III. METODE PENELITIAN A. Waktu dan Tempat Penelitian

III.
METODE PENELITIAN
A. Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Desember 2014 – Mei 2015 di UPT
Laboratorium Terpadu dan Sentra Inovasi Teknologi Universitas Lampung,
analisis FTIR dilaksanakan di UGM Yogyakarta, dan analisis LC/MS
dilaksanakan di LIPI Serpong.
B. Alat dan bahan
1.
Alat
Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah culture flash, gelas kimia, labu
ukur, gelas ukur, pipet ukur, erlenmeyer, corong kaca, tabung reaksi, rak tabung
reaksi, spatula, akuarium, lampu, selang, pompa aerator, lampu UV, kain saring
400 mesh, pinset, sentrifuse, kaca preparat, mikroskop (Axioo 10 Carl-Zeiss),
oven, neraca analitik, botol sampel, desikator, lemari pendingin, lampu UV
(kohler/SN402006),
Prominence),
chamber,
MPLC
pinset,
(Medium
kolom,
Pressure
HPLC
(Shimadzu/LC-20A
Liquid
Chromatography)
(Buchi/Sepacoterm), microplate reader (Hospitex Diagnostics), spektrofotometer
UV-Vis (Varian/Cary 50 Probe), spektrofotometer FTIR (Shimadzu Prestige-21),
spektrofotometer LC/MS Mariner.
30
2.
Bahan
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah Spirulina sp. dari BBPBL Lampung, akuades, alkohol 70%, air laut, limbah POME, kertas saring, indikator
pH universal, natrium karbonat, natrium hidroksida, asam klorida, asam sulfat,
glukosa, natrium dihidrogen fosfat.monohidrat, dinatrium hidrogen fosfat tujuh
hidrat, ammonium sulfat, tembaga sulfat lima hidrat, natrium klorida, media
Conway/Walne, pupuk (Urea, ZA, TSP), Amberlite XAD 16 (Sigma), Cosmosil
75C18 - OPN, silika, plat KLT C18, plat KLT silika, alumunium foil, plastik wrap,
kapas, kasa, pereaksi ninhidrin, pereaksi dragendorf, pereaksi serium sulfat,
isopropanol, etanol, diklorometana, metanol, asam askorbat dan DPPH.
C. Metode Penelitian
1.
Kultivasi Spirulina sp.
Spirulina sp. dikultivasi pada media POME 5%. Pembuatan media kultivasi
diawali dengan mengatur derajat keasaman dari nilai pH 4 menjadi nilai pH 8 – 10
yang sesuai untuk pertumbuhan Spirulina sp., dengan cara menambahkan 4 gram
Na2CO3 ke dalam 1 Liter POME. Kemudian membuat media pupuk (0,03 gram
ZA, 0,03 gram Urea, 0,01 gram TSP untuk 1 Liter air laut, Anindiastuti et al.,
2007) yang di dalamnya mengandung POME. Untuk kultivasi awal dilakukan
adaptasi pada media POME 5%, 10% dan 15% dengan skala 250 mL. Setelah itu,
bibit Spirulina sp. dikultivasi yang dilengkapi dengan sistem aerasi udara, sistem
pencahayaan dengan sinar matahari dan berlangsung selama 10 – 14 hari, serta
dilakukan pengamatan secara mikroskopik.
31
Kultivasi Spirulina sp. dilakukan menggunakan akuarium skala 80 L
menggunakan media POME 5% yang dilengkapi dengan sistem aerasi udara,
sistem pencahayaan dengan sinar matahari dan berlangsung selama 10 – 14 hari.
2.
Pemanenan Spirulina sp.
Spirulina sp. yang telah dikultivasi selama 2 minggu dilakukan pemanenan
menggunakan kain saring berukuran 400 mesh (Vonshak, 2002). Biomassa dan
filtrat Spirulina sp. ditampung di wadah terpisah.
3.
Isolasi Senyawa Peptida
Sebanyak 50 gram biomassa Spirulina sp. ditambah dengan 100 mL air, kemudian
diultrasonifikasi selama 30 menit. Setelah itu, disentrifugasi dengan kecepatan
12000 rpm selama 10 menit pada suhu 4 oC, kemudian dilakukan pemisahan
antara filtrat dan padatan. Selanjutnya padatan diekstraksi menggunakan pelarut
metanol : air (7 : 3), kemudian diultrasonifikasi selama 30 menit. Setelah itu,
disentrifugasi dengan kecepatan 12000 rpm selama 10 menit pada suhu 4 oC,
kemudian dilakukan pemisahan antara filtrat dan padatan. Filtrat yang didapat,
dikeringkan menggunakan rotary evaporator.
Sebanyak 5 L filtrat Spirulina sp. dilakukan isolasi metode kromatografi kolom
secara ionik berdasarkan pertukaran ion menggunakan resin XAD 16 (Visscher et
al., 2008), kemudian dielusi dengan etanol 30%, isopropanol 20%, isopropanol
40% dan isopropanol 70% pH 2. Fraksi isopropanol 70% pH 2 adalah fraksi yang
positif, fraksi tersebut dikeringkan menggunakan rotary evaporator. Ekstrak yang
32
didapat diidentifikasi menggunakan kromatografi lapis tipis dengan C18 sebagai
fase diam dan metanol : air + TFA 0,1% (8 : 1) sebagai fase gerak, kemudian
dilakukan pemisahan menggunakan kromatografi kolom sesuai dengan kondisi
tersebut. Fraksi yang positif mengandung senyawa peptida diidentifikasi
menggunakan MPLC, menggunakan kolom C18 dielusi secara gradien dengan
eluen MeOH : H2O.
4.
Uji Antioksidan
Uji aktivitas antioksidan juga dilakukan secara kuantitatif menggunakan
microplate reader (Anggraini, 2012). Ekstrak kasar (± 2 mg) dilarutkan dalam
metanol sehingga diperoleh kadar 2000 ppm. Sampel dimasukkan ke dalam plate
96-well sebanyak 100 l dan ditambah dengan 100 l larutan DPPH 0,2 mM
dalam metanol. Blanko yang digunakan adalah metanol. Sampel dan blanko
yang sudah ditambahkan larutan DPPH diinkubasi di ruang gelap pada suhu
kamar selama 30 menit lalu diukur pada panjang gelombang 492 nm
menggunakan microplate reader. Reaksi positif akan memberikan perubahan
warna DPPH dari ungu menjadi kuning. Persentasi peredaman radikal DPPH oleh
senyawa antioksidan dihitung berdasarkan persamaan :
Dimana Ablank merupakan absorbansi balnko dan Atest merupakan absorbansi
ekstrak sampel.
33
5.
Identifikasi Menggunakan Spektrofotometer UV – Vis
Sampel senyawa peptida yang telah dimurnikan dilakukan analisis menggunakan
spektrofotometer UV – Vis dengan pelarut metanol pada panjang gelombang 200
– 400 nm.
6.
Identifikasi Menggunakan Spektrofotometer FTIR
Sampel senyawa peptida yang telah dimurnikan kemudian di pres pada pelet KBr
dengan perbandingan sampel dan KBr 1 : 100. Background yang digunakan
adalah pelet KBr murni. Spektrum direkam pada mode transmitan pada bilangan
gelombang 4000–400 cm-1.
7.
Identifikasi
Menggunakan
Spektrofotometer
LC/MS
(Liquid
Chromatography/Mass Spectroscopy)
Sampel senyawa peptida yang telah dimurnikan kemudian dilakukan analisis
LC/MS Mariner dengan metode flow rate 0,05 mL/min, volume injeksi 2 L,
eluen metanol.