issues with Beta2-adrenoceptor Agonists:
Pharmacology and Molecular and Cellular Mechanisms, Clin Rev Allergy
Immunol, 31(3) : 119-130
Arul, V., Miyazaki, S. and Dhananjayan, R., 2005, Studies on the Antiinflammatory, Antipyretic and Analgesic Properties of the Leaves of
Aegle marmelos Corr, J Ethnopharmacol, 96(1) : 159-163
Arumugam, S., Kavimani, S., Kadalmani, B., Ahmed, A.B.A., Akbarsha, M.A.
and Rao, M.V., 2008, Antidiabetic Activity of Leaf and Callus
Extracts of Aegle marmelos in Rabbit, ScienceAsia,34 : 317-321
Barnes, P.J., 1990, Muscarinic Receptors in Airways: Recent Developments, J.
Appl. Physiol, 68(5) : 1777-1785
Bryce, P.J., Mathias, C.B., Harrison, K.L., Watanabe, T., Geha, R.S. and Oettgen,
H.C., 2006, The H1 Histamine Receptor Regulates Allergic Lung
Responses, J. Clin. Invest, 116(6) : 1624-1632
Currie, G.P., Lee, D.K.C. and Srivastava, P., 2005, Long-acting Bronchodilator or
Leukotriene Modifier as Add-on Therapy to Inhaled Corticosteroids in
Persistent Asthma?,Chest, 128(4) : 2954-2962
De Backer, M.D., Gommeren, W., Moereels, H., Nobels, G., Van Gompel, P.,
Leysen, J.E. and Luyten, W.H., 1993, Genomic Cloning, Heterologous
Expression and Pharmacological Characterization of a Human Histamine
H1 Receptor, Biochem. Biophys. Res. Commun, 197(3) : 1601-1608
Delmotte, P., Ressmeyer, A., Bai, Y. and Sanderson, M.J., 2010, Mechanisms of
Airway Smooth Muscle Relaxation Induced by Beta2-adrenergic
Agonists, Front. Biosci, 15 : 750-764
Devalia, J.L. and Davies, R.J., 1999, Effect of Antihistamines on Epithelial Cells,
Clin. Exp. Allergy, 29(3) : 64-68
Dickenson, J.M. and Hill, S.J., 1991, Histamine-stimulated Increases in
Intracellular Calcium in the Smooth Muscle Cell Line, DDT1MF-2,
Biochem. Pharmacol, 42(8) : 1545-1550
Djikstra, D., Stark, H., Chazot, P.L., Shenton, F.C., Leurs, R., Werfel, T. and
Gutzmer, R., 2008, Human Inflammatory Dendritic Epidermal Cells
Express a Functional Histamine H4 Receptor, J. Invest. Dermatol, 128(7)
: 1696-1703
Du Buske, L.M., 2006, Clinical Comparison of Histamine H1-receptor Antagonist
Drugs,J. Allergy Clin.Immunol., 98(6) : 307-318
Ehlert, F.J., 2003, Contractile Role of M2 and M3 Muscarinic Receptors in
Gastrointestinal, Airway and Urinary Bladder Smooth Muscle, Life Sci.,
74(2-3) : 355-366
Escribano, L., Akin, C., Castells, M. and Schwartz, L.B., 2006, Current Options in
the Treatment of Mast Cell Mediator-related Symptoms in Mastocytosis,
Inflamm Allergy Drug Targets, 5(1) : 61-77
Gosens, R., Zaagsma, J, Meurs, H. and Halayko, A.J., 2006, Muscarinic Receptor
Signaling in the Pathophysiology of Asthma and COPD, Respir.Res.7(1) :
73-87
Graziano, F.M., Cook, E.B. and Stahl, J.L., 2000, Antihistamines and Epithelial
Cells, Allergy Asthma Proc, 21(3) : 129-133
27
Hendeles, L., Marshik, P.L., Ahrens, R., Kifle, Y. and Shuster, J., 2005, Response
to Nonprescription Epinephrine Inhaler During Nocturnal asthma, Ann.
Allergy Asma Immunol, 95(6) : 530-534
Iriyoshi, N., Takeuchi, K., Yuta, A., Ukai, K. and Sakakura, Y., 1996, Increased
Expression of Histamine H1 Receptor mRNA in Allergic Rhinitis, Clin.
