BAB III METODE PENELITIAN A. Jenis penelitian

BAB III
METODE PENELITIAN
A. Jenis penelitian
Jenis
penelitian
yang
dilakukan
adalah
penelitian
dasar
dengan
menggunakan metode deskriptif (Nazir, 1998).
B. Populasi dan sampel
Populasi yang digunakan dalam penelitian ini adalah bakteri endorizosfer
Ageratum conyzoides, sedangkan sampel dari penelitian ini adalah enam isolat
biakan murni bakteri endorizosfer A. conyzoides yaitu B14 (Shewanella), B15
(Pseudomonas), I13 (Brochothrix), I14 (Kurthia), I18 (Corynebacterium), dan
G11 (Listeria).
C. Waktu dan lokasi pengamatan
Penelitian ini dimulai dari bulan Januari 2013 sampai dengan Juni 2013
yang dilaksanakan di Laboratorium Mikrobiologi FPMIPA UPI Bandung.
D. Alat dan bahan
Daftar alat dan bahan yang digunakan dalam penelitian ini dapat dilihat
pada Lampiran 2.
E. Langkah kerja
1. Tahap persiapan
Pada tahap persiapan ini dilakukan pengecekan alat dan bahan yang
akan digunakan dalam penelitian. Semua alat-alat kaca dan plastik
dibersihkan dan khusus untuk alat-alat kaca dilakukan sterilisasi panas
lembab menggunakan autoclave pada suhu 121oC selama 15 – 20 menit
dengan tekanan 1,5 atm. Dilakukan juga pembuatan medium Luria Agar
(LA) dan Luria Broth (LB) yang akan digunakan untuk subkultur keenam
isolat dari cryo dan pembuatan kurva tumbuh keenam bakteri tersebut.
Fajrul Ihsan, 2013
Identifikasi Metabolit Sekunder Potensial Antibakteri Pada Bakteri Endorizosfer Ageratum
Conyzoides
Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu
19
Semua
medium
yang
dibuat
dilakukan
sterilisasi
panas
lembab
o
menggunakan autoclave pada suhu 121 C selama 15 – 20 menit dengan
tekanan 1,5 atm
2. Tahap penelitian
a. Subkultur bakteri
Sebanyak enam isolat bakteri endorizosfer dari penelitian
sebelumnya yaitu B14, B15, I13, I14, I18, dan G11 disubkultur pada
medium LA untuk peremajaan dan diinkubasi pada suhu 37oC.
b. Pembuatan kurva tumbuh
Metode yang digunakan dalam pembuatan kurva tumbuh ini
adalah
metode
turbidimetri.
Sebanyak
satu
ose
bakteri
uji
diinokulasikan ke dalam medium aktivasi yaitu 10 ml LB dalam
Erlenmeyer bervolume 50 ml dan diinkubasi selama 24 jam pada
water bath shaker dengan suhu 37oC dan agitasi 121 rpm. Setelah
kultur berumur 24 jam, kultur dipindahkan pada 90 ml LB dalam
Erlenmeyer bervolume 250 ml dan diinkubasi kembali pada water
bath shaker dengan suhu 37oC selama 24 jam dan agitasi 121 rpm.
Pada inkubasi kedua ini dilakukan pengukuran turbiditas kultur, setiap
jamnya diambil sebanyak 700 µl kultur dan dimasukan ke dalam
cuvete untuk dilakukan pengukuran turbiditas dengan menggunakan
spectrofotometer
pada panjang gelombang 600 nm, dengan
menggunakan medium LB tanpa penambahan isolat sebagai blanko
(Matlock, 2011; Sezonov, 2007). Kurva tumbuh bakteri uji akan
didapat dari nilai absorbansi (sumbu Y) kultur pada tiap-tiap waktu
inkubasi (sumbu X) (Cappucino dan Sherman, 1987). Dari hasil kurva
tumbuh ini akan didapatkan umur bakteri tersebut untuk mencapai
fase stasioner dimana pada fase tersebut bakteri akan memproduksi
metabolit sekunder.
20
c. Skrining
supernatan
yang
memiliki
aktivitas
menghambat
pertumbuhan bakteri patogen
Pada tahapan ini dilakukan pengkulturan terhadap keenam isolat
bakteri endorizosfer A. conyzoides hingga mencapai fase stasioner.
Setelah mencapai fase stasioner sebanyak 1 ml kultur dimasukkan ke
dalam tabung mini sentrifuga steril untuk dilakukan sentrifugasi pada
kecepatan 10.000 rpm selama 10 menit (Ahamed, 2012). Selanjutnya
dilakukan pengujian aktivitas penghambatan dari tiap-tiap supernatan
terhadap pertumbuhan bakteri uji yaitu Staphylococcus aureus,
Pseudomonas aeruginosa, dan Eschericia coli dengan nilai turbiditas
yang setara dengan standar 0,5 McFarland (Pro Lab Diagnostic,
2012).