Exp. Allergy, 26(4) : 379-385
Janković, S.M., Milovanović, D.R. and Janković, S.V., 1999, Schild's Equation
and the Best Estimate of pA2 Value and Dissociation Constant of an
Antagonist, Croat. Med. J, 40(1) : 67-70
Janssen, L.J. and Killian, K., 2006, Airway Smooth Muscle as a Target of Asthma
Therapy: History and New Directions, Respir. Res., 7 : 123
Jarvie, E.M., Cellek, S. and Sanger, G.J., 2008, Potentiation by Cholinesterase
Inhibitors of Cholinergic Activity in Rat Isolated Stomach and Colon,
Pharmacol. Res, 58(5) : 297-301
Johansson, S.G.O, 2009, New Nomenclature and Clinical Aspects of Allergic
Diseases, in Pawankar, R., Holgate, S.T. and Rosenwasser, R.J., Allergy
Frontiers : Classification and Pathomechanisms, Vol. 2, Springer, Japan.
Kamalakkannan, N. and Prince, P.S.M., 2003, Effect of Aegle marmelos Correa.
(Bael) Fruit Extract on Tissue Antioxidants in Streptozotocin Diabetic
Rats, Indian J. Exp. Biol, 41(11) : 1285-1288
Kamalakkannan, N. and Prince, P.S.M., 2005, The Effect of Aegle marmelos Fruit
Extract in Streptozotocin Diabetes : a Histopathological Study, J Herb
Pharmacother, 5(3) : 87-96
Lullmann, H., Mohr, K., Ziegler, A. and Bieger, D., 2000, Color Atlas of
Pharmacology, Second Edition., Thieme, New York
Magnan, A., Meunier, J.P., Saugnac, C., Gasteau, J. and Neukirch, F., 2008,
Frequency and Impact of Alergic Rinitis in Asthma Patients in Everyday
General Medical Practice: a French Observational Cross-sectional Study,
Allergy, 63(3) : 292-298
Mak, J.C. and Barnes, P.J., 1990, Autoradiographic Visualization of Muscarinic
Receptor Subtypes in Human and Guinea-pig Lung, Am. Rev. Respir. Dis,
141(6) : 1559-1568
Maity, P., Hansda, D., Bandyopadhyay, U. and Mishra, D.K., 2009, Biological
Activities of Crude Extracts and Chemical Constituents of Bael, Aegle
marmelos (L.) Corr, Indian J. Exp. Biol, 47(11), 849-861.
Nugroho, A.E,Riyanto, S., Sukari, M.A. and Maeyama, K., 2008, The Effects of
Compounds Isolated from Aegle marmelos Correa, on Histamine Release
from Mast Cells, in 81st Annual meeting of Japanese pharmacological
Society, Yokohama., March 17 - 18th2008.
Nugroho, A.E., Riyanto, S., Sukari, M.A. dan Maeyama, K., 2010, Pengaruh
Lupene-ol and Lupene-on dari Aegle marmelos Correa terhadap
Pelepasan Enzim β–hexoaminodase dari Sel Mast, Jurnal Ilmu
Kefarmasian Indonesia, 8(1) : 55-60
Nugroho, A.E., Sahid, N.A., Riyanto, S., Maeyama, K., and Ikawati, Z, 2011,
Effects of Marmin Isolated from Aegle marmelos Correa on L-histidine
Decarboxilase Enzyme in RBL-2H3 Cells, Thai J. Pharm. Sci.35 : 1-7
Offermanns, S. and Rosenthal, W., 2008, Encyclopedia of Molecular
Pharmacology, 2nded., Springer-Verlag, New York
28
Riyanto, S., Sukari, M.A., Rahmani, M., Gwendoline, C.L.E., Taufiq-Yap, Y.H.,
Aimi, N. and Kitajima, M., 2001a, Alkaloids from Aegle marmelos
(Rutaceae), Malaysian Journal of Analytical Sciences, 7(2) : 463-465
Riyanto, S., Sukari, M.A., Rahmani, M. dan Ali, A.M., 2001b. Identifikasi dan
Uji Bioaktivitas Lupeol and Marmin yang dipisahkan dari Korteks Aegle
marmelos.Biologi, 2(11): 685-692
Riyanto, S., 2003, Phytochemical Studies and Bioactivity Tests of Murraya
paniculata Jack., Aegle marmelos Correa and Zingiber Amaricans Blume,
Dissertasi, University Putra Malaysia.
Sonar, S. and Renz, H., 2009, Biology of Neurotrophins, Neuropeptides, and
Muscarinic Receptors in Asthma, in Allergy Frontiers : Clasiffication and
Pathomechanism, Vol. 2, pp. 469-491, Springer, Tokyo., 2009.