Sebanyak 1 ose masing-masing koloni bakteri uji yang berumur
18 - 24 jam diencerkan dengan aquades steril yang ditempatkan pada
tabung reaksi steril secara terpisah. Lalu dilakukan pengukuran nilai
turbiditas menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang
625 nm dengan aquades steril tanpa inokulum sebagai kontrol. Bakteri
uji yang digunakan adalah yang memiliki nilai turbiditas yang sama
dengan standar 0,5 McFarland. Jika terlalu tinggi atau rendah maka
dilakukan pengenceran dengan aquades steril atau penambahan
bakteri uji, hingga mencapai nilai turbiditas yang setara dengan nilai
turbiditas standar 0,5 McFarland (Andrews, 2008). Setelah itu
sebanyak 1 ml bakteri uji dan 9 ml medium LBA dituangkan pada
cawan petri steril dan dihomogenkan.
Sebanyak 20 µl supernatan dari tiap-tiap kultur isolat bakteri
endorizosfer A. conyzoides diujikan terhadap tiap-tiap bakteri uji
dengan menggunakan metode difusi cakram (Coyle, 2005) lalu
diinkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam. Kemudian dilakukan
pengukuran diameter zona hambat dari tiap-tiap supernatan yang
diujikan dengan menggunakan jangka sorong (Cappuccino dan
Sherman, 1987).
21
d. Ekstraksi metabolit sekunder
Isolat bakteri endorizosfer A. conyzoides yang menunjukkan
aktivitas penghambatan terhadap bakteri uji dikultur kembali pada 100
ml medium LB hingga mencapai waktu inkubasi yang ditentukan
berdasarkan hasil skrining. Kemudian kultur dipindahkan ke dalam
tabung mini sentrifuga steril dan disentrifugasi pada kecepatan 10.000
rpm selama 10 menit untuk memisahkan pelet dan supernatan.
Supernatan yang telah terpisah dipindahkan ke labu pemisah dan
diekstrak menggunakan etil asetat untuk mendapatkan larutan ekstrak
metabolit sekunder (Ahamed, 2012).
Larutan ekstrak metabolit sekunder yang didapat dievaporasi pada
vakum evaporator dengan suhu 40oC hingga terbentuk ekstrak kering
dari larutan tersebut (Garcia et al., 2012). Ekstrak kering yang
terbentuk kemudian dilarutakan dalam DMSO 1% dengan konsentrasi
40 mg/ml lalu disimpan dalam botol fial gelap pada suhu 4oC (Liang
et al., 2012).
e. Uji aktivitas antibakteri
Pengujian aktivitas antibakteri dari ekstrak supernatan ini
dilakukan kepada tiga isolat bakteri patogen yaitu Pseudomonas
aeruginosa, Staphylococcus aureus, dan Eschericia coli. Bakteri uji
diencerkan dalam aquades steril hingga mencapai konsentrasi 1,5 x
108 cfu/ml atau setara dengan nilai turbiditas standar 0,5 McFarland
(Pro Lab Diagnostic, 2012). Lalu sebanyak 1 ml bakteri uji dituangkan
pada cawan Petri bersama 9 ml medium LA dan dihomogenkan.
Pengujian aktivitas antibakteri dilakukan dengan menggunakan
metode difusi cakram (Coyle, 2005). Sebanyak 20 µl masing-masing
ekstrak diujikan dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37oC.
Setelah diinkubasi selama 24 jam dilakukan pengukuran zona hambat
dengan menggunakan jangka sorong (Cappuccino dan Sherman,
1987). Untuk melihat potensi sensitivitas ekstrak metabolit sekunder
22
maka besaran zona hambat yang terbentuk dibandingkan dengan skala
sensitivitas obat antibiotik (Tabel 3.1) (Sharma et al., 2009).
Tabel 3.1 Skala sensitivitas obat antibiotik
Diameter
Sensitivitas
zona hambat (mm)
1
µ<6
Tidak sensitif
2
6<µ<9
Sensitivitas rendah
3
9 < µ < 12
Sensitivitas sedang
4
µ > 12
Sensitivitas tinggi
Ket: µ(zona hambat pada kultur)
Sumber: Sharma et al., 2009
No
f. Identifikasi senyawa pada ekstrak kasar metabolit sekunder dengan
GC-MS (Gas Chromatography-Mass Spectrometry)
Tahap identifikasi ini dilakukan untuk mengetahui identitas
senyawa aktif pada ekstrak kasar metabolit sekunder dari bakteri
endorizosfer A. conyzoides. Identifikasi senyawa potensial antibakteri
pada ekstrak kasar dilakukan dengan menggunakan GC-MS, tahap ini
sekaligus merupakan sebagai tahapan analisis data pada penelitian ini.
23
F. Alur penelitian
Alur penelitian dapat dilihat pada gambar di bawah ini:
Tahap persiapan alat dan bahan
Subkultur bakteri endohizosfer
dari cryo ke medium LA
Pembuatan Kurva Tumbuh
keenam bakteri endorhizosfer A.
conyzoides pada medium LB
Skrining supernatan dan bakteri endorhizosfer A.
conyzoides dengan aktivitas antibakteri
Pengkulturan isolat potensial hingga
waktu inkubasi berdasarkan hasil
skrining
Ekstraksi metabolit sekunder
Uji aktivitas antibakteri ekstrak metabolit
sekunder kasar terhadap bakteri patogen
(E. coli, P. aeruginosa, dan S. aureus)
Identifikasi senyawa aktif potensial
antibakteri pada ekstrak metabolit sekunder
kasar menggunakan GC-MS
Pengumpulan dan analisis data
Pembuatan laporan
Gambar 3.1 Alur penelitian