Sudharameshwari, K. and Radhika, J., 2007, Antibacterial Screening of Aegle
marmelos, Lawsonia inermis and Albizzia Libeck, Afr. J. Trad. CAM,4(2)
: 199 – 204
Takase, H., Yamamoto, K., Hirano, H., Saito, Y. and Yamashita, A., 1994,
Pharmacological Profile of Gastric Mucosal Protection by Marmin and
Nobiletin from a Traditional Herbal Medicine, Aurantii fructus
immaturus, Jpn. J. Pharmacol, 66(1) : 139-147
Tanaka, K., 1996, The Clinical Application of Long-acting Preparations of
Theophylline, Nippon Rinsho, 54(11) : 3108-3112
Taylor-Clark, T., Sodha, R., Warner, B. and Foreman, J., 2005, Histamine
Receptors that Influence Blockage of the Normal Human Nasal Airway,
Br. J. Pharmacol, 144(6) : 867-874
Venkatesan, D., Karrunakarn, C., Kumar, S.S. and Swamy, P.P., 2009,
Identification of Phytochemical Constituents of Aegle marmelos
Responsible for Antimicrobial Activity against Selected Pathogenic
Organisms, Etnobot.Leaf.,13 : 1362-1372
Vogel, H.G., 2002, Drug Discovery and Evaluation : Pharmacological Assays,
Second Edition., Springer Berlin-Heidelberg, New York.
Yamada, Y., Nakatani, N. and Fuwa, H., 1987, Epoxyaurapten and Marminfrom
Juice Oil in Hassaku (Citrus hassaku) and the Spasmolytic Activity of 7Geranyloxycoumarin-related Compounds, Agric. Biol. Chem.,51(4) :
1105-1110
Zhao, S., Wang, J., Yang, Y., He, Z. and Liao, Q., 2009, Organ Bath in Detecting
the Effect of One-hour Warm Ischemia on Pulmonic Arteries and Bronchi
from Non-heart-beating Donor Lungs, Chin. Med. J, 122(23) : 2903-2906
29
LAMPIRAN
1. Lampiran. 1 (Justifikasi biaya penelitian)
1 Belanja bahan habis pakai
Jenis Bahan
-
Gas karbogen (PT. Aneka Gas)
Histamin (Sigma)
NaCl p.a (Sigma)
KCl p.a grade (Sigma)
MgSO4.7H2O p.a (Sigma)
EDTA (Merck)
NaH2PO4.2H2O (Sigma)
Glukosa (Merck)
NaHCO3 (Sigma)
CaCl2.2H2O (Sigma)
DMSO (Merck)
Akuades (lab kimia
instrumental UGM)
Larutan saline (lab kimia
Instrumental UGM)
Kertas Polygraph recorder
(Brataco)
Pisau scalpel (Brataco)
Kloroform (Merck)
Blue tip (Brataco)
Yellow tip (Brataco)
Etanol antiseptic (Brataco)
Masker dan sarung tangan
(One Med)
Benang Cat Gut (One Med)
Hewan uji marmut
Pemakaian lab fitomedisin
Pemakaian lab farmakologi
Pemakaian Organ bath
Pemakaian Contraction
recorder
2 Biaya perjalanan
- Transport pengurusan Ethical
clearance ke BBvet
- Transport belanja kebutuhan
bahan uji
Jumlah
1
tabung
50 g
50 g
50 g
50 g
100 g
100 g
100 g
50 g
50 g
50 ml
Harga satuan
Total
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
Rp 250.000/tabung
Rp 54.000/10 g
Rp 12.000/10 g
Rp 23.000/10 g
Rp 25.000/10 g
Rp 12.500/10 g
Rp 12.000/10 g
Rp 5.000/10 g
Rp 15.000/10 g
Rp 23.000/10 g
Rp 12.000/10 ml
Rp 250.000
Rp 270.000
Rp 60.000
Rp 115.000
Rp 125.000
Rp 125.000
Rp 120.000
Rp 50.000
Rp 75.000
Rp 115.000
Rp 60.000
1 bks
20 pcs
20 ekor
1bulan
4 bulan
4 kali
x Rp 2.000/l
x
Rp 45.000/l
x
Rp 150.000/gulung
x Rp 5.000/pcs
x Rp 150.000/l
x Rp 100.000/bks
x Rp 100.000/bks
x Rp 25.000/l
x
Rp 50.000/bks
x Rp 5.000/pcs
x Rp 20.000
x Rp 50.000
x Rp 100.000
x Rp 100.000
1 kali
x Rp 50.000
1 kali
x Rp 100.000
= Rp. 100.000
5 kali
x Rp.500.000
= Rp. 500.000
10 l
1l
1
gulung
20 pcs
1l
1 bks
1 bks
2l
Rp 20.000
Rp 45.000
Rp 150.000
Rp 100.000
Rp 150.000
Rp 100.000
Rp 100.000
Rp 50.000
Rp 50.000
Rp 100.000
= Rp 400.000
= Rp. 100.000
= Rp. 400.000
= Rp. 400.000
= Rp. 50.000
Total Rp. 3.600.000
Total Rp. 600.000
30
3 Publikasi dan administatif
- Pengurusan publikasi
- Cetak laporan dan CD
Rp 800.000
Rp.100.000
4 Honorarium
- Honor ketua
- Honor anggota
= Rp.800.000
= Rp.100.000
Total
Rp. 900.000
Rp 225.000
Rp.675.000
Total Rp. 900.000
2. Lampiran. 2 (Susunan Organisasi Tim Penelitian)
Ketua tim peneliti
: Puguh Novi Arsito, M.Sc.,Apt.
Penanggungjawab ekstraksi
: Ratih Dwi Amaliah
Penanggungjawab uji aktivitas
: Aditya Rizqi Abdi Setyo
Analisis data dan supervisor
: Puguh Novi Arsito, M.Sc.,Apt
Publikasi dan laporan
: Arko Jatmiko Wicaksono, M.Sc.,Apt.
3. Lampiran. 3 (Biodata Ketua dan Anggota)
Ketua Peneliti
a. Nama Lengkap dan Gelar
: Puguh Novi Arsito, M.Sc.,Apt.
b. Tempat, Tanggal Lahir
: 7 Nov 1986
c.
: 173 224
NIK
d. Jabatan Fungsional
:-
e. Jabatan Struktural
:-
f. Fakultas/Program Studi
: FKIK/ Farmasi
g. Perguruan Tinggi
: UMY
h. Bidang Keahlian
: Farmakologi
Yogyakarta, 24 Agustus 2016
Puguh Novi Arsito, M.Sc.,Apt
(173 224)
31
Anggota Peneliti
Anggota. 1
a. Nama Lengkap dan Gelar
: Arko Jatmiko W, M.Sc.,Apt.
b. Tempat, Tanggal Lahir
: Sleman, 20 September 1987
c.
: 201 248
NIK
d. Jabatan Fungsional
:-
e. Jabatan Struktural
:-
f. Fakultas/Program Studi
: FKIK / Ilmu Farmasi
g. Perguruan Tinggi
: UMY
h. Bidang Keahlian
: Farmakologi dan Toksikologi
Yogyakarta, 24 Agustus 2016
Ketua Pelaksana
Puguh Novi Arsito, M.Sc.,Apt.
(NIK: 201 248)
Anggota. 2
a. Nama Lengkap
: Ratih Dwi Amaliah
b. Tempat, Tanggal Lahir
: Tamiang layang, 4 Nov 1994
c. Alamat
: Jl Glagah UH No.234, Yogyakarta
d. Fakultas/Program Studi
: FKIK / S1 Ilmu Farmasi
e. Perguruan Tinggi
: UMY
Yogyakarta, 24 Agustus 2016
Anggota Pelaksana,
Ratih Dwi Amaliah
20120350023
32
Anggota. 3
a. Nama Lengkap
: Aditya Rizqi Abdi Setyo
b. Tempat, Tanggal Lahir
: Sintang, 1 Nov 1994
c. Alamat
: jl dharma putra, Kalbar
d. Fakultas/Program Studi
: FKIK / Farmasi
e. Perguruan Tinggi
: UMY
Yogyakarta, 24 Agustus 2016
Anggota Pelaksana,
Aditya Rizqi Abdi Setyo
(20120350051)
33
Lampiran. 4 Surat Pernyataan
SURAT PERNYATAAN
Dengan ini saya yang bertandatangan di bawah ini:
Nama
: Puguh Novi Arsito, M.Sc.,Apt.
NIK
: 173 224
Prodi/Fakultas
: Ilmu Farmasi/FKIK
Bidang Keahlian
: Farmakologi
Menyatakan dengan sesungguhnya bahwa, sehubungan dengan pengajuan laporan
Kemitraan LP3M UMY:
1. Karya usulan yang diajukan adalah karya asli penulis
2. Hanya mengusulkan satu penelitian yang didanai LP3M
3. Tidak sedang menjadi ketua peneliti pada penelitian lain yang dibiayai
Ditlitabmas Dirjen Dikti
Demikian surat pernyataan ini saya buat dengan sebenar-benarnya.
Yogyakarta, 24 Agustus 2016
Ketua Penelitian
Puguh Novi Arsito, M.Sc.,Apt.
NIK: 173224
